Выделение треонил-тРНК синтетазы из Тhermus thermophilus
Описан метод выделения высокоочищенного препарата треонил-тРНК синтетазы из Т. thermophilus. В процессе выделения треонил-тРНК синтетазы использовали высаливание сульфатом аммония, хроматографию на ДЭАЭ-сефарозе, оксиапатите, гепарин-сефарозе и гидрофобную хроматографию на поливиниловом сорбенте Тоу...
Gespeichert in:
| Datum: | 1989 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Schriftenreihe: | Биополимеры и клетка |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154629 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Выделение треонил-тРНК синтетазы из Тhermus thermophilus / А.Д. Яремчук, М.А. Тукало, С.П. Егорова, Г.X. Мацука // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 2. — С. 102-104. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154629 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1546292025-02-23T17:49:25Z Выделение треонил-тРНК синтетазы из Тhermus thermophilus Виділення треоніл-тРНК синтетази з Тhermus thermophilus Isolation of Threonyl–tRNA synthetase from Thermos thermophilus Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. Егорова, С.П. Мацука, Г.Х. Краткие сообщения Описан метод выделения высокоочищенного препарата треонил-тРНК синтетазы из Т. thermophilus. В процессе выделения треонил-тРНК синтетазы использовали высаливание сульфатом аммония, хроматографию на ДЭАЭ-сефарозе, оксиапатите, гепарин-сефарозе и гидрофобную хроматографию на поливиниловом сорбенте Тоуореагl НW-65. Выход очищенного фермента составлял 9 мг на 1 кг клеток Т. thermophilus. Треонил-тРНК синтетаза является димером а2-типа. Молекулярная масса фермента составляет 148000. Описано метод виділення високоочищеного препарату треоніл-тРНК синтетази з Т. thermophilus. У процесі виділення треоніл-тРНК синтетази використано висолювання сульфатом амонію, хроматографію на ДЕАЕ-сефарозі, оксиапатиті, гепарин-сефарозі і гідрофобну хроматографію на полівініловому сорбенті Тоуореагl Нw-65. Вихід очищеного ферменту становив 9 мг на 1 кг клітин Т. thermophilus. Треоніл-тРНК синтетаза є димером α2-типу. Молекулярна маса ферменту становить 148000. A method for isolation of high-purified threonyl-tRNA synthetase from T. thermophllus is described, including ammonium sulfate fractionation, chromatography on DEAE-sepharose, hydroxyapatite, heparine-sepharose and hydrophobic chromatography on Toyopearl HW-65. Yield of the purified enzyme was 9 mg from 1 kg of T. thermophllus cells. The enzyme is a dimer protein (a2 type) with molecular mass of 148 kDa. 1989 Article Выделение треонил-тРНК синтетазы из Тhermus thermophilus / А.Д. Яремчук, М.А. Тукало, С.П. Егорова, Г.X. Мацука // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 2. — С. 102-104. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000B0 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154629 577.112.088.3 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Краткие сообщения Краткие сообщения |
| spellingShingle |
Краткие сообщения Краткие сообщения Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. Егорова, С.П. Мацука, Г.Х. Выделение треонил-тРНК синтетазы из Тhermus thermophilus Биополимеры и клетка |
| description |
Описан метод выделения высокоочищенного препарата треонил-тРНК синтетазы из Т. thermophilus. В процессе выделения треонил-тРНК синтетазы использовали высаливание сульфатом аммония, хроматографию на ДЭАЭ-сефарозе, оксиапатите, гепарин-сефарозе и гидрофобную хроматографию на поливиниловом сорбенте Тоуореагl НW-65. Выход очищенного фермента составлял 9 мг на 1 кг клеток Т. thermophilus. Треонил-тРНК синтетаза является димером а2-типа. Молекулярная масса фермента составляет 148000. |
| format |
Article |
| author |
Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. Егорова, С.П. Мацука, Г.Х. |
| author_facet |
Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. Егорова, С.П. Мацука, Г.Х. |
| author_sort |
Яремчук, А.Д. |
| title |
Выделение треонил-тРНК синтетазы из Тhermus thermophilus |
| title_short |
Выделение треонил-тРНК синтетазы из Тhermus thermophilus |
| title_full |
Выделение треонил-тРНК синтетазы из Тhermus thermophilus |
| title_fullStr |
Выделение треонил-тРНК синтетазы из Тhermus thermophilus |
| title_full_unstemmed |
Выделение треонил-тРНК синтетазы из Тhermus thermophilus |
| title_sort |
выделение треонил-трнк синтетазы из тhermus thermophilus |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Краткие сообщения |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154629 |
| citation_txt |
Выделение треонил-тРНК синтетазы из Тhermus thermophilus / А.Д. Яремчук, М.А. Тукало, С.П. Егорова, Г.X. Мацука // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 2. — С. 102-104. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT âremčukad vydelenietreoniltrnksintetazyizthermusthermophilus AT tukaloma vydelenietreoniltrnksintetazyizthermusthermophilus AT egorovasp vydelenietreoniltrnksintetazyizthermusthermophilus AT macukagh vydelenietreoniltrnksintetazyizthermusthermophilus AT âremčukad vidílennâtreoníltrnksintetazizthermusthermophilus AT tukaloma vidílennâtreoníltrnksintetazizthermusthermophilus AT egorovasp vidílennâtreoníltrnksintetazizthermusthermophilus AT macukagh vidílennâtreoníltrnksintetazizthermusthermophilus AT âremčukad isolationofthreonyltrnasynthetasefromthermosthermophilus AT tukaloma isolationofthreonyltrnasynthetasefromthermosthermophilus AT egorovasp isolationofthreonyltrnasynthetasefromthermosthermophilus AT macukagh isolationofthreonyltrnasynthetasefromthermosthermophilus |
| first_indexed |
2025-11-24T04:42:51Z |
| last_indexed |
2025-11-24T04:42:51Z |
| _version_ |
1849645461426667520 |
| fulltext |
10 Патон Ε. БЖиволуп A. #., Вараница JI. А. Присутствие двух сильных промото-
ров определяет ориентацию фрагмента ДНК при встраивании в плазмиду
pUC19 // Биополимеры и клетка.— 1986.—2, № 4.—С. 217—219.
11. Патон Е. Б., Крупская И. В., Живолуп А. Н. Ориентационные эффекты, вызывае-
мые присутствием в плазмиде pUC фрагментов rplJL-rpoBC-onepoua Escherichia
coli / / Т а м же.— 1988.-4, № 3.—С. 163—167.
12. Plasmid vector pBR322 and its special-purpose derivatives — a review / P. Balbas,
X. Soberon, E. Merino et a l . / / G e n e . — 1986.—50, N 1.—P. 3—40.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 20.06.88
У Д К 577.112.088.3
ВЫДЕЛЕНИЕ ТРЕОНИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ
ИЗ Thermus thermophilus*
А. Д. Яремчук, М. А. Тукало, С. П. Егорова, Г. X. Мацука
Аминоацил-тРНК синтетазы представляют группу ферментов, играющих существен-
ную роль в реализации генетической информации. Их специфическое взаимодействие
с тРНК до сих пор является одной из важнейших проблем молекулярной биологии.
Особый интерес вызывает треонил-тРНК синтетаза бактерий, поскольку для этого
фермента показана отрицательная авторегуляция биосинтеза на уровне трансляции
[1]. При этом установлено, что нуклеотидная последовательность участка собственной
мРНК, с которым связывается треонил-тРНК синтетаза при ингибировании трансля-
ции, гомологична последовательности антикодонового стебля тРНК Т Ь г , который вза-
имодействует с треонил-тРНК синтетазой. Следовательно, изучение комплекса т Р Н К Т Ь г
с треонил-тРНК синтетазой может способствовать выяснению молекулярного механиз-
ма взаимодействия оператора и репрессора трансляции. Для исследований удобным
объектом является треонил-тРНК синтетаза из экстремального термофила Т. thermo-
philus, которая обладает высокой термостабильностью.
В настоящем сообщении описан метод выделения высокоочищенного препарата
треонил-тРНК синтетазы из Т. thermophilus.
Бактериальная масса Т. thermophilus выращена в Ин-те физиологии и биохимии
микроорганизмов АН СССР, пострибосомальный супернатант был любезно предостав-
лен М. Б. Гарбер (Ин-т белка АН СССР). Суммарный препарат тРНК из Escherichia
coli получен из ВНИИ прикл. биохимии (Олайне, ЛатвССР). Треонил-тРНК синтетаз-
ную активность определяли по начальной скорости образования аминоацил-тРНК. Ин-
кубационная смесь в 0,05 мл содержала 100 мМ трис-НС1-буфер, рН 8,0, 10 мМ MgCl2,
5 мМ АТР, 0,4 мМ 14С-треонин, 4 мг/мл суммарной тРНК Е. coli, 0,2 мг/мл бычьего
сывороточного альбумина, 10 мМ KCl и от 0,1 до 10 мкг белка (в зависимости от
степени очистки фермента). Смесь инкубировали при 55°С в течение 30 с. Реакцию
останавливали добавлением 200 мкл 10 %-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Обра-
зовавшиеся осадки отмывали на миллипоровых фильтрах 50 мл 5 %-ной ТХУ. Радио-
активность проб определяли на сцинтилляционном счетчике SL-30 фирмы «Intertechni-
que» (Франция). За единицу активности треонил-тРНК синтетазы принимали количе-
ство фермента, катализирующее аминоацилирование 1 нмоля тРНКт 1 1 Г за 1 мин при
55 °С. Молекулярную массу треонил-тРНК синтетазы изучали методом электрофореза
в полиакриламидном геле (ПААГ) в нативных условиях при разных концентрациях
геля [2], молекулярную массу субъединиц — с помощью электрофореза в ПААГ в при-
сутствии DS-Na [3].
На первой стадии очистки треонил-тРНК синтетазы использовали высаливание
пострибосомального супернатанта сульфатом аммония (45% насыщения). Полученный
осадок диализовали против 50 мМ трис-НС1-буфера, рН 7,8, содержащего 5 мМ MgCl2,
0,1 мМ азид натрия, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид (бу-
фер А) и наносили на колонку (5X50 см) с ДЭАЭ-сефарозой («Pharmacia», Швеция),
уравновешенную этим же буфером. Элюцию проводили в буфере А в градиенте кон-
центрации NaCl от 0,03 до 0,3 М. Фракцию, обладающую треонил-тРНК синтетазной
* Представлена членом редколлегии А. В. Ельской.
102 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.—Т. 5. № 2
активностью, диализовали против 10 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,8, содержа-
щего 5 мМ β-меркаптоэтанол, 0,1 мМ азид натрия, 0,1 мМ фенилмстилсульфонилфто-
рид (буфер Б) и наносили на колонку (2,5X55 см) с оксиапатитом («Віо-Rad», США),
уравновешенную буфером Б. Фермент элюировали в градиенте концентрации калий-
фосфатного буфера от 0,01 до 0,2 М. Активную фракцию треонил-тРНК синтетазы вы-
саливали сульфатом аммония (45 % насыщения) и хроматографировали на колонке
(2 ,5X60 см) с поливиниловым сорбентом Toyopearl HW-65 («Тоуо Soda», Япония) в
буфере А в обратном градиенте концентрации сульфата ам-
мония от 35 до 10 % насыщения. Фракцию, содержащую
треонил-тРНК синтетазную активность, диализовали про-
тив буфера А и наносили на колонку (0 ,9X25 см) с ге-
парин-сефарозои («Pharmacia», Швеция) , уравновешенную
этим же буфером. Элюцию проводили в буфере А в гра-
диенте концентрации KCl от 0 до 0,25 М. Высокоочищен-
ный препарат треонил-тРНК синтетазы хранили при —20 °С
в буфере А, содержащем 50 % глицерина. Данные, харак-
теризующие степень очистки треонил-тРНК синтетазы на
каждой стадии выделения, представлены в таблице.
Из 1 кг бактериальной массы Т. thermophilus было
получено около 9 мг высокоочищенного препарата трео-
Электрофорез в ПААГ в присутствии DS-Na: 1 — смесь
стандартных белков; 2— треонил-тРНК синтетаза Т. ther-
mophilus после хроматографии на гепарин-сефарозе
Polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodi-
um dodecyl sulfate: / — molecular mass s tandard; 2 — thre-
onyl- tRNA synthetase T. thermophilus a f te r chromatography
on a Hepar in-Sepharose column
Очистка треонил-тРНК синтетазы из Т. thermophilus
Purification of threonyl-tRNA synthetase from T. thermophilus
Основные стадии очистки Общий бе-
л о к , мг
Общая ак-
тивность,
ед. акт.
Удельная
актив-
ность,
ед.акт./
/мг
Степень
очистки Еыход, %
Пострибосомальный супернатант 39200 3528 0,09 1 100
Высаливание сульфатом аммония,
45 % насыщения 16000 4640 0,29 3,2 131,5
Хроматография на ДЭАЭ-сефарозе 2700 4428 1,64 18,2 125,5
Хроматография на оксиапатите 360 3701 10,28 114,2 104,9
Гидрофобная хроматография на 94 2080 22,12 245,8 58,9
Toyopear l
Хроматография на гепарин-сефарозе 9 612 68,00 755,5 17,3
нил-тРНК синтетазы с удельной активностью 68 ед./мг. Кроме результатов электро-
форетического анализа (рисунок), о высокой степени чистоты полученного препарата
фермента свидетельствуют также данные об отсутствии примесей других аминоацил-
т Р Н К синтетаз, содержание которых определяли, используя смесь 14С-аминокислот гид-
ролизата хлореллы и избыток 12С-треонина. Молекулярная масса треонил-тРНК синте-
тазы, по данным электрофореза в ПААГ, составляет 148000. Фермент представляет со-
бой структурный димер, состоящий из двух идентичных субъединиц с молекулярной
массой 74000. Аналогичная олигомерная структура и близкие молекулярные массы по-
казаны для треонил-тРНК синтетаз из других прокариотических объектов [4, 5].
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.—Т. 5, JVg 2 103
ISOLATION OF THREONYL-tRNA SYNTHETASE
FROM THERMUS THERMOPHILUS
A. D. Yaremchuk, M. A. Tukalo, S. P. Egorova, G. Kh. Matsuka
Inst i tute of Molecular Biology and Genetics
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
A method for isolation of high-purified threonyl-tRNA synthetase from T. thermophilus
is described, including ammonium sulfate fractionation, chromatography on DEAE-sepha-
rose, hydroxyapatite, heparine-sepharose and hydrophobic chromatography on Toyopearl
HW-65. Yield of the purified enzyme was 9 mg from 1 kg of T. thermophilus cells. The
enzyme is a dimer protein (a 2 type) with molecular mass of 148 kDa.
1. Grunberg-Manago M. Regulation of the expression of aminoacyl-tRNA synthetases
and translat ion factors / / E . coli and S. typhimurium: cellular and molecular biolo-
g y / E d s J. L. Ingraham et a l .—Washington, 1987.— P. 1386—1409.
2. Hedrick J. L., Smith A. J. Estimation of molecular weight by polyacrylamide gel
e l ec t rophores i s / /Arch . Biochem. and Biophys.— 1968.—126, N 1.—P. 155—164.
3. Weber K., Osborn M. The reability of molecular weight by dodecylsulphate-polyacryla-
mide gel e l ec t ropho re s i s / / J . Biol. Chem.— 1969.—244, N 16.—P. 4406—4412.
4. Threonyl-transfer ribonucleic acid synthetase from Escherichia coli: subunit s tructure
and genetic analysis of the structural gene by means of a mutated enzyme and of a
specialized t ransducing lambda bacteriophage / H. Hennecke, A. Bock, J. Thomale,
G. N a s s / / J . B a c t e r i o L - 1977.—131, N 2 .—P. 943—950.
5. Yamada H. Rapid purification of threonyl-tRNA synthetase from phosphocellulose / /
J. Biochem.— 1978.—83, N 6 ,—P. 1583—1589.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 01.11.88
104 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989 —Т. 5, № 2
|