Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика
Предложен простой и быстрый метод получения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика. Процедура состоит из трех стадий и включает в себя осаждение пост- митохондриального супернатанта полиэтиленгликолем с последующими хроматографиями на анионо-(ДЭАЭ-целлюлоза) и катионо-(фосфоцеллюлоза) обменни...
Збережено в:
| Дата: | 1994 |
|---|---|
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1994
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154710 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика / Г.В. Турковская, В.Ф. Шалак, К.В. Семенихин, Б.С. Негруцкий // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 2. — С. 24-27. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154710 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1547102025-02-10T01:44:55Z Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика Експрес-метод виділення фенілаланіл-тРНК синтетази із печінки кроля Fast procedure for isolation of phenylalanyl-tRNA synthetase from rabbit liver Турковская, Г.В. Шалак, В.Ф. Семенихин, К.В. Негруцкий, Б.С. Предложен простой и быстрый метод получения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика. Процедура состоит из трех стадий и включает в себя осаждение пост- митохондриального супернатанта полиэтиленгликолем с последующими хроматографиями на анионо-(ДЭАЭ-целлюлоза) и катионо-(фосфоцеллюлоза) обменниках. Запропоновано швидкии, простий та не потребуючий дорогого обладнання метод одержання фенілаланіл-тРНК синтетази iз печінки кроля. Він складаеться з трьох стаій i включає осаджування поліетиленгліколем постмітохондріального супернатанта з наступивши хроматографіями на ДЕАЕ-целюлозі i фосфоцелюлозі. Simple and fast method for isolation of phenylalanyl-tRNA synthetase from rabbit liver is proposed. Three-step procedure includes polyethylene glycol precipitation of post-rnitochondrial supernatant with subsequent DEAE-cellulose and phosphocellulose chromatographies. 1994 Article Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика / Г.В. Турковская, В.Ф. Шалак, К.В. Семенихин, Б.С. Негруцкий // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 2. — С. 24-27. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00039E https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154710 577.152 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| description |
Предложен простой и быстрый метод получения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика. Процедура состоит из трех стадий и включает в себя осаждение пост- митохондриального супернатанта полиэтиленгликолем с последующими хроматографиями на анионо-(ДЭАЭ-целлюлоза) и катионо-(фосфоцеллюлоза) обменниках. |
| format |
Article |
| author |
Турковская, Г.В. Шалак, В.Ф. Семенихин, К.В. Негруцкий, Б.С. |
| spellingShingle |
Турковская, Г.В. Шалак, В.Ф. Семенихин, К.В. Негруцкий, Б.С. Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика Биополимеры и клетка |
| author_facet |
Турковская, Г.В. Шалак, В.Ф. Семенихин, К.В. Негруцкий, Б.С. |
| author_sort |
Турковская, Г.В. |
| title |
Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика |
| title_short |
Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика |
| title_full |
Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика |
| title_fullStr |
Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика |
| title_full_unstemmed |
Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика |
| title_sort |
экспресс-метод выделения фенилаланил-трнк синтетазы из печени кролика |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1994 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154710 |
| citation_txt |
Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика / Г.В. Турковская, В.Ф. Шалак, К.В. Семенихин, Б.С. Негруцкий // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 2. — С. 24-27. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT turkovskaâgv ékspressmetodvydeleniâfenilalaniltrnksintetazyizpečenikrolika AT šalakvf ékspressmetodvydeleniâfenilalaniltrnksintetazyizpečenikrolika AT semenihinkv ékspressmetodvydeleniâfenilalaniltrnksintetazyizpečenikrolika AT negruckiibs ékspressmetodvydeleniâfenilalaniltrnksintetazyizpečenikrolika AT turkovskaâgv ekspresmetodvidílennâfenílalaníltrnksintetaziízpečínkikrolâ AT šalakvf ekspresmetodvidílennâfenílalaníltrnksintetaziízpečínkikrolâ AT semenihinkv ekspresmetodvidílennâfenílalaníltrnksintetaziízpečínkikrolâ AT negruckiibs ekspresmetodvidílennâfenílalaníltrnksintetaziízpečínkikrolâ AT turkovskaâgv fastprocedureforisolationofphenylalanyltrnasynthetasefromrabbitliver AT šalakvf fastprocedureforisolationofphenylalanyltrnasynthetasefromrabbitliver AT semenihinkv fastprocedureforisolationofphenylalanyltrnasynthetasefromrabbitliver AT negruckiibs fastprocedureforisolationofphenylalanyltrnasynthetasefromrabbitliver |
| first_indexed |
2025-12-02T13:45:20Z |
| last_indexed |
2025-12-02T13:45:20Z |
| _version_ |
1850404367845294080 |
| fulltext |
УДК 577.152
Г. В. Турковская, В. Ф. Шалак, К. В. Семенихин, Б. С. Негруцкий
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ
ФЕНИЛАЛАНИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРОЛИКА
Предложен простой и быстрый метод получения фенилаланил-тРНК синтетазы из пе
чени кролика. Процедура состоит из трех стадий и включает в себя осаждение пост-
митохондриального супернатанта полиэтиленгликолем с последующими хроматографи-
ями на анионо-(ДЭАЭ-целлюлоза) и катионо-(фосфоцеллюлоза) обменниках.
Введение. Фенилаланил-тРНК синтетаза отличается от других амино-
ацил-тРНК синтетаз из высших эукариот целым рядом особенностей,
в числе которых уникальная тетрамерная структура и большое сродст
во к рибосомам [1, 2]. Необходимость поиска быстрого и надежного
метода очистки этого фермента объясняется, среди прочего, доступно
стью и глубокой изученностью его субстрата — фенилаланиновой тРНК.
В то же время адекватного по простоте и надежности метода получе
ния фенилаланил-тРНК синтетазы, несмотря на ряд попыток, предпри
нятых в последнее время [3, 4], все еще не предложено. Изучение же
особенностей фермент-субстратного взаимодействия, равно как и ис
следование влияния фактора элонгации 1 на этот процесс, как предло
жено нами ранее [5], требуют получения препаративных количеств вы-
сокоочищенного фермента.
Задача настоящего исследования состояла в разработке простого и
быстрого метода выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени
кролика.
Материалы и методы. Препарат суммарной тРНК получали, как
описано ранее [6]. Активность фенилаланил-тРНК синтетазы опреде
ляли в реакции аминоацилирования тРНК. Реакционная смесь содер
жала в объеме 50 мкл 50 мМ HEPES, рН 7,8, 100 мМ КС1, 15 мМ
MgCl2, 3 мМ АТФ, 133 мкг суммарной тРНК из печени кролика.,
55,5 мкМ Ь-[14С]фенилаланин. Реакцию вели 15 мин при 37 °С и оста
навливали добавлением 0,5 мл охлажденной 10 %-й трихлоруксусной
кислоты. Осадки отмывали на фильтрах GF/C («Whatman», "Англия),
фильтры высушивали и радиоактивность определяли на счетчике LKB.
Электрофорез белков в 12,5 %-м полиакриламидном геле с 0,1 %-м
DS-Na проводили по методу Леммли [7]. Ультрацентрифугирование
фенил ал анил-тРНК синтетазы в градиенте плотности 15—25 % глице
рина осуществляли в 20 мМ HEPES, рН 7,55, содержавшем 5 мМ MgCl2
и 3 мМ ДТТ при 4 °С в течение 16 ч при 39 000 об/мин (ротор SW-65,
Spinco L5).
Результаты и обсуждение. Нами предложена следующая схема
очистки фенилаланил-тРНК синтетазы: 1) фракционирование полиэти
ленгликолем; 2) хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, 3) хроматография.
на фосфоцеллюлозе.
Печень шести кролей (после двух дней голодания) гомогенизиро
вали в двух объемах 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, содержавшего 5 мМ
MgCl2, 6 мМ ДТТ, 2 мМ ПМСФ, 10 %-й глицерин. К постмитохондрн-
альному супернатанту по каплям прибавляли 50 %-й раствор полиэти-
ленгликоля 6000 в том же буфере, исключая глицерин и ПМСФ, до ко-
© Г. В. Турковская, В. Ф. Шалак, К. В. Семенихин, Б. С. Негруцкий, 1994
24 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 2
нечной концентрации 3 %. При такой концентрации полиэтиленглико-
ля происходило количественное осаждение фракции полирибосом. Оса
док формировали без перемешивания 20 мин, отделяли центрифугиро
ванием и растворяли в 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, содержавшем 5 мМ
MgCl2, 35 мМ КС1, 10%-й глицерин, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА (бу
фер А) при помощи гомогенизатора Поттера. Для отделения фенил-
аланил-тРНК синтетазной активности от рибосом к полученному ра
створу прибавляли 4 М КС1 до конечной концентрации 0,4 М и после
перемешивания в течение 20 мин при 4 °С центрифугировали 2 ч при
1 — оптическая плотность при 280 нм; 2 — фенилаланил-тРНК синтетазная активность;
3 — градиент КС1. На колонку с сорбентом (объем 180 мл) наносили 170 мл раствора
белка с концентрацией 56 мг/мл. Элюцию проводили линейным градиентом КО (объе
мом 700 мл), собирая 3-мл фракции. Активность фермента определяли, как описано
в разделе «Материалы и методы»
Рис. 2. Хроматография препарата фенилаланил-тРНК синтетазы на фосфоцеллюлозе
Р11: 1 — оптическая плотность при 280 нм; 2 — фенилаланил-тРНК синтетазная ак
тивность; 3 — градиент калий-фосфатного буфера. На колонку с сорбентом (объем
15 мл) наносили 210 мл раствора белка. Элюцию проводили линейным градиентом ка
лий-фосфатного буфера (о0ъем 40 мл), собирая фракции по 2 мл
22 000 об/мин (ротор SW-27, Spinco L5) для осаждения полирибосом.
Надосадочную жидкость диализовали в течение ночи против 50 мМ
трис-HCl, рН 7,5, содержавшего 5 мМ MgCl2 и 1 мМ ДТТ, осветляли
центрифугированием и наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой («Re-
anal», Венгрия), уравновешенной буфером А. После промывки этим
же буфером до исчезновения на выходе колонки оптической плотности
при 280 нм связавшиеся с сорбентом белки элюировали линейным гра
диентом концентрации (0,035—0,5 М) КС1 в буфере А, собирая фрак
ции по 3 мл (рис. 1). Фенилаланил-тРНК синтетазную активность оп
ределяли по реакции аминоацилирования. Фракции, содержащие наи
большую активность, объединяли, разбавляли в 5 раз буфером Б
(25 мМ К-фосфатный буфер, рН 6,8, 1 мМ ДТТ, 0,05 мМ ПМСФ, 0,1 мМ
ЭДТА, 10 %-й глицерин) и наносили на колонку с фосфоцеллюлозой
Р11 («Whatman»), уравновешенной буфером Б. Затем промывали дву
мя объемами буфера Б и связавшиеся с колонкой белки элюировали
линейным градиентом К-фосфатного буфера (0,25—0,5 М), собирая
фракции по 2 мл (рис. 2). После определения ферментативной актив
ности по градиенту и электрофореза фракций, содержащих активность,
фракции с максимальной степенью очистки (80—90%) объединяли,
диализовали в течение ночи против 50 мМ HEPES, рН 7,5, и 20 %-го
глицерина и хранили в жидком азоте. Молекулярная масса субъеди
ниц фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика составила, по
данным электрофореза, 68 000 и 74 000, что полностью коррелирует с
аналогичными показателями для фенилаланил-тРНК синтетазы из дру
гих эукариотических источников [1, 3, 4].
При разработке данного метода мы стремились максимально ис
пользовать уже имеющиеся в литературе данные об особенностях фе-
ISSiN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 2 2 5
нилаланил-тРНК синтетазы из высших эукариот. Поскольку значитель
ная часть молекул этого фермента в клетке связана с рибосомами [2],
логично исключить на первом этапе очистки огромную массу клеточ
ных белков, не имеющих сродства к рибосомам. Для этого рибосомную
фракцию осаждали полиэтиленгликолем непосредственно из постмито-
хондриального супернатанта. Непрочно связанные с рибосомами белки,
включая фенилаланил-тРНК синтетазу, были затем смыты с рибосом
0,4 М КС1.
Еще одной особенностью белка, отразившейся на выборе дальней
шего пути очистки, был его слабощелочной заряд. По литературным
данным, изоэлектрическая точка фенилаланил-тРНК синтетазы из выс
ших эукариот находится в области 8,0 [3]. Такой белок должен обла
дать небольшим, но вполне определенным сродством к слабому анионо-
обменнику, например, к ДЭАЭ-целлюлозе. Как выяснилось, фенилала-
нил-тРНК синтетаза связывалась с данным сорбентом, однако элюция
этого фермента происходила при весьма низкой ионной силе (рис. 1),
что и обеспечивало значительную степень очистки (таблица). С другой
стороны, такому белку должно быть присуще существенное сродство
к сильному катионообменнику (фосфоцеллюлозе). Действительно,
при хроматографии на данном носителе фенилаланил-тРНК синтетаза
элюировалась с колонки уже при высоких концентрациях элюэнта
(рис. 2), причем кратность очистки на этом этапе достигала 2138 раз
(таблица).
Следует отметить, что длительное хранение либо повторное размо
раживание— замораживание фермента не приводило к заметному сни
жению его активности, но характеризовалось появлением в геле двух
минорных полос в более низкомолекулярной области. Интересно, что
похожая картина наблюдалась при ограниченном протеолизе фенил-
аланил-тРНК синтетазы из печени овцы [3]. Наличие двух пиков фе-
нилаланил-тРНК синтетазной активности при ультрацентрифугирова
нии такого препарата в градиенте плотности глицерина (данные не при
ведены) позволяет предположить, что данные пептиды являются про
дуктами расщепления исходного белка, не потерявшими ферментатив
ной активности.
В последнее время описано несколько методик выделения фенил-
аланил-тРНК синтетазы из различных источников [3, 4, 6]. Преиму
щества предложенного нами метода заключаются, во-первых, в суще
ственном сокращении (с пяти до трех) количества стадий очистки и,
во-вторых, в исключении являвшихся прежде обязательными процедур
хроматографии на гидроксиапатите, приводивших к значительному сни
жению активности фермента [3]. Поскольку эукариотические амино-
ацил-тРНК синтетазы характеризуются повышенной структурной ла
бильностью [1], сокращение количества стадий очистки должно бла
готворно влиять на нативность полученного препарата, а исключение
хроматографии на гидроксиапатите, в свою очередь, приводить к сохра
нению активности фермента. Немаловажное значение имеет также и
применение в данной методике общедоступных носителей и обычного
хроматографического оборудования.
Очистка фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика
Стадия очистки
Общее
количество
белка, мг
Специфиче
ская актив
ность, ед/мг*
Выход, % Степень
очистки
Постмитохондриальный суперна-
тант 45 000' 0,08 100 1
ПЭГ,, 3 % 9 520 0,3 92 3,7
ДЭАЭ-целлюлоза 90 32,2 80,5 402,5
Фосфоцеллюлоза 3,5 171 16,6 2138
* Специфическую активность определяли как количество фермента, необходимое для
синтеза 1 нмоль фенил ал анил-тРНК за 1 мин при 37 ° С.
26 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 2
Таким образом, нами разработан простой и быстрый метод полу
чения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика, что будет ис
пользовано для изучения роли этого фермента в структурно-функцио
нальных взаимоотношениях компонентов эукариотического аппарата
трансляции.
Работа частично финансировалась Государственным Комитетом по
вопросам науки и технологий (грант 5.2/130)
Г. В. Турковська, В. Ф. Шалак, К. I. Семенихш, Б. С. Негруцький
ЕКСПРЕС-МЕТОД ВИД1ЛЕННЯ
ФЕШЛАЛАШЛ-тРНК СИНТЕТАЗИ 13 ПЕЧ1НКИ КРОЛЯ
Р е з ю м е
Запропоновано швидкии, простий та не потребуючий дорогого обладнання метод одер-
жання фешлалашл-тРНК синтетази i3 печшки кроля. Вш складаеться з трьох стадш
i включае осаджува.ння ,пол!етиленгл1колем постм1тохондр1ального суперяата.нта з на
ступивши хроматограф1ями на ДЕАЕ-целюлоз1 i фосфоцелюлозк
И. V. Turkovskaya, V. F. Shalak, К. V. Semenikhin, В. S. Negrutskii
FAST PROCEDURE FOR ISOLATION
OF PHENYLALANYL-tRNA SYNTHETASE FROM RABBIT LIVER
S и m in а г у
Simple and fast method for isolation of phenylalanyl-tRNA synthetase from rabbit li
ver is proposed. Three-step procedure includes polyethylene glycol precipitation of post-
mitochondrial supernatant with subsequent DEAE-cellulose and phosphocellulose chroma
tographies.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Киселев Л. Л., Фаворова О. О., Лаврик О. И. Биосинтез белков от аминокислот до
аминоацил-тРНК.— М. : Наука, 1984.—С. 10—215.
2. Тscheme J. S., Weinstein I. В., banks К. W. et al. Phenylalanyl-transfer ribonucleic
acid synthetase activity associated with rat liver ribosomes and microsomes // Bio
chemistry.— 1973.— 12, N 20.—P. 3859—3865.
3. Pailiez J.-P., Waller J.-P. Phenylalanyl-tRNA synthetase from sheep liver and yeast//
J. Biol. Chem.—1984.—259, N 24.—P. 15491—15496.
4. Вартанян О. А., Машанов-Голиков А. В., Вольфсон А. Д. и др. Быстрый метод
выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из млекопитающих и получение монокло-
нальных антител к этому ферменту // Молекуляр. биология.— 1990.— 24, № 3.—
С. 788—793.
5. Negrutskii В. S., Deutscher M. P. Channeling of aminoacyl-tRNA for protein synthe
sis in vivo /I Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1991.—88.—P. 4991—4995.
6. Brungraber E. F. A simplified procedure for the preparation of «soluble» RNA from
rat liver//Biochem. and Biophys. Res. Communs.— 1962.— 8, N 1.— P. 1—3.
7. Laemmll V. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4//Nature.—1970.—227, N 5259.—P. 680—685.
8. Ducruix A., Hounwanou N., Reinbolt J. et al. Purification and reversible subunit dis
sociation of overproduced Escherichia coli phenylalanyl-tRNA synthetase//Biochim.
et biophys. acta.—1983.—741.—P. 244—250.
И.Н-Т молекуляр. биологии и генетики АН Украины, 'Киев Получено 18.10.93
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 2 27
|