Перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы HSV-I в составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в клетках печени
Ген тимидинкиназы (tk) вируса HSV-I включен в преформированную капсиду вируса полиомы и в составе полученных стабильных искусственных вирусоподобных частиц (ИВЧ) внутривенно введен крысам весом 30 г. Проведен электрофоретический анализ индуцированной в клетках печени активности tk HSV-I. Одновременн...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1987 |
| Main Author: | |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1987
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154705 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы HSV-I в составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в клетках печени / Р.А. Захарян // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 4. — С. 220, 223. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859638178879635456 |
|---|---|
| author | Захарян, Р.А. |
| author_facet | Захарян, Р.А. |
| citation_txt | Перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы HSV-I в составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в клетках печени / Р.А. Захарян // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 4. — С. 220, 223. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Ген тимидинкиназы (tk) вируса HSV-I включен в преформированную капсиду вируса полиомы и в составе полученных стабильных искусственных вирусоподобных частиц (ИВЧ) внутривенно введен крысам весом 30 г. Проведен электрофоретический анализ индуцированной в клетках печени активности tk HSV-I. Одновременно проведен гибридизационный (по Саузерну) анализ ДНК целых клеток и очищенных ядер гепатоцитов, эндотелиальных и Купферовских клеток для выявления гена tk HSV-I.
Полученный результат свидетельствует, что ИВЧ по сравнению с Са-преципитатом и нуклеопротеидными комплексами более эффективны в переносе in vivo гена tk в ядра печени и в индукции выраженной транзиторной активности tk. Глюкокортикоиды ингибируют транспорт изученных комплексов в эндотелиальные, Купферовские клетки и стимулируют их транспорт в гепатоциты.
Ген тимідинкінази (tk) вірусу HSV-I включений у преформовану капсиду вірусу поліоми і в складі отриманих стабільних штучних вірусоподібних частинок (ІВЧ) внутрішньовенно введений щурам масою 30 г. Проведено електрофоретичний аналіз індукованої в клітинах печінки активності tk HSV-I. Одночасно проведено гібридизаційний (за Саузерном) аналіз ДНК цілих клітин і очищених ядер гепатоцитів, ендотеліальних і Купферовських клітин для виявлення гена tk HSV-I. Отриманий результат свідчить, що ІВЧ порівняно з Са-преципітатом і нуклеопротеїдними комплексами більш ефективні у перенесенні in vivo гена tk в ядра печінки і в індукції вираженої транзиторної активності tk. Глюкокортикоїди інгібують транспорт вивчених комплексів в ендотеліальні, Купферовські клітини і стимулюють їхній транспорт у гепатоцити.
The thymidine kinase gene (tk) of HSV-I is included into the preformed empty capsid of the polyoma virus and in the composition of the obtained stable artificial polyoma-like particles (PLP) is intravenously injected into rats weighing 30 g. Electrophoretic profile of the induced HSV-I tk activity in the liver cells has been investigated. The Southern hybridization analysis of DNA from the whole cells and purified nuclei of hepatocytes, endothelial and Kupffer cells is carried out to reveal gene tk HSV-I. The results obtained indicate that PLP are more effective than Ca-precipitate and nucleoprotein complexes in tk gene transfer in vivo into the liver cells and in the transitory expression of the HSV-I tk-activity. Glucocorticoids stimulate transfer of tk gene into hepatocytes and inhibit its transfer into endothelial and Kupffer cells of the liver.
|
| first_indexed | 2025-12-07T13:18:52Z |
| format | Article |
| fulltext |
Генноинженерная
биотехнология
У Д К 572.5:576.312
ПЕРЕНОС И ТРАНЗИТОРНАЯ ЭКСПРЕССИЯ
ГЕНА ТИМИДИНКИНАЗЫ HSV-I
В СОСТАВЕ РЕКОНСТРУИРОВАННЫХ ВИРУСОПОДОБНЫХ
И НУКЛЕОПРОТЕИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ
Р. А. Захарян
Введение. Ранее [1—4] сообщалось о конструировании искусственных
вирусоподобных частиц (ИВЧ) на основе капсид вируса полиомы в ка-
честве переносчика генетического материала в клетки эукариот. Было
показано, что ИВЧ в 100—150 раз превосходят метод Са-преципитата
в трансформации обработанных in vitro клеток и по эффективности
действия приближаются к результатам, получаемым при использовании
микроинъекций [5]. В настоящей работе описан перенос гена тими-
динкиназы (tk) вируса герпеса в составе преформированной капсиды
вируса полиомы (ИВЧ) в клетки печени крысы (in vivo). В клетках
печени животных, инъецированных ИВЧ, изучена активность tk HSV-I.
Одновременно осуществлен гибридизационный анализ по Саузерну
Д Н К гепатоцитов и ретикулоэндотелиальных клеток для выявления в
них интактного гена tk HSV-I. Аналогичный эксперимент проведен с
геном tk HSV-I в составе Д Н К pBR322 в виде Са-преципитата и ре-
конструированного нуклеосомоподобного комплекса.
Материалы и методы. Выделение Д Н К плазмиды pBR322 tk. Рекомбинантная
Д Н К pBR322 tk содержит ген tk вируса герпеса HSV-I в составе ВатНІ-фрагмента
3500 пар оснований (п. о.), клонированного по ВатНІ-участку pBR322. Ε. coli Η В101
выращивали в стандартных условиях до плотности А65о = 1,0 в присутствии хлорамфе-
>школа («Serva», ФРГ, 180 мкг/мл); из клеточной биомассы выделяли Д Н К pBR322
tk по [5]. Полученный препарат Д Н К очищали обработкой нуклеазой SI («Serva»,
ФРГ) с последующей депротеинизацией и хроматографией на колонке с биогелем А-15.
Д Н К из элюата осаждали этанолом (—20 °С).
В ы д е л е н и е Ρ ν u Ι-φ ρ а г м е к τ а ( о к о л о 2 0 0 0 п. о.) г е н a t k H S V - I .
Д Н К pBR322 tk разрезали эндонуклеазой PvuII, полученные фрагменты разделяли элек-
трофорезом в 0,5 %-ном легкоплавком агарозном геле («MSE», Англия). PvuII-фраг-
мент гена tk экстрагировали из геля при 65 °С двойным объемом свежеперегнанного
фенола (рН 8,0), насыщенного буферным раствором (0,1 Μ трис-HCl, рН 8,0, 0,2 %-
ный β-меркаптоэтанол, 0,1 %-ный гидроксихинолин, 0,3 Μ NaCl, 10 мМ ЭДТА).
В ы д е л е н и е к л е т о ч н о й Д Н К , п р о в е д е н и е г и б р и д и з а ц и и н а
ф и л ь т р а х . Клеточную Д Н К выделяли по [6], расщепляли эндонуклеазами PstI,
Вgill у Smal. Полученные фрагменты фракционировали электрофорезом в 1,8 %-ном
агарозном геле и переносили на нитроцеллюлозные фильтры по методу Саузерна [7].
Д л я гибридизации использованы меченные 3 2 Р Рсш-фрагменты (ген tk) со специфиче-
ской активностью 108 имп/мин на 1 мкг ДНК. Гибридизацию проводили в условиях,
описанных в работе [8].
Ф р а к ц и о н и р о в а н и е к л е т о к п е ч е н и . Суспензию клеток печени полу-
чали после перфузии ткани печени 0,05 %-ным раствором коллагеназы («Serva», ФРГ) .
Гепатоциты, эндотелиальные и Купферовские клетки (РЭС) разделяли в градиенте кон-
центрации 50—30 % метризамида [9]. Фракционирование градиента проводили со дна
пробирки при 580 нм на приборе ИА-5 («ISCO», США).
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1987.— Т. 3, № 4 215
П о л у ч е н и е н у к л е о п р о т е и д н ы х (Η Π) к о м п л е к с о в г е н а t k .
Очистка пустых капсид вируса полиомы, реконструирование ИВЧ на основе преформи-
рованных пустых капсид вируса полиомы и tk-гена описаны ранее [2, 3]. Реконструк-
ция гена tk в НП-комплекс с дискретным набором нуклеосомоподобных структур осу-
ществлена в присутствии набора гистонов и анионных ДНК-связывающих белков кро-
ви [10] в условиях, описанных в работе [11]. Реконструированные комплексы исполь-
зованы для внутривенного введения в виде Са-преципитата, который получали анало-
гично Са-ДНК-преципитату. Д Н К была переведена в Са-форму в растворе 125 мМ
СаСЬ. Дексаметазонацетат («Serva», ФРГ) вводили из расчета 50 мкг на 100 г веса
внутривенно крысам 20-дневного возраста за 6 ч до введения гена tk в составе комп-
лексов.
О п р е д е л е н и е а к т и в н о с т и t k . Гомогенат ткани печени в растворе
(0,01 Μ трис-HCl, рН 7,5, 0,15 Μ КС1, 1 мМ 2-меркаптоэтанол и 50 мкМ тимидин)
обрабатывали ультразвуком, центрифугировали при 30 000 g 30 мин, надосадок исполь-
зовали для анализа активности tk по [12]. Надосадок (1 мг белка) фракционировали
электрофорезом в 5 %-ном полиакриламидном геле (ΠΛΑΓ) («Serva», ФРГ) , как опи-
сано в работе [12]. В инкубационную смесь вносили 1 мкМ [ 3H]TdR 1990 ГБк/моль
(ВО «Изотоп», Моск. отд-ние), сорбцию синтезированного [ 3 H]dTMP на ДЭАЭ-целлю-
лозе («Sigma», США) и измерение радиоактивности проводили в основном, как описа-
но в работе [13].
В л и я н и е т и м и д и н о в о г о а н а л о г а 5-э τ и л д е з о к с и у ρ и д и н а н а
а к т и в н о с т ь t k . Активность tk (клеточной и HSV-I) определяли по описанной вы-
ше методике [12] в присутствии 50 мкМ 5-этилдезоксиуридина. Процент активности
вычислен относительно величины, определяемой в отсутствие аналога.
Результаты и обсуждение. ИВЧ, НП-комплекс и Са-преципитат с
геном tk из расчета 105 молекул гена tk на клетку печени вводили
внутривенно крысам 20-дневного возраста. Через 6, 24 и 72 ч после
т>
а б 6 a
Рис. 1. Электрофоретическое распределение в 5 %-ном ПААГ активности tk HSV-I
клеток печени крыс после внутривенного введения ИВЧ и НП-комплекса, содержащих
100 мкг гена tk HSV-I (PvuII-фрагмент): а — контроль (интактные крысы); б — 24,
в — 72 ч после введения ИВЧ; г — 24 ч после введения НП-комплекса (200 мкг Д Н К ) .
Электрофоретическая подвижность (Rf) вычислена относительно подвижности красите-
ля бромфенола синего
Fig. 1. Electroforetic distribution in 5 % PAAG of the thymidine kinase activity from the
liver cells of ra ts af ter intravenous injection of artificial virus-like (AVL) particles, nuc-
leo-protein complexes containing tk gene of HSV-I: a — control (intact ra t s ) ; б — 24 h
af ter injection of AVL particles (100 μg of tk gene); в — 72 h after injection of AVL;
г — 24 h after injection of nucleo-protein complex (200 μg of tk gene)
инъекций одновременно проведены электрофоретический анализ рас-
пределения активности tk и гибридизационное изучение клеточной Д Н К ,
выделенной из целых клеток и очищенных ядер гепатоцитов, эндоте-
лиальных и Купферовских клеток с Д Н К гена tk HSV-I.
Электрофоретический анализ (в 5%-ном ПААГ) активности tk кле-
ток печени интактных животных и получивших внутривенно ген tk
HSV-I приведен на рис. 1. В клетках печени интактных крыс выявлены
две tk с Rf 0,2 и 0,8—0,9. Последняя соответствует tk-активности мито-
хондрий. В клетках печени крыс, получивших ген tk HSV-I в составе
ИВЧ, через 24 ч после инъекции обнаруживается добавочный пик
tk-активности, мигрирующей с Rf 0,45—0,5, соответствующий tk-актив-
216 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1987.— Т. 3, № 4 216
пости, индуцируемой в мышиных клетках вирусом HSV-I или при
трансформации геном tk HSV-I in vitro [12, 14]. Индуцируемая доба-
вочная активность составляет 20 % общей и к 72 ч после инъекции
ИВЧ снижается до минимума. Добавочная tk-активность с Rf, соот-
ветствующей Rf вирусной tk, обнаруживается и при введении 200 мкг
гена tk в составе НП-комплекса (через 24 ч после инъекции комплекса)
и количественно соответствует tk-активности митохондрий. При вве-
дении 200 мкг гена tk в составе Са-ДНК-преципитата, равно как и
через 6 ч после введения ИВЧ и НП-комплекса, обнаружить доба-
вочную tk-активность, характеризующуюся Rf 0,45—0,5, не удалось.
Эксперименты по изучению влияния ингибитора HSV-I вирусспе-
цифической tk 5-этилдезоксиуридина на активность тимидинкиназ,
фракционированных электрофорезом в 5%-ном ПААГ, показали, что
добавочная tk-активность, индуцируемая в печени при внутривенном
введении гена tk HSV-I, ингибируется в присутствии 5-этилдезокси-
уридина на 80—70 %, в то время как клеточная активность tk не меня-
ется даже в присутствии его при концентрации 100 мМ.
Очевидно, что внутривенное введение гена tk HSV-I в составе
ИВЧ или НП-комплекса обеспечивает в клетках печени через 24 ч
после инъекции достаточно выраженный транзиторный синтез фермента
HSV-I tk, активность которой в определенной степени обнаруживается
и через 72 ч после инъекции ИВЧ.
Определенный интерес представляло выявление распределения вво-
димых внутривенно tk-комплексов в клетках печени, гепатоцитах, а
также в клетках РЭС и их субклеточных фракциях. ДНК, изолиро-
ванную из гепатоцитов и клеток РЭС, расщепляли эндонуклеазами
PstI, Bglll, Smal, и после разделения полученных фрагментов электро-
форезом в агарозном геле в их составе методом гибридизации выявили
интактные гены tk HSV-I (Ріш//-фрагмент) (рис. 2, α, б). Через 6 ч
после инъекции ИВЧ, НП-комплексов и Са-преципитата гены tk HSV-I
обнаруживаются как в гепатоцитах, так и в клетках РЭС, по-видимо-
му, в цитоплазме или ассоциированные с плазматической мембраной
этих клеток, так как в ядерной фракции tk-ген в данных условиях экспе-
римента выявить не удается. Интенсивность полос на радиоавтографе
при использовании ИВЧ (в идентичных условиях эксперимента) суще-
ственно выше, чем при применении НП-комплекса и Са-преципитата.
Д Н К , изолированная из клеток печени интактных крыс, в данных усло-
виях эксперимента не дает полос гибридизации с tk-геном HSV-I. Через
24 ч после инъекции tk-гена в составе НП-комплекса или Са-преципи-
тата в ядрах гепатоцитов обнаруживается при использовании для ана-
лиза 100 мкг клеточной Д Н К слабый сигнал гибридизуемости в обоих
случаях.
В случае же ИВЧ через 24 ч после инъекции при рестрикции 20 мкг
клеточной Д Н К выявляются полосы гибридизации с tk-геном HSV-I
как в цитоплазме, так и ядрах гепатоцитов.
Ранее нами было показано, что глюкокортикоиды стимулируют пе-
ренос Д Н К в клетки печени, предположительно гепатоциты [15]. В экс-
перименте с предварительным введением дексаметазона (рис. 2, б)
показано, что дексаметазон существенно (по интенсивности полосы
гибридизуемости) повышает транспорт tk-гена в гепатоциты как в со-
ставе НП-комплексов, так и в составе ИВЧ. При этом полностью
блокирован их транспорт в клетки РЭС. Очевидно, что глюкокортикои-
ды можно использовать для избирательного транспорта экзогенно вво-
димых генов в гепатоциты печени in vivo.
Полученные данные показывают возможность переноса (в составе
ИВЧ и НП-комплекса) и транзиторной экспрессии экзогенного генети-
ческого материала в клетках печени.
Известно, что узким местом в процессе ДНК-опосредованной транс-
формации является переход Д Н К из цитоплазмы в ядро [5] и «разде-
вание» вируса полиомы именно в ядрах инфицированных клеток [16].
Использование ИВЧ для переноса гена существенно облегчает преодо-
Б! ] ΟΠΟ Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА.— 1987,— Т. 3. .\о 4 217
Рис. 2. Оонаружснис экзогенной Д Н К гена tk HSV-I (PvuIJ-фрагмент) в гепатоцитах
и клетках РЭС: а — инъецировано 10 мкг tk-гена в составе ИВЧ, рестриктазы Pst!„
BglJJ (2 — Д Н К ядер клеток РЭС; 3, 4 — Д Н К целых клеток РЭС; 5, 6 — Д Н К гепа-
тоцитов; 7 — Д Н К ядер гепатоцитов), НП-комплекса (8— Д Н К гепатоцитов, Smal:
9 — Д Н К клеток РЭС), Са-преципитата (10 — Д Н К гепатоцитов); Д Н К изолирован!
через 6 ч после инъекции, рестрицировано по 5 мкг Д Н К (1, 11, 12 — контроль); инъе-
цировано 10 мкг tk-гена в составе Са-преципитата (13, 14 — Д Н К ядер гепатоцитов)
и НП-комплекса (17, 18 — Д Н К ядер гепатоцитов); Д Н К изолирована через 24 ч пос-
ле инъекции, рестрицировано по 100 мкг ДНК; б — инъецировано 10 мкг tk-гена в
составе ИВЧ (1 — Д Н К цитоплазмы гепатоцитов; 4 — Д Н К ядер гепатоцитов; ДНК.
изолирована через 24 ч после инъекции, рестрицировано по 20 мкг Д Н К ) , НП-комплек-
са через 6 ч после введения дексаметазона (6 — Д Н К ядер гепатоцитов, Smal·, 7 —
Д Н К цитоплазмы гепатоцитов, Psil\ 13 — Д Н К клеток РЭС; Д Н К изолирована через
24 ч после инъекции, рестрицировано по 20 мкг ДНК) и в составе ИВЧ через б ч
после введения дексаметазона (10 — Д Н К цитоплазмы гепатоцитов; 11—ДНК ядер
гепатоцитов, Bglll·, 12 — Д Н К ядер гепатоцитов, Smal·, 9 — 40 пг Д Н К PvuII-фрагмен-
та (маркер) tk-гена HSV-I, Smal·, Д Н К изолирована через 24 ч после инъекции, рестри-
цировано по 10 мкг Д Н К ) . Д Н К цитоплазмы — тотальная РНК цитоплазмы (100 мкг),
к которой добавляли 20 мкг Д Н К печени крысы и после соответствующей обработки
РНКазой и очистки использовали в рестрикционном анализе для поиска tk-гена
Fig. 2. Detection (by the Southern blot analysis) of exogenous tk-gene of HSV-I DNA
into hepatocytes, endothelial and Kupffer cells. 5 μg of DNA were digested by PstI,
Bglll, Smal, fractionated on a 1.8 % agarose gel, t ransferred into nitrocellulose filter
and hybridized with P32 PvuII tk DNA: a — DNA was isolated,6 h after injection of AVL,
containing 10 μg of tk gene. 1 — DNA from the liver of intact rats; 2 — DNA from nuc-
leus of endothelial cells; 3, 4 — DNA from whole endothelial cells; 5, 6 — DNA from he-
patocytes; 7 — DNA from nucleus of hepatocytes. DNA was isolated 6 h after injection
of nucleoprotein complex and Ca-precipitate: 8 — DNA from hepatocytes (Smal), 9 —
DNA from endothelial cells, 10— DNA from hepatocytes; 11, 12 — DNA from the liver
of intact rats. DNA isolated 24 h after injection of 10 μg of tk gene as a Ca-precipitate
218 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1987.— Т. 3, № 4 218
ление барьера ядерной мембраны в условиях in vivo, что ранее было
продемонстрировано и для экспериментов in vitro [1, 4], где частота
трансформации достигает (5,6—6,5) · 103 трансформантов на 106 клеток
на 1 мкг ДНК. В наших экспериментах через 24 ч после инъекции
ИВЧ, содержащих 10 мкг гена tk, в 20 мкг Д Н К ядер гепатоцитов
обнаруживается сигнал гибридизации с геном tk, по интенсивности
сопоставимый с гибридизацией с 40 пг гена tk (Рсш/7-фрагмент).
После инъекции в составе ИВЧ десятикратно большего количества
Рис. 3. Гибридизация с геном tk HSV-I Д Н К ядер клеток печени крыс, которым вво-
дили ИВЧ (100 мкг гена tk): 1, 3 — смесь 50 мкг Д Н К с 40 пг гена tk; 2 — 50 мкг
Д Н К интактных крыс; 4 — 40 пг tk-гена HSV-I (PvuII-фрагмент); 5 — 50 мкг Д Н К .
Д Н К изолирована через 4 дня после инъекции
Fig. 3. Hybridization analyses with tk gene of HSV-I of genomic DNAs prepared from
nuclei of the rat liver cells 4 days af ter injection of AVL (100 μg of tk gene). 1,3—
Mixture of 50 μ ^ of DNA rat liver cells (after injection of AVL) and 40 pg of tk gene;
2 — 50 μg of DNA from the liver cells of intact rats; 4 — 40 pg of tk gene HSV-I
(PvuII f ragment ) ; 5 — 50 μg of DNA from the rat liver cells after injection of AVL
Рис. 4. Гибридизация с геном tk HSV-I Д Н К ядер клеток печени крыс, которым вво-
дили ИВЧ (100 мкг гена tk): 1, 3 — 50 мкг ДНК; 2, 4 — 50 мкг Д Н К (после действия
EcoRI/Smal на Д Н К из интегрированного гена tk HSV-I изолирован фрагмент разме-
ром около 1300 п. о.)
Fig. 4. Hybridization analysis of genomic DNAs prepared from nuclei of the rat liver
cells 4 days after injection of AVL by tk gene of HSV-I (100 μg of tk gene). 1,3 —
50 μg of DNA from the rat liver cells af ter injection of AVL; 2, 4 — 50 μg of DNA
from the rat liver cells after injection of AVL (DNA digested by EcoRI/Smal)
(100 мкг гена tk) в клетках печени обнаруживается достаточно выра-
женная транзиторная экспрессия гена tk (рис. 1,6) , в определенной
степени выявляемая и через 72 ч (рис. Ι , β ) , что доказывает эффектив-
ность переноса гена tk в ядра клеток печени и предполагает возмож-
ную его интеграцию в геном. Д Н К ядер клеток печени крыс, которым
(13, 14) and nucleoprotein-complex (77, 18), 100 μ ^ of DNA were digested; 13, 14, 17,
/<9 — D N A from hepatocytes; б — DNA was isolated 24 h after injection of AVL; 20 μ £
of DNA were digested. 1 — DNA from cytoplasm of hepatocytes, 4 — DNA from nuclei of
hepatocytes. Nucleoprotein-complex was injected б h after injection of dexamethasone,
DNA was isolated 24 h after injection of tk gene, 20 μ g of DNA were digested. 6 — DNA
from nuclei of hepatocytes (Smal ) , 7 — D N A from cytoplasm of hepatocytes, 13 — DNA
from whole endothelial cells; AVL were injected 6 h after injection of dexamethasone,
DNA was isolated 24 h after injection of tk gene. 10 μg of DNA were digested. 10 —
DNA from cytoplasm of hepatocytes; 11, 12 — DNA from nuclei of hepatocytes, 9 —
40 pg of DNA tk gene (PvuII f ragment)
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1987.— Т. З, № 4 219
после инъекции и изучена методом гибридизации с геном tk H b V - l .
В гибридизации использована Д Н К с молекулярной массой (10—12) X
Х106 , полученная после обработки ультразвуком (рис. 3, 4). Полу-
ченный результат свидетельствует в пользу переноса экзогенного гене-
тического материала в составе ИВЧ в клетки печени in vivo, сопро-
вождающегося транзиторной экспрессией его, что дает надежду в
будущем успешно реализовать этот метод для стабильной трансфор-
мации клеток; вопрос заключается в поисках путей по повышению ре-
комбинационной способности транспортируемого гена. Предварительные
данные, полученные нами in vitro, показывают что эффективность
трансформации с помощью ИВЧ можно существенно повысить за счет
лигирования с геном tk транспозоноподобного элемента Alu-повтора.
TRANSFER AND TRANSITORY EXPRESSION
OF HSV-I THYMIDINE KINASE GENE IN THE COMPOSITION
OF RECONSTRUCTED VIRUS-LIKE AND NUCLEOPROTEIN
COMPLEXES IN THE LIVER CELLS
R. A. Zakharyan
Institute of Experimental Biology,
Academy of Sciences of the Armenian SSR, Yerevan
S u m m a r y
The thymidine kinase gene (tk) of HSV-I is included into the preformed empty capsid
of the polyoma virus and in the composition of the obtained stable artificial polyoma-
like particles (PLP) is intravenously injected into rats weighing 30 g. Electrophoretic
profile of the induced HSV-I tk activity in the liver cells has been investigated. The So-
uthern hybridization analysis of DNA from the whole cells and purified nuclei of hepato-
cytes, endothelial and Kupffer cells is carried out to reveal gene tk HSV-I. The results
obtained indicate that PLP are more effective than Ca-precipitate and nucleoprotein com-
plexes in tk gene transfer in vivo into the liver cells and in the transitory expression of
the HSV-I tk-activity. Glucocorticoids stimulate transfer of tk gene into hepatocytes and
inhibit its transfer into endothelial and Kupffer cells of the liver.
1. Slilaty S. N., Aposhian Η. V. Gene-transfer by polyoma-like particles assembled in
cell free system//Science.— 1983.—220, N 4598.—P. 725—727.
2. Barr S. ΜKeck K., Aposhian Η. V. Cell-free assembly of a polyoma-like particle
from empty capsids and DNA//Viro logy .— 1979.—96, N 2 .—P. 656—660.
3. Aposhian Η. V., Zakharian R. A. Assembly of a polyoma-like particle from empty
capsids and DNA in a cell-free sys t em/ /Adv . Enzyme Regul.— 1980.— 18, N 1.—
P. 275—287.
4. Захарян P. Α., Гаспарян Э. Г., Апошян В. Г. Транспорт гена β-лактамазы в составе
искусственных вирусоподобных частиц в клетки человека и его экспрессия // Биол.
журн. Армении — 1982 — 35, № 9 — С . 730—734.
5. Capecchi Μ. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into
cultured mammalian cel ls / /Cel l .— 1980.—22, N 2 .—P. 479—488.
6. Kirby R. S. A new method for the isolation of DNA//Biochem. J.— 1958.—66, N 2 —
P. 495—501.
7. Southern Ε. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by
gel electrophoresis/7 J. Мої. Biol.— 1975.—98, N 3 .—P. 503—517.
8. Pellicer Α., Wigler M., Axel R. The transfer and stable integration of the HSV thy-
midine kinase gene into mouse cel ls / /Cel l .— 1978.— 14, N 1.— P. 133—141.
9. Munthe-Caas A. S., Seglen P. O. The use of metrizimide as a gradient medium for
isopicnic of rat liver cells,// FEBS Lett.— 1974.—43, N 3 .—P. 252—256.
10. Brehm S. P., Hoch S. O., Hoch J. A. DNA-binding proteins in human serum/ /Biochem.
and Biophys. Communs.— 1975.—63, N 1.—P. 24—31.
11. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which bind histones and t ransfer
them to D N A / R . A. Iaskey, В. M. Honda, A. D. Mills, J. M. F inch / /Na ture .— 1978.—
275, N 5679.—P. 416—420.
12. Cheng Y.-C., Ostrander M. Deoxythymidine kinase induced in HeLa TK~ cells by
herpes simplex virus type I and type I I / / J . Biol. Chem.— 1976.-251, N 9 .—P. 2605—
2610.
(Окончание см. на с. 223).
220 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1987.—Т. 3. М> 4.
7. Патоп Ε. Б., Вудмаска Μ. И., Свердлов Ε. Д. Присутствие собственного промотора
гроВ-гена снижает стабильность рекомбинантных однонитевых фагов, содержащих
этот ген//Биополимеры и клетка.— 1985.— 1, № 3.— С. 160—162.
8. Zinder N. D., Boeke J. D. The filamentous phage (Ff) as vectors for recombinant
DNA — a review/ /Gene.— 1982.— 19, N 1.—P. 1 — 10.
9. Maniatis Т., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning — a laboratory m a n u a l -
New York : Cold Spring Harbor, 1982,—545 p.
10 Birnboim H. C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombi-
nant plasmid D N A / / N u c l . Acids Res.— 1979.—7, N 6 .—P. 1513—1523.
11 Collins / . Deletions, insertions and rearrangements affecting rpoB gene expression//
Мої. and Gen. Genet.— 1979.— 173, N 1.— P. 217—220.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Получено 29.01.87
Киев
Окончание. Начало см. на с. 215—220.
13. Olasha w Ν. Ε., Kress Ε. D., Cristofalo V. J. Thymidine triphosphate synthesis in se-
nescent W 138 cells IJ Exp. Cell Res.— 1983.— 149, N 2 .—P. 347—354.
14. Transfer of purified FISV thymidine kinase gene to cultured mouse cells / Μ Wigler,
S. Silverstein, L. S. Lee et al. // Cell.— 1977.— 11, N 1.—P. 223—232.
15. Захарян P. А. Ген-транспорт in vivo и его регуляция глюкокортикоидами//Струк-
тура и транскрипция генома: Тез. докл. IV симпоз. СССР—ФРГ — Ереван, 198Г —
С. 19.
16. Qasba Р. КAposhian FI. V. DNA and gene therapy: t ransfer of mouse DNA to hu-
man and mouse embryonic cells by polyoma pseudovirions // Proc. Nat. Acad. Sci.
USA.— 1971.—68, N 10.—P. 2345—2349.
Ин-т эксперим. биологии АН АрмССР, Ереван Получено 15.09.85
Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА.— 1987.— Т. 3, № 4 223
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154705 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T13:18:52Z |
| publishDate | 1987 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Захарян, Р.А. 2019-06-15T18:19:25Z 2019-06-15T18:19:25Z 1987 Перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы HSV-I в составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в клетках печени / Р.А. Захарян // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 4. — С. 220, 223. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001F2 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154705 572.5:576.312 Ген тимидинкиназы (tk) вируса HSV-I включен в преформированную капсиду вируса полиомы и в составе полученных стабильных искусственных вирусоподобных частиц (ИВЧ) внутривенно введен крысам весом 30 г. Проведен электрофоретический анализ индуцированной в клетках печени активности tk HSV-I. Одновременно проведен гибридизационный (по Саузерну) анализ ДНК целых клеток и очищенных ядер гепатоцитов, эндотелиальных и Купферовских клеток для выявления гена tk HSV-I. Полученный результат свидетельствует, что ИВЧ по сравнению с Са-преципитатом и нуклеопротеидными комплексами более эффективны в переносе in vivo гена tk в ядра печени и в индукции выраженной транзиторной активности tk. Глюкокортикоиды ингибируют транспорт изученных комплексов в эндотелиальные, Купферовские клетки и стимулируют их транспорт в гепатоциты. Ген тимідинкінази (tk) вірусу HSV-I включений у преформовану капсиду вірусу поліоми і в складі отриманих стабільних штучних вірусоподібних частинок (ІВЧ) внутрішньовенно введений щурам масою 30 г. Проведено електрофоретичний аналіз індукованої в клітинах печінки активності tk HSV-I. Одночасно проведено гібридизаційний (за Саузерном) аналіз ДНК цілих клітин і очищених ядер гепатоцитів, ендотеліальних і Купферовських клітин для виявлення гена tk HSV-I. Отриманий результат свідчить, що ІВЧ порівняно з Са-преципітатом і нуклеопротеїдними комплексами більш ефективні у перенесенні in vivo гена tk в ядра печінки і в індукції вираженої транзиторної активності tk. Глюкокортикоїди інгібують транспорт вивчених комплексів в ендотеліальні, Купферовські клітини і стимулюють їхній транспорт у гепатоцити. The thymidine kinase gene (tk) of HSV-I is included into the preformed empty capsid of the polyoma virus and in the composition of the obtained stable artificial polyoma-like particles (PLP) is intravenously injected into rats weighing 30 g. Electrophoretic profile of the induced HSV-I tk activity in the liver cells has been investigated. The Southern hybridization analysis of DNA from the whole cells and purified nuclei of hepatocytes, endothelial and Kupffer cells is carried out to reveal gene tk HSV-I. The results obtained indicate that PLP are more effective than Ca-precipitate and nucleoprotein complexes in tk gene transfer in vivo into the liver cells and in the transitory expression of the HSV-I tk-activity. Glucocorticoids stimulate transfer of tk gene into hepatocytes and inhibit its transfer into endothelial and Kupffer cells of the liver. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Генно-инженерная биотехнология Перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы HSV-I в составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в клетках печени Перенесення і транзиторна експресія гена тимідинкінази HSV-I у складі реконструйованих вірусоподібних і нуклеопротеїдних комплексів у клітинах печінки Transfer and transitory expression of HSV-I thymidine kinase gene in the composition of reconstructed virus-like and nucleoprotein complexes in the liver cells Article published earlier |
| spellingShingle | Перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы HSV-I в составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в клетках печени Захарян, Р.А. Генно-инженерная биотехнология |
| title | Перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы HSV-I в составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в клетках печени |
| title_alt | Перенесення і транзиторна експресія гена тимідинкінази HSV-I у складі реконструйованих вірусоподібних і нуклеопротеїдних комплексів у клітинах печінки Transfer and transitory expression of HSV-I thymidine kinase gene in the composition of reconstructed virus-like and nucleoprotein complexes in the liver cells |
| title_full | Перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы HSV-I в составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в клетках печени |
| title_fullStr | Перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы HSV-I в составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в клетках печени |
| title_full_unstemmed | Перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы HSV-I в составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в клетках печени |
| title_short | Перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы HSV-I в составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в клетках печени |
| title_sort | перенос и транзиторная экспрессия гена тимидинкиназы hsv-i в составе реконструированных вирусоподобных и нуклеопротеидных комплексов в клетках печени |
| topic | Генно-инженерная биотехнология |
| topic_facet | Генно-инженерная биотехнология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154705 |
| work_keys_str_mv | AT zaharânra perenositranzitornaâékspressiâgenatimidinkinazyhsvivsostaverekonstruirovannyhvirusopodobnyhinukleoproteidnyhkompleksovvkletkahpečeni AT zaharânra perenesennâítranzitornaekspresíâgenatimídinkínazihsviuskladírekonstruiovanihvírusopodíbnihínukleoproteídnihkompleksívuklítinahpečínki AT zaharânra transferandtransitoryexpressionofhsvithymidinekinasegeneinthecompositionofreconstructedviruslikeandnucleoproteincomplexesinthelivercells |