Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека

Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека

Одним из наиболее перспективных методов для изучения открытой недавно субклеточной организации ряда метаболических процессов и механизмов их протекания в высших эукариотах является использование пермеабилизованных клеток. Существующие методы пермеабилизации предлагают довольно жесткую обработку мемб...

Повний опис

Збережено в:
Бібліографічні деталі
Опубліковано в: :Биополимеры и клетка
Дата:1997
Автор: Негруцкий, Б.С.
Формат: Стаття
Мова:Russian
Опубліковано: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1997
Теми:
Клеточная биология
Онлайн доступ:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154654
Теги: Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека / Б.С. Негруцкий // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 1. — С. 70-74. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154654
record_format dspace
spelling Негруцкий, Б.С.
2019-06-15T17:25:50Z
2019-06-15T17:25:50Z
1997
Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека / Б.С. Негруцкий // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 1. — С. 70-74. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.
0233-7657
DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00046A
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154654
577
Одним из наиболее перспективных методов для изучения открытой недавно субклеточной организации ряда метаболических процессов и механизмов их протекания в высших эукариотах является использование пермеабилизованных клеток. Существующие методы пермеабилизации предлагают довольно жесткую обработку мембран, приводящую к потере интегральности внутриклеточного содержимого. В настоящей работе для пермеабилизации клеток животных и человека использован детергент мягкого действия, растительный гликозид сапонин. Это вещест­во оказалось практически единственным из тестированных, использование которого позволило обеспечить, с одной стороны, существенную сохранность внутриклеточной организации и, с другой, – доступ экзогенных макромолекул внутрь клетки. Разработаны щадящие условия перфо­рации цитоплазматических мембран, отличающиеся для прикрепленных к поверхности и находя­щихся в суспензии клеток. Показана высокая функциональная активность пермеабилизованных клеток и доступность интерьера клеток флюоресцентно меченным белкам.
Одним з найперспективніиіих методів вивчення відкритої недавно субклітинної організації ряду метаболічних процесів і механізмів їх протікання у вищих еукаріотах є використання пермеабілізованних клітин. Існуючі методи пермеабілізації пропонують доволі жорстку обробку мембран, що призводить до втрати інтегральності вмісту клітин. У цій роботі для пермеабілізації клітин тварин і людини використано детер­гент м'якої дії – рослинний глікозид сапонін. Ця речовина виявилася практично єдиною із тестованих, використання якої дозволило забезпечити, з одного боку, значне збереження внутрішньоклітинної організації і, з другого, – доступ екзо­генних макромолекул всередину клітин. Розроблено м'які умо­ви перфорації цитоплазматичних мембран, які різняться для прикріплених до поверхні і перебуваючих у суспензії клітин. Показано високу функціональну активність пермеабілізованих клітин та доступність інтер'єру клітин флюоресцентно мі­ченим білкам.
The permeabilized cell system appears one of the most promising methods to study recently discovered subcellular organization of some metabolic processes and the functional mechanisms involved. The existing permeabilization procedures offer rather harsh membrane treatment which leads to the loss of cell integrity. The plant glycoside saponin was used to permeabilize human and animal cells in this work. The saponin treatment is found to provide both essential conservation of intracetlular organization and unlimited access of exogenous macromolecutes to the inside of cell. The permeabilization conditions are slightly different for immobilized cells and cells in suspension. High functional activity of permeabilized cells as well as the availability of the interior of cells to fluorescently labeled macromolecules are demonstrated.
Автор глубоко признателен проф. М. Дойчеру (США) и проф. В. Меллеру (Нидерланды) за возможность проведения экспериментов в их лабораториях, а также Др. Р. Стапуленису (Литва) — за консультации и поддержку. Часть работы была осуществлена в ходе выполнения краткосрочного проекта FEBS. Данная работа частично финансировалась Министерством по делам науки и технологии Украины (грант № 5.4/73).
ru
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Биополимеры и клетка
Клеточная биология
Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека
М`який та ефективний метод пермеабілізації клітин тварин і людини
Gentle and effective mehod to permeabilize the animal and human cell membrane
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека
spellingShingle Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека
Негруцкий, Б.С.
Клеточная биология
title_short Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека
title_full Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека
title_fullStr Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека
title_full_unstemmed Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека
title_sort мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека
author Негруцкий, Б.С.
author_facet Негруцкий, Б.С.
topic Клеточная биология
topic_facet Клеточная биология
publishDate 1997
language Russian
container_title Биополимеры и клетка
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format Article
title_alt М`який та ефективний метод пермеабілізації клітин тварин і людини
Gentle and effective mehod to permeabilize the animal and human cell membrane
description Одним из наиболее перспективных методов для изучения открытой недавно субклеточной организации ряда метаболических процессов и механизмов их протекания в высших эукариотах является использование пермеабилизованных клеток. Существующие методы пермеабилизации предлагают довольно жесткую обработку мембран, приводящую к потере интегральности внутриклеточного содержимого. В настоящей работе для пермеабилизации клеток животных и человека использован детергент мягкого действия, растительный гликозид сапонин. Это вещест­во оказалось практически единственным из тестированных, использование которого позволило обеспечить, с одной стороны, существенную сохранность внутриклеточной организации и, с другой, – доступ экзогенных макромолекул внутрь клетки. Разработаны щадящие условия перфо­рации цитоплазматических мембран, отличающиеся для прикрепленных к поверхности и находя­щихся в суспензии клеток. Показана высокая функциональная активность пермеабилизованных клеток и доступность интерьера клеток флюоресцентно меченным белкам. Одним з найперспективніиіих методів вивчення відкритої недавно субклітинної організації ряду метаболічних процесів і механізмів їх протікання у вищих еукаріотах є використання пермеабілізованних клітин. Існуючі методи пермеабілізації пропонують доволі жорстку обробку мембран, що призводить до втрати інтегральності вмісту клітин. У цій роботі для пермеабілізації клітин тварин і людини використано детер­гент м'якої дії – рослинний глікозид сапонін. Ця речовина виявилася практично єдиною із тестованих, використання якої дозволило забезпечити, з одного боку, значне збереження внутрішньоклітинної організації і, з другого, – доступ екзо­генних макромолекул всередину клітин. Розроблено м'які умо­ви перфорації цитоплазматичних мембран, які різняться для прикріплених до поверхні і перебуваючих у суспензії клітин. Показано високу функціональну активність пермеабілізованих клітин та доступність інтер'єру клітин флюоресцентно мі­ченим білкам. The permeabilized cell system appears one of the most promising methods to study recently discovered subcellular organization of some metabolic processes and the functional mechanisms involved. The existing permeabilization procedures offer rather harsh membrane treatment which leads to the loss of cell integrity. The plant glycoside saponin was used to permeabilize human and animal cells in this work. The saponin treatment is found to provide both essential conservation of intracetlular organization and unlimited access of exogenous macromolecutes to the inside of cell. The permeabilization conditions are slightly different for immobilized cells and cells in suspension. High functional activity of permeabilized cells as well as the availability of the interior of cells to fluorescently labeled macromolecules are demonstrated.
issn 0233-7657
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154654
citation_txt Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека / Б.С. Негруцкий // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 1. — С. 70-74. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.
work_keys_str_mv AT negruckiibs mâgkiiiéffektivnyimetodpermeabilizaciikletokživotnyhičeloveka
AT negruckiibs mâkiitaefektivniimetodpermeabílízacííklítintvarinílûdini
AT negruckiibs gentleandeffectivemehodtopermeabilizetheanimalandhumancellmembrane
first_indexed 2025-11-26T11:52:03Z
last_indexed 2025-11-26T11:52:03Z
_version_ 1850620237782712320
fulltext I S S N 0233-7657 . Биополимеры и клетка. 1997. Т. 13. № 1 Мягкий и эффективный метод пермеабилизации клеток животных и человека Б. С. Негруцкий Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины 252143, Киев, ул. Академика Заболотного, 150 Одним из наиболее перспективных методов для изучения открытой недавно субклеточной организации ряда метаболических процессов и механизмов их протекания в высших эукариотах является использование пермеабилизованных клеток. Существующие методы пермеабилизации предлагают довольно жесткую обработку мембран, приводящую к потере интегральности внутриклеточного содержимого. В настоящей работе для пермеабилизации клеток животных и человека использован детергент мягкого действия, растительный гликозид сапонин. Это вещест­ во оказалось практически единственным из тестированных, использование которого позволило обеспечить, с одной стороны, существенную сохранность внутриклеточной организации и, с другой, — доступ экзогенных макромолекул внутрь клетки. Разработаны щадящие условия перфо­ рации цитоплазматических мембран, отличающиеся для прикрепленных к поверхности и находя­ щихся в суспензии клеток. Показана высокая функциональная активность пермеабилизованных клеток и доступность интерьера клеток флюоресцентно меченным белкам. Введение. Пермеабилизованные клетки — важный инструмент для изучения самых разнообразных клеточных процессов, предлагающий возможности, недоступные при изучении интактных клеток либо изолированных макромолекул. Позволяя добавле­ ние извне ферментов, как и ингибиторов, система пермеабилизованных клеток сохраняет элементы клеточной структуры, необходимые для протекания этих процессов in vivo. Особое значение приобрета­ ет использование этой системы в связи с открытием компартментализации и каналирования многих ме­ таболических путей клетки [1—3]. Механизм ка­ налирования подразумевает наличие статических и динамических фермент-ферментных взаимодейст­ вий в процессе синтеза метаболитов, что может быть связано с образованием в субклеточных ком- партментах не только стабильных, но и лабильных макромолекулярных ассоциатов [2]. Система пер­ меабилизованных клеток незаменима для изучения механизмов протекания метаболических и регуля- торных процессов в таких компартментах. К сожа­ лению, большинство из известных к настоящему времени методов пермеабилизации предлагает до­ вольно жесткие условия, зачастую приводящие к потере интегральности внутренней структуры кле­ ток, перемешиванию и вытеканию их содержимого © Б. С Н Е Г Р У Ц К И Й , 1997 [4]. Применение подобных методов может приве­ сти к неадекватным результатам в случае изучения сложноорганизованных и высокоструктурирован­ ных процессов, к каким относится, например, кле­ точный биосинтез белка [3, 5 ] . Задачей настоящей работы было предложить универсальный метод пермеабилизации клеток млекопитающих, позволяющий при неограничен­ ном доступе экзогенных макромолекул внутрь кле­ ток сохранить функциональную активность перфо­ рированных клеток и лабильную внутриклеточную инфраструктуру. Материалы и методы. Реагенты для культиви­ рования клеток произведены «GIBCO» (США); са­ понин, компоненты системы белкового синтеза, трипановый голубой — фирмой «Sigma» (США). [ 4 С ]фенилаланин и [ 3 5S ]метионин были из «ICN» (США). Пластиковая посуда для культивирования клеток предоставлена фирмой «Falcon» (США). Первичную культуру клеток фибробластов крайней плоти человека VH25 (15—18 пассажи) поддерживали в ДМЕМ (модифицированная Дал- бекко среда Иггла) («GIBCO»), дополненной 10 %- й фетальной сывороткой теленка («GIBCO»), при 37 °С в воздухе, содержащем 5 % С 0 2 . После трипсинизации суспензию клеток разбавляли в 5— 10 раз ДМЕМ с 10 %-й фетальной сывороткой теленка, переносили в чашку Петри, на дне кото- 70 МЯГКИЙ И Э Ф Ф Е К Т И В Н Ы Й М Е Т О Д П Е Р М Е А Б И Л И З А Ц И И КЛЕТОК рой помещены стерильные покровные стекла (три стекла на чашку). Клетки оставляли на ночь при 37 °С, после чего использовали для эксперимента. Культуру клеток яичника китайского хомячка (СНО) поддерживали в монослое в ДМЕМ в при­ сутствии 5 % сыворотки коровы («GIBCO»), 5 % фетальной сыворотки теленка, 2 мМ глутамина («Sigma») и 0,35 мМ пролина («Sigma») при 37 °С в атмосфере 5 % С 0 2 . Клетки пересаживали через каждые 4 дня с разбавлением 1:5 и использовали для экспериментов после достижения ими конфлу- энтности. Критерием пермеабилизованности клеток была их доступность красителю трипановому голубому, который не проникает сквозь цитоплазматическую мембрану интактных клеток. Для изучения доступ­ ности интерьера пермеабилизованных клеток мак­ ромолекулам применяли метод флюоресцентного мечения белков и тРНК [6, 7] с последующим введением макромолекул в пермеабилизованные клетки. Результаты и обсуждение. Для выбора проце­ дуры, действие которой на клетку являлось бы наиболее приемлемым компромиссом между эф­ фективностью пермеабилизации и сохранением внутренней структурированности клетки, был изу­ чен эффект дигитонина, стрептолизина-О, фосфо- липазы С, сапонина, а также электропорации на проницаемость цитоплазматической мембраны кле­ ток китайского хомячка. Установлено, что подав­ ляющее большинство указанных методов вызывает полное разрушение части клеток и значительное разрушение ультраструктуры многих других кле­ ток, о чем можно судить как на основании визуаль­ ных наблюдений клеток в микроскоп, так и по крайне низкой активности таких клеток в трансля­ ции мРНК, даже при условии инкубации пермеа­ билизованных клеток в среде, содержащей низко­ молекулярные компоненты бесклеточных систем белкового синтеза. Оказалось, что лишь инкубация клеток с растительным гликозидом сапонином и фосфолипазой С не вызывает заметного изменения клеточной ультраструктуры (данные не приведе­ ны). Было, однако, установлено, что применение фосфолипазы С не приводит к достаточно эффек­ тивной пермеабилизации цитоплазматических мембран во всем изучавшемся диапазоне концент­ раций данного фермента. Таким образом, для по­ следующей работы был выбран сапонин. На рис. 1 приведена зависимость эффективно­ сти пермеабилизации суспензии клеток СНО от концентрации сапонина. Как следует из рис. 1, а, практически 100 %-я пермеабилизация клеток до­ стигается при к о н ц е н т р а ц и и детергента 100 мкг/мл. Настолько же эффективной пермеаби­ лизации можно достичь и при более низкой, 75 мкг/мл, концентрации сапонина, если сразу же 100 - і 0 40 80 120 0 10 20 30 Сапонин, мкг/мл мин, 0°С Р и с 1. Пермеабилизация сапонином клеток СНО в суспензии: а — клетки ( 2 - Ю 7 ) сняты с поверхности фляжек трипсином, разделены на аликвоты, ресуспендированы в буфере А и инку­ бированы с различными концентрациями сапонина. После пер­ меабилизации клетки были отцентрифугированы, ресуспенди­ рованы в буфере А, окрашены трипановым голубым и подсчита­ ны в гемацитометре; б—клетки ( 2 , 2 - 1 0 7 ) обработаны сапони­ ном (75 мкг/мл) по стандартной методике, ресуспендированы в буфере А, инкубированы на льду указанное время, окрашены трипановым голубым и подсчитаны в гемацитометре после обработки детергентом и промывки клеток выдержать их на льду в течение 10 мин (рис. 1,6). Действие холодового шока, по всей видимости, дополняет действие сапонина на мембраны. До­ ступность интерьера пермеабилизированных кле­ ток экзогенным макромолекулам подтверждается при использовании флюоресцентно меченных тРНК и РНКазы А (данные не приведены). Необходимо подчеркнуть, что, имея перед со­ бой цель максимального сохранения клеточной субструктуры при пермеабилизации цитоплазмати­ ческой мембраны, необходимо учитывать весь ком­ плекс воздействий на клетку при пермеабилиза­ ции. Так, для получения суспензии клеток, расту­ щих на поверхности, обычно рекомендуется применение скребка. Однако жесткое удаление клеток с поверхности чашки Петри уже само по себе приводит к частичному их разрушению. Оче­ видно, поэтому, несмотря на то, что для пермеаби­ лизации клеток, снятых с поверхности скребком, необходима значительно меньшая концентрация 71 Н Б Г Р У Ц К И Й В. С. сапонина, 30 мкг/мл, при микроскопическом на­ блюдении они выглядят значительно более разру­ шенными. Часть клеток при такой обработке сли­ пается, образуя агрегаты. В силу этого для получе­ ния суспензии пермеабилизованных клеток рекомендуется использовать снятие клеток с повер­ хности трипсином. Возможное попадание этого фермента в пермеабилизированые клетки снимает­ ся отмывкой клеток в буфере с 10 %-й фетальной сывороткой теленка, содержащей естественные ин­ гибиторы трипсина. Обнаружено также, что введе­ ние сахарозы в буфер для пермеабилизации способ­ ствует предотвращению образования клеточных аг­ регатов. Таким образом, предлагается следующая про­ цедура пермеабилизации клеток СНО: конфлуэнт- ные клетки промывают ФБС (137 мМ хлорид натрия, 5 мМ хлорид калия, 1,4 мМ К Н 2 Р 0 4 , 8 мМ Na 2 HP0 4 ) и обрабатывают трипсином, согласно обычной процедуре. Затем во фляги (объем 75 см3) с клетками добавляют 20 мл среды ДМЕМ с 10 %-й фетальной сывороткой теленка для ингибирования трипсина. Освобожденные с поверхности клетки промывают дважды по 10 мл ФБС и один раз — буфером, содержащим 130 мМ сахарозу, 45 мМ ацетат калия, 45 мМ хлорид калия, 20 мМ ХЕПЕС, 0 200 Сапонин, мкг/мл Рис. 3. Пермеабилизация сапонином фибробластов человека, растущих на поверхности. В опыте использованы две чашки Петри, содержащие шесть покровных стекол с иммобилизован­ ными фибробластами каждая. Клетки на покровных стеклах обрабатывали возрастающими количествами сапонина, как опи­ сано в тексте. После промывки буфером Б на каждое покровное стекло добавлена капля трипановаго голубого, и клетки немед­ ленно наблюдали в микроскоп *200- 0 J0 20 Время, мин Рис. 2. Биосинтез белка в интактных (У) и пермеабилизованных (2) клетках СНО, а также в клеточном гомогенате (3). 2 - Ю 7 клеток были разделены на три равные порции: одна обработана сапонином, вторая оставлена интактной. Клетки третьей порции были гомогенизированы в гомогенизаторе Поттера и центрифу­ гированы в течение 10 мин при 10000 g. Супернатант использо­ вали для изучения синтеза белка в цитозоле разрушенных клеток. После инкубации в смеси для биосинтеза белка пробы осаждали горячей ТХУ, кипятили в течение 5 мин и сорбирова­ ли на фильтры G F / C рН 7,4, 0,3 мМ дитиотреитол (буфер А). Клетки ресуспендируют в буфере А (50 мкл/10 7 клеток). Общий объем суспензии измеряют микропипеткой, используя наконечник с обрезанным концом. Затем к клеткам добавляют равный объем сапонина (150 мкг/мл буфера А). Суспензию осторожно пе­ ремешивают, инкубируют в течение 6 мин при 37 °С, затем 10 мин на льду и центрифугируют 1 мин при 400 g. Осадок клеток ресуспендируют в буфере А с необходимыми для последующих экспе­ риментов добавками. Так, для изучения белкового синтеза необходимо дополнить буфер А смесью, содержащей 0,8 мМ АТФ, 0,07 мМ ГТФ, 30 мкг/мл креатинфосфокиназы, 7.5 мМ креатинфос- фат, 1,3 мМ ацетат магния, 50 мкМ смесь амино­ кислот, 100 мкМ [ 1 4С ]фенилаланин (концентрации конечные). Мягкий, неразрушительный характер предложенной процедуры подтверждается сравне­ нием белкового синтеза в интактных и пермеаби­ лизованных клетках, а также в клеточном гомоге­ нате (рис 2). Значительно более высокий уровень белкового синтеза по сравнению с клеточным гомо­ генатом и отсутствие различий между инактными и пермеабилизованными клетками на протяжении значительного промежутка времени инкубации свидетельствуют о высокой активности белок-син- тезирующего аппарата в сапонизированных клет­ ках. Интересно, что снижение скорости белкового 72 МЯГКИЙ И Э Ф Ф Е К Т И В Н Ы Й М Е Т О Д П Е Р М Е А Б И Л И З А Ц И И КЛЕТОК синтеза в пермеабилизованных клетках может быть преодолено добавлением в систему значитель­ ного избытка аминокислот, т. е. является результа­ том потери низкомолекулярных компонентов, а не распада внутриклеточных компартментов белково­ го синтеза. Полученные данные свидетельствуют о неразрушительном, щадящем характере действия сапонина на организацию и функционирование метаболических процессов в пермеабилизованных клетках. Необходимо отметить, что в ряде случаев не­ обходимо осуществить пермеабилизацию сапони­ ном клеток, прикрепленных к поверхности. Это особенно важно для изучения внутриклеточной локализации флюоресцентно меченных белков при сохранении существующей in vivo организации ци- тоскелета клетки, тем более, что использование сапонина не вызывает увеличения аутофлюорес- ценции клеток [8 ]. Фибробласты человека, расту­ щие на покровных стеклах, являются удобной мо­ делью для изучения распределения различных бел­ ков в клетке. Зависимость пермеабилизации этих клеток от концентрации сапонина приведена на рис. 3. При обработке фибробластов сапонином (125 мкг/мл) наблюдается практически полная доступность кле­ ток трипановому голубому. Возможность входа в клетку макромолекул подтверждена при использо­ вании флюоресцентно меченных белков — оваль- бумина (45 кДа), альбумина (60 кДа), различных субъединиц фактора элонгации 1 (EF-1). На рис 4 показано распределение в пермеабилизованной клетке меченной ФИТЦ а-субъединицы EF-1 (50 кДа). Таким образом, для пермеабилизации клеток, прикрепленных к поверхности, предлагается следу­ ющая модификация метода. Все процедуры прово­ дят при 37 °С. Фибробласты, растущие на покров- Рис. 4. Доступность интерьера пермеабилизованных клеток флюоресцентно меченным макромолекулам. Интактные (а) и пермеабилизованные (б) клетки инкубировали с меченным ФИТЦ фактором элонгации EF-la в течение 5 мин. После промывки ФБС клетки фиксировали 3,8 %-м формальдегидом и фотографировали 601 Время инкубации, мин Рис. 5. Кинетика биосинтеза белка в пермеабилизованных сапонином фибробластах человека. Биосинтез белка в прикреп­ ленных к поверхности клетках проводили в буфере, описанном в тексте. По истечении времени инкубации клетки осаждали горячей ТХУ. Покровные стекла с клетками кипятили с 5 %-й ТХУ в течение 5 мин в пластиковых сцинтилляционных флако­ нах. После охлаждения во флаконы добавляли сцинтиллятор и подсчитывали радиоактивность ных стеклах, промывают дважды 2 мл ФБС и один раз — 2 мл буфера Б (30 мМ сахароза, 50 мМ ацетат калия, 50 мМ хлорид калия, 20 мМ ХЕПЕС, рН 7,4). Затем в чашку добавляют 1 мл раствора сапонина в буфере Б (конечная концентрация 125 мкг/мл) и инкубируют в течение 6 мин. После полного удаления сапонина с помощью пипетки клетки осторожно промывают буфером Б, содержа­ щим необходимые для последующих экспериментов добавки. Так, для изучения белкового синтеза буфер Б дополняют смесью, содержащей 5 мМ АТФ, 13 мМ креатинфосфат, 5 мМ глюкозу, 6 мМ ацетат маг­ ния, 250 мкМ смесь 19 аминокислот (без метиони- на), 250 мкМ [ 3 5S ]метионин. Линейность графика зависимости накопления продукта белкового синте­ за от времени на протяжении 20 мин (рис. 5) свидетельствует о возможности эффективного фун­ кционирования метаболических процессов в иммо­ билизованных клетках после сапонизации и пред­ полагает наличие, в основном, неповрежденной инфраструктуры пермеабилизованных фибробла­ стов человека. Пермеабилизующее действие растительного гликозида сапонина было впервые отмечено еще в 1962 г. [9 ]. Этот детергент мягкого действия имеет 73 НЕГР У ЦК И Й Б С. сродство к холестерину и примечателен тем, что при низких концентрациях способен пермеабилизо- вать преимущественно цитоплазматическую мемб­ рану клеток млекопитающих, а не внутренние их мембраны [10]. Поэтому использование сапонина представляется целесообразным именно в тех слу­ чаях, когда необходимо максимально сохранить лабильные субклеточные структуры. Интересно, что ранее этот детергент использовали в карди­ нально отличающихся целях — либо для вымыва­ ния цитоплазматических белков из клетки в доста­ точно жестких условиях [11 ], либо для того, чтобы обеспечить проникновение в клетку низкомолеку­ лярных компонентов, например, фосфатидилсерина [12] или ионов Са 2 + [13]. В настоящей работе разработаны условия ща­ дящей пермеабилизации сапонином клеток млеко­ питающих, обеспечивающие доступ макромолекул внутрь клеток при сохранении их высокой метабо­ лической активности, по крайней мере в белковом синтезе. Предложенный метод представляется воз­ можным использовать для изучения in situ субкле­ точного уровня организации и регуляции метабо­ лических процессов, функционирование которых в клетках требует точной колокализации и компарт- ментализации различных макромолекул — участ­ ников данной метаболической цепи. Метод универ­ сален для клеток животных и человека и пригоден для пермеабилизации как иммобилизованных на поверхности, так и находящихся в суспензии кле­ ток. Автор глубоко признателен проф. М. Дойчеру (США) и проф. В. Меллеру (Нидерланды) за воз­ можность проведения экспериментов в их лабора­ ториях, а также Др. Р. Стапуленису (Литва) — за консультации и поддержку. Часть работы была осуществлена в ходе выполнения краткосрочного проекта FEBS. Данная работа частично финансиро­ валась Министерством по делам науки и техноло­ гии Украины (грант № 5.4/73). Б. С. Негруцький М\який та ефективний метод пермеабілізації клітин тварин і людини Резюме Одним з найперспективніиіих методів вивчення відкритої недавно субклітинної організації ряду метаболічних процесів і механізмів їх протікання у вищих еукаріотах є використання пермеабілізованних клітин. Існуючі методи пермеабілізації пропонують доволі жорстку обробку мембран, що призводить до втрати інтегральності вмісту клітин. У цій роботі для пермеабілізації клітин тварин і людини використано детер­ гент м'якої дії — рослинний глікозид сапонін. Ця речовина виявилася практично єдиною із тестованих, використання якої дозволило забезпечити, з одного боку, значне збереження внутрішньоклітинної організації і, з другого, — доступ екзо­ генних макромолекул всередину клітин. Розроблено м'які умо­ ви перфорації цитоплазматичних мембран, які різняться для прикріплених до поверхні і перебуваючих у суспензії клітин. Показано високу функціональну активність пермеабілізованих клітин та доступність інтер'єру клітин флюоресцентно мі­ ченим білкам. В. S. Negrutskii Gentle and effective mehod to permeabilize the animal and human cell membrane Summary The permeabilized cell system appears one of the most promising methods to study recently discovered subcellular organization of some metabolic processes and the functional mechanisms involved. The existing permeabilization procedures offer rather harsh mem­ brane treatment which leads to the loss of cell integrity. The plant glycoside saponin was used to permeabilize human and animal cells in this work. The saponin treatment is found to provide both essential conservation of intracellular organization and unlimited access of exogenous macromolecules to the inside of cell. The permeabilization conditions are slightly different for immobilized cells and cells in suspension. High functional activity of per­ meabilized cells as well as the availability of the interior of cells to fluorescently labeled macromolecules are demonstrated. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Srere P. A. Complexes of sequential metabolic enzymes / / Ann. Rev. Biochem.—1987.—56.—P. 8 9 — 1 2 4 . 2. Spivey H. O., Merz J. M. Metabolic compartmentation / / BioEssays .—1989.—10.—P. 127—130. 3. Negrutskii B. S., Deutscher M. P. Channeling of aminoacyl- tRNA for protein synthesis in vivo II Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1991 .—88 .—P. 4 9 9 1 — 4 9 9 5 . 4. Heppel L. A , Makan N. Methods for rapidly altering the permeability of mammalian cells / / J. Supramol. Struct.— 1977 .—6.—P. 399—409 . 5. Ryazanov A. G., Ovchinnikov L. P., Spirin A. S. Development of structural organization of protein-synthesizing machinery from prokaryotes to eukaryotes / / Biosystems.—1987.—20.— P. 275—288. 6. Melan M. A., Sluder G. Redistribution and differential extrac­ tion of soluble proteins in permeabilized cultured cells / / J. Cell Sc i .—1992 .—101 .—P. 7 3 1 — 7 4 3 . 7. Newmeyer D. D., Finlay D. R., Forbes D. J. In vitro transport of a fluorescent nuclear protein and exclusion of non-nuclear proteins / / J. Cell B io l .—1986 .—103 .—P. 2091—2102 . 8. Jacob M.C., Favre M., Bensa J.-C. Membrane cell per­ meabilization with saponin and multiparametric analysis by flow cytometry / / Cytometry .—1991.—12.—P. 5 5 0 — 5 5 8 . 9. Bangham A. D., Home R.-W. Action of saponin on biological cell membranes / / Nature .—1962 .—196 .—P. 9 5 2 — 9 5 3 . 10. Wassler M., Jonasson I., Persson R., Fries E. Differential permeabilization of membranes by saponin treatment of isolated rat hepatocytes / / Biochem. J . — 1 9 8 7 . — 2 4 7 . — P . 407—415. 11. Lin A., Krockmalnic G., Penman S. Imaging cytoskeleton- mitochondrial membrane attachments by embedment-free elec­ tron microscopy of saponin-extracted cells / / Proc. Nat. Acad. Sci. U S A . — 1 9 9 0 . — 8 7 . — P . 8 5 6 5 — 8 5 6 9 . 12. Voelker D. R. Characterization of phosphatidyl-serine synthesis and translocation in permeabilized animal cells / / J. Biol. Chem.—1990 .—265 .—P. 14340—14346 . 13. Burgess G. M., McKinney J. S., Fabiato A. et al. Calcium pools in saponin-permeabilized gunea pig hepatocytes / / Ib id .—1983.—258.—P. 15336—15345 . УДК 577 Поступила в редакцию 26.12.96 74

Схожі ресурси