Определение полной нуклеотидной последовательности генома человека: проекты и перспективы
Дан обзор широко дискутирующихся в зарубежной печати проектов определения нуклеотидной последовательности генома человека, различных стратегических подходов к решению этой грандиозной задачи. Описаны предлагающиеся схемы автоматического сиквенирования ДНК, в том числе основывающиеся на введении флюо...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1989 |
| 1. Verfasser: | |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154408 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Определение полной нуклеотидной последовательности генома человека: проекты и перспективы / В.М. Кавсан // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 2. — С. 16-25. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154408 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Кавсан, В.М. 2019-06-15T15:13:22Z 2019-06-15T15:13:22Z 1989 Определение полной нуклеотидной последовательности генома человека: проекты и перспективы / В.М. Кавсан // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 2. — С. 16-25. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000A1 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154408 577.113.5+575.113 Дан обзор широко дискутирующихся в зарубежной печати проектов определения нуклеотидной последовательности генома человека, различных стратегических подходов к решению этой грандиозной задачи. Описаны предлагающиеся схемы автоматического сиквенирования ДНК, в том числе основывающиеся на введении флюоресцентной метки с автоматическим считыванием нуклеотидной последовательности с электрофореграммы или прямо с «сиквенирующего» геля. Обсуждаются стоимость проекта и значение ожидаемых результатов. Наведено огляд проектів визначення нуклеотидної послідовності геному людини, які широко дискутуються в зарубіжній пресі, а також різних стратегічних підходів до вирішення цього грандіозного завдання. Описано пропоновані схеми автоматичного секвенування ДНК, у тому числі такі, що грунтуються на введенні флуоресцентної мітки з автоматичним зчитуванням нуклеотидної послідовності з електрофореграми або прямо з «секвенувального» гелю. Обговорюються вартість проекту і значення очікуваних результатів. The lively discussion on human genome sequencing is continuing on the pages of science and popular journals. Despite this fact, the most developed west countries began the organization and technical works directed to the bulk reading of the DNA sequences. The cost of the suggested project became lower in the course of this review writing. Therefore, the work on this project is assumed to be completed within the real terms. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Дискуссии Определение полной нуклеотидной последовательности генома человека: проекты и перспективы Визначення повної нуклеотидної послідовності геному людини: проекти і перспективи Determination of the complete nucleotide sequence of the human genome: projects and prospects Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Определение полной нуклеотидной последовательности генома человека: проекты и перспективы |
| spellingShingle |
Определение полной нуклеотидной последовательности генома человека: проекты и перспективы Кавсан, В.М. Дискуссии |
| title_short |
Определение полной нуклеотидной последовательности генома человека: проекты и перспективы |
| title_full |
Определение полной нуклеотидной последовательности генома человека: проекты и перспективы |
| title_fullStr |
Определение полной нуклеотидной последовательности генома человека: проекты и перспективы |
| title_full_unstemmed |
Определение полной нуклеотидной последовательности генома человека: проекты и перспективы |
| title_sort |
определение полной нуклеотидной последовательности генома человека: проекты и перспективы |
| author |
Кавсан, В.М. |
| author_facet |
Кавсан, В.М. |
| topic |
Дискуссии |
| topic_facet |
Дискуссии |
| publishDate |
1989 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Визначення повної нуклеотидної послідовності геному людини: проекти і перспективи Determination of the complete nucleotide sequence of the human genome: projects and prospects |
| description |
Дан обзор широко дискутирующихся в зарубежной печати проектов определения нуклеотидной последовательности генома человека, различных стратегических подходов к решению этой грандиозной задачи. Описаны предлагающиеся схемы автоматического сиквенирования ДНК, в том числе основывающиеся на введении флюоресцентной метки с автоматическим считыванием нуклеотидной последовательности с электрофореграммы или прямо с «сиквенирующего» геля. Обсуждаются стоимость проекта и значение ожидаемых результатов.
Наведено огляд проектів визначення нуклеотидної послідовності геному людини, які широко дискутуються в зарубіжній пресі, а також різних стратегічних підходів до вирішення цього грандіозного завдання. Описано пропоновані схеми автоматичного секвенування ДНК, у тому числі такі, що грунтуються на введенні флуоресцентної мітки з автоматичним зчитуванням нуклеотидної послідовності з електрофореграми або прямо з «секвенувального» гелю. Обговорюються вартість проекту і значення очікуваних результатів.
The lively discussion on human genome sequencing is continuing on the pages of science and popular journals. Despite this fact, the most developed west countries began the organization and technical works directed to the bulk reading of the DNA sequences. The cost of the suggested project became lower in the course of this review writing. Therefore, the work on this project is assumed to be completed within the real terms.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154408 |
| citation_txt |
Определение полной нуклеотидной последовательности генома человека: проекты и перспективы / В.М. Кавсан // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 2. — С. 16-25. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT kavsanvm opredeleniepolnoinukleotidnoiposledovatelʹnostigenomačelovekaproektyiperspektivy AT kavsanvm viznačennâpovnoínukleotidnoíposlídovnostígenomulûdiniproektiíperspektivi AT kavsanvm determinationofthecompletenucleotidesequenceofthehumangenomeprojectsandprospects |
| first_indexed |
2025-11-25T21:04:12Z |
| last_indexed |
2025-11-25T21:04:12Z |
| _version_ |
1850543592270987264 |
| fulltext |
Iungstrends und Konsequenzen fiir die arztlichen A u f g a b e n / / M i i n c h e n med. Wo-
chenschr.— 1986.—128, N 5.—S. 68—72.
45. Three research groups produce DNA probes for cystic f i b r o s i s / / D r u g Hicense Op-
port.— 1985.—N 12.—P. 55.
4 6 . A t l a n H. Biotechnologies, homme et na tu r e / /Fu tu r ib l e s .— 1987.—N 108.—P. 7—
25.
47. Индукция нестабильных мутаций у Drosophila melanogaster микроинъекцией Д Н К
онкогенных вирусов в полярную плазмиду эмбрионов. Сообщ. 2. Анализ роли инъ-
ецируемой Д Н К / К . Г. Газарян, С. Д. Набирочкин, Ε. Н. Набирочкина и д р . / /
Генетика.— 1987.—23, № 2.—С. 214—227.
48. Набирочкин С. Д., Набирочкина Е. H., Газарян К. Г. Индукция нестабильных му-
таций у Drosophila melanogaster микроинъекцией Д Н К онкогенных вирусов в по-
лярную плазмиду эмбрионов. Сообщ. 1. Зависимость от генотипа э м б р и о н а / / Т а м
же.—С. 202—213.
49. Emerman M., Temin Η. М. Comparison of promoter suppression in avian and muri-
ne retrovirus v e c t o r s / / N u c l . Acids Res.— 1986.—14, N 23.—P. 9381—9396.
50. Gilinas CTemin H. M. Nondefective spleen necrosis virus-derived vectors define
the upper size limit for packaging reticuloendotheliosis viruses / / Proc. Nat. Acad.
Sci. USA.— 1986.—83, N 23.—P. 9211—9215.
51. Rhode B. W., Emerman M., Temin Η. M. Instability of large direct repeats in retro-
virus v e c t o r s / / J . Virol.— 1987.—61, N 3 .—P. 925—927.
52. Plasmid mediated mutagenesis of a cellular gene in transfected eukaryotic cells /
C. R. Brandt, F. M. Buonaguro, J. K. McDougall, D. A. Galloway / / Nucl. Acids
Res.— 1987.—15, N 2 .—P. 561—573.
53. Dougherty J. P., Temin Η. M. High mutation rate of a spleen necrosis virus-based
retrovirus v e c t o r / / М о ї . and Cell. Biol.— 1986.—6, N 12.—P. 4387—4395.
54. Inactiuation of a transfected gene ,in human fibroblasts can occur by deletion, ampli-
fication, phenotypic switching, or methylation / M. M. Gebara, C. Drevon, S. A. Har-
court et al. / / Ibid.— 1987.—7, N 4 .—P. 1459—1464.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Получено 12.01.88»
Киев
УДК 577.113.5 + 575.113
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛНОЙ
НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА: ПРОЕКТЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ
В. М. Кавсан
На страницах научных журналов еще продолжается дискуссия о том,
нужно или не нужно расшифровывать первичную структуру всей Д Н К
наследственного аппарата человека, а уже ряд лабораторий США,
Западной Европы и Японии получил гранты для начала работ, связан-
ных с этой грандиозной задачей. Ее решение позволит значительно
глубже понять и использовать молекулярные механизмы жизни. С од-
ной стороны, это даст возможность распознать системы координирован-
ной регуляции экспрессии генов и локализовать гены, ответственные за
длинный список наследственных болезней и, конечно, в первую очередь
злокачественных новообразований. С другой стороны, определение по-
следовательностей Д Н К предоставит данные, имеющие огромный инте-
рес сами по себе: они дадут основу для сравнения строения многих
генов со сходными функциями, сопоставления организации целых се-
мейств генов и последовательностей, ответственных за их активность,
подойти к генетическому картированию индивидуальных личностей с
наиболее высоким разрешением [1].
В течение последних двух лет в разных городах США прошло бо-
лее десятка научных совещаний различного характера, посвященных
обсуждению перспектив определения полной нуклеотидной последова-
тельности генома человека. Одно из таких совещаний в г. Санта Фе,
организованное DOE (Department of Energy) , собрало чрезвычайно
влиятельных ученых Соединенных Штатов в этой области естество-
знания. Среди них были У. Гилберт, Д. Балтимор, У. Водмер, М. Син-
16 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА,— 1989.—Т. 5, Xe 2"
гер, У. Дулитл и др., всего около 50 человек. Хотя по поводу необхо-
димости такого проекта высказывались разные мнения, общее резюме
было: "Wc arc encouraged to proceed" («Мы настроены продолжать.. .»).
Уже через несколько месяцев после совещания создан оргкомитет и на
первый год назначен бюджет (20 млн долларов) для его работы по
разработке проекта. Участие и организация совещания департаментом
энергетики показательны и многообещающи: интерес крупных и со-
стоятельных, но не имеющих прямого отношения к биологии учрежде-
ний предполагает отсутствие необходимости оттягивания средств от
других биологических исследований.
Определение полной пуклеотидпой последовательности генома че-
ловека, по мнению У. Гилберта, представляет собой «Грааль генетики
человека» [2]. Этот проект кажется гигантским д а ж е в сравнении
с такими, как проект физики высоких энергий или проект орбиталь-
ных станций. Если рассчитывать на использование современной техно-
логии, он должен был бы занять 30000 человеко-лет и стоить около
2 млрд долларов (для сравнения, проект по сверхпроводимости оце-
нивается в 3 млрд долларов) .
В США пока нет единого мнения о форме разрабатываемого про-
екта. У. Гилберт предлагает создать специализированный Институт
Генома Человека, а стратегия сиквенирования должна быть в первую
очередь направлена на особо интересные районы генома и участки,
о которых известно, что они имеют важное значение. Однако остальные
исследователи, предполагающие включиться в сиквенировапие челове-
ческого генома, полагают, что будет лучше, если занимающиеся этой
проблемой лаборатории будут разбросаны по стране или д а ж е по всему
миру. Это даст возможность с разных сторон улучшать и модифициро-
вать методы сиквенирования в разных лабораториях. Проект, правда,
имеет и противников [3]. Мало кто отрицает нацело пользу полного
сиквенирования генома человека. В основном возражения сводятся к
тому, что этот проект отвлечет средства от других, может быть, не
менее или даже более важных биологических задач. Другие считают,
что сиквенировапие меньших геномов, например, генома кишечной па-
лочки или нематоды, потребует меньших затрат и в то же время даст
больше информации о жизненных явлениях, чем сиквенировапие гено-
ма человека. Третьи думают, что полезнее определить последователь-
ности основных, важных участков генома человека, чем расшифровы-
вать полную последовательность всего генома. Тем не менее наиболее
авторитетная группа ученых, среди которых лауреаты Нобелевской
премии Д. Балтимор, У. Гилберт, Р. Далбеко, считает, что проект —
это вход в новую эру биологии.
Немаловажным представляется вопрос об источнике Д Н К , кото-
рую будут сиквепировать. Это может быть либо Д Н К одного индиви-
дуума, либо материал из различных источников, например отдельные
хромосомы от различных индивидуумов. В любом случае, конечно, бу-
дет утеря информации о вариациях человеческого генетического мате-
риала. Руководитель лаборатории в Лос-Аламосе М. Битепски предло-
жил устроить соревнование между мужчинами и женщинами всего
мира: кто сделает наибольший вклад в проект, Д Н К того человека и
будет спквепировапа [4].
Две стратегии предлагается для достижения цели проекта. Соглас-
но одной из них, Д Н К каждой из хромосом после их «сортипга» наре-
зается рсстриктазами типа SfiI, дающими относительно малое количе-
ство длинных фрагментов. Сравнительно небольшими усилиями путем
сиквенирования концов фрагментов и перекрывающихся последователь-
ностей расположить эти фрагменты в хромосоме, после чего приступить
к определению пуклеотидных последовательностей более мелких "фраг-
ментов (рис. 1). Хромосом-специфические банки относительно коротких
фрагментов (5000—10000 п. п.) были сконструированы уже в середине
1986 г. В настоящее время закапчивается работа по созданию и ха-
рактеристике банков, включающих фрагменты геномной Д Н К человека
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА — 1989.—Т. 5, № 9 2 - 8-930 17
величиной до 50000 п. н. Разработаны, продаются и уже во многих
лабораториях используются приборы для быстрого разделения хромо-
сом в относительно больших количествах. Руководители DOE и ряда
друг.их учреждений США считают, что проект реально осуществим и
его стоимость по сравнению с предполагавшейся вначале удастся в са-
мое короткое время значительно снизить.
Другая стратегия в определении полной первичной структуры ге-
нома человека состоит в возможном сиквенировании фрагментов Д Н К ,
дробленной случайным образом, а затем в составлении единой после-
довательности за счет перекрывающихся участков. В 1984 г. Е. Сэда
Рис. 1. Стадии фрагментирования человеческого генома [5]
Fig. 1. Fragmentat ion stages of human genome [5]
Рис. 2. Количество клонов и прочитанных гелей для сиквенирования Д Н К [6]: а — пол-
нота сиквенирования 5 тыс. п. н. Д Н К как функция количества прочитанных гелей
(предполагается, что с каждого геля считывается в среднем 250 н.); б — количество
прочитанных гелей и полнота сиквенирования обеих цепей Д Н К
Fig. 2. The number of clones and gel readings necessary for DNA sequencing [6]: a —
sequence completion of 5 kb DNA as a function of the number of gel readings (it is as-
sumed that on the average 250 base pairs are read every reading); б — the number of
gel readings and sequence completion of both DNA chains
в Нац. ин-те генетики разработал метод «дробовика» (shotgun-method) ,
позволяющий анализировать 7—8 тыс. п. н. в день [6]. Этот метод в
последнее время получил значительное развитие и заключается в дроб-
лении Д Н К ультразвуком на короткие фрагменты, которые затем кло-
нируются случайным образом в составе бактериофага М13, после чего
используется улучшенная техника Сэнгера [7]. Далее результаты ана-
лиза обрабатываются компьютером для составления последовательнос-
ти фрагметов (рис. 2) . При такой стратегии расчеты показывают, что
человеческий геном вручную (без автоматических машин) может быть
сиквенирован за 1 год десятью тысячами исследователей, если принять
величину Д Н К около 1 м или 2,9 млрд п. н.
Конечно, такой стратегический подход к подготовке материала,
как метод «дробовика» с последующим использованием высокой сте-
пени автоматизации сиквенса и мощных компьютеров для обработки
полученных результатов, весьма перспективен. Однако сейчас пока еще
большинство методов быстрого сиквенирования длинных фрагментов
Д Н К включает прогрессивное укорачивание фрагментов с последующим
субклонированием в составе специальных векторов для сиквенирования
(так называемых «сиквенирующих векторов»). Прогрессивное укоро-
чение Д Н К осуществлялось обычно с помощью Д Н К а з ы I, нуклеазы
ВаІЗІ или экзонуклеазы III с последующей обработкой нуклеазой Si.
Эти методики занимают довольно много времени, а скорости гидролиза
ВаІЗІ или экзонуклеазой III далеко не постоянны, что создает допол-
нительные трудности. Ахмед [8], а потом Пенг и By [9] предложили
метод транспозон-опосредованных делеций. Они сконструировали плаз-
миду, соединявшую участок инициации репликации Ori бактериофага
М13 и участок транспозона Тп9 (рис. 3). Длинный фрагмент Д Н К ,
18 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА,— 1989.—Т. 5, Xe 2"
клонированный в составе такого вектора, будет прогрессивно укорачи-
ваться с одного конца путем транспозон-зависимых делеций in vivo,
После этого плазмиды, включающие различные по размерам фрагмен-
ты ДНК, могут быть превращены в одноцепочечную Д Н К в том
же хозяине, после чего последовательность можно определить с по-
мощью техники Сэнгера. Метод не требует дополнительного субкло-
нирозапия.
Очистка многочисленных фрагментов ДНК после клонирования в
составе бактериофагов или плазмид представляет длительный и трудо-
емкий процесс. Автоматический экстрактор нуклеиновых кислот фирмы
Рис. 3. Плазмида pAA-PZl-НЗ до и после транспозон-опосредованной делении |"9]
Fig. 3. ρΛΛ-ΡΖΙ-ЫЗ plasmid before and after the transposon-mediated deletion [9]
Рис. 4. Упрощенная схема автоматического сиквенатора Д Н К [12]
Fig. 4. Simplified scheme of the automatic DNA sequencer [12]
"Applied Biosystems" (США) осуществляет очистку Д Н К или РНК
из вирусов, клеток, биологических жидкостей, тканей. Использование
автоматизации в этом процессе стандартизует процедуру, уменьшает
возможность загрязнения нуклеазами, дает длинные молекулы ДНК,
позволяет обрабатывать одновременно в едином модуле до восьми
проб. Границы объема обрабатываемого биологического материала до-
вольно широки — от 5 мкл до 1 мл. В автомате используются экстрак-
ция и колоночная хроматография, полностью заменившая центрифуги-
рование. Вся процедура занимает около 3 ч [10].
В обоих использующихся в настоящее время методах сиквеиирова-
ния фрагментов Д Н К — энзиматическом Сэнгера [7] и химическом
Максама—Гилберта [11] —обычно проводят четыре отдельные реак-
ции. В энзиматическом методе эти реакции дают фрагменты Д Н К , за-
капчивающиеся аденозином (А), цитозином (С), гуанозипом (G) либо
тимидипом (T). В химическом методе обычно получаются фрагменты,
закапчивающиеся G, G + A , С + Т или С. В обоих случаях продукты
реакций разделяются электрофоретически на соседствующих дорожках
полиакрилампдного геля с высоким разрешением. Получающийся ав-
тограф всего геля используется для определения относительных раз-
меров фрагментов ДНК, образующихся в каждой из четырех реакций.
Нуклеотидиая последовательность Д Н К определяется прямо из этой
информации.
Хотя обе техники по критериям настоящего времени считаются вы-
сокоэффективными (на сегодняшний день определена последователь-
ность более IO6 п. н.), они, тем пе менее, требуют значительной затраты
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА — 1989.—Т. 5, № 9 2 - 8-930 19
труда квалифицированных сотрудников и для их осуществления необхо-
димо применение дорогостоящих радиоактивных изотопов.
Использование вместо радиоактивной флюоресцентной метки по-
мимо прочих преимуществ способствует также автоматизации процесса.
Л . Худ и соавт. из Калифори. технол. ин-та поставили для себя целью
решение двух задач. Во-первых, получать, сохранять и анализировать
информацию о пуклеотидной последовательности прямо во время элек-
трофореза (рис. 4). Это сделает ненужным перепое информации с геля
па рентгеновскую пленку (радиоавтография) , устранит тенденциозный
ручной анализ и необходимость изготовления нескольких перекрываю-
щихся гелей. Вместо этого единственный гель может «прогоняться» до
тех пор, пока не будет достигнуто нужное разрешение. Во-вторых, избе-
жать применения радиоактивных изотопов — опасных, дорогих и неста-
бильных [12].
Д л я решения обеих задач вместо изотопов стали использовать
флюорофоры. Флюоресценция дает достаточную чувствительность для
детекции в течение реального времени малых количеств Д Н К , присут-
ствующих па «сиквенирующем» геле (около 10 фмолей в полосе). Д л я
каждого основания при этом используется свой флюорофор (т .е . для
четырех оснований используются четыре различных флюорофора) в
каждой специфической реакции. После этого продукты всех четырех
реакций соединяются и вместе подвергаются электрофорезу. Образую-
щиеся в каждой реакции фрагменты Д Н К определяются в нижней части
геля и идентифицируются по цвету. Эти данные постоянно собираются
специальными датчиками во время электрофореза и сохраняются, а
затем анализируются компьютером для выдачи готовой нуклеотидпоп
последовательности. Принцип вначале был приложен к стандартной
технике сиквенировапия по Сэпгеру, а для затравки полимеразпых
реакций использованы синтезированные химическим путем флюоресци-
рующие олигодезоксирибонуклеотиды. Один из способов получения
таких затравок заключается в синтезе производного тимидипа, содер-
жащего фосфорамидитное начало у З'-углерода и защищенную амино-
группу у 5'-углерода. При использовании этой молекулы в конечном
цикле присоединения олигонуклеотидного синтеза фосфорамидитпым
методом продукт после снятия защиты и отщепления от твердой фазы
представляет собой олигонуклеотид, содержащий единственную алифа-
тическую аминогруппу на б'-конце. Этот материал может быть теперь
легко конъюгирован с различными коммерческими аминореактивными
флюоресцирующими красителями.
Выбор флюоресцентной метки имеет большое значение для авто-
матического сиквенатора: 1) абсорбционный и эмиссионный максимумы
должны быть в видимом районе спектра, как можно дальше от длин-
новолновой области, чтобы свести к минимуму рассеяние и флюоресци-
рующий фон; 2) эмиссионные максимумы флюорофоров должны зна-
чительно отличаться друг от друга, чтобы краски были хорошо разли-
чимы; 3) краски должны быть сильно флюоресцирующими для доста-
точной чувствительности; 4) краски не должны заметно мешать гибри-
дизации олигонуклеотидного праймера, так как при этом заметно
уменьшается эффективность синтеза в соответствующих реакциях;
5) краски не должны значительно нарушать и различаться в электро-
форетической подвижности соответствующих ДНК-фрагментов; па са-
мом деле это все же происходит и компьютеру приходится вводить соот-
ветствующие поправки. При нанесении на каждую дорожку геля по
одной краске разрешение достигает более 400 оснований в течение
около 16 ч, если же наносить все четыре краски,— разрешение пока
только около 200 оснований, но система быстро модифицируется и
улучшается. В конце 1986 г. машина при автоматизации всех реакций
д а в а л а 1 % ошибок, сиквепируя одну цепь и 0 ,01%, сиквепируя обе
цепи, что соответствует лучшим стандартам на сегодня (1 ошибка па
10000 оснований) [13].
Использование флюоресцентной метки в технике Максама—Гил-
2 0 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА — 1989 —Т. 5, № 2
берта позволит использовать дешевые и стабильные реагенты, что даст
возможность применить их для автоматизации процесса. Техника Мак-
сима—Гилберта включает пять последовательных этапов: специфиче-
ские модификации оснований, остановка реакций, серии переосаждений
этанолом и центрифугирования, расщепление пиперидином и повторные
выпаривания при уменьшенном давлении. Эта техника имеет целый ряд
недостатков: сама методика довольно длительна, всегда есть возмож-
ность потери фрагмента Д Н К при осаждении этанолом и центрифуги-
ровании; гидразин может копреципитировать с Д Н К при осаждении
этанолом и мешать специфичности реакции. Автоматизация процесса
могла бы в какой-то мере устранить отмеченные недостатки.
Первый шаг к автоматизации техники сиквенирования Д Н К по
Максаму—Гилберту был сделан Чувпило и Кравченко [14], предложив-
шими проводить реакции на твердой подложке, что устраняло потери
и резко сократило время обработки. Недостаток метода — механиче-
ская непрочность предложенной ими подложки (бумага DE 81) — б ы л
устранен модификацией Розенталя и соавт. [15, 16] с использованием
новой, основанной на целлюлозе, подложки с анионообменными свой-
ствами. Однако такой подход хорош для сиквенирования только корот-
ких олигонуклеотидов и не подходит для длинных фрагментов Д Н К .
Кроме того, пиперидин должен все же удаляться повторной лиофили-
зацией, что отнимает относительно много времени. Поэтому следующим
шагом D автоматизации техники Максама—Гилберта было использова-
ние обращенно-фазовой хроматографии. Здесь радиоактивно меченный
обычным способом фрагмент Д Н К наносят в равных количествах на
четыре колонки Ci8 Sep-pak. Д Н К иммобилизуется смолой не изучен-
ным до конца способом и обрабатывается в течение 2 мин диметил-
сульфатом в колонке G, 4 мин — 50%-ной муравьиной кислотой в ко-
лонке А, 3 мин — 60%-ным гидразином в колонке T и 4 мин — 60%-ным
гидразином+1,5 M хлористым натрием в колонке С. Реакции идут на
смоле с той же скоростью, что и в растворе, их останавливают в нуж-
ное время пропусканием через колонки раствора, согласно протоколу
Максама—Гилберта , после чего колонки промывают 5%-ным ацетонит-
рилом в триэтиламмоний бикарбонате, удаляющим гидразин, муравьиную
кислоту, диметилсульфат и др., а Д Н К элюируют 10%-ным пиперидином.
Элюаты нагревают до 90 °С, добавляют уксусную кислоту для образо-
вания пиперидинацетата, пропускают через свежие четыре колонки,
новые элюаты выпаривают и запускают на «сиквенирующий» гель. При
этом способе пет угрозы потери Д Н К при осаждении этанолом, сниже-
ния специфичности в результате копреципитации этанолом гидразина,
не нужны многочисленные центрифугирования, удаление пиперидина
легко осуществляется в вакууме. Вся процедура занимает около 1,5 ч.
Сиквенирующая машина на основе техники Максама—Гилберта
уже продается японской фирмой "Seiko". Эта машина обрабатывает
одновременно 12 образцов и выдает за день последовательность до
6000 оснований. Работа этой машины основана на стандартной техни-
ке Максама—Гилберта с использованием радиоактивного фосфора для
метки сиквенируемого фрагмента и радиоавтографии гелей. Лимитирую-
щий фактор — приготовление гелей — устраняется выпуском готовых
полиакриламидных блоков 20X40 см и 0,2 мм толщиной, уже покрытых
ацетатной пленкой и годных для экспозиции с рентгеновской пленкой,
так называемый "Gensor gel" фирмы t tFuji Photo Film Со." (Япония).
Стоимость одной пленки 16 долларов. Д л я увеличения разрешения та-
кие пленки предполагается делать также с контролируемым градиен-
том плотности.
Естественно, что работа с гелями и рентгеновскими пленками
производится роботами. Д л я быстрой и правильной интерпретации
радиоавтографов ряд фирм продает автоматические сканнеры. Так,
фирма "Bio Rad" (США) предлагает Gene-Master DNA Worksta t ion
для введения, сохранения и анализа последовательностей нуклеиновых
кислот. Д л я введения в компьютер нуклеотидной последовательности
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА — 1989.—Т. 5, № 9 2 - 8-930 21
используется тактильный карандаш, позволяющий считывать ее прямо
с радиоавтографа в три раза быстрее, чем при обычном чтении. Про-
пуски избегаются специальным приспособлением, и голос повторяет
каждое основание, которое вводится, чтобы проверять последователь-
ность без отрыва от радиоавтографа. Сканнеры, выпускающиеся фирма-
ми '4Hitachi Sof tware" и "Seiko" (Япония) для учета полос па радио-
автографе, имеют либо встроенные камеры, либо контактные сенсорные
датчики. Правильное узнавание истинного сигнала па геле, необходи-
мая коррекция деформированных полос и аккуратное удаление арте-
фактных полос производятся с помощью специальной программы ком-
пьютера. С автографов среднего качества и разрешением до 250 основа-
ний на каждом можно считывать нуклеотидную последовательность до
60 тыс. оснований в день с ошибкой менее 1 %. Точность может быть
увеличена в 10 раз при использовании улучшенного оптического про-
цессора и компьютера более высокой квалификации. Проверка после-
довательности по двум комплементарным цепям Д Н К снизит величину
ошибки до 0,001 %.
Фирма "Genof i t" (Франция) предлагает прибор "Genoscope", по-
зволяющий автоматически считывать разделяющиеся радиоактивные
полосы по мере их разрешения у дна «сиквенирующего» геля. При этом
можно использовать технику Сэнгера или Максама—Гилберта . Авто-
матический контроль компьютером, отсутствие необходимости обраба-
тывать авторадиограммы с геля и т. д. в значительной мере сокращают
время эксперимента.
Фирмой "Seiko" (Япония) вместе с серийным выпуском сиквени-
рующей машины, основанной на стандартной технике Максама—Гил-
берта, разработана модель машины для сиквенирования техникой Сэн-
гера. Производительность такой машины — до 30000 оснований в день
и уже сейчас имеются идеи по ее улучшению. Одновременно и парал-
лельно японскими учеными развиваются техника сиквенирования с ис-
пользованием специфических флюоресцентных меток, характерных для
каждого основания, и автоматизация этого процесса.
Задача стоит поистине грандиозная. Еще сегодня обычная техника
сиквенирования позволяла каждый год добавлять в генный банк ком-
пьютера последовательности до IO6 оснований. Но только человеческий
геном состоит из 3-Ю 9 пар оснований, распределенных между 23 пара-
ми хромосом! Тем не менее история технологии показывает, что на
смену повторяющимся простым действиям всегда приходила сложная
индивидуальная задача для машины. Сиквенирование Д Н К — первый
кандидат на автоматизацию, что даст возможность освободить квали-
фицированных исследователей от повторяющихся механических и часто
очень скучных и утомительных манипуляций, повысить объективность
оценки результатов, обеспечить более быстрое накопление данных и
удешевить стоимость анализа. Если сейчас опытный исследователь опре-
деляет последовательность IO3 оснований в день (IO5 оснований в год)
с примерной стоимостью 1 доллар за основание, то машина должна
довести это количество до IO6 оснований в день стоимостью примерно
0,1 доллар за основание.
Д л я обработки огромного количества поступающей информации
потребуются компьютеры Сгау-класса [18]. Конечно, понадобятся боль-
шие усилия для развития техники манипуляций с такой массой дан-
ных. Какой-то опыт оперирования нуклеотидными последовательностя-
ми уже имеется в американском «National DNA database», известном
как «Gen Bank», однако в скором будущем появится примерно в IO3
больше информации, чем имеется в настоящее время. Сейчас «Gen
Bank» тратит 30 центов за одно основание при операциях по сохра-
нению 6 млн оснований. В будущем, д а ж е если стоимость снизится
на порядок, затраты на оперирование накопленными данными составят
более IO5 долларов в течение 10 лет [13].
Не последнюю роль играет написание последовательностей огром-
ной длины, читабельное как для исследователей, так и для машины.
22 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА,— 1989.—Т. 5, Xe 2"
Хайаши и Мунаката предлагают записывать четыре основания Д Н К
в виде четырех музыкальных нот [19]. Лейз и Финдлей [20] предпо-
читают графическое изображение, где четыре основания распределены
в линейном формате: значения для G, A, T и С будут + 2 , + 1 , —1 и
—2. В примере, показанном на рис. 5, 100 нуклеотидов из кодирующей
последовательности мажорного гена комплекса гистосовместимости
мыши изображены предлагаемым способом. Отмечены важные после-
довательности ТАТА-бокс (здесь ТАТТАТ) и ATG-кодон. Такое напи-
Рис. 5. Последовательность 100 н. мажорного гена комплекса гистосовместимости мы-
ши E [20]. Верхние и нижние штрихи — A, G и С, T соответственно; коротие и длин-
ные штрихи соответствуют GC- и АТ-богатым участкам последовательности
Fig. 5. Sequence of hundred nucleotides of the rat E major histocompatibility gene [20]
сание имеет несколько интересных преимуществ. Во-первых, легко раз-
личаются участки, богатые пуринами и пиримидинами. Во-вторых, сай-
ты рестрикции здесь выявляются как вращательно-симметричные
участки, легко выхватывающиеся глазом. В-третьих, весьма мало нуж-
но времени для определения того, что пара CG встречается довольно
редко. В-четвертых, чтобы превратить одну последовательность в по-
следовательность комплементарной цепи достаточно только перевер-
нуть ее вдоль горизонтальной оси. Такой узкий формат легко читается
машиной и позволяет соответствующим образом подготовленному чи-
тателю перенести последовательность с печатной страницы прямо в
компьютер.
Таким образом, уже сегодня имеется и интенсивно разрабатыва-
ется техника, позволяющая определить полную последовательность
генома человека в реальные сроки с относительно умеренными затра-
тами средств. Соединенные Штаты, Япония, страны Западной Европы
по-разному намечают подходы к решению этой задачи, которые, одна-
ко, не исключают друг друга и способны к объединению. Один из
проектов, предлагаемых Ф. Блатнером из Висконсинского ун-та (США) ,
предполагает образование станций, разбросанных по всей стране. Каж-
дая станция будет обслуживаться двумя техническими работниками
и четырьмя автоматическими сиквенирующими машинами. К а ж д а я ма-
шина будет иметь 40 линий. К а ж д а я линия способна сиквенировать
750 остатков за смену. Время работы — 2 смены по 8 ч 5 дней в неде-
лю. Следовательно, 750 остатков-40 линий-4 машины-2 смены-5 дней =
= 1,2 млн п. н. в неделю или 60 млн п. н. в год. Количество нуклеотид-
ных последовательностей, которое необходимо сиквенировать с учетом
перекрывающихся фрагментов, нужно увеличить по меньшей мере в
10 раз. Значит, для определения первичной структуры всего человече-
ского генома нужно сиквенировать 35· IO9 п. н., т. е. 580 станций за-
кончат работу за 1 год. Стоимость каждой станции оценивается в
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА — 1989.—Т. 5, № 9 2 - 8-930 23
0,5 млн долларов, вся стоимость проекта будет значительно меньше
предполагавшейся вначале — менее 300 млн долларов [21].
В Японии, напротив, склоняются к образованию единого большого
комплекса для определения последовательностей Д Н К (фабрика сик-
венса) , который может быть международным центром для обслужи-
вания лабораторий и индивидуальных исследователей всего мира. Серд-
цем такого комплекса должна стать высокопроизводительная сиквени-
рующая супермашина, подобная высокопродуктивным индустриальным
линиям, которые не только позволяют развить большую скорость про-
цесса и дать экономию труда и затрат, но также обеспечивают лег-
кость контроля и воспроизводимость, увеличивающие достоверность
результатов. При Совете науки и технологии Японии создан Комитет
по разработке автоматизации сиквенирования Д Н К , работающий в
содружестве с рядом индустриальных компаний. В настоящее время
все элементы разработанной линии сиквенирования уже существуют
с интерфейсами между ними. Конечно, система включает устройства-
роботы для отбора бляшек, экстракции и очистки Д Н К из последних.
За основу работы сиквенирующей машины в такой линии выбрана
техника Сэнгера, хотя химический сиквенс по Максаму — Гилберту
также предполагается использовать в случаях, когда применение тех-
ники Сэнгера неадекватно. Вся система, однако, роботизирована не
полностью, так что опытный оператор играет в ней основную роль для
получения точных результатов [22].
Предлагаются и уже вводятся в жизнь и другие проекты внедре-
ния в последовательность человеческого генома. Так, С. Бреннер пред-
полагает характеризовать клетки из разных дифференцированных ти-
пов тканей по генам, активным в клетках этих тканей, используя тех-
нику копирования молекул информационных Р Н К с помощью обратной
транскрипции. Одна из задач заключается в идентификации целых
классов генов, близких по строению и/или функции, которые затем
могут быть размещены в человеческом геноме с помощью молекуляр-
ной гибридизации. Д л я этой цели С. Бреннер (директор Отд-ния моле-
куляр. генетики в Кэмбридже) набирает команду из б—12 человек,
которая будет работать в Бабрахэме (близ Кэмбриджа) на базе Ин-та
исследований физиологии и генетики животных. Финансирование ра-
боты будет осуществлено отчасти полученной им премией (Louis J e a n -
tet Foundat ion Price) — 300 тыс. фунтов стерлингов; остальные деньги
(до 200—250 тыс. фунтов стерлингов в год) будут предоставлены Со-
ветом мед. исследований и из других источников [23].
Конечно, сейчас трудно предсказать, какой из обсуждаемых подхо-
дов будет наиболее выигрышным и кого в гандикапе по определению
полной нуклеотидной последовательности человеческого генома ждет
триумфальный успех. Одно лишь несомненно: определение первичной
структуры геномной Д Н К будет важнейшей частью активности молеку-
лярных биологов будущего и даже, возможно, последнего десятилетия
нынешнего столетия. И сейчас, хотим мы этого или нет, наступает эра
массированного чтения последовательностей оснований. Наиболее раз-
витые капиталистические страны Запада и Востока интенсивно ведут
организационные и технические работы, направленные на ускорение
этого процесса. Отставание в нем, по выражению известного японского
исследователя А. Вада [5], можно сравнить с отставанием в строи-
тельстве больших ускорителей частиц, гигантских телескопов, долго-
срочных программ исследования космоса.
24 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА,— 1989.—Т. 5, Xe 2"
DETERMINATION OF THE COMPLETE NUCLEOTIDE SEQUENCE
OF THE HUMAN GENOME: PROJECTS AND PROSPECTS
V. M. Kavsan
Institute of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
The lively discussion on human genome sequencing is continuing on the pages of scien-
ce and popular journals. Despite this fact, the most developed west countries began the
organization and technical works directed to the bulk reading of the DNA sequences. The
cost of the suggested project became lower in the course of this review writing. There-
fore, the work on this project is assumed to be completed within the real terms.
1. Dulbecco R. A turning point in cancer research: sequencing the human g e n o m e / /
Science.— 1986.—231, N 4742.—P. 1055—1057.
2. Lewin R. Proposal to sequence the human genome stirs debate / / Ibid.—232, N 4758.—1
P. 1598—1600.
3. Walsh J. BMarks J. Sequencing the human g e n o m e / / N a t u r e . — 1986.—322,
N 6080.— P. 590.
4. Palca / . Department of energy on the m a p / / I b i d . — 3 2 1 , N 6068.—P. 371.
5. Wada A., Soeda E. Strategy for building an automatic and high speed DNA-sequen-
cing system / / Proc. 4th congr. of the fed. of Asian and Oceanian biochemists.—
Singapore, 1986.—P. 1—16.
6. Soeda E. A «shotgun» DNA sequencing technology which can analyze genes at a
rate of 8000 per d a y / / T e c h n o c r a t . — 1984.— 17, N 7 .—P. 39—42.
7. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibi-
tors / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA.— 1977.—74, N 2 .—P. 5463—5467.
8. Ahmed A. A rapid procedure for DNA sequencing using transposon-promoted deletions
in Escherichia coli / / Gene.— 1985.—39, N 2—3.— P. 305—310.
9. Peng Z.-G., Wu R. A simple and rapid nucleotide sequencing strategy and its ap-
plication in analyzing a rice histone 3 g e n e / / I b i d . — 1986.— 45, N 3.— P. 247·—252.
10 .Automated nucleic acid e x t r a c t o r / / P r o c e s s Biochem.— 1986.—21, N 4.— P. 13.
11. Maxain A. M., Gilbert W. Sequencing end-labelled DNA with base-specific chemical
cleavages / / M e t h . E n z y m o L - 1980.—65, pt 1.—P. 499—560.
12. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis / L. M. Smith, I. Z. San-
ders, R. I. Kaiser et a l . / / N a t u r e . — 1986.—321, N 6071.—P. 674.
13. Lewin R. DNA sequencing goes au tomat ic / /Sc ience .— 1986.—233, N 4759,—P. 24.
14. Chuvpilo S. A., Kravchenko V. V. A simple and rapid method for sequencing DNA / /
FEBS Lett.— 1985.— 179, N 1.—P. 34—37.
15. Solid-phase methods for sequencing of nucleic acids. 1. Simultaneous sequencing of
different oligodeoxyribonucleotides using a new, mechanically stable anion-exchange
p a p e r / A . Rosenthal, S. Schwerther, V. Hahn, T. H u n g e r / / N u c l . Acids Res.— 1985.—
13, N 4 .—P. 1173—1184.
16. Gross B., Rosenthal A. Simultaneous sequencing of RNA by solid-phase chemical
degradation using DE 81 anion-exchange paper / / G e n e Anal. Tech.— 1987.— 4, N 3.—
P. 57—61.
17. Jagadeeswaran P., Kaul R. K. Use of reverse-phase chromotography in the Maxam-
Gilbert method of DNA sequencing a step toward automation / / Ibid.— 1986.—3,
N 5.— P. 79—85.
18. Parkinson D. More parallel than o t h e r s / / N a t u r e . — 1985.—316, N 6031,—P. 765—
766.
19. Hayasht K., Munakata N. Basically m u s i c a l / / I b i d . — 1984.—310, N 5973.—P. 95.
20. Lathe R., Findlay R. Machine-readable DNA sequences / / Ibid — 311, N 5987.—P. 610.
21. Palca J. The numbers game / / Ibid.— 1986,—321, N 6068,—P. 371.
22. Wada A. Automated high-speed DNA sequenc ing / / Ib id .— 1987.—325, N 6107.—
P. 771—772.
23. Maddox /. Brenner homes on the human g e n o m e / / I b i d —326, N 6109.—P. 119.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 25.02.88
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № 2 25
|