Матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с А-участком 70S рибосом Escherichia coli в отсутствие транспептидации
Измерены константы ассоциации Phe-тPHK Phe с А-участком 70S рибосом в условиях блокирования ее связывания с P-участком деацилированной тPHK Phe . По зависимости величины константы ассоциации от температуры рассчитаны энтальпия (ΔH° ~ 11 ккал/моль) и энтропия (ΔS 0~–5 кал-моль⁻¹ - град⁻¹) этого взаим...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1989 |
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154971 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с А-участком 70S рибосом Escherichia coli в отсутствие транспептидации / Д.Б. Дорохов, В.Б. Одинцов. С.В. Кириллов // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 60-67. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154971 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Дорохов, Д.В. Одинцов, В.Б. Кириллов, С.В. 2019-06-16T07:30:17Z 2019-06-16T07:30:17Z 1989 Матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с А-участком 70S рибосом Escherichia coli в отсутствие транспептидации / Д.Б. Дорохов, В.Б. Одинцов. С.В. Кириллов // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 60-67. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000C2 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154971 547.963.3 Измерены константы ассоциации Phe-тPHK Phe с А-участком 70S рибосом в условиях блокирования ее связывания с P-участком деацилированной тPHK Phe . По зависимости величины константы ассоциации от температуры рассчитаны энтальпия (ΔH° ~ 11 ккал/моль) и энтропия (ΔS 0~–5 кал-моль⁻¹ - град⁻¹) этого взаимодействия. Константа ассоциации Phe-tPHKPhe, измеренная при 0 °C и блокировании Р-участка нерасщепляемым аналогом пептидил-тРНК, хорошо согласуется с этой зависимостью. Около двух ионов магния прямо или опосредованно принимают участие в матричнозависимом взаимодействии Phe-тPHKPhe с А-участком 70S рибосом. Виміряно константи асоціації Phe-тPHKPhe з А-ділянкою 70S рибосом за умов блокування її зв’язування з P-ділянкою деацильованої тPHKPhe. По залежності величини константи асоціації від температури розраховано ентальпію (ΔH0 ~ 11 ккал /моль) і ентропію (ΔS0 ~ –5 кал ·моль⁻¹·град⁻¹) цієї взаємодії. Константа асоціації Phe-tPHKPhe, виміряна за температури 0 оC і блокування Р-ділянки нерозщеплюваним аналогом пептидил-тРНК, добре узгоджується з цією залежністю. Приблизно два іони магнію прямо або опосередковано беруть участь у матричнозалежній взаємодії Phe-тPHKPhe з А-ділянкою 70S рибосом. The equilibrium binding constants of Phe-tRNAPhe to A-site of Escherichia coli ribosomes were measured when the P-site was initially preoccupied by tRNAphe. The temperature dependence of association constant values has permitted calculating enthalpy (ΔH°~ 11 kcal/mol) and entropy ΔS0 – 5 cal-mol⁻¹-degree⁻¹. Association constant of Phe-tRNAplRJ measured at 0 °C and during blocking of P-site with a unsplittable analog of peptidyl-tRNA is in good agreement with that dependence. Авторы выражают благодарность В.И. Махно за предоставленные препараты рибосом. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с А-участком 70S рибосом Escherichia coli в отсутствие транспептидации Матрицезалежне зв’язування аміноацил-тРНК з А-ділянкою 70S рибосом Escherichia coli за відсутності транспептидації Template-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A-site of Escherichia coli 70S ribosomes in the absence of transpeptidation Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с А-участком 70S рибосом Escherichia coli в отсутствие транспептидации |
| spellingShingle |
Матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с А-участком 70S рибосом Escherichia coli в отсутствие транспептидации Дорохов, Д.В. Одинцов, В.Б. Кириллов, С.В. Структура и функции биополимеров |
| title_short |
Матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с А-участком 70S рибосом Escherichia coli в отсутствие транспептидации |
| title_full |
Матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с А-участком 70S рибосом Escherichia coli в отсутствие транспептидации |
| title_fullStr |
Матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с А-участком 70S рибосом Escherichia coli в отсутствие транспептидации |
| title_full_unstemmed |
Матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с А-участком 70S рибосом Escherichia coli в отсутствие транспептидации |
| title_sort |
матричнозависимое связывание аминоацил-трнк с а-участком 70s рибосом escherichia coli в отсутствие транспептидации |
| author |
Дорохов, Д.В. Одинцов, В.Б. Кириллов, С.В. |
| author_facet |
Дорохов, Д.В. Одинцов, В.Б. Кириллов, С.В. |
| topic |
Структура и функции биополимеров |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| publishDate |
1989 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Матрицезалежне зв’язування аміноацил-тРНК з А-ділянкою 70S рибосом Escherichia coli за відсутності транспептидації Template-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A-site of Escherichia coli 70S ribosomes in the absence of transpeptidation |
| description |
Измерены константы ассоциации Phe-тPHK Phe с А-участком 70S рибосом в условиях блокирования ее связывания с P-участком деацилированной тPHK Phe . По зависимости величины константы ассоциации от температуры рассчитаны энтальпия (ΔH° ~ 11 ккал/моль) и энтропия (ΔS 0~–5 кал-моль⁻¹ - град⁻¹) этого взаимодействия. Константа ассоциации Phe-tPHKPhe, измеренная при 0 °C и блокировании Р-участка нерасщепляемым аналогом пептидил-тРНК, хорошо согласуется с этой зависимостью. Около двух ионов магния прямо или опосредованно принимают участие в матричнозависимом взаимодействии Phe-тPHKPhe с А-участком 70S рибосом.
Виміряно константи асоціації Phe-тPHKPhe з А-ділянкою 70S рибосом за умов блокування її зв’язування з P-ділянкою деацильованої тPHKPhe. По залежності величини константи асоціації від температури розраховано ентальпію (ΔH0 ~ 11 ккал /моль) і ентропію (ΔS0 ~ –5 кал ·моль⁻¹·град⁻¹) цієї взаємодії. Константа асоціації Phe-tPHKPhe, виміряна за температури 0 оC і блокування Р-ділянки нерозщеплюваним аналогом пептидил-тРНК, добре узгоджується з цією залежністю. Приблизно два іони магнію прямо або опосередковано беруть участь у матричнозалежній взаємодії Phe-тPHKPhe з А-ділянкою 70S рибосом.
The equilibrium binding constants of Phe-tRNAPhe to A-site of Escherichia coli ribosomes were measured when the P-site was initially preoccupied by tRNAphe. The temperature dependence of association constant values has permitted calculating enthalpy (ΔH°~ 11 kcal/mol) and entropy ΔS0 – 5 cal-mol⁻¹-degree⁻¹. Association constant of Phe-tRNAplRJ measured at 0 °C and during blocking of P-site with a unsplittable analog of peptidyl-tRNA is in good agreement with that dependence.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154971 |
| citation_txt |
Матричнозависимое связывание аминоацил-тРНК с А-участком 70S рибосом Escherichia coli в отсутствие транспептидации / Д.Б. Дорохов, В.Б. Одинцов. С.В. Кириллов // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 60-67. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT dorohovdv matričnozavisimoesvâzyvanieaminoaciltrnksaučastkom70sribosomescherichiacolivotsutstvietranspeptidacii AT odincovvb matričnozavisimoesvâzyvanieaminoaciltrnksaučastkom70sribosomescherichiacolivotsutstvietranspeptidacii AT kirillovsv matričnozavisimoesvâzyvanieaminoaciltrnksaučastkom70sribosomescherichiacolivotsutstvietranspeptidacii AT dorohovdv matricezaležnezvâzuvannâamínoaciltrnkzadílânkoû70sribosomescherichiacolizavídsutnostítranspeptidacíí AT odincovvb matricezaležnezvâzuvannâamínoaciltrnkzadílânkoû70sribosomescherichiacolizavídsutnostítranspeptidacíí AT kirillovsv matricezaležnezvâzuvannâamínoaciltrnkzadílânkoû70sribosomescherichiacolizavídsutnostítranspeptidacíí AT dorohovdv templatedependentbindingofaminoacyltrnatotheasiteofescherichiacoli70sribosomesintheabsenceoftranspeptidation AT odincovvb templatedependentbindingofaminoacyltrnatotheasiteofescherichiacoli70sribosomesintheabsenceoftranspeptidation AT kirillovsv templatedependentbindingofaminoacyltrnatotheasiteofescherichiacoli70sribosomesintheabsenceoftranspeptidation |
| first_indexed |
2025-11-26T10:18:18Z |
| last_indexed |
2025-11-26T10:18:18Z |
| _version_ |
1850618617552437248 |
| fulltext |
m i d a t e / B . Golcnska, R. Millon, C Backendor i et al. / / Ibid.— 1 9 8 1 1 1 5 , N З,—
P. 479—484.
18. Cross-linking between 16S r ibosomal RNA and protein S4 in Escherichia coli r iboso-
mal 30S subun i t s effected by t r ea tmen t with b i su l f i t e /hydraz ine and b romopyruva t e /
N. Nitta1 0 . Kuge, S. Yui et a l . / / I b i d . — 1986.—157, N 3 , — P . 427—432.
19. Stofjler G., Stofjler-Meilicke M. I m m u n o electron microscopy on Escherichia coli
r i b o s o m e s / / S t r u c t u r e , funct ion, and genet ics of r ibosomes / Eds B. Hardes ty ,
G. K r a m e r . — N e w York: Spr inger , 1986 .—P. 28—46.
20. Ribosome s t ructure , funct ion, and evolut ion: m a p p i n g r ibosomal RNA, proteins, and
func t iona l sites in three d imens ions / M. Oakcs, E. Henderson , A. Sche inman et
a ! . / / I b i d . — P. 47—67.
И н - Т биоорг. химии Сиб. отд-ния АН СССР, Получено 03.05.88
Новосибирск
r R N A - P R O T E I N I N T E R A C T I O N S IN ESCHERICHIA COLI 70S R I B O S O M E S
AND IN C O M P L E X O F INITIATION BY DATA O F C R O S S - L I N K S
W I T H B I F U N C T I O N A L P t ( I I ) D E R I V A T I V E
P. G. Chistnakov, M. Abdukayumov, A. G. Venyaminova, S. N. Vladimirov,
D. M. Graifer, S. A. Kazakov, G. G. Kcirpova
Ins t i tu te of Bioorgan ic Chemist ry ,
Siberian Branch of the Academy of Sciences of the U S S R , Novosibirsk
S u m m a r y
rRNA-prote in cross- l inks in 70S 3 5S-Iabelled r ibosomes in the free s ta te and within ini-
t ia t ion complex r i b o s o m e · A U G U 6 - f M e t - t R N A f M e t were inves t iga ted u s ing b i func t iona l
c leavable r eagen t {dichloro [N 5 N j N r
5 N^tet rakis- (2-aminoethyl ) -1 .6-hexamethylendiamine-
d ip la t inum ( I I ) ]}d ich lor ide . The sets of prote ins cross-l inked to 16S and 23S rRNA in
free 70S r ibosomes and in 70S ini t iat ion complex were shown to s l ight ly differ . It w a s
found tha t one of L7/L12 d imers borders on one of 16S rRNA sites (a d is tance ^ 1 , 5 nm)
both in free r ibosomes and in ini t iat ion complex.
УДК 547.963.3
Д. Б. Дорохов, В. Б. Одинцов. С. В. Кириллов
МАТРИЧНОЗАВИСИМОЕ СВЯЗЫВАНИЕ АМИНОАЦИЛ-тРНК
С А-УЧАСТКОМ 70S РИБОСОМ ESCHERICHIA COLI
В ОТСУТСТВИЕ ТРАНСПЕПТИДАЦИИ
Измерены константы ассоциации Phe-TPHKvhe с А-участком 70S рибосом в условиях
блокирования ее связывания с P-участком деацилированной TPHKphe. Но зависимости
величины константы ассоциации от температуры рассчитаны энтальпия (SH° ~ Jl ккал/
моль) и энтропия (AS0~—5 кал-моль-1 - град-1) этого взаимодействия. Константа ас-
социации Phe-TPHKphe, измеренная при O0C и блокировании Р-участка нерасщепляе-
мым аналогом пептидил-тРНК, хорошо согласуется с этой зависимостью. Около двух
ионов магния прямо или опосредованно принимают участие в матричнозависимом вза-
имодействии Phe-TPHKphe с А-участком 70S рибосом.
Введение. Получение количественных данных о взаимодействии амино-
ацил-тРНК с А-участком рибосомы представляет большой интерес, так
как именно оно обеспечивает, по-видимому, точность отбора очередной
аминокислоты в процессе элонгации и, как следствие, высокую точность
трансляции. Однако до настоящего времени не получено не только срав-
нительных физико-химических характеристик взаимодействия близких
по кодовым свойствам аминоацил-тРНК с А-участком комплекса рибо-
сома— матрица, но и не рассчитаны термодинамические параметры
взаимодействия соответствующей кодону аминоацил-тРНК с А-участ-
ком в условиях равновесия. Трудность состоит в выборе системы для
его измерения.
Ранее было показано, что Phe-TPHKphe обладает большим срод-
ством к Р-участку комплекса [705+поли (U) ], чем к Α-участку, и при
60 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 5 — 9-92 65
повышении концентрации тРНК происходит последовательное запол-
нение сначала P-, а потом А-участков 70S рибосомы с быстрым образо-
ванием diPhe [1—3]. Ясно, что условия неравновесны и исследовать
термодинамику взаимодействия аминоацил-тРНК с Α-участком невоз-
можно. По-видимому, для такого исследования необходимо блокирова-
ние Р-участка лигандом, не дающим возможности системе выходить из
равновесия посредством образования пептидной связи.
Попытка использовать в качестве субстрата Р-участка нерасщеп-
ляемый аналог пептидил-тРНК, а именно АсРЬе-тРНК™-еге<ь которая
из-за особенностей своей структуры неспособна образовывать пептид-
ной связи, не позволила измерить все термодинамические параметры
взаимодействия Phe-τΡΗΚ с Α-участком комплекса [705+поли ( U ) +
+AcPhe-TPHKox-eredb хотя и были получены некоторые физико-хими-
ческие характеристики такого взаимодействия при O0C [4]. Система же
с использованием другого нерасщепляемого аналога иептидил-тРНК,
так называемой амидной тРНК, кажется нам бесперспективной для
этих целей вследствие практически одинакового сродства этой тРНК к
А- и Р-участкам рибосом.
Следует упомянуть еще работу Питере и Яруса, в которой была
предпринята попытка измерения термодинамических параметров связы-
вания аналога аминоацил-тРНК — Phelac-TPHKphe — с А- и Р-участка-
ми 70S рибосомы в отсутствие факторов элонгации [5]. В этой работе
в качестве специфического ингибитора связывания тРНК с Р-участком
рибосомы применяли антибиотик эдеин. В присутствии эдеина авторы
измерили константу диссоциации аминоацил-тРНК с рибосомой, счи-
тая, что связывание тРНК происходит с Α-участком. Однако позже по-
явилась работа, специально посвященная исследованию влияния эдеи-
на на взаимодейстьие тРНК с рибосомой [6], где показано, что эдеин
ингибирует связывание тРНК одновременно на А- и Р-участках рибо-
сомы и, следовательно, не может применяться в качестве ингибитора
толъко Р-участка.
Таким образом, из-за неучтенной специфики действия эдеина при
дискриминации тРНК-связывающих участков рибосомы часть экспери-
ментальных результатов и выводов работы Питере и Яруса вызывает
сомнение. Так, авторы на основании констант диссоциации Phelac-
TPHKp h e приходят к выводу, что сродство аминоацил-тРНК к А- и P-
участкам рибосом практически равно, что, как известно, противоречит
целому ряду экспериментальных результатов [1—3].
В связи с вышесказанным в настоящей работе мы предприняли по-
пытку измерения термодинамических параметров взаимодействия Phe-
TPHKp h e с А-участком 70S рибосом при Р-участке, блокированном деа-
цилированной тРНК.
Материалы и методы. 30S и 50S субчастицы рибосом выделяли из клеток Е. coll
MRE-600 по методике, описанной ранее [3]. Поли (U) фракционировали после щелоч-
ного гидролиза на колонке сефадекса G-100, как описано в [7], и в работе использо-
вали фракцию со средней молекулярной массой около 30000.
Препараты [ 3 H j P h e - T P H K p h e и [ М С] P h e - T P H K p h e после аминоацилирования обо-
гащали па БД-целлюлозе, как описано в [8]. Степень обогащения составляла 1400+
+ 1500 пмолей/ед. A2GO- Равномерно меченную [1 4C] урацилом т Р Н К выделяли из кле-
ток Е. coli AT 2473, дефектных по синтезу урацила [9], и обогащали до содержания
1500 пмолей P h e - T P H K p h e на БД-целлюлозе [8]. После деацилирования при рН 9,0
и 37 °С в течение 1 ч препарат равномерно меченной [ и С ] т Р Н К Р 1 , е трижды переосаж-
дали этанолом, растворяли в воде и хранили в жидком азоте.
Эксперименты по определению количества образованного комплекса между т Р Н К
н рибосомами проводили в стандартном буферном растворе (0,02 M трис, рН 7,4, 0,2 M
NH 4 Cl) . Концентрация ионов магния и температура изменялись от эксперимента к эк-
сперименту. В буфер добавляли ЭДТА и ионы магния при соотношении концентраций
1 ; 0,05. Условия и детали проведения экспериментов даны в подписях к рисункам. Ко-
личество образованного комплекса определяли по радиоактивности, оставшейся после
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 5 — 9-92 65
фильтрации инкубационной смеси через нитроцеллюлозные мембранные фильтры «Syn-
рог» (ЧССР) с диаметром пор 0,4 мкм [10]. Д л я счета двойной радиоактивной метки
3 Н / М С фильтры растворяли в 1 мл ацетона, добавляли 15 мл сцингиллятора и счи-
тали на сцинтилляционном спектрометре «Вескшап» 8501 (США).
Антибиотик тетрациклин («Serva», ФРГ) использовали при его конечной концент-
рации 5 · Ю - 5 М.
Результаты и обсуждение. Для изучения равновесного взаимодей-
ствия аминоацил-тРНК с Α-участком рибосом в отсутствие транспепти-
дации необходимо надежно блокировать ее взаимодействие с Р-сайтом.
При выбранной нами концентрации ионов магния (10 мМ) можно до-
статочно эффективно реализовывать как EF-Tu-зависимое, так и бес-
факторное взаимодействие аминоацил-тРНК с Α-участком рибосом.
В то же время в этих условиях сродство деацилированной т Р Н К к P-
Рис. 1. Изотерма адсорбции [ 1 4 С ] т Р Н К P h е на Р-участке комплекса [ 7 0 S + п о л и ( U ) ] .
Инкубационные смеси различного объема (от 0,1 до 4 мл) содержали в стандартном
буферном растворе при 10 мМ MgCl 2 10 пмолей 70S, 5 мкг поли (U) и 6,3 пмоля
[ 1 4 С ] т Р Н К Р Ь е . Время инкубации 1 ч при 23 °С
Fig. 1. The adsorp t ion isotherm of [ I 4 C ] t R N A P 1 ^ to P-s i te of [ 7 0 S + p o l y ( U ) ] complex.
Incubat ion mix tu res of d i f ferent vo lumes (0.1-4 ml) conta ined 10 pmol of 70S, 5 μ £ of
po ly (U) and 6.3 pmol of [ 1 4 C ] t R N A P h e in s t a n d a r d buf fe r solut ion (with 10 m M MgCl 2 ) .
The incubat ion t ime w a s 1 h at 23 °С
Рис. 2. Кинетики ассоциации и диссоциации [ 3 H ] P h e - T P H K p h e на А-участке 70S ри-
босомы при 17 °С. Инкубационная смесь объемом 0,1 мл в стандартном буферном
растворе при 10 мМ MgCl 2 содержала 6 пмолей 70S, 3 мкг поли (U) , 20 пмолей
[ 1 4 C ] T P H K p h e , 24 пмоля [ 3 H ] P h e - T P H K p h e ( / ) и 50 пмолей немеченой P h e - T P H K p h e
(2). Д л я изотопного разбавления в инкубационную смесь добавляли 50 пмолей неме-
ченой P h e - T P H K p h e после 1 ч инкубации (3). Значение ν для [ 1 4 C ] T P H K p h e (4) конт-
ролировали во всех случаях и обозначали соответствующими открытами символами
Fig. 2. Kinetics of associa t ion and dissociat ion of [ 3 H] P h e - t R N A P h e to Α-site of 70S
r ibosome at 17 °С. The incubat ion mixture in a vo lume of 0.1 ml in s t a n d a r d buffer so-
lution (with 10 m M MgCl 2 ) conta ined 6 pmol of 70S, 3 u g of p o l y ( U ) , 20 pmol of
[ 1 4 C ] t R N A P h e , 24 pmol of [ 3 H] P h e - t R N A P h e (J) and 50 pmol of unlabel led P h e - I R N A p h e
(2). Af t e r 1 h of incubat ion for isotopic di lut ion 50 pmol of unlabel led P h e - t R N A p h e
was added in the incubat ion mix ture (3). The ν va lue for [1 4C] t R N A P h e (4) w a s cont-
rolled in all the cases and marked with cor respond ing symbols
участку как минимум на порядок выше [8], что является залогом на-
дежного экранирования Р-участка деацилированной тРНК.
На рис. 1 представлена изотерма адсорбции [ 1 4 С]тРНК Р Ь е на Р-уча-
стке комплекса [70S + поли (U) ]. Измерения проводили методом пере-
менного объема [4]. Определенная из этого эксперимента величина
константы ассоциации (6-108 M - 1 ) хорошо согласуется с величинами,
полученными ранее [8] для данных условий эксперимента. Антибиотик
тетрациклин, специфический ингибитор Α-участка, на это взаимодей-
ствие не влиял. Доля [14C] TPHKp h e , активной во взаимодействии с P-
участком рибосом, определенная из этрго эксперимента, составила 57 %
и учитывалась в дальнейшем.
Зная долю активной т Р Н К и равновесную константу ассоциации,
мы можем создать такую ее концентрацию, что величина ν (среднее ко-
62 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1 (JS9. Т. 5. Ліь 3
личество молекул т Р Н К на рибосому) будет равна I. Если для деаци-
лированной т Р Н К v ^ l , то связывание аминоацил-тРНК будет проис-
ходить только с А-участком. Это может отразиться на доле рибосом,
активных в связывании аминоацил-тРНК, но не на величине констан-
ты. Если же для деацилированной т Р Н К ν < 1 , то связывание амино-
ацил-тРНК будет происходить с вакантными P- и Α-участками рибо-
сом, что скажется не только на доле активных рибосом, но и на вели-
чине константы ассоциации аминоацил-тРНК.
Все дальнейшие эксперименты проводили в две стадии.
]. Формировали комплекс [ 7 0 5 + п о л и (U) ] и к нему добавляли
[ 1 4 C]TPHK p h e в количестве, необходимом для связывания только одной
(или чуть более) молекулы т Р Н К И инкубировали в течение 1 ч. При
этом реализуется связывание только с Р-участком. В течение этого вре-
мени достигается равновесие [8].
Рис. 3. Изотерма адсорбции [ 3 H] P h e - T P H K p h e на Α-участке комплекса [ 7 0 S + n o -
л и ( и ) + [ 1 4 C ] T P H K p h e ] при различных температурах представлена в виде зависимости
l / β от 1 / г : 1—25; 2—17; 3—11°С. Инкубационные смеси объемом 0,1 мл при указан-
ной температуре в стандартном буферном растворе при 10 мМ MgCI 2 содержали
5,1 пмоля Г3Н] P h e - T P H K p h e и переменное количество комплекса [ 7 0 Б + п о л и (U) +
+ [1 4C] T P H K p h e ] (концентрация комплекса в пробе (0,8—3,3) · IO7 M - 1 ) . Время инку-
бации 3 ч
Fig. 3. The adsorp t ion i so therms of [ 3 H ] P h e - t R N A P h e to Α-site of [ 7 0 S + p o l y ( U ) +
+ [1 4C] t R N A p h e ] complex at d i f ferent t empera tu res w a s presented as l / β vs 1/r plot:
1—25; 2—17; 3—11°C. The incubat ion mix tures in vo lume of 0.1 ml in the s t a n d a r d
buf fe r (with 10 m M MgCl 2 ) at the co r respond ing t empera tu re conta ined 5.1 pmol
[ 3 H ] P h e - t R N A P h c and var iab le a m o u n t of [ 7 0 S + p o l y (U) + [ 1 4 C ] t R N A P h e ] complex con-
cent ra t ion (0.8 to 3.3· IO7 M - 1 ) . The incubat ion t ime is 3 h
Рис. 4. Зависимость Вант-Гоффа для P h e - T P H K p h e на Α-участке комплекса [ 7 0 S + п о -
ли ( U ) + T P H K p h e ] при 10 мМ MgCI2 . Показаны значения константы ассоциации, рас-
считанные на основании результатов экспериментов, проведенных различными метода-
ми: 1 — из зависимости l / β от 1/г; 2 — из зависимости 1/v от 1/С; 3 — К А « при 0°С,
определенная экстраполяцией
Fig . 4. Vant -Hof f plot for b ind ing of P h e - t R N A P h e to Α-site of [7-OS+poly (U) +
+ t R N A p h e ] complex at 10 m M MgCl 2 . Associat ion cons tan t va lues calcula ted on the ba-
sis_of resu l t s f rom exper iments carried out by d i f ferent me thods are shown: 1 — f rom
l / β vs 1 / r plot; 2 — f r o m \/v vs 1/C plot; 3 — KA
a at 0 ° C determined by ex t rapo la t ion
Рис. 5. Изотермы адсорбции [ 3 H ] P h e - T P H K p h e на Α-участке комплекса [ 7 0 S + n o -
л и ( U ) + [ 1 4 C ] T P H K p h e ] при различных концентрациях ионов магния: /—20; 2—18; З—
14; 4—10 мМ. Инкубационные смеси объемом 0,1 мл при 24 °С в стандартном буфер-
ном растворе при различных концентрациях MgCl 2 содержали 10 пмолей 70S, 5 мкг
поли (U), переменное количество [ 3 H ] P h e - T P H K p h e и в зависимости от концентрации
MgCl 2 различное количество [ 1 4 C ] T P H K p h e : 18 пмолей при 20, 20 пмолей при 18,
25 пмолей при 14 и 30 пмолей при 10 мМ MgCl 2 . Время инкубации после внесения
[ 3 H ] P h e - T P H K p h e 3 ч
Fig. 5. The adsorp t ion isotherm of [ 3 H ] P h e - t R N A P h e to Α-site of [ 7 0 S + p o l y (U) +
+ [ 1 4 C ] t R N A P h e ] complex wi th d i f ferent concen t ra t ions of m a g n e s i u m ions: 1—20; 2—18;
5—14; 4—10 mM. Incubat ion mix tures in a vo lume of 0.1 ml at 24 °С in s t a n d a r d bu f f e r
solut ion with d i f ferent MgCl 2 concent ra t ions conta ined 10 pmol of 70S, 5 μ £ of p o l y ( U ) ,
var iable quant i ty of [ 3 H] P h e - t R N A p h e and dependence of d i f ferent quan t i ty of
[ 1 4 C ] t R N A p h e on MgCl 2 concent ra t ion; 18 pmol at 20 m M MgCl 2 ; 25 pmol at 14 m M
MgCl2 ; 30 pmol at 10 m M MgCl 2 . The incubat ion t ime a f t e r addi t ion of [ 3 H ] P ' h e - t R N A P h e
was 3 h
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 5 — 9-92 65
2. После формирования комплекса [705+поли ( U ) + T P H K p h e ] в
инкубационную смесь вносили [3H] Phe-TPHKphe и изучали взаимодей-
ствие с рибосомами.
На рис 2 приведены результаты измерения кинетик взаимодейст-
вия Phe-TPHKphe с комплексом [708+ПОЛИ ( U ) + [14C] TPHKp h e] . Это
взаимодействие обратимо, так как при изотопном разбавлении
[3H] Phe-TPHKphe немеченой Phe-TPHKphe уровень конечного связыва-
ния при прямой (ассоциация) и
Величины констант ассоциации Phe-TPHKphe
с Α-участком комплекса \705>-\-поли(и)-{-
+TPHKphe] при 10 мМ MgCl2 и различных
температурах
Values of association constant of Phe-tRNAPhe
with Α-site of the [70S+poly [U) -\-tRNAphe]
complex at 10 mM MgCl2 and different
temperatures
Ka-ΙΟ"7 M--1
Метод
измерения
Метод
измерения
11 °С 17 °С 25 °С
4 , 6 + 0 , 7 2 , 2 + 0 , 4 1 , 7 + 0 , 2
5 , 0 + 0 , 6 2 , 6 + 0 , 3 1 , 7 + 0 , 2
l /β от 1 I r
1/v от 1IC
обратной (изотопный обмен) ре-
акции стремится к одной и той
же величине (рис. 2, кривые 2 и
3). Следует отметить также, что
процесс связывания аминоацил-
тРНК медленный (около 3 ч).
На протяжении всего экспери-
мента уровень связывания деа-
цилированной [14C] TPHKp h^ ос-
тается постоянным (ν = 1)
(рис. 2, кривая 4). Более того,
тетрациклин в концентрации 5 Х
X 1 0 - 5 M полностью ингибирует
взаимодействие Phe-TPHKphe с
комплексом [705+поли (U) +
+ [ 1 4 С ] т Р Н К Р Ь е ] . Таким обра-
зом, мы имеем дело с обрати-
мым взаимодействием Phe-TPHKphe с Α-участком комплекса [70S+
+ п о л и (U) + [1 4C]TPHKp h e] .
Изотермы адсорбции Phe-TPHKphe на Α-участке комплекса [70S +
+ п о л и ( U ) + [1 4С]тРНКР Ь е] были исследованы методом, сходным с ме-
тодом переменного объема. Фиксированное количество [3H] Phe-
TPHKp h e титровали увеличивающимися концентрациями комплекса
[705 + поли (U) + [ 1 4 C ] TPHKp h e] , при этом следили за долей связанной
деацилированной тРНК, величина ν для которой не менялась и была
равна 1. Результаты приведены в виде зависимости l / β от 1 / г на рис. 3
(β — доля связанной Phe-TPHKphe, г — концентрация свободного комп-
лекса [705+поли ( U ) + T P H K p h e ] ) и на их основании показано, что до-
ля Phe-TPHKphe , активной в связывании с Α-участком рибосом, состав-
ляет 74 % (в дальнейшем это учитывалось при расчете константы ас-
социации Phe-TPHKphe с Α-участком комплекса). Величины констант
приведены в таблице.
Константа ассоциации при равновесии не должна зависеть от того,
что мы в конкретном эксперименте считали сорбентом, а что — сорба-
том. Другими словами, если мы снимем зависимость ν (средняя доля
Α-участков, занятых Phe-TPHKphe) от С (концентрация свободной
Phe-TPHKp h e) , величины констант должны совпадать. Действительно,
когда фиксированное количество комплекса [705+поли (U) +
+ [ 1 4С]тРНКР Ь е] (величина 7 для [ 1 4 С ] т Р Н К Р П е = 1,1±0,1) титровали
увеличивающимися концентрациями [3H] Phe-TPHKphe, величины кон-
стант ассоциации Phe-TPHKphe с Α-участком комплекса, рассчитанные
из изотерм адсорбции Ленгмюра, в пределах ошибки совпали с полу-
ченными ранее, и их величины также приведены в таблице.
Таким образом, нам удалось измерить величины констант ассоци-
ации аминоацил-тРНК с А-участком рибосом в отсутствие транспепти-
дации при различных температурах.
Зная зависимость величины констант ассоциации от температуры,
можно рассчитать термодинамические параметры взаимодействия со-
гласно уравнениям:
d In КЇ
где AG0 изменение стандартной свободной энергии; R — универсаль-
64 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 5 — 9-92 65
ная газовая постоянная; T—абсолютная температура; К л
а — констан-
та ассоциации Phe-TPHKphe с А-участком рибосом; А#°, AS0 — соот-
ветственно изменения энтальпии и энтропии.
На рис. 4 представлена зависимость Ig КА
а от 1 / Т для взаимодей-
ствия Phe-TPHKphe с А-участком комплекса [705+поли (U) + T P H K p h e ] .
Рассчитанная величина КАа Ю -8 M - 1 практически совпадает с величи-
ной константы ассоциации, измеренной в экспериментальной системе,
где в качестве лиганда Р-участка использовали нерасщепляемый ана-
лог пептидил-тРНК, AcPhe-TPHKoxered [4]. Такое совпадение свиде-
тельствует о том, что термодинамические пара-
метры взаимодействия Phe-TPHKphe с А-участ-
ком рибосом ( Δ # ° = 1 1 ± 3 ккал/моль; AS0 =
Рис. 6. Зависимость lg/CA
a для связывания P h e - T P H K p h e
на А-участке комплекса [ 7 0 5 + п о л и (U) + T P H K p h e ] от
l g [ M g 2 + ] . Построена на основании экспериментальных дан-
ных, представленных на рис. 5
Fig . 6. The Ig К л а vs Ig M g 2 + plot for b ind ing of Phe-
t R N A P h e to Α-site of | 7 0 S + p o l y ( U ) + t R N A P h e ] complex
w a s cons t ruc ted on the basis of exper imenta l da ta f rom
Fig . 5
= — ( 5 + 0 , 5 кал -моль - 1 · град - 1 ) , рассчитанные из экспериментов в дан-
ной системе, можно, по-видимому, перенести в экспериментальную сис-
тему, где участок блокируется аналогом пептидил-тРНК.
Важной характеристикой взаимодействия тРНК с участком рибо-
сом является количество ионов магния, прямо или опосредованно при-
нимающих участие в этом взаимодействии. Для прояснения этого воп-
роса мы сняли изотермы адсорбции Phe-TPHKphe с комплексом [70S+
+поли (U)+TPHK p h e ] при постоянной температуре и различных кон-
центрациях ионов магния. Рассчитанные из них константы поли (U)-за-
висимой ассоциации Phe-TPHKphe с А-участком 70S рибосом при раз-
личных концентрациях соли и t0 24 °С представлены ниже:
[Mg 2 +], мМ 10 14 18 20
/С£ · Ю - 7 , M - 1 . 1 ,6+0,2 3 , 2 ± 0 , 4 5 ± 0 , 5 7 , 2 ± 0 , 7
Изотермы адсорбции получали титрованием фиксированного количест-
ва комплекса [70Б+поли (U) + [14C] TPHKphe] различным количеством
[3HJPhe-TPHKp h e . Рис. 5 иллюстрирует зависимости 1/v от 1 /С. Уро-
вень связывания [14C] радиоактивности оставался постоянным во время
всего эксперимента ( v = l ) .
На рис. 6 приведена логарифмическая зависимость констант ассо-
циации от логарифма концентрации ионов магния. Она линейна и под-
чиняется уравнению: Alg ΚΑ
α = ηΔ lg[Mg2+].
В этом случае величина может быть интерпретирована как коли-
чество ионов магния, прямо или опосредованно участвующих во вза-
имодействии [8, 11, 12]. Величина η в данном случае составляет 2 ,1±
±0,2 , а линейность зависимости позволяет находить экстраполяцией
величины констант ассоциации в областях концентраций ионов Mg2+,
где прямые измерения затруднены из-за очень высокого или очень низ-
кого сродства Phe-TPHKphe к А-участку 70S рибосом. Отсутствие от-
клонения зависимости от прямой свидетельствует о том, что концентра-
ция ионов [Mg2+] имеет чисто количественное влияние на величину
константы ассоциации.
Таким образом, используя деап^лированную тРНК в качестве ин-
гибитора связывания аминоацил-тРНК на Р-участке, нам удалось оп-
ределить термодинамические параметры взаимодействия аминоацил-
тРНК и показать, что, по-видимому, и при ингибировании связывания
аминоацил-тРНК на Р-участке нерасщепляемым аналогом пептидил-
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 5 — 9-92 65
Изотермы адсорбции получали титрованием фиксированного количест-
ва комплекса [708+поли (U) + [14C] TPHKphe] различным количеством
[3H]Phe-TPHKp h e . Рис. 5 иллюстрирует зависимости 1/v от 1 /С. Уро-
вень связывания [14C] радиоактивности оставался постоянным во время
всего эксперимента ( v = l ) .
На рис. 6 приведена логарифмическая зависимость констант ассо-
циации от логарифма концентрации ионов магния. Она линейна и под-
чиняется уравнению: Alg ΚΑ
α = ηΔ lg[Mg2+].
В этом случае величина может быть интерпретирована как коли-
чество ионов магния, прямо или опосредованно участвующих во вза-
имодействии [8, 11, 12]. Величина η в данном случае составляет 2 ,1±
±0,2 , а линейность зависимости позволяет находить экстраполяцией
величины констант ассоциации в областях концентраций ионов Mg2+,
где прямые измерения затруднены из-за очень высокого или очень низ-
кого сродства Phe-TPHKphe к А-участку 70S рибосом. Отсутствие от-
клонения зависимости от прямой свидетельствует о том, что концентра-
ция ионов [Mg2+] имеет чисто количественное влияние на величину
константы ассоциации.
Таким образом, используя деаи^лированную тРНК в качестве ин-
гибитора связывания аминоацил-тРНК на Р-участке, нам удалось оп-
ределить термодинамические параметры взаимодействия аминоацил-
тРНК и показать, что, по-видимому, и при ингибировании связывания
аминоацил-тРНК на Р-участке нерасщепляемым аналогом пептидил-
тРНК эти параметры должны быть близки. При взаимодействии ами-
коацил-тРНК с А-участком 70S рибосом принимают участие два иона
магния, прямо и опосредованно. Этим взаимодействие аминоацил-тРНК
с А-участком 70S рибосом отличается от такового с малой 30S суб-
частйцей, которое практически не зависит от ионов Mg2+ [12] и от вза-
имодействия аминоацил-тРНК с Р-участком [705+поли (U)]-комплек-
са, сильно зависящего от [Mg2+] [8].
Авторы выражают благодарность В. И. Махно за предоставлен-
ные препараты рибосом.
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Механизм кодон-антикодонового взаимодействия в рибосомах. Взаимодействие
а м и н о а ц и л - т Р Н К с 70S рибосомами Escherichia coli в отсутствие ф а к т о р а элонга-
ции EF-Tu и Γ Τ Φ / К. Ш. Кемхадзе , В. Б. Одинцов, В. И. М а х н о и др. / / Молеку-
ляр. биология.— 1981.—15, № 4 . — С . 779—789.
2. Mechanism of c o d o n - a n t i c o d o n in te rac t ion in r ibosomes . C o d o n - a n t i c o d o n in te rac t ion
of a m i n o a c v l - t R N A at the r ibosomal donor si te / S. V. Kiri l lov, K- Sh. K c m k h a d z e ,
Ε. M. MakaVov et a l . / / F E B S Let t .— 1980.—120, N 4 . — P . 221—224.
3. Kirillov S. V., Makhno V. I., Seinenkov Yu. P. M e c h a n i s m of c o d o n - a n t i c o d o n inte-
rac t ion in r ibosomes . Direct f unc t iona l evidence t h a t i so la ted 30S s u b u n i t s con t a in
t w o codon-spec i f ic b i n d i n g s i tes for t r a n s f e r R N A / / N u c l . Acids Res .— 1980.—8,
N 1 . — P . 183—196.
4. Quantitative s t udy of the in te rac t ion of a m i n o a c y l - t R N A with the Α-si te of Esche-
richia coli r ibosomes . Equi l ib r ium and kinet ics p a r a m e t e r s of b i n d i n g in the absence
of EF-Tu f ac to r and G T P / K. Sh. Kemkhadze , V. B. Od in t sov , V. I. M a k h n o et a l . / /
F E B S Lett — 1981,—125, N 1 , — P . 10—14.
5. Peters M., Yarus M. T r a n s f e r R N A select ion at the r ibosomal A and P si tes / / J .
Мої. Biol .— 1979.—134, N 3 , — P . 471—491.
6. Особенности влияния антибиотика эдеина на взаимодействие т Р Н К с участием А,
P и E 70S рибосом Escherichia coli/ Ю. П. Семенков, В. И. Махно , Ε. М. М а к а -
ров, С. В. К и р и л л о в / / М о л е к у л я р . б и о л о г и я — 1984—18, № 5 . — С . 1348—1351.
7. Comparative s t u d y of the in te rac t ion of po lyur idy l ic acid wi th 30S s u b u n i t s and 70S
r ibosomes of Escherichia coli / V. I. Ka tun in , Yu. P . Semenkov , V. I. M a k h n o , S. V. Ki-
r i l l o v / / N u c l . Acids Res.— 1980.—8, N 2 . — P . 403—421.
8. Семенков Ю. П., Макаров Ε. M., Кириллов С. В. Количественное изучение взаимо-
действия деацилированной т Р Н К с P- , А- и Е-сайтами 70S рибосомы Escherichia
coli / / Биополимеры и клетка .— 1985.—1, JVb 4 , — С . 183—193.
9. Grajevskaya R. A., Ivanov Yu. VSaminsky Ε. М. 70S r ibosomes of Escherichia coli
have an add i t i ona l site fo r deacy la ted t R N A b i n d i n g / / Eur . J . Biochem.— 1982.—128,
N 1 . — P . 47—52.
10. The mechanism of c o d o n - a n t i c o d o n in te rac t ion in r ibosomes . H e t e r o g e n e i t y of t R N A
complexes wi th 70S r ibosomes of Escherichia coli / S. V. Kiri l lov, V. I. M a k h n o ,
V. B. Odinzov , Yu. P. S e m e n k o v 11 Ibid.— 1978.—89, N 3 . — P . 305—313.
11. Кириллов С. В. Механизм кодон-антикодонового взаимодействия в р и б о с о м а х / /
Итоги науки и т е х н и к и . — М . : В И Н И Т И , 1983.—С. 5—98.— (Биол. химия; Т. 18).
12. Как участки с в я з ы в а н и я рибосомы различают функциональные ф о р м ы т Р Н К ? /
Ε. М. М а к а р о в , В. И. Катунин, В. Б. Одинцов и д р . / / М о л е к у л я р . биология.—
1 9 8 4 . - 1 8 , № 5 . — С . 1342—1347.
Ленингр . ин-т ядер, физики
им. Б. П. Константинова А Н С С С Р , Гатчина
Ин-т эколог, генетики А Н М С С Р , Кишинев
Получено 12.01.88
T E M P L A T E - D E P E N D E N T B I N D I N G O F A M I N O A C Y L - t R N A
T O T H E A - S I T E O F ESCHERICHIA COLI 70S R I B O S O M E S
IN T H E A B S E N C E O F T R A N S P E P T I D A T I O N
D. B. Dorokhovt V. B. Odintsov, S. V. Kirillov
B. P . K o n s t a n t i n o v Nuc lea r P h y s i c s Ins t i tu te ,
A c a d e m y of Sciences of the U S S R , L e n i n g r a d , Ga t ch ina
I n s t i t u t e of Eco log ica l Genet ics ,
Academy of Sciences of the M o l d a v i a n SSR, Kishinev
S u m m a r y
The equi l ibr ium b i n d i n g c o n s t a n t s of P h e - t R N A P h e to Α-s i te of Escherichia coli r iboso-
mes were m e a s u r e d w h e n the P - s i t e w a s ini t ia l ly preoccupied by t R N A P h e . The t e m p e r a -
t u r e dependence of a s soc ia t ion c o n s t a n t v a l u e s h a s pe rmi t t ed c a l c u l a t i n g e n t h a l p y
66 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Τ. 5. № З
( Л / / ° ~ 11 kca l /mol ) and entropy Δ5° 5 c a l - m o l " 1 - deg ree - 1 . Associa t ion cons t an t of
Phe-IRNA r l K " measured al O0C and du r ing blocking of P-s i te with a unsp l i t t ab le ana-
log of pept idyl - tRNA is in good agreement with tha t dependence.
УДК 577.217:337.32
JL JI. Иванов, 3. П. Мартинкус, Р. Р. Стапуленис, JI. Ю. Лукошявичюс,
А. В. Лекис
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕЙЦИЛ-тРНК СИНТЕТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ
В БЕЗРИБОСОМНЫХ ЭКСТРАКТАХ ПЕЧЕНИ КРОЛИКА
И МИОКАРДА СВИНЬИ
Изучено распределение лейцил-тРНК синтетазной активности в безрибосомных экстрак-
тах печени кролика и миокарда свиньи. IIpu ишемии миокарда в обоих исследованных
экстрактах отмечено частичное перераспределение активности этого фермента между
фракциями различной молекулярной массы. Высказывается предположение о том, что
процессы ассоциации — диссоциации аминоацил-тРНК синтетаз могут участвовать в ре-
гуляции скорости белкового синтеза в эукариотических клетках.
Введение. Известно, что эукариотические аминоацил-тРНК синтетазы
(АРСазы) в отличие от прокариотических ферментов функционируют в
составе высокомолекулярных комплексов [1, 2], образуют ассоциаты с
рибосомами и микросомами [3—5], обладают высоким сродством к вы-
сокомолекулярной РНК [3—6]. Предполагается, что эти эволюционно
приобретенные свойства АРСаз необходимы для их частичной компарт-
ментализации в клетке в местах функционирования [4, 5]. Кроме того,
в последние годы установлено, что при некоторых физиологических и
патологических изменениях в организме, приводящих к нарушению био-
синтеза белка, имеет место разнонаправленное перераспределение
АРСаз между комплексами различной молекулярной массы либо меж-
ду комплексами и фракцией свободных ферментов [7—12].
В данной работе проведено изучение распределения лейцил-тРНК
синтетазной активности в безрибосомных экстрактах печени кролика и
миокарда свиньи в норме и на модели нарушения биосинтеза белка —
экспериментальном инфаркте миокарда кролика (ЭИМ) и тотальной
ишемии миокарда свиньи, которые, как мы установили ранее, сопро-
вождаются изменением активности компонентов аппарата трансляции
[13—15].
Материалы и методы. Методики воспроизведения Э И М у кролика и тотальной
ишемии миокарда свиньи описаны в работах [14, 16].
П о л у ч е н и е б е з р и б о с о м н ы х э к с т р а к т о в . Ткань печени либо мио-
карда гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе в двух объемах буфера А
(20 мМ трис-HCl, рН 7,5, ЗО мМ KCl, 2 мМ MgCl 2 , 250 мМ сахароза , 0,1 мМ дитио-
треитол, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид) . Гомогенат центрифугировали 15 мин
при 27000 g и 90 мин при 105000 g и отбирали надосадочную жидкость (безрибосом-
пый экстракт) .
Х р о м а т о г р а ф и я н а с е ф а р о з е 6 В. 4 мл безрибосомного экстракта на-
носили на колонку с сефарозой 6В («Pharmacia Fine Chemicals», Швеция) ( 1 6 Х
Х 7 5 0 мм) , уравновешенную буфером А. Элюцию проводили тем ж е буфером. Объем
фракций — 3 мл, скорость элюции 10 мл/ч .
Молекулярную массу полученных белковых фракций определяли по калибровоч-
ной кривой, используя маркеры со следующей молекулярной массой: альдолаза —
158000, ката лаза — 232000, ферритин — 440000, тироглобулин — 669000, декстран голу-
бой — 2000000.
Активность лейцил-тРНК синтетазы (лейРС) определяли по начальной скорости
реакции аминоацилирования т Р Н К при насыщающих концентрациях субстратов. Реак -
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 3 5 — 9-92 65
|