Оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов - мембранные переносчики для введения peакционноспособных производных олигонуклеотидов в клетки
Изучение действия алкилирующих производных олигонуклеотидов затруднено вследствие их низкой проницаемости через клеточные мембраны. В работе предложено использовать для доставки олигонуклеотидных производных в клетку реконструированные оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов. Разработаны быстрые м...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1989 |
| Main Authors: | , , , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155021 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов - мембранные переносчики для введения peакционноспособных производных олигонуклеотидов в клетки / В.В. Власов, Ε.М. Иванова, Ю.Д. Кренделев, И.В. Кутявин, Μ.Н. Овандер, А.С. Райт, Ф.П. Свинарчук, Л.А. Якубов // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 4. — С. 52-58. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859632329880764416 |
|---|---|
| author | Власов, В.В. Иванова, Е.М. Кренделев, Ю.Д. Кутявин, И.В. Овандер, М.Н. Райт, А.С. Свинарчук, Ф.П. Якубов, Л.А. |
| author_facet | Власов, В.В. Иванова, Е.М. Кренделев, Ю.Д. Кутявин, И.В. Овандер, М.Н. Райт, А.С. Свинарчук, Ф.П. Якубов, Л.А. |
| citation_txt | Оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов - мембранные переносчики для введения peакционноспособных производных олигонуклеотидов в клетки / В.В. Власов, Ε.М. Иванова, Ю.Д. Кренделев, И.В. Кутявин, Μ.Н. Овандер, А.С. Райт, Ф.П. Свинарчук, Л.А. Якубов // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 4. — С. 52-58. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Изучение действия алкилирующих производных олигонуклеотидов затруднено вследствие их низкой проницаемости через клеточные мембраны. В работе предложено использовать для доставки олигонуклеотидных производных в клетку реконструированные оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов. Разработаны быстрые методы заключения олигонуклеотидных производных в мембранные везикулы, позволяющие сохранить химические свойства активных группировок. Для реагентов, заключенных в переносчики, при меньших концентрациях производных в среде достигаются степени алкилирования поли(А)⁺РНК в 10–100 раз большие, чем при простом добавлении олигонуклеотидных производных в клеточную суспензию.
Вивчення дії алкілувальних похідних олігонуклеотидів ускладнено внаслідок їхньої низької проникності через клітинні мембрани. Запропоновано використовувати для доставки олігонуклеотидних похідних у клітину реконструйовані оболонки вірусу Сендай і тіні еритроцитів. Розроблено швидкі методи введення олігонуклеотидних похідних у мембранні везикули, що дозволяє зберегти хімічні властивості активних угруповань. Для реагентів, вміщених у переносники, при менших концентраціях похідних у середовищі досягаються ступені алкілування полі(А)⁺ РНК у 10–100 разів більші, ніж при простому додаванні олігонуклеотидних похідних у клітинну суспензію.
Poor penetration of oligonucleotide derivatives through mammalian cell membranes interferes with their action as inhibitors of cellular nucleic acid functions. This difficulty can be overcome using reconstituted Sendai virus envelopes and erythrocyte ghosts as membrane carriers of the oligonucleotide derivatives. Fast methods for incorporation of reactive oligonucleotide derivatives into membrane carriers have been developed. In the model experiments membrane carriers incorporating alkylating oligothymidylate derivatives are delivered into ascite carcinoma Krebs 2 cells and it is shown that they are transfered efficiently into cytosol and react with complementary poly (A)⁺ sequences of cellular RNAs. Efficiency of delivery of oligonucleotide reagents into cells 10—100 times increases when using the membrane vehicles.
|
| first_indexed | 2025-12-07T13:12:04Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 577.352.32
В. В. Власов, Ε. М. Иванова, Ю. Д. Кренделев, И. В. Кутявин,
Μ. Н. Овандер, А. С. Райт, Ф. П. Свинарчук, Л. А. Якубов
ОБОЛОЧКИ ВИРУСА СЕНДАЙ И ТЕНИ ЭРИТРОЦИТОВ -
МЕМБРАННЫЕ ПЕРЕНОСЧИКИ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ
PEАКЦИОННОСПОСОБНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В КЛЕТКИ
Изучение действия алкилирующих производных олигонуклеотидов затруднено вслед-
ствие их низкой проницаемости через клеточные мембраны. В работе предложено ис-
пользовать для доставки олигонуклеотидных производных в клетку реконструирован-
ные оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов. Разработаны быстрые методы заклю-
чения олигонуклеотидных производных в мембранные везикулы, позволяющие сохра-
нить химические свойства активных группировок. Для реагентов, заключенных в пере-
носчики, при меньших концентрациях производных в среде достигаются степени алки-
лирования поли(А)+РНК в 10—100 раз большие, чем при простом добавлении олиго-
нуклеотидных производных в клеточную суспензию.
Введение. Полученные в последнее время данные о возможности подав-
ления олигопуклеотидами и их производными размножения вирусов и
трансляции определенных м Р Н К свидетельствуют о перспективности
таких производных, как биологически активных веществ широкого
спектра действия. Применение реакционноспособных производных оли-
гонуклеотидов представляет особый интерес, поскольку они, во-первых,
могут эффективно инактивировать нуклеиновые кислоты за счет кова-
лентного присоединения к комплементарным нуклеотидным последова-
тельностям и, во-вторых, использование относящихся к ним аффинных
реагентов открывает возможность для детального изучения процессов
взаимодействия олигонуклеотидов с клеткой: механизма транспорта в
клетку и взаимодействия с клеточными биополимерами. Рапсе было по-
казано, что олигонуклеотиды и их производные захватываются клетка-
ми но механизму эндоцитоза, и эффективность этого процесса невелика
[1]. Одним из подходов к увеличению эффективности доставки олиго-
нуклеотидных производных в клетки может явиться использование мем-
бранных переносчиков: реконструированных оболочек вируса Сепдай
(POBC) и теней эритроцитов. Вещества, упакованные в мембранные
везикулы, при слиянии мембран клеток доставляются непосредственно
в клеточный цитозоль [2]. Описанные методы заключения веществ в
мембранные переносчики неприменимы для экспериментов с реакциои-
носпособными производными олигонуклеотидов, такими как алкилиру-
ющие производные, поскольку в соответствии с этими методами заклю-
чаемые вещества длительное время инкубируются в водных растворах,
т. е. в условиях разрушения реакционноспособных производных. В па-
стоящей работе найдены мягкие условия заключения реакционноспособ-
ных производных олигонуклеотидов в мембранные переносчики (РОВС
и тени эритроцитов), исследована доставка этих производных в клетки
животных и их реакция с клеточными Р Н К .
Материалы и методы. Олигонуклеотиды и их алкилирующие производные синте-
зированы по методам, описанным ранее [3, 4]. [ 3 2 P j -метку в олигонуклеотиды вводили
с помощью обмена 5 '-концевого фосфата , как описано в работе [5] . Выращивание ви-
руса Сендай и очистку вирионов дифференциальным центрифугированием проводили
ло описанным методам [6]. Д л я получения [ 3 5 S]-меченного вируса в аллантоисный
мешок во время инфекции вводили 18,5 М Б к [ 3 5 S ] метионина в 200 мкл 0,14 M NaC!.
Удельная радиоактивность вируса составляла (1 - -5 ) -105 имп/мин на 1 мг вирусно-
го белка.
P O B C получали, используя процедуру медленного диализа , как описано в рабо-
те [7], с применением либо октилглюкозида, либо его тиоаналога (синтезированного
Грачевой Э. А. по методу [8] ) , либо детергента C H A P S («Serva», Ф Р Г ) . К 200 мкл
вирусной суспензии (20 % по объему, 125 м г / м л вирусного белка по Лоури) прилива-
ли 20 мкл 30 %-ного раствора детергента и после инкубации 30 мин при комнатной
5 2 I S S X 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А 19S9. Т. 5. N°. 4 52
температуре центрифугировали для удаления коровых вирусных частиц 20 мин при
50000 g. Супернатант диализировали против трех смен (по 10 мл) SSC, меняя буфер
к а ж д ы е 5 ч. З а т е м суспензию центрифугировали 20 мин при 50000 g для выпадения
осадка вирусных оболочек.
З а к л ю ч е н и е о л и г о н у к л е о τ и д н ы χ п р о и з в о д н ы х в в и р у с н ы е
о б о л о ч к и . К 20 мкл 50 %-ной (по объему) суспензии P O B C приливали 10 мкл
раствора , с о д е р ж а щ е г о 70 о. е. А2 6о/мл олигонуклеотидного производного
[ 3 2 P ] C l R ( р Т ) 16 (4[ (М-2-хлорэтил-Ы-метил)амино]бензил-5 ' -фосфамида гексадекатими-
д и л а т а ) . Смесь подвергали пятикратному з а м о р а ж и в а н и ю в ж и д к о м азоте и оттаива-
нию под струей воды комнатной температуры. При проведении процедуры з а м о р а ж и -
вания-оттаивания в манните оболочки и олигонуклеотидные производные предваритель-
но переводили в 0,15 M раствор маннита, для чего олигонуклеотидное производное
о с а ж д а л и 10 объемами ацетона с 20 %-ным LiClO4 , промывали ацетоном, высушивали
и растворяли в 0,16 M манните. P O B C в солевом растворе о с а ж д а л и центрифугирова-
нием и ресуспендировали в 0,15 M манните.
После последнего р а з м о р а ж и в а н и я смесь разбавляли 300 мкл SSC и центрифуги-
ровали 20 мин при 50000 g и 4°С . Д а л е е оболочки вновь суспендировали в SSC, соби-
рали центрифугированием, затем опять суспендировали в 200 мкл S S C и полученную
таким образом суспензию P O B C с заключенным в них производным использовали
для обработки клеток.
П о л у ч е н и е т е н е й э р и т р о ц и т о в и у п а к о в к а в н и х п р о и з в о д -
н ы х о л и г о н у к л е о τ и д о в. Образцы крови р а з б а в л я л и буфером S S C и отмыва-
ли суспензию эритроцитов двукратным осаждением и ресуспендированием в этом ж е
буфере. К 10 % (по объему) суспензии эритроцитов в S S C приливали па холоду
20 объемов буфера: 0,007 M K H 2 P O 4 - N a 2 H P O 4 , р Н 7,4, 4 мМ MgSO 4 , 0,5 м г / м л
A T P [9] . Полученные тени эритроцитов о с а ж д а л и центрифугированием (10000 g,
5 мин при 2 °С) и переосаждали в буфере 2 X S S C , с о д е р ж а щ е м 2 м г / м л глюкозы. Гу-
стую суспензию теней эритроцитов приливали на льду к равному объему раствора
олигонуклеотидного производного, выдерживали 5 мин при 0 °С и затем инкубировали
при 37 °С различное время, после чего отмывали полученную суспензию па холоду от
свободного производного, оставшегося в растворе. Клетки обрабатывали тенями эри-
троцитов с заключенными в них олигонуклеотидными производными, д о б а в л я я к кле-
точной суспензии тени в количестве 0,1—0,2 объема осадка клеток и вносили в смесь
0,5 гемагглютинирующих единиц инактивированного УФ-светом вируса Сендай.
К у л ь т у р а к л е т о к . В работе использованы клетки асцитной карциномы
Кребс-2, перевиваемые на мышах линии CC57BR. В экспериментах с олигонуклеотид-
ными производными концентрация клеток составляла 5 - Ю 6 к л / м л . После инкубации в
среде Игла , содержащей олигонуклеотидные производные или мембранные переносчи-
ки, в течение 2 ч при 37 °С клетки промывали трехкратным осаждением (1000 g,
10 мин) и ресуспендировали в растворе Хенкса. Аликвоты клеточной суспензии про-
считывали в жидкостном сцинтилляционном счетчике.
В ы д е л е н и е Р Н К и з к л е т о к , обработанных олигонуклеотидными производ-
ными, проводили по методике, описанной в работе [10]. Д л я определения количества
радиоактивной метки, ковалентно связанной с полимерным нуклеотидным материалом,
выделенную Р Н К подвергали хроматографическому разделению на сефадексе G-75 в
присутствии 8 M мочевины. Поли ( A ) + Р Н К выделяли хроматографией полученной
Р Н К на поли (U) -сефарозе [11] . П о содержанию [ 3 2 P ] - м е т к и в полученных препаратах
определяли степень алкилирования фракций Р Н К .
Результаты и обсуждение. У п а к о в к а о л и г о н у к л е о т и д н ы х
п р о и з в о д н ы х в P O B C и и х в з а и м о д е й с т в и е с к л е т -
к а м и . Д л я упаковки Д Н К в P O B C обычно используется процедура
медленного диализа детергеитного раствора компонентов вирусной мем-
браны. Реконструирующиеся в процессе удаления детергента вирусные
оболочки захватывают в свой внутренний объем часть находящейся в
растворе нуклеиновой кислоты [6]. Эффективность захвата нуклеино-
вой кислоты в вирусные оболочки при использовании такой процедуры
невелика; процесс диализа занимает несколько часов или суток, что
исключает возможность использования такого метода для упаковки в
вирусные оболочки реакциопноспособных производных нуклеиновых
кислот, таких как алкилирующиеся производные. В своей работе для
I S S X 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А 19S9. Т. 5. N°. 4 5 3
подобной цели мы применили процедуру, которая может быть выполне-
на быстро и при пониженных температурах. Предварительно получен-
ные «пустые» P O B C подвергали замораживанию — оттаиванию в рас-
творе, содержащем производные олигонуклеотидов, аналогично мето-
дике, используемой для упаковки водорастворимых веществ в липосомы
[12]. Замораживание — оттаивание проводили в 0,15 M растворе мап-
нита при низкой ионной силе, что позволяет повысить уровень захвата
веществ в липосомы [13]. Оказалось, что в достаточно широком интер-
Рис. 1. Сорбция вируса Сеидай и P O B C
клетками Кребс-2: Р О В С , 0,06 мкл осадка
на І мл клеточной суспензии ( / ) ; вирус
Сендай, 0,06 (2) и 0,3 (3) мкл осадка па
1 мкл клеточной суспензии
Fig. 1. Adsorp t ion of Sendai v i rus and R S V E
(reconst i tu ted Sendai v i rus envelope) by
ascite carc inoma Krebs 2 cells. 1 — RSVH,
0.06 μΐ of pellet per 1 ml of the cell suspen-
sion; 2 — Sendai virus, 0.06 μΐ of v i rus pellet
per 1 ml of the cell suspension; 3 — Sendni
virus. 0.3 μΐ of v i rus pellet per 1 ml of the
cell suspens ion
вале концентраций производных олигонуклеотидов (Ю -6—10~л М) их
захват в вирусные оболочки составляет 25—30 % от количества веще-
ства, введенного в перемораживаемую смесь. Таким образом, РОВС,
несмотря на наличие сложной мембранной структуры, содержащей бел-
ковые комплексы, ответственные за сорбцию и слияние частиц с кле-
точной мембраной, оказались способными захватывать вещества в про-
цедуре замораживания — оттаивания, аналогично липосомам. На рис. 1
представлены кинетические кривые связывания с клетками асцитпой
карциномы Кребс-2 [35S]-меченного вируса Сендай, а также вирусных
оболочек, содержащих производные олигонуклеотидов. Кривая связы-
вания вируса клетками имеет сложный характер: через 1 ч инкубации
с клетками связывается около 50 % вируса, введенного в среду. Из при-
веденных данных видно, что при равных исходных концентрациях ви-
русные частицы и реконструированные вирусные оболочки связываются
с клетками с близкой эффективностью. Таким образом, процедура за-
м о р а ж и в а н и я — оттаивания не нарушает способности вирусных оболо-
чек взаимодействовать с клетками. На рис. 2, а, приведена зависимость
уровня связывания клетками упакованных в вирусные оболочки произ-
водных олигонуклеотидов от количества Р О В С в среде при постоянной
концентрации клеток. Видно, что взаимодействие Р О В С с клетками за-
висит от соотношения Р О В С : клетки. При низких концентрациях ви-
русных оболочек (до 0,1 мкл/мл при концентрации клеток 5-Ю 6 кл/мл =
= 10 мкл/мл) связывание меченого материала за 2 ч инкубации дости-
гает 60 % для клеток асцитной карциномы Кребс, т. е. уровень связы-
вания примерно соответствует уровню связывания с клетками иптакт-
ного вируса Сендай (рис. 1). С увеличением содержания Р О В С в среде
выше 0,1 мкл/мл при концентрации клеток 10 мкл/мл эффективность
связывания Р О В С с клетками становится ниже, очевидно, вследствие
насыщения мест связывания на поверхности клеток. Однако при этом
продолжает увеличиваться абсолютное количество радиоактивного ма-
териала, связанного с клетками, по-видимому, отражая процесс слия-
ния мембран Р О В С с мембраной клеток (рис. 2 , 6 ) . При объемных со-
отношениях Р О В С : клетки, превышающих 0,05—0,1, наблюдался лизис
клеток. Аналогичные данные были получены для прикрепленной культу-
ры клеток L-фибробластов мыши. Реконструированные вирусные обо-
лочки, содержащие олигонуклеотидные производные, были стабильны-
ми в течение трехчасовой инкубации с клетками: более 90 % несвязав-
шегося с клетками радиоактивного материала осаждалось из культу-
ральной жидкости 15-минутным центрифугированием при 50000 g.
54 I S S X 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А 19S9. Т. 5. N°. 4 54
Б ы с т р а я у п а к о в к а о л и г о н у к л е о т и д н ы х п р о и з -
в о д н ы х в т е н и э р и т р о ц и т о в и и х в з а и м о д е й с т в и е
с к л е т к а м и . Описанные методы пагружения теней эритроцитов во-
дорастворимыми веществами включают две стадии: 1) лизис эритро-
цитов гипоосмотическим шоком с последующей отмывкой полученных
теней лизирующим раствором и выдерживание на холоду в растворе
с веществом, которое необходимо
ввести в тени; 2) инкубация иагру-
г*^. женных теней в солевом растворе
\ при 37 °С в течение 1 ч для восста-
новления целостности мембраны
эритроцитов [2, 9] .
Условия первой стадии упаков-
ки являются достаточно мягкими
для введения в тени эритроцитов
реакционноспособных производных
Рис. 2. Связывание клетками упакованного в P O B C ClR (рТ) ю (сі) и то ж е с добавле-
нием P O B C (б)
Fig . 2. Up take of C lR(рТ) ί6 packed into R S V E by the ascitc carc inoma cells (a) and
the s ame with addi t ion of R S V E (6)
Рис. 3. Зависимость количества γ - [ 3 2 P ] A T P , з ахватываемого тенями эритроцитов от
времени инкубации при 37 °С в S S C (2 мкл осадка теней в 2 X S S C инкубировали с
1 мкл γ - [ 3 2 P ] ATP (1 мМ) в SSC, затем отмывали двукратным осаждением и ресуспен-
дированием в SSC)
Fig. 3. Amount of γ - [ 3 2 P ] - A T P enclosed by erythrocyte ghos t s ve r sus the t ime of incu-
bat ion at 37 °С in SSC bu f f e r (2 μΐ of ghos t s pellet in 2 X S S C were incubated wi th 1 μΐ
of γ - [ 3 2 P ] A T P (1 mM) in SSC buffer , washed twice bv cen t r i fuga t ion and resuspended
in the SSC buffer )
олигонуклеотидов, если процедуры отмывки и инкубации проводить при
О °С в солевом растворе (SSC) с глюкозой (2 мг /мл) , а не в лизиру-
ющем гипоосмотическом буфере. В специальных экспериментах мы об-
наружили, что применение последнего приводит к значительным поте-
рям вещества при переводе нагруженных теней в солевой раствор.
Д л я того чтобы выяснить, какое минимальное время необходимо
для восстановления целостности эритроцитарной мембраны, были про-
ведены модельные опыты, в которых в тени эритроцитов включали
T- [ 3 2 PjATP, выдерживали их различное время при 37 °С и отмывали
материал, не удерживаемый в тенях. Н а рис. 3 приведена зависимость
уровня захвата 7-[ 3 2P] ATP тенями эритроцитов от времени инкубации
при 37 °С. Видно, что у ж е пятиминутной инкубации достаточно для вос-
становления структуры клеточной стенки эритроцита. При добавлении
полученных таким способом теней эритроцитов к суспензии клеток мы
наблюдали под микроскопом типичную, описанную в литературе [2],
картину взаимодействия теней эритроцитов с клетками от сорбции на
поверхности клеток, появления характерных вытягиваний мембраны в
виде «ушек», соответствующих частично слившимся эритроцитам, до
восстановления округлых клеток. Практически все клетки при соотно-
шении объема теней и клеток в суспензии 1 : 10 через 15 мин инкуба-
ции при 37 °С имели по 1—2 «ушка», что свидетельствовало о слиянии
эритроцитной и плазматической мембран.
I S S X 0233-7657 . Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А 19S9. Т. 5. N°. 4 5 5
А л к и л и р о в а п и е Р Н К в к л е т к а х а с ц и т н о й к а р ц и -
н о м ы К р е б с п р о и з в о д н ы м и о л и г о н у к л е о т и д о в , до -
с т а в л е н н ы м и с п о м о щ ь ю м е м б р а н н ы х п е р е н о с ч и к о в .
Чтобы убедиться в том, что слияние мембранных переносчиков с клет-
ками приводит к введению их содержимого в клеточный цитозоль, мы
провели эксперименты по алкилированию внутриклеточных Р Н К ал-
килирующими производными гексадекатимидилата (СЩ(рТ)іб), упако-
ванными в POBC и тени эритроцитов. Мишенями для этого реагента
являются последовательности, широко представленные в м Р Н К клеток.
В контрольных экспериментах было использовано аналогичное произ-
водное олигонуклеотида случайной структуры pTTCCTTCCCGTCTTCC
(pQ)i6, для которого не имеется специальных последовательностей-ми-
шеней в нуклеиновых кислотах клеток. Результаты приведенных экспе-
риментов представлены в таблице, откуда видно, что при обработке
клеток мембранными переносчиками, содержащими радиоактивные ал-
килирующие производные олигонуклеотидов, наблюдается включение
метки в полимерную клеточную РНК. В случае производного олиготи-
мидилата, по не производного олигонуклеотида (pQ)ie, фракция Р Н К ,
обогащенная поли (А)-последовательностями хроматографией па по-
ли (U) -сефарозе, содержит на порядок больше радиоактивного материа-
ла по сравнению с препаратом суммарной РНК. Эти данные свидетель-
ствуют о специфичности взаимодействия олигонуклеотидных реагентов
с комплементарными последовательностями клеточных РНК. Из табли-
цы следует также, что относительное связывание реагента клетками в
случае применения мембранных переносчиков составляет 25—30 % от
количества реагента, введенного в инкубационную смесь с клетками,
против 0,3 % при непосредственном введении реагента в культуральную
среду в аналогичных условиях. Из связавшегося с клетками радиоак-
тивного материала в случае прямой обработки клеток реагентами менее
0,07 оказывается связано с полимерной фракцией РНК. При использо-
вании мембранных переносчиков эта величина составляет 0,25—0,3. Та-
ким образом, можно полагать, что доставляемые мембранными перенос-
чиками производные олигонуклеотидов более эффективно поступают в
цитоплазму клеток по сравнению с производными, захваченными клет-
ками из раствора по механизму эндоцитоза. Оценивая возможность уве-
личения количеств реагентов, доставляемых в клетку, важно отметить,
Алкилировапие РНК в клетках асцитной карциномы Кребса производными
олигонуклеотидов, упакованными в мембранные переносчики
Alkylation of RNA in the ascite carcinoma Krebs cells by oligonucleotide derivatives
packed into membrane vehicles
Тип переносчика
Усреднен-
ная
концент-
рация
в среде,
мкМ
Связыва-
ние
с клет-
ками, %
Усреднен-
ная
внутри-
клеточная
концент-
рация,
мкМ*
Метка
поли-
мерной
рнк**,
%
Степень
алкилирования
поли(А)+ РНК**
Свободное производное
ClR(PT) 1 6 0,2 0,3 0,12 0,02 0,3' • ю - 5
P O B C
ClR(PT) 1 6 0,01 25 0,41 — 1,3 •Ю- 5
» 0,04 25 1,7 — 8- IO-5
ClR(PQ) 1 6 0,02 28 1,0 — 7,5· •Ю- 7
Тени эритроцитов
СЩ(рТ) 1 б 0,04 30 2,1 9 2-•Ю- 4
ClR(PQ) 1 6 0,04 41 2,7 11 3,3· • IO-6
* — величина определена, как отношение количества реагентов, связанных с клеткой,
к объему клетки; ** — указаны проценты радиоактивного реагента, связавшегося с вы-
сокополимерной Р Н К , по данным хроматографии на сефадексе, от содержащегося в
среде с клетками; *** — величина рассчитана на основании содержания [ 3 2 P ] во фрак-
ции полимерной Р Н К , полученной аффинной хроматографией на поли (U)-сефарозе,
как отношение молей олигонуклеотидного реагента к количеству молей нуклеотида
мономера.
5 6 I S S N 0233-71)57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А 1989. Т. 5. № 4
что концентрации реагентов в мембранных переносчиках в описанных
выше опытах (150 мкМ) не являются предельными. Возможно увели-
чение концентраций производных в мембранных переносчиках до 1—
10 мМ, при этом можно рассчитывать па пропорциональное увличение
количества материала, доставляемого в клетки. Отметим также, что
при введении реагентов непосредственно в растворы при увеличении их
концентрации выше 0,5—1 мкМ относительная доля связываемого клет-
ками материала быстро падает. Таким образом, использование мемб-
ранных переносчиков позволяет добиться повышения эффективности
связывания производных олигонуклеотидов с клетками и открывает
возможность созданию высоких концентраций реагентов в цитоплазме
клеток, позволяющих достигнуть высоких степеней модификации кле-
точных Р Н К .
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Взаимодействие алкилирующих производных олигонуклеотидов с фибробластами
мышей / В. В. Власов, О. Е. Горохова, Ε. М. Иванова и др. / / Биополимеры и клет-
ка.— 1986.—2, № 6 . — С . 323—327.
2. Celis I. Е. Microinject ion of somat ic cells wi th micropipet tes : compar i son wi th other
t r a n s f e r t e c h n i q u e / / B i o c h e m . J .— 1984.—223, N 2 . — P . 281—291.
3. Зарытова В. Φ., Иванова Ε. M., Романенко В. Г. Синтез олигонуклеотидов в хло-
роформе триэфирным м е т о д о м / / Б и о о р г . химия.— 1983.—9, № 4.— С. 516—521.
4. Бауск Е. В., Горн В. В., Лебедев А. В. Унифицированный вариант твердофазного
триэфирного синтеза 5 ' -фосфорилированных олигодезоксинуклеотидов на основе
β-цианэтиловых и я-хлорфениловых эфиров Ы-ацилнуклеозид-б ' -фосфатов / / Там
же.— 1985.—11, № 6 . — С . 815—820.
5. Berchner К. L., Folk W. R. Polynucleot ide k inase exchange react ion EcoRI c l eavage
and methy la t ion of DNAs con t a in ing modif ied pyr imidines in the recogni t ion sequ-
ence / / J . Biol. Chem.— 1977.—252, N 11 .—P. 3176—3178.
(j. Fusogenic reconst i tu ted Sendai v i rus envelopes as vehicle for in t roduc ing DNA into
viable m a m m a l i a n c e l l s / A . Vains te in , A. Razin, A. Graes sman , A. L o y t e r / / M e t h .
E n z y m o L - 1983.—101.—P. 492—512.
7. Reconstitution and fusogen ic proper t ies of Senda i v i rus envelopes / M. C. H a r m s e n ,
J. Wilschut , G. Scherphof et a l . / / E u r . J. Biochem.— 1985.—149, N 2 . — P . 591—599.
8. Saito S., Tsuehiya T. Synthes i s of a lkyl -P-D-th ioglucopyranosides , a series of new
nonionic de te rgen t s / / C h e m . P h a r m . Bull .— 1985.—33, N 2 . — P . 503—508.
9. Nash G. BMeiselman H. J. Effect of p repara t ive procedure on the vo lume and con-
tent of revealed red cell g h o s t s / / B i o c h i m . et biophys. acta .— 1985.—815, N 3.—
P. 477—485.
10. Маниатие Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.— М. : Мир,
1984.—480 с.
11. Направленная модификация полиадениловых фрагментов информационной Р Н К в
клетках асцитной карциномы Кребс 2 алкилирующим производным нонатимидил-
уридина / Ε. М. Иванова , Г. Г. Карпова , Д . Г. Кнорре и д р . / / М о л е к у л я р . биоло-
гия.— 1984,—18, № 3 . — С . 613—619.
12. Lurquin P. F. E n t r a p m e n t of genet ic ma te r i a l into l iposomes and delivery to c e l l s / /
Liposome t e c h n o l o g y . — B o c a Roton: CRC press, 1984 .—P. 187—193.
13. Получение липосом с лекарственными препаратами / В. Г. Будкер, Т. Е. Вахрушева ,
Е. В. Киселева, Н. Б. Х р и с т о л ю б о в а / / Х и м . фарм. журн.— 1987.— № 3.— С. 347.
Ин-т биоорг. химии Сиб. отд-ния АН СССР, Новосибирск Получено 01.03.88
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев
S E N D A I V I R U S E N V E L O P E S
AND ERYTHROCYTE G H O S T S AS M E M B R A N E V E H I C L E S FOR T R A N S P O R T
O F T H E R E A C T I V E O L I G O N U C L E O T I D E D E R I V A T I V E S INTO T H E C E L L S
V. V. Vlasov, Ε. Μ. Ivanova, Yu. D. Krendelev, I. V. Kutyavin,
M. N. Ovander, A. S. Ryte, F. P. Svinarehuk, L. A. Yakubov
Ins t i tu te of B ioorgan ic Chemist ry ,
Siber ian Branch of the Academy of Sciences of the U S S R , Novosibirsk
Ins t i tu te of Molecular Biology and Genet ics
of the Academy of Sciences of the Ukra in i an SSR, Kiev
S u m m a r y
Poor pene t ra t ion of ol igonucleot ide der ivat ives t h r o u g h m a m m a l i a n cell m e m b r a n e s
in te r feres with their act ion as inhibi tors of cel lular nucleic acid func t ions . This di f f icul ty
I S S X 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А 19S9. Т. 5. N°. 4 57
can be overcome us ing reconsti tuted Sendai virus envelopes and erythrocyte ghosts as
membrane carriers of the oligonucleotide derivatives. Fas t methods for incorporation of
reactive oligonucleotide derivatives into membrane carriers have been developed. In the
model experiments membrane carr iers incorporat ing a lkyla t ing oligothyrnidylate deriva-
tives are delivered into ascite carcinoma Krebs 2 cells and it is shown that they are
t ransfered efficiently into cytosol and react with complementary poly (A) sequences of
cellular RNAs. Efficiency of delivery of oligonucleotide reagents into cells 10—100 times
increases when us ing the membrane vehicles.
УДК 577.21
В. А. Вахнтов, Ю. Μ. Никоноров
НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
БОЛЬШОГО ПОВТОРА 5S ДНК
У ДИПЛОИДНОЙ ПШЕНИЦЫ TRITICUM MONOCOCCUM L.
Определена нуклеотидная последовательность большой повторяющейся единицы 5S
ДНК у диплоидной пшеницы Т. monococcum протяженностью 485 п. н. Показано, что
различия в размерах двух семейств повторов 5S ДНК у данного вида пшеницы связа-
ны с делецией 154 п. н. в центральной области межгенного спейсера. Выявлена высо-
кая гомология областей, кодирующих 5S рРНК, терминирующих последовательностей,
о -концов межгенных спейсеров в обоих семействах повторов 5S ДНК, а также между
повторами одинаковой протяженности у двух образцов Т. monococcum. Установлено,
что в отличие от двудольных растений у изученных видов злаков последовательность
AT AT AT ATT А локализована ближе к 5/-концу межгенного спейсера.
В геноме диплоидной пшеницы Т. monococcum имеются два семейства
повторяющихся последовательностей Д Н К , кодирующих 5S р Р Н К , раз-
мерами около 320 и 500 п. н. [1]. Ранее они были клонированы нами
в плазмидах pTm5S7 и pTm5S12 и тогда ж е определена нуклеотидная
последовательность малого повтора 5S Д Н К [1]. В настоящей работе
представлена первичная структура 5S Д Н К размером 500 п. п., клони-
рованной в плазмиде pTm5S12.
Материалы и методы. В качестве объекта исследований использован диплоидный
вид пшеницы Т. monococcum (номер каталога В И Р — 8555). Методы выделения Д Н К
рекомбинантных плазмид, включения радиоактивной метки и определения первичной
структуры клонированных фрагментов Д Н К были подробно описаны нами в предыду-
щей работе [1].
Результаты и обсуждение. Д л я определения первичной структуры
вставка рекомбинантной плазмиды pTm5S12, содержащей 5S Д Н К Т.
monococcum размером около 500 п. н., была переклонирована в плаз-
миде pUC19. Нуклеотидная последовательность гена 5S р Р Н К и меж-
генного спейсера представлена на рисунке. Д л я сравнения приведены
также первичные структуры 5S Д Н К в повторах размером 320 п. н. из
этого ж е образца и 500 п. и., клонированной в плазмиде pTm5S73 (Т.
monococcum, к-45297 [2]).
Нуклеотидную последовательность Д Н К , кодирующей 5S р Р Н К ,
идентифицировали исходя из первичной структуры 5S р Р Н К мягкой
пшеницы, определенной МакКеем и др. [3]. Из рисунка видно, что
в направлении транскрипции клонированная нами 5S Д Н К содержит
кодирующий фрагмент размером 90 п. п., представляющий собой З'-ко-
нец одного гена, межгенный спейсер и фрагмент размером 30 п. п. 5'-
конца гена 5S р Р Н К следующего повтора. Следовательно, последова-
тельность, узнаваемая рестриктазой BamHI, находится внутри кодиру-
ющей области гена 5S р Р Н К .
5 8 I S S X 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А 19S9. Т. 5. N°. 4 58
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155021 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T13:12:04Z |
| publishDate | 1989 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Власов, В.В. Иванова, Е.М. Кренделев, Ю.Д. Кутявин, И.В. Овандер, М.Н. Райт, А.С. Свинарчук, Ф.П. Якубов, Л.А. 2019-06-16T08:38:12Z 2019-06-16T08:38:12Z 1989 Оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов - мембранные переносчики для введения peакционноспособных производных олигонуклеотидов в клетки / В.В. Власов, Ε.М. Иванова, Ю.Д. Кренделев, И.В. Кутявин, Μ.Н. Овандер, А.С. Райт, Ф.П. Свинарчук, Л.А. Якубов // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 4. — С. 52-58. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000D3 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155021 577.352.32 Изучение действия алкилирующих производных олигонуклеотидов затруднено вследствие их низкой проницаемости через клеточные мембраны. В работе предложено использовать для доставки олигонуклеотидных производных в клетку реконструированные оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов. Разработаны быстрые методы заключения олигонуклеотидных производных в мембранные везикулы, позволяющие сохранить химические свойства активных группировок. Для реагентов, заключенных в переносчики, при меньших концентрациях производных в среде достигаются степени алкилирования поли(А)⁺РНК в 10–100 раз большие, чем при простом добавлении олигонуклеотидных производных в клеточную суспензию. Вивчення дії алкілувальних похідних олігонуклеотидів ускладнено внаслідок їхньої низької проникності через клітинні мембрани. Запропоновано використовувати для доставки олігонуклеотидних похідних у клітину реконструйовані оболонки вірусу Сендай і тіні еритроцитів. Розроблено швидкі методи введення олігонуклеотидних похідних у мембранні везикули, що дозволяє зберегти хімічні властивості активних угруповань. Для реагентів, вміщених у переносники, при менших концентраціях похідних у середовищі досягаються ступені алкілування полі(А)⁺ РНК у 10–100 разів більші, ніж при простому додаванні олігонуклеотидних похідних у клітинну суспензію. Poor penetration of oligonucleotide derivatives through mammalian cell membranes interferes with their action as inhibitors of cellular nucleic acid functions. This difficulty can be overcome using reconstituted Sendai virus envelopes and erythrocyte ghosts as membrane carriers of the oligonucleotide derivatives. Fast methods for incorporation of reactive oligonucleotide derivatives into membrane carriers have been developed. In the model experiments membrane carriers incorporating alkylating oligothymidylate derivatives are delivered into ascite carcinoma Krebs 2 cells and it is shown that they are transfered efficiently into cytosol and react with complementary poly (A)⁺ sequences of cellular RNAs. Efficiency of delivery of oligonucleotide reagents into cells 10—100 times increases when using the membrane vehicles. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов - мембранные переносчики для введения peакционноспособных производных олигонуклеотидов в клетки Оболонки вірусу Сендай і тіні еритроцитів – мембранні переносники для введення реакційноздатних похідних олігонуклеотидів у клітини Sendai virus envelopes and erythrocyte ghosts as membrane vehicles for transport of the reactive oligonucleotide derivatives into the cells Article published earlier |
| spellingShingle | Оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов - мембранные переносчики для введения peакционноспособных производных олигонуклеотидов в клетки Власов, В.В. Иванова, Е.М. Кренделев, Ю.Д. Кутявин, И.В. Овандер, М.Н. Райт, А.С. Свинарчук, Ф.П. Якубов, Л.А. Структура и функции биополимеров |
| title | Оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов - мембранные переносчики для введения peакционноспособных производных олигонуклеотидов в клетки |
| title_alt | Оболонки вірусу Сендай і тіні еритроцитів – мембранні переносники для введення реакційноздатних похідних олігонуклеотидів у клітини Sendai virus envelopes and erythrocyte ghosts as membrane vehicles for transport of the reactive oligonucleotide derivatives into the cells |
| title_full | Оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов - мембранные переносчики для введения peакционноспособных производных олигонуклеотидов в клетки |
| title_fullStr | Оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов - мембранные переносчики для введения peакционноспособных производных олигонуклеотидов в клетки |
| title_full_unstemmed | Оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов - мембранные переносчики для введения peакционноспособных производных олигонуклеотидов в клетки |
| title_short | Оболочки вируса Сендай и тени эритроцитов - мембранные переносчики для введения peакционноспособных производных олигонуклеотидов в клетки |
| title_sort | оболочки вируса сендай и тени эритроцитов - мембранные переносчики для введения peакционноспособных производных олигонуклеотидов в клетки |
| topic | Структура и функции биополимеров |
| topic_facet | Структура и функции биополимеров |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155021 |
| work_keys_str_mv | AT vlasovvv oboločkivirusasendaiiteniéritrocitovmembrannyeperenosčikidlâvvedeniâpeakcionnosposobnyhproizvodnyholigonukleotidovvkletki AT ivanovaem oboločkivirusasendaiiteniéritrocitovmembrannyeperenosčikidlâvvedeniâpeakcionnosposobnyhproizvodnyholigonukleotidovvkletki AT krendelevûd oboločkivirusasendaiiteniéritrocitovmembrannyeperenosčikidlâvvedeniâpeakcionnosposobnyhproizvodnyholigonukleotidovvkletki AT kutâviniv oboločkivirusasendaiiteniéritrocitovmembrannyeperenosčikidlâvvedeniâpeakcionnosposobnyhproizvodnyholigonukleotidovvkletki AT ovandermn oboločkivirusasendaiiteniéritrocitovmembrannyeperenosčikidlâvvedeniâpeakcionnosposobnyhproizvodnyholigonukleotidovvkletki AT raitas oboločkivirusasendaiiteniéritrocitovmembrannyeperenosčikidlâvvedeniâpeakcionnosposobnyhproizvodnyholigonukleotidovvkletki AT svinarčukfp oboločkivirusasendaiiteniéritrocitovmembrannyeperenosčikidlâvvedeniâpeakcionnosposobnyhproizvodnyholigonukleotidovvkletki AT âkubovla oboločkivirusasendaiiteniéritrocitovmembrannyeperenosčikidlâvvedeniâpeakcionnosposobnyhproizvodnyholigonukleotidovvkletki AT vlasovvv obolonkivírususendaiítíníeritrocitívmembranníperenosnikidlâvvedennâreakcíinozdatnihpohídniholígonukleotidívuklítini AT ivanovaem obolonkivírususendaiítíníeritrocitívmembranníperenosnikidlâvvedennâreakcíinozdatnihpohídniholígonukleotidívuklítini AT krendelevûd obolonkivírususendaiítíníeritrocitívmembranníperenosnikidlâvvedennâreakcíinozdatnihpohídniholígonukleotidívuklítini AT kutâviniv obolonkivírususendaiítíníeritrocitívmembranníperenosnikidlâvvedennâreakcíinozdatnihpohídniholígonukleotidívuklítini AT ovandermn obolonkivírususendaiítíníeritrocitívmembranníperenosnikidlâvvedennâreakcíinozdatnihpohídniholígonukleotidívuklítini AT raitas obolonkivírususendaiítíníeritrocitívmembranníperenosnikidlâvvedennâreakcíinozdatnihpohídniholígonukleotidívuklítini AT svinarčukfp obolonkivírususendaiítíníeritrocitívmembranníperenosnikidlâvvedennâreakcíinozdatnihpohídniholígonukleotidívuklítini AT âkubovla obolonkivírususendaiítíníeritrocitívmembranníperenosnikidlâvvedennâreakcíinozdatnihpohídniholígonukleotidívuklítini AT vlasovvv sendaivirusenvelopesanderythrocyteghostsasmembranevehiclesfortransportofthereactiveoligonucleotidederivativesintothecells AT ivanovaem sendaivirusenvelopesanderythrocyteghostsasmembranevehiclesfortransportofthereactiveoligonucleotidederivativesintothecells AT krendelevûd sendaivirusenvelopesanderythrocyteghostsasmembranevehiclesfortransportofthereactiveoligonucleotidederivativesintothecells AT kutâviniv sendaivirusenvelopesanderythrocyteghostsasmembranevehiclesfortransportofthereactiveoligonucleotidederivativesintothecells AT ovandermn sendaivirusenvelopesanderythrocyteghostsasmembranevehiclesfortransportofthereactiveoligonucleotidederivativesintothecells AT raitas sendaivirusenvelopesanderythrocyteghostsasmembranevehiclesfortransportofthereactiveoligonucleotidederivativesintothecells AT svinarčukfp sendaivirusenvelopesanderythrocyteghostsasmembranevehiclesfortransportofthereactiveoligonucleotidederivativesintothecells AT âkubovla sendaivirusenvelopesanderythrocyteghostsasmembranevehiclesfortransportofthereactiveoligonucleotidederivativesintothecells |