Зкспрессия β-галактозидазы Escherichia coli в гепатоцитах мыши
Исследована возможность переноса гена бактериальной β-галактозидазы (плазмида рGА293) в составе липосом непосредственно в печень двухмесячных мышей линии ВАLВ/с. Тестирование продукта экспрессии. lасZ-гена проведено иммунофлюоресцентным методом через 24 ч после инъекции. Установлено, что продукт экс...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1989 |
| Автори: | , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154404 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Зкспрессия β-галактозидазы Escherichia coli в гепатоцитах мыши / И.Е. Костецкий, С.П. Шпилевая, Л.И. Лихачева, Л.Г. Жарова, Д.М. Иродов, В.С. Кириллова, В.А. Кордюм // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 2. — С. 51-58. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859637622359457792 |
|---|---|
| author | Костецкий, И.Е. Шпилевая, С.П. Лихачева, Л.И. Жарова, Л.Г. Иродов, Д.М. Кириллова, В.С. Кордюм, В.А. |
| author_facet | Костецкий, И.Е. Шпилевая, С.П. Лихачева, Л.И. Жарова, Л.Г. Иродов, Д.М. Кириллова, В.С. Кордюм, В.А. |
| citation_txt | Зкспрессия β-галактозидазы Escherichia coli в гепатоцитах мыши / И.Е. Костецкий, С.П. Шпилевая, Л.И. Лихачева, Л.Г. Жарова, Д.М. Иродов, В.С. Кириллова, В.А. Кордюм // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 2. — С. 51-58. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Исследована возможность переноса гена бактериальной β-галактозидазы (плазмида рGА293) в составе липосом непосредственно в печень двухмесячных мышей линии ВАLВ/с. Тестирование продукта экспрессии. lасZ-гена проведено иммунофлюоресцентным методом через 24 ч после инъекции. Установлено, что продукт экспрессии зтого гена обнаруживается у 20–25 % гепатоцитов, о чем свидетельствует появление яркого свечения в этих клетках. В вариантах с инъецированием физиологического раствора, плазмид рGА293 и рGА293ZΔ без липосом, а также липосом, нагруженных ДНК плазмиды рGА293ZΔ, уровень флюоресценции гепатоцитов был низким и сравним с таковым у интактных животных. Экспрессия lacZ-гена происходит с одинаковой интенсивностью в разных участках печени и не зависит от места введения. Индивидуальные животные проявляют различную ответную реакцию на введение чужеродного генетического материала.
Досліджено можливість перенесення гена бактерійної β-галактозидази (плазміда рGА293) у складі ліпосом безпосередньо в печінку двомісячних мишей лінії ВАLВ/с. Тестування продукта експрессії lасZ-гена проведено імунофлуоресцентним методом через 24 год після ін’єкції. Встановлено, що продукт експресії цього гена виявляється у 20–25 % гепатоцитів, про що свідчить поява яскравого свічення у цих клітинах. У варіантах з ін’єктуванням фізіологічного розчину, плазмід рGА293 і рGА293ZΔ без ліпосом, а також ліпосом, навантажених ДНК плазміди рGА293ZΔ, рівень флуоресценції гепатоцитів був низьким і порівнянним з таким у інтактних тварин. Експресія lacZ-гена відбувається з однаковою інтенсивністю у різних ділянках печінки і не залежить від місця введення. Індивідуальні тварини по-різному реагують у відповідь на введення чужорідного генетичного матеріалу.
The expression of the bacterial β-galactosidase gene as a part of plasmid pGA293 in the mouse liver hepatocytes has been demonstrated 24 h after direct injection of the above plasmid inclosed into liposomes into the liver.
|
| first_indexed | 2025-12-07T13:17:51Z |
| format | Article |
| fulltext |
14. Human erythropoietin gene: high level expression in stably transfccted mammalian
cells and chromosomal localization / J. S. Powell, IC L. Berkner. R. V. Lebo, J. W.
A d a m s o n / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA.— 1986.—83, N 17.—P. 6465—6469.
15 Correction of the anemia of end-stage renal disease with recombinant human eryth-
ropoietin / / N e w Eng. J. Med.— 1987.—316, N 2 ,—P. 73—78.
16. Effect of human erythropoietin derived from recombinant DNA on the anemia of pa-
tients maintained by chronic hacmodialysis / C. G. Winearls, D. 0 . Oliver, M. S. Pip-
pard et a l . / / L a n c e t . — 1986.—2, N 8517.—P. 1175—1178.
17. Клонирование гена эритропоэтина человека / И. А. Крамерова, Н. С. Незнанов,
В. М. Божков и др. / / Молекуляр. генетика.— 1988.— № 7.— С. 26—28.
18. Mulligan R. Cv Berg P. Selection for animal cells that express Escherichia coli gene
coding for xantine-guanine phosphoribosyltransferase / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—
1981.-78, N 4 .—P. 2072—2076.
19. Grunstein M., Hogness D. Colony hybridization: a method for the isolation of clo-
ned DNAs that contain a specific gene / / Ibid.— 1975.—72, N 10.—P. 3961—3965.
20. Graham F. L., Van der Eb A. J. A new technique for the assay of infectivity of hu-
man adenovirus 5 D N A / / V i r o l o g y . — 1973.—52, N 2 .—P. 456—467.
21. Монакова Т. Ε. Гомеостатические процессы в изолированных системах и организ-
мах.— Красноярск : Медицина, 1983.—210 с.
22. Krysial G. A simple microassay for erythropoietin based on 3H-thimidine incorporati-
on into spleen cells treated with pheny lhyd raz ine / /Exp . Hematol.— 1983.—11, N 7.—
P. 649—660.
23. Radioimmunoassay of erythropoietin: circulating levels in normal and polycythemic
human being / J . F. Garcia, S. Ebbe, L. Hollander et a l . / / J . Lab. and CHn. Med.—
1982,—99, N 6 .—P. 624—635.
24 Modulation of gene expression in multiple hematopoietic cell leneages following ret-
roviral vector gene transfer / M.-C. Magli, J. E. Dick, D. Huszar et a l . / / P r o c . Nat.
Acad. Sci. USA.— 1987,—84, N 3 .—P. 789—794.
25. Potter H., Weir L., Leder P. Enhancer-dependent expression of human immunoglobu-
lin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation / / Ibid.—
1984.-81, N 22,— P. 7161—7165.
НИИ биомед. технологии МЗ СССР, Москва Получено 10.12.87
УДК 577.212:577.352.27
ЭКСПРЕССИЯ β-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ Escherichia coli
В ГЕПАТОЦИТАХ МЫШИ
И. Е. Костецкий, С. П. Шпилевая, Л. И. Лихачева,
Л. Г. Жарова, Д. М. Иродов, В. С. Кириллова, В. А. Кордюм
Введение клонируемых генов в отдельные органы и ткани взрослого ор-
ганизма является важным средством изучения их функционирования, а
также механизмов, регулирующих экспрессию этих генов, что позволяет
охарактеризовать работы в этом направлении как поиск путей генной
терапии. К настоящему времени достаточно хорошо разработаны мето-
ды трансформации эукариотических клеток in vitro (среди них Са-фос-
фатпып, ДЭАЭ-декстраповый, электропорация, микроинъекция и др.).
Поэтому один из подходов в генной терапии основан на трансформации
in vitro извлеченных из организма животного клеток и после селек-
ции— их обратная трансплантация тому же животному [1—4]. Однако
наряду с очевидными достоинствами метода ретрансплантации клеток
животных в ряде случаев он не может применяться с достаточной эф-
фективностью, из-за чего прямая инъекция генетического материала
непосредственно в орган или ткань может оказаться предпочтительнее.
Так, при интраперитонеальной инъекции Са-фосфатного преципитата
Д Н К через сутки были обнаружены значительные количества чужерод-
ной Д Н К в животных тканях новорожденных крыс, особенно в печени
и селезенке [5, 6]. Экзогенная Д Н К активно транскрибировалась, и
экспрессия генов инсулина, человеческого гормона роста прослежива-
лась по белковым продуктам в печени и селезенке или по соответству-
ющим транскриптам.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА — 1989.—Т. 5, Л° 2 4* 51
Главная задача при введении экзогенной Д Н К in vivo заключается
в защите Д Н К от нуклеазного гидролиза (в кровотоке, инкубационной
среде, па мембранах или внутри трансформируемых клеток). С этой
целью разработан и апробирован ряд подходов, заключающихся в ре-
конструкции in vitro чужеродной Д Н К в нуклеопротеидный комплекс в
присутствии гистонов и анионных ДНК-связывающих белков [7—9].
В качестве переносчиков генетического материала in vivo используют
также искусственные вирусоподобные частицы [10], микрокапсулы [7],
липосомы [11, 12]. Применение липосом имеет ряд преимуществ перед
другими системами: биодеградируемость самих носителей, нетоксич-
ность их для клеток животных, возможность переноса практически лю-
бых биологически активных веществ и др. Варьирование состава липо-
сом предоставило возможность направленно влиять на избирательность
мх накопления в определенных клетках печени (гепатоцитах, клетках
Купфера или эндотелия) [12]. Очевидно, использование различных ли-
гандов, варьирование состава липосом наряду с применением многих
других подходов позволит в будущем разработать надежные методы
преимущественного накопления липосом (а следовательно, и переноси-
мых ими биологически активных веществ) в определенных клетках за-
данного органа. С этой точки зрения использование липосом для пере-
носа плазмидной Д Н К кажется предпочтительнее по сравнению с дру-
гими способами доставки.
Целью нашей работы явилось изучение экспрессии гена бактери-
альной β-галактозидазы в гепатоцитах печени взрослых мышей после
инъекции плазмидной ДНК, заключенной в липосомы, непосредственно
в заданный орган. Для этого разработана модельная система, позволя-
ющая установить наличие продукта экспрессии и оценить его уровень
в каждой клетке. Она включает маркерный ген (β-галактозидаза Е. со-
Ii), систему доставки (инъекция заключенной в липосомы плазмидной
Д Н К непосредственно в печень), тестирование продукта экспрессии спе-
цифическими поликлональными антисыворотками с использованием им-
мунофлюоресцентного анализа (ИФ) с последующей микроцитофото-
метрией.
Материалы и методы. П л а з м и д ы . В работе использовали Д Н К плазмиды
pGA293, любезно предоставленной нам д-ром Симинович (Канада). Данная плаз-
мида содержит IacZ ген Е. coli, кодирующий синтез бактериальной β-галактозидазы.
Производная этой плазмиды, pGA293Z&, была лишена £со#/-фрагмента, несущего
/acZ-последовательности, и использовалась нами в качестве контроля. Данные плазми-
ды заключали в большие моноламеллярные липосомы методом Ca-fuzion.
П о л у ч е н и е и о ч и с т к а с ы в о р о т о к . Иммунизацию кролей проводили очи-
щенной β-галактозидазой, выделенной из Е. coli. Полученную специфическую сыворот-
ку (титры 1 : 32, 1 : 16 по Ухтерлони) подвергали очистке печеночным порошком [14].
Меченный флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) ослиный антикроличий глобулин ос-
вобождали от несвязанного флюорохрома на 1 %-ной агарозе. Рабочее разведение кро-
личьей сыворотки к бактериальной β-галактозидазе при окраске цитологических препа-
ратов 1 : 10, люминесцентной— 1 : 16.
О б ъ е к т , и н ъ е к ц и я м а т е р и а л а . Исследование проведено на двухмесячных
мышах линии BALB/с. На вариант опыта выделяли группу животных из четырех осо-
бей, каждый опыт имел в среднем трехкратную повторность. Инъекции материала про-
водили в крупную нижнюю долю печени. Локализацию нужной доли печени устанав-
ливали через разрез наружного покрова на уровне органа. Проводимая операция не
оказывала заметного отрицательного воздействия на животных.
Объем вводимого в печень животного материала во всех вариантах составил
60 мкл на особь. В случае инъецирования плазмид pGA293ZΔ и pGA293, заключенных
в липосомы, вводимый материал содержал 300 мкг липидов и 10 мкг плазмидной ДНК.
Кроме того, проведены инъекции плазмиды pGA293 без липосом и липосом без плаз-
миды. Для проверки адекватных реакций животных на введение экзогенного материа-
ла использованы инъекции физиологического раствора (10 мМ трис-HCl, рН 7,5).
Контролем к проведенным вариантам инъекций служили интактные животные.
П р и г о т о в л е н и е п р е п а р а т о в г е п а т о ц и т о в . Для цитологических пре-
52 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА — 1989.—Т. 5, Л° 2 4* 52
паратов использовали участок печени, в который вводили материал. Измельченную на
кусочки ткань отмывали от элементов крови, выдерживали не менее 30 мин в холод-
ном Na-дитратном буфере (0,88%-ный NaCl, 0,7 %-ный Ка-цитрат, 0,1 %-ная глюкоза,
5 мкг/мл гепарин, рН 7,4) и использовали для получения мазков гепатоцитов. Качест-
во мазков, их плотность проверяли под световым микроскопом. Мазки фиксировали
20 мин охлажденным при 4 °С ацетоном. Морфологическую сохранность и функциональ-
ную интактпость гепатоцитов проверяли на отдельных препаратах окрашиванием их
0,2 %-ным трипановым синим [15]. Выход целых неповрежденных клеток гепатоцитов,
которые не окрашивались трипановым синим, колебался в пределах 90—95 %.
И с с л е д о в а н и е ц и т о л о г и ч е с к и х п р е п а р а т о в . . Продукт экспрессии
/acZ-гена в гепатоцитах мышей тестировали непрямым ИФ методом [16] с использо-
ванием плацебо. Препараты исследовали на люминесцентном микроскопе MJ1-2 с фо-
тометрической приставкой при длине волны 520 нм с зондом 0,5 мкм2. При просмотре
препаратов пользовались объективом Х70 для водной иммерсии. В ультрафиолете ок-
рашенный продукт экспрессии IacZ-гена флюоресцировал зеленым светом. Интенсив-
ность све іения каждого отдельного гепатоцита определялась как средняя величина от
измерении зондом трех точек в различных участках цитоплазмы клетки. По каждому
опыту измерения проводили на 30—50 гепатоцитах препарата с 4—5-кратной пов-
тор ностыо.
Результаты и обсуждение. Для доставки плазмидной Д Н К непо-
средственно в заданный орган в отличие от описанных в литературе
методов мы использовали липосомы. Они облегчают доставку Д Н К в
клетки π защищают ее от биодеградации [17], инъекция же липосом
непосредственно в орган позволяет увеличить эффективность этих про-
цессов. Тестирование бактериальной β-галактозидазы осуществляли че-
рез 24 и 48 ч после инъецирования заключенной в липосомы плазмид-
ной Д Н К (рис. 1).
При анализе флюоресценции гепатоцитов мышей контрольных
групп (введение липосом, физиологического раствора) через 24 и 48 ч
после инъекции между отдельными вариантами отмечалась сходная
Рис. 1. Флюоресценция гепатоцитов: а — интактной мыши; б — через 24 ч после инъ-
екции плазмиды pGA293 в составе липосом
Fig. 1. Fluorescence of hepatocytes: а — of intact mouse, б — 24 h after injection of
plasmid pGA293 included into liposomes
реакция па введенный экзогенный материал. Интенсивность флюорес-
ценции гепатоцитов была подобна таковой у интактпых животных. Ци-
топлазма клеток проявляла слабое тусклое свечение, ядра не флюорес-
цировали. Распределение гепатоцитов по флюоресценции соответство-
вало нормальному распределению, что свидетельствует об отсутствии
процессов, влияющих на интенсивность флюоресценции в клетках.
Гспатоциты животных, которым инъецировали в составе липосом
плазмиду pGA293ZA (без lacZ-rena) через 24 ч также проявляли низкий
уровень флюоресценции цитоплазмы. Но здесь уже наблюдается не-
большое смещение максимума па кривой распределения в сторону боль-
шей интенсивности флюоресценции, а также намечаются отклонения от
нормального распределения: часть клеток обладает более яркой, вы-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА— 1989.—Т, 5 № ? 53
ходящей за пределы гауссовской кривой, флюоресценцией (рис. 2, а, б).
Наибольшее смещение максимума на кривой распределения в сторону
большей интенсивности флюоресценции отмечено при инъецировании
животным плазмиды pGA293 (содержащей IacZ-ген), но без липосом.
Опытной группе животных инъецировали плазмиду pGA293 и в составе
липосом.
Через 24 ч после инъекции в популяции гепатоцитов появляются
клетки с ярко флюоресцирующей цитоплазмой (рис. 2, в). При разло-
Рис. 2. Распределение гепатоци-
тов по интенсивности флюоресцен-
ции: 1 — интактное животное; че-
рез 24 ч после инъекции плазмид
PGA293Z Δ (2) и pGA293 (3) в
составе липосом
Fig. 2. Distribution of hcpatocy-
tcs by fluorescence intensity: 1 —
intact animal, 2 — 24 h after in-
jection of plasmid pGA293ZΛ in-
cluded into liposomes, 3 — 24 h
after injection of plasmid pGA293
included into liposomes
Рис. 3. Математический анализ
кривой распределения гепато-
цитов (через 24 ч после вве-
дения плазмиды pGA293 в со-
ставе липосом) по интенсивнос-
ти флюоресценции (см. в тек-
сте)
Fig. 3. Mathematical analysis
of hepatocytes distribution cur-
ve (24 h after introduction of
plasmid pGA293 included into
liposomes) by fluorescence in-
tensity (see text)
жении кривой распределения опытного варианта на составляющие вы-
являются два основных пика, соответствующие различной интенсивности
флюоресценции (рис. 1; рис. 3,1), и группа клеток, составляющая око-
ло 5 % общего числа с наиболее яркой флюоресценцией в диапазоне, в
2—3 раза превышающем общий уровень (рис. 3).
Первый пик, соответствующий по форме распределению светимос-
ти гепатоцитов в варианте с инъецированием Д Н К pGA293ZA (до 75 %
клеток), представляет, по-видимому, !^трансформированные плазмидой
клетки либо трансформанты, в которых плазмида по каким-либо причи-
нам не экспрессируется (рис. 3,2) .
Второй пик (около 22 % гепатоцитов) соответствует интенсивно
светящимся клеткам, яркая специфическая флюоресценция их цито-
плазмы рассматривается как свидетельство присутствия продукта экс-
прессии— бактериальной β-галактозидазы. Появление 5 % гепатоцитов
с наиболее яркой флюоресценцией можно объяснить особенностями ме-
таболического состояния некоторых клеток, обеспечивающего наиболее
эффективную экспрессию lacZ-гена. (рис. 3,3) .
При обработке препаратов неспецифической кроличьей сывороткой
специфической люминесценции гепатоцитов мышей как опытной, так и
контрольной групп животных не наблюдалось. Этот факт дает основа-
ние полагать, что второй пик на кривой распределения опытного вари-
анта появляется именно из-за присутствия бактериальной β-галакто-
зидазы.
Форма обоих пиков очень сходна. В каждом к форме гауссовской
кривой добавляется небольшое правое плечо. Это можно объяснить
иным физиологическим состоянием небольшой части клеток печени.
Отсутствие такого плеча в распределениях, соответствующих всем конт-
ролям, где отсутствует плазмидная ДНК, свидетельствует о том, что
54 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА — 1989.—Т. 5, Л° 2 4* 54
наблюдаемые изменения являются ответом на наличие экзогенной плаз-
мидной ДНК.
Результаты обнаруженных закономерностей можно представить в
виде данных по средней интенсивности флюоресценции гепатоцитов
(отп. ед.) через 24 ч в зависимости от типа инъецированного материала
(выборка для каждого варианта составила 220 клеток). Доверительные
границы средних значений и достоверность разницы двух пиков на
опытной кривой определяли для вероятности β = 0,99. Популяция кле-
ток с наиболее интенсивной флюоресценцией в наших данных отсутст-
вует из-за ее малочисленности.
Интактные животные 14,5+4,2
После инъекции плазмиды
pGA293ZA 18,1+3,8
После инъекции плазмиды
pGA293
I пик клеток 25,7+3,8
II пик клеток 40,5+3,3
Через 48 ч после инъекции в печень мышей липосом, нагруженных
pGA293y в гепатоцитах части животных продолжает тестироваться про-
дукт экспрессии /acZ-гена. Однако и здесь сказываются индивидуаль-
ные особенности животных. Так, у одних интенсивность флюоресценции
гепатоцитов снижается до уровня контроля (pGA293ZA в составе липо-
сом) , у других — продолжает оставаться на высоком уровне, но про-
является варьирование соотношения между клетками с разной интен-
сивностью флюоресценции. У гепатоцитов контрольной группы живот-
ных, которым инъецировалась плазмида pGA293ZA в составе липосом,
наблюдались незначительное увеличение флюоресценции по сравнению
с интактными животными и типичная для этого варианта форма рас-
пределения.
Выбор ИФ метода для тестирования продуктов экспрессии чуже-
родного гена был не случаен. Большая чувствительность, относительная
простота ИФ анализа, вероятность определения ничтожно малых кон-
центраций веществ в отдельной клетке и специфичность являются его
существенными преимуществами перед другими методами. Особым до-
стоинством использованного метода является возможность обнаружи-
вать наличие экспрессии не по суммарному продукту, а дифференциро-
ванно тестировать его в отдельных клетках и тканях органа. Этот
метод в последнее время, судя по литературе, успешно используется
рядом авторов для определения продукта экспрессии чужеродного гене-
тического материала в культурах различных клеток млекопитающих.
Таким образом была показана экспрессия эпидермальиых кератиновых
генов и локализация продукта в эпителиальных клетках, мышиных и
человеческих фибробластах [18]; установлен продукт экспрессии генов
оболочки вируса лейкемии мышей и его распределение на поверхности
клеток CVl [19]; изучена локализация гибридного мембранного белка
в СУУ-клетках, являющегося продуктом экспрессии SV40 рекомбинант-
пого вектора [20]; продемонстрирована экспрессия вирусного T-анти-
гена SV40 в клетках костного мозга [21] и др.
При работе с гепатоцитами обращает на себя внимание фоновое
свечение их цитоплазмы (аутолюминесценция) в зеленой области спект-
ра, где тестируется продукт экспрессии ZacZ-гена — β-галактозидаза, что
может, на первый взгляд, искажать конечный результат. На рис. 4
приведены результаты измерений собственной люминесценции из пече-
ни иитактных животных и аутолюмииесценции гепатоцитов после вве-
дения в печень чистых липосом и плазмиды pGA293 в составе липосом.
Аутолюминесценция гепатоцитов у интактных животных после инъек-
ции липосом и плазмидной Д Н К в составе липосом была слабой и по
значениям интенсивности свечений различий между этими вариантами
ие отмечалось, она также была ниже, чем у гепатоцитов интактных жи-
вотных после окраски ИФ методом (см. рис. 2, а). При измерении сла-
бофлюоресцирующих клеток в последнем случае (в нашем исследова-
БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, До 2 55
нии это, например, гепатоциты интактных животных после инъекций
липосом, чистой плазмиды pGA293 или физиологического раствора)
вклад аутолюминесценции в значения интенсивности свечения значи-
тельно больше, чем при работе с ярко флюоресцирующими препарата-
ми (pGA293 в составе липосом). Однако, исходя из того, что аутолю-
минесценция при 520 нм у гепатоцитов исследованных вариантов прак-
тически одинакова, она не является фактором, способным влиять на
корректность измерений.
В проведенных исследованиях для введения генетического материа-
ла непосредственно в заданный орган использовали липосомы, хорошо
Рис. 4. Аутолюминесценции гепа-
•цитов: 1 — интактное животное;
2, 3 — через 24 ч после инъекции
липосом и плазмиды pGA293 в со-
ставе липосом соответственно
Fig. 4. Autolumincscence of hepa-
tocytes: 1 — intact animal, 2, 3 —
24 h after injection of liposomes
and plasmid pGA293 included in-
to liposomes, respectively
взаимодействующие с клетками и облегчающие доставку в них плаз-
мидпых ДНК. В пользу этого свидетельствуют полученные результа-
ты — эффективная экспрессия бактериального /acZ-гепа в гепатоцитах
при введении животным pGA293 в составе липосом, и отрицательные —
при использовании в опытах плазмидной Д Н К без липосом. Незначи-
тельные отличия в светимости гепатоцитов в последнем варианте инъ-
екций по сравнению с люминесценцией гепатоцитов других контроль-
ных вариантов доказывают низкую трансформирующую способность
плазмидной Д Н К без липосом. Причиной этого может являться, в част-
ности, деградация плазмидной ДНК, не защищенной липосомами, что
подтверждается данными литературы. Так, описана деградация и эли-
минация свободной Д Н К при введении ее интраперитоиеалыю новорож-
денным крысам [6] — через 48 ч большая часть инъецированной ДНК,
содержащая низкомолекулярные продукты, обнаруживалась в мочевом
пузыре. Предполагается также [5], что деградация Д Н К в печени
может быть связана с индукцией эндогенной эндонуклеазной активно-
сти; кроме того, интактная Д Н К плохо проникает в клетки.
Как отмечено выше, инъецирование исследуемого материала про-
водилось нами в нижнюю большую долю печени. Было проанализирова-
но (по измерению содержания продукта экспрессии IacZ-гена) распро-
странение введенного материала в каждой доле органа. Как оказалось,
различий в интенсивности люминесценции между гепатоцитами разных
препаратов установлено не было, т. е. ДНК, заключенная в липосомы,
распределялась по всем долям печени. Однако Бенвенисти и др. [6],
изучая распределение в печеночной ткани Са-фосфатного преципитата
Д Н К при иитраперитонеальном введении его новорожденным крысам,
получили неоднозначные результаты. У одного животного распределе-
ние Д Н К по четырем долям печени было одинаковым, у второго — от-
мечены вариации в содержании Д Н К по трем долям печени. В связи
с этим, учитывая возможность неравномерного распределения материа-
ла по органу, а также для унифицирования проводимых нами исследо-
ваний препараты гепатоцитов готовили из той доли печени, в которую
инъецировали материал. В наших опытах отмечалась также четкая ин-
дивидуальная реакция животных на вводимый материал. В пределах
одного опыта среди выбранной группы мышей встречались экземпляры,
которые практически не проявляли либо проявляли очень слабую ре-
акцию на инъецированный материал, и особи с ярко выраженной от-
ветной реакцией. Положительный ответ — появление в гепатоцитах бак-
териальной β-галактозидазы — был получен в 50 % случаев. Индивиду-
альная реакция животных на введенный материал отмечалась также
54 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА — 1989.—Т. 5, Л° 2 4* 56
при иптраперитонеальном введении Са-фосфатного преципитата плаз-
мидиой Д Н К [6], при этом наряду с высокой частотой экспрессии от-
мечено неравномерное распределение генов по гепатоцитам. Для сниже-
ния вариабельности в содержании продукта экспрессии при инъекции в
печень мышей были удачно использованы одновременно с Са-фосфат-
ным преципитатом плазмидной Д Н К гидролитические ферменты — гиа-
луронидаза и коллагеназа [5]. При таком сочетании вводимого мате-
риала был достигнут положительный эффект в более однородном по-
ступлении экзогенной Д Н К в трансформированный орган и в большее
количество клеток.
Таким образом, на примере бактериального lacZ-reна показано, что
локальное введение в печень чужеродного генетического материала
обеспечивает его функционирование в органе, что достаточно корректно
определяется иммунофлюоресцентиым анализом. Прямая инъекция ли-
посомной суспензии непосредственно в печень представляется в ряде
случаев предпочтительнее внутривенной, так как в этом случае липо-
сомы непосредственно контактируют с гепатоцитами, обеспечивая до-
ставку экзогенной Д Н К B эти клетки. Высокий процент клеток, где тес-
тируется продукт экспрессии гена бактериальной β-галактозидазы через
24 ч после инъекции, вряд ли связан с интеграцией плазмид в геном и
объясняется, по-видимому, функционированием плазмид в свободном
состоянии.
EXPRESSION OF ESCHERICHIA COLI β-GALACTOSIDASE
IN MURINE HEPATOCYTES
I. Ε. Kostetsky, S. P. Shpilevaya, L. I. Likhacheva,
L. G. Zharova, D. Μ. Irodov, V. S. Kirillova, V. A. Kordium
Institute of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
The expression of the bacterial β-galactosidase gene as a part of plasmid pGA293 in the
mouse liver hepatocytes has been demonstrated 24 h after direct injection of the above
plasmid inclosed into liposomes into the liver.
Г Insertion of a new gene of viral origin into bone marrow cells of mice / Iv E. Mer-
' cola, D. S. Howard, J. Browne et al. / / Science.— 1980.—208, N 4 4 4 7 . - P . 1033-1035.
2 Генетическая трансформация соматических клеток. 2. Анализ состояния плазмидных
последовательностей в хромосомных ДНК и активность тимидинкиназы в клетках
трансформированных клонов / Н. В. Томилин, О. И. Подгорная, Д. С. Абрамян,
О К Глебов / /Цитология.— 1985.—27, № 5.—С. 554—564.
3 St Louis D., Verma L М. Whole animal gene transfer 11 Gene transfer vectors mam-
malian cells.—New York: Cold Spring Harbor Lab., 1987.—P. 94—102.
4 Implantation of genetically engineered fibroblasts into mice: implications for gene
t h e r a p y / R . F. Selden, M. J. Skoskiewicz, K- B. Howie et a l . / /Science .— 1987.—236,
N 4802.—P. 714—718. r ^ f . , „
5 Dubensky T. Wv Campbell В. AVillarreal L. P. Direct transfection of viral and
plasmid DNA into the liver or spleen of m i c e / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA.— 1984.—-
81, N 23.—P. 7529—7533.
6 Benvenisty NReshef L. Direct introduction of genes into rats and expression of the
g e n e s / / I b i d . — 1986.—83, N 24.—P. 3551—3555.
7 Марголис JI. ББергельсон JI. Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками.—
' М. : Наука, 1986.—240 с.
8. Захарян Р. А. Перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы HSV-I в
составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в
клетках печени / /Биополимеры и клетка.— 1987.—3, № 4.— С. 215—220.
9 Stavridis J. СPsallidopoulos М. Use of transferrin as a gene-carrier to the erythroid
cells of the marrow / / C e l l and Мої. Biol.— 1982.—28, N 1.—P. 15—18.
10. Price J.f Turner D., Cepko C. Lineage analysis in the vertebrate nervous system by
retrovirus-mediated gene t r a n s f e r / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA.— 1987.—84, N 1.—
P. 156—160.
11. Manning E. J., Millson G. C. Infectivity of liposomally encapsulated nucleic acids
isolated from EMC virus and scrapie-infected mouse bra in / / In terv i ro logy.— 1983.—
20, N 2—3,—P. 164—168.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА — 1989.—Т. 5, Л° 2 4* 57
12. In vivo expression of rat insulin after intravenous administration of the liposome-
entrapped gene for rat insulin I / C. Nicolau, C. Ie Pape, Ph. Soriano et al. / / Proc.
Nat. Acad. Sci. USA.— 1983.—80, N 4 — P. 1068—1072.
13 Gynheung An., Hidaka K., Siminovitch L. Expression of bacterial β-galactosidase in
animal c e l l s / / M o L and Cell. Biol.— 1982.—2, N 12.—P. 1628—1632.
14. Зильбер А. Иммунологический анализ — Μ . : Медицина, 1968.— 185 с.
15. Seglen Р. О. Effects of amino acids, ammonia and leupeptin on protein synthesis and
degradation in isolated rat hepa tocy tes / /Biochem. J.— 1978.—174, N 3.— P. 469—
474.
16. Coons A. H., Ledis E. M., Connolly J. M. Studies on antibody production. 1. A met-
hod for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to
a study of the hyperimmune r a b b i t / / J . Exp. Med.— 1955.—102, N 1.—P. 49—59.
17. Грегориадис Г., Аллис Η. Α. Липосомы в биологических системах.— Μ . : Медицина,
1983.—384 с.
18. Giudice G. J., Fuehs Е. The transfection of epidermal keratin genes into fibroblasts
and simple epithelial cells: evidence for inducing a type I keratin by a type II / / Gene
Cell.— 1987.—48, N 3 .—P. 453—463.
19. T-lymphocyte priming and protection against Friend leukemia by vaccina-retrovirus
env gene recombinant / P. L. Earl, B. Moss, R. P. Morrison et al. / / Science.— 1986.—
234, N 4777.—P. 728—731.
20. Peterson R. G., Lamb R. A. Ability of the hydrophobic fusion-related external domain
of a paramyxovirus F. protein to act as a membrane anchor / / Cell.— 1987.—48,
N 3 .—P. 441—452.
21. Трансформация клеток костного мозга грызунов рекомбинантной плазмидой
pBRSV / Т. Б. Казакова, В. А. Шатов, И. А. Вербина и др . / /Цитология .— 1986.—
28, № 12.—С. 1345—1350.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 09.09.88
УДК 577.21:579.25.5
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЭКСПРЕССИИ
ЭКЗОГЕННОГО ГЕНА ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА
В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФИБРОБЛАСТАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Л. Н. Неборачко, Л. Л. Лукаш, Б. М. Трояновский,
И. С. Варзанова, Т. И. Бужиевская, В. А. Кордюм
Во всем мире наблюдается рост заболеваемости диабетом. По некото-
рым оценкам он занимает третье место среди причин смертности в раз-
витых странах мира. Разработка методов лечения этой патологии яв-
ляется одной из первоочередных задач биотехнологии в медицине [1].
Биотехнология в западных странах добилась значительных успехов в
производстве инсулина человека генноинженерным путем. В то же вре-
мя единственным радикальным мероприятием, способным устранить мо-
лекулярную основу иисулинзависимого диабета, является перенос гена
инсулина человека пациентам в такой молекулярной конструкции, кото-
рая обеспечивает его экспрессию в клетках больных, в том числе в не-
специализированных.
Экспрессия гена инсулина у взрослых животных происходит в β-
клетках поджелудочной железы, составляющих лишь 1 % общего чис-
ла ее клеток. У эмбрионов млекопитающих инсулин синтезируется
также в печени [2], нервной ткани (мозге) [2—5], желточном мешке
[6]. Клетки мозга обладают более слабой системой процессирования
этого гормона, чем клетки поджелудочной железы: проинсулии в пер-
вом случае значительно превышает содержание инсулина [5]. У чело-
века ген, кодирующий инсулин, расположен в 11-й хромосоме. Его
структурная часть состоит из трех экзонов и двух интронов. Регуляция
экспрессии обеспечивается б'-фланкирующей областью, включающей
уникальные последовательности и тандемные повторы [7]. Эта область
обеспечивает ту высокую тканеспецифичность, которая и отмечалась
выше. Поэтому для экспрессии гена инсулина в клетках, в которых он
в норме пе работает, обычно используют стандартный прием присоеди-
58 БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, До 2 58
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154404 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T13:17:51Z |
| publishDate | 1989 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Костецкий, И.Е. Шпилевая, С.П. Лихачева, Л.И. Жарова, Л.Г. Иродов, Д.М. Кириллова, В.С. Кордюм, В.А. 2019-06-15T15:12:03Z 2019-06-15T15:12:03Z 1989 Зкспрессия β-галактозидазы Escherichia coli в гепатоцитах мыши / И.Е. Костецкий, С.П. Шпилевая, Л.И. Лихачева, Л.Г. Жарова, Д.М. Иродов, В.С. Кириллова, В.А. Кордюм // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 2. — С. 51-58. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000A6 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154404 577.212:577.352.27 Исследована возможность переноса гена бактериальной β-галактозидазы (плазмида рGА293) в составе липосом непосредственно в печень двухмесячных мышей линии ВАLВ/с. Тестирование продукта экспрессии. lасZ-гена проведено иммунофлюоресцентным методом через 24 ч после инъекции. Установлено, что продукт экспрессии зтого гена обнаруживается у 20–25 % гепатоцитов, о чем свидетельствует появление яркого свечения в этих клетках. В вариантах с инъецированием физиологического раствора, плазмид рGА293 и рGА293ZΔ без липосом, а также липосом, нагруженных ДНК плазмиды рGА293ZΔ, уровень флюоресценции гепатоцитов был низким и сравним с таковым у интактных животных. Экспрессия lacZ-гена происходит с одинаковой интенсивностью в разных участках печени и не зависит от места введения. Индивидуальные животные проявляют различную ответную реакцию на введение чужеродного генетического материала. Досліджено можливість перенесення гена бактерійної β-галактозидази (плазміда рGА293) у складі ліпосом безпосередньо в печінку двомісячних мишей лінії ВАLВ/с. Тестування продукта експрессії lасZ-гена проведено імунофлуоресцентним методом через 24 год після ін’єкції. Встановлено, що продукт експресії цього гена виявляється у 20–25 % гепатоцитів, про що свідчить поява яскравого свічення у цих клітинах. У варіантах з ін’єктуванням фізіологічного розчину, плазмід рGА293 і рGА293ZΔ без ліпосом, а також ліпосом, навантажених ДНК плазміди рGА293ZΔ, рівень флуоресценції гепатоцитів був низьким і порівнянним з таким у інтактних тварин. Експресія lacZ-гена відбувається з однаковою інтенсивністю у різних ділянках печінки і не залежить від місця введення. Індивідуальні тварини по-різному реагують у відповідь на введення чужорідного генетичного матеріалу. The expression of the bacterial β-galactosidase gene as a part of plasmid pGA293 in the mouse liver hepatocytes has been demonstrated 24 h after direct injection of the above plasmid inclosed into liposomes into the liver. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Дискуссии Зкспрессия β-галактозидазы Escherichia coli в гепатоцитах мыши Експресія β-галактозидази Escherichia coli в гепатоцитах миші Expression of Escherichia coli β-Galactosidase in murine hepatocytes Article published earlier |
| spellingShingle | Зкспрессия β-галактозидазы Escherichia coli в гепатоцитах мыши Костецкий, И.Е. Шпилевая, С.П. Лихачева, Л.И. Жарова, Л.Г. Иродов, Д.М. Кириллова, В.С. Кордюм, В.А. Дискуссии |
| title | Зкспрессия β-галактозидазы Escherichia coli в гепатоцитах мыши |
| title_alt | Експресія β-галактозидази Escherichia coli в гепатоцитах миші Expression of Escherichia coli β-Galactosidase in murine hepatocytes |
| title_full | Зкспрессия β-галактозидазы Escherichia coli в гепатоцитах мыши |
| title_fullStr | Зкспрессия β-галактозидазы Escherichia coli в гепатоцитах мыши |
| title_full_unstemmed | Зкспрессия β-галактозидазы Escherichia coli в гепатоцитах мыши |
| title_short | Зкспрессия β-галактозидазы Escherichia coli в гепатоцитах мыши |
| title_sort | зкспрессия β-галактозидазы escherichia coli в гепатоцитах мыши |
| topic | Дискуссии |
| topic_facet | Дискуссии |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154404 |
| work_keys_str_mv | AT kosteckiiie zkspressiâβgalaktozidazyescherichiacolivgepatocitahmyši AT špilevaâsp zkspressiâβgalaktozidazyescherichiacolivgepatocitahmyši AT lihačevali zkspressiâβgalaktozidazyescherichiacolivgepatocitahmyši AT žarovalg zkspressiâβgalaktozidazyescherichiacolivgepatocitahmyši AT irodovdm zkspressiâβgalaktozidazyescherichiacolivgepatocitahmyši AT kirillovavs zkspressiâβgalaktozidazyescherichiacolivgepatocitahmyši AT kordûmva zkspressiâβgalaktozidazyescherichiacolivgepatocitahmyši AT kosteckiiie ekspresíâβgalaktozidaziescherichiacolivgepatocitahmiší AT špilevaâsp ekspresíâβgalaktozidaziescherichiacolivgepatocitahmiší AT lihačevali ekspresíâβgalaktozidaziescherichiacolivgepatocitahmiší AT žarovalg ekspresíâβgalaktozidaziescherichiacolivgepatocitahmiší AT irodovdm ekspresíâβgalaktozidaziescherichiacolivgepatocitahmiší AT kirillovavs ekspresíâβgalaktozidaziescherichiacolivgepatocitahmiší AT kordûmva ekspresíâβgalaktozidaziescherichiacolivgepatocitahmiší AT kosteckiiie expressionofescherichiacoliβgalactosidaseinmurinehepatocytes AT špilevaâsp expressionofescherichiacoliβgalactosidaseinmurinehepatocytes AT lihačevali expressionofescherichiacoliβgalactosidaseinmurinehepatocytes AT žarovalg expressionofescherichiacoliβgalactosidaseinmurinehepatocytes AT irodovdm expressionofescherichiacoliβgalactosidaseinmurinehepatocytes AT kirillovavs expressionofescherichiacoliβgalactosidaseinmurinehepatocytes AT kordûmva expressionofescherichiacoliβgalactosidaseinmurinehepatocytes |