Векторы для клонирования и определения активности элементов транскрипционной системы бактерий. Клонирование терминатора транскрипции оперона рРНК из архебактерий Halobacterium halobium

Сконструированы рекомбинантные плазмиды рММ24 и pVR41, содержащие промоторный район Pᵣ бактериофага λ с областями инициации транскрипции и инициации трансляции репрессора λсrо, полилинкер и участок терминации транскрипции бактериофага fd. Показано, что в клетках Е. coli синтезируются короткие гибрид...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1987
Hauptverfasser:	Скрипкин, Е.А., Манькин, А.С., Копылов, А.М., Худяков, Ю.Е.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1987
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Генно-инженерная биотехнология
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155027
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Векторы для клонирования и определения активности элементов транскрипционной системы бактерий. Клонирование терминатора транскрипции оперона рРНК из архебактерий Halobacterium halobium / Е.А. Скрипкин, А.С. Манькин, А.М. Копылов, Худяков Ю. Е // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 5. — С. 263-269.— Бібліогр.: 12 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155027
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1550272025-02-23T18:03:19Z Векторы для клонирования и определения активности элементов транскрипционной системы бактерий. Клонирование терминатора транскрипции оперона рРНК из архебактерий Halobacterium halobium Вектори для клонування і визначення активності елементів транскрипційної системи бактерій. Клонування термінатора транскрипції оперону рРНК з архебактерій Halobacterium halobium Vectors for cloning and activity determination of the elements of the bacterial transcription system: cloning the transcription terminator of the rRNA operon of the archaebacterium Halobacterium halobium Скрипкин, Е.А. Манькин, А.С. Копылов, А.М. Худяков, Ю.Е. Генно-инженерная биотехнология Сконструированы рекомбинантные плазмиды рММ24 и pVR41, содержащие промоторный район Pᵣ бактериофага λ с областями инициации транскрипции и инициации трансляции репрессора λсrо, полилинкер и участок терминации транскрипции бактериофага fd. Показано, что в клетках Е. coli синтезируются короткие гибридные мРНК, кодируемые мини-геном. Встраивание в полилинкерную последовательность мини-гена других структур, терминирующих транскрипцию (например, предполагаемого терминатора транскрипции оперона рРНК H. halobium), приводит к образованию в клетках Е. coli гибридных РНК соответствующей длины, экспрессию которых можно наблюдать при выращивании бактерий на среде с радиоактивным предшественником. Сконструйовано рекомбінантні плазміди рММ24 і pVR41, які містять промоторний район Pᵣ бактеріофага λ з областями ініціації транскрипції і ініціації трансляції репресора λсrо, полілінкер і ділянку термінації транскрипції бактеріофага fd. Показано, що в клітинах Е. coli синтезуються короткі гібридні мРНК, які кодуються міні-геном. Вбудовування в полілінкерну послідовність міні-гена інших структур, термінуючих транскрипцію (наприклад, передбачуваного термінатора транскрипції оперона рРНК H. halobium), призводить до утворення в клітинах Е. coli гібридних РНК відповідної довжини, експресію яких можна спостерігати при вирощуванні бактерій на середовищі з радіоактивним попередником. The pBR322 vector was used for constructing recombinant plasmids pMM24 and pVR41, containing the promoter region Pᵣ of the bacteriophage λ including the transcription and translation starting points of the cro-repressor, the polylinker with the restriction sites for several restrictases and the tandem of the terminators of the fd phage. The constructed mini-gene is transcribed in E. coli cells into the corresponding mini-mRNA. The transcription of this gene could occur either constitutively or under the conduction of the c1857 represser of the phage λ. The polylinker sequence in the gene body could be used to introduce various regulator structures between the promoter and the terminators. A putative transcription terminator of the rRNA operon from the archaebacterium H. halobium was cloned inside the mini-gene. This archaebacterial sequence was shown to function as an effective terminator in the eubacterial system. 1987 Article Векторы для клонирования и определения активности элементов транскрипционной системы бактерий. Клонирование терминатора транскрипции оперона рРНК из архебактерий Halobacterium halobium / Е.А. Скрипкин, А.С. Манькин, А.М. Копылов, Худяков Ю. Е // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 5. — С. 263-269.— Бібліогр.: 12 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001FA https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155027 577.214.625 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Генно-инженерная биотехнология Генно-инженерная биотехнология
spellingShingle	Генно-инженерная биотехнология Генно-инженерная биотехнология Скрипкин, Е.А. Манькин, А.С. Копылов, А.М. Худяков, Ю.Е. Векторы для клонирования и определения активности элементов транскрипционной системы бактерий. Клонирование терминатора транскрипции оперона рРНК из архебактерий Halobacterium halobium Биополимеры и клетка
description	Сконструированы рекомбинантные плазмиды рММ24 и pVR41, содержащие промоторный район Pᵣ бактериофага λ с областями инициации транскрипции и инициации трансляции репрессора λсrо, полилинкер и участок терминации транскрипции бактериофага fd. Показано, что в клетках Е. coli синтезируются короткие гибридные мРНК, кодируемые мини-геном. Встраивание в полилинкерную последовательность мини-гена других структур, терминирующих транскрипцию (например, предполагаемого терминатора транскрипции оперона рРНК H. halobium), приводит к образованию в клетках Е. coli гибридных РНК соответствующей длины, экспрессию которых можно наблюдать при выращивании бактерий на среде с радиоактивным предшественником.
format	Article
author	Скрипкин, Е.А. Манькин, А.С. Копылов, А.М. Худяков, Ю.Е.
author_facet	Скрипкин, Е.А. Манькин, А.С. Копылов, А.М. Худяков, Ю.Е.
author_sort	Скрипкин, Е.А.
title	Векторы для клонирования и определения активности элементов транскрипционной системы бактерий. Клонирование терминатора транскрипции оперона рРНК из архебактерий Halobacterium halobium
title_short	Векторы для клонирования и определения активности элементов транскрипционной системы бактерий. Клонирование терминатора транскрипции оперона рРНК из архебактерий Halobacterium halobium
title_full	Векторы для клонирования и определения активности элементов транскрипционной системы бактерий. Клонирование терминатора транскрипции оперона рРНК из архебактерий Halobacterium halobium
title_fullStr	Векторы для клонирования и определения активности элементов транскрипционной системы бактерий. Клонирование терминатора транскрипции оперона рРНК из архебактерий Halobacterium halobium
title_full_unstemmed	Векторы для клонирования и определения активности элементов транскрипционной системы бактерий. Клонирование терминатора транскрипции оперона рРНК из архебактерий Halobacterium halobium
title_sort	векторы для клонирования и определения активности элементов транскрипционной системы бактерий. клонирование терминатора транскрипции оперона ррнк из архебактерий halobacterium halobium
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1987
topic_facet	Генно-инженерная биотехнология
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155027
citation_txt	Векторы для клонирования и определения активности элементов транскрипционной системы бактерий. Клонирование терминатора транскрипции оперона рРНК из архебактерий Halobacterium halobium / Е.А. Скрипкин, А.С. Манькин, А.М. Копылов, Худяков Ю. Е // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 5. — С. 263-269.— Бібліогр.: 12 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT skripkinea vektorydlâklonirovaniâiopredeleniâaktivnostiélementovtranskripcionnojsistemybakterijklonirovanieterminatoratranskripciioperonarrnkizarhebakterijhalobacteriumhalobium AT manʹkinas vektorydlâklonirovaniâiopredeleniâaktivnostiélementovtranskripcionnojsistemybakterijklonirovanieterminatoratranskripciioperonarrnkizarhebakterijhalobacteriumhalobium AT kopylovam vektorydlâklonirovaniâiopredeleniâaktivnostiélementovtranskripcionnojsistemybakterijklonirovanieterminatoratranskripciioperonarrnkizarhebakterijhalobacteriumhalobium AT hudâkovûe vektorydlâklonirovaniâiopredeleniâaktivnostiélementovtranskripcionnojsistemybakterijklonirovanieterminatoratranskripciioperonarrnkizarhebakterijhalobacteriumhalobium AT skripkinea vektoridlâklonuvannâíviznačennâaktivnostíelementívtranskripcíjnoísistemibakteríjklonuvannâtermínatoratranskripcííoperonurrnkzarhebakteríjhalobacteriumhalobium AT manʹkinas vektoridlâklonuvannâíviznačennâaktivnostíelementívtranskripcíjnoísistemibakteríjklonuvannâtermínatoratranskripcííoperonurrnkzarhebakteríjhalobacteriumhalobium AT kopylovam vektoridlâklonuvannâíviznačennâaktivnostíelementívtranskripcíjnoísistemibakteríjklonuvannâtermínatoratranskripcííoperonurrnkzarhebakteríjhalobacteriumhalobium AT hudâkovûe vektoridlâklonuvannâíviznačennâaktivnostíelementívtranskripcíjnoísistemibakteríjklonuvannâtermínatoratranskripcííoperonurrnkzarhebakteríjhalobacteriumhalobium AT skripkinea vectorsforcloningandactivitydeterminationoftheelementsofthebacterialtranscriptionsystemcloningthetranscriptionterminatoroftherrnaoperonofthearchaebacteriumhalobacteriumhalobium AT manʹkinas vectorsforcloningandactivitydeterminationoftheelementsofthebacterialtranscriptionsystemcloningthetranscriptionterminatoroftherrnaoperonofthearchaebacteriumhalobacteriumhalobium AT kopylovam vectorsforcloningandactivitydeterminationoftheelementsofthebacterialtranscriptionsystemcloningthetranscriptionterminatoroftherrnaoperonofthearchaebacteriumhalobacteriumhalobium AT hudâkovûe vectorsforcloningandactivitydeterminationoftheelementsofthebacterialtranscriptionsystemcloningthetranscriptionterminatoroftherrnaoperonofthearchaebacteriumhalobacteriumhalobium
first_indexed	2025-11-24T06:34:31Z
last_indexed	2025-11-24T06:34:31Z
_version_	1849652487688028160
fulltext	Генноинженерная биотехнология УДК 577.214.625 ВЕКТОРЫ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭЛЕМЕНТОВ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ СИСТЕМЫ БАКТЕРИЙ. КЛОНИРОВАНИЕ ТЕРМИНАТОРА ТРАНСКРИПЦИИ ОПЕРОНА рРНК ИЗ АРХЕБАКТЕРИЙ HALOBACTERIUM HALOBIUM Е. А. Скрипкин, А. С. Манькин, А. М. Копылов, Ю. Е. Худяков Введение. В настоящее время создан целый ряд векторных систем, по- зволяющий изучать не только экспрессию генов в клетках микроорга- низмов, но и активность их регуляторных областей. Как правило, такую активность оценивают по количеству образующегося белка либо непо- средственно, либо по его ферментативной активности. Однако количество образующегося белкового продукта зависит от ряда факторов, включающих как эффективность транскрипции и трансляции, так и стабильность полученных м Р Н К и гибрид- ного белка. В данной работе представлены векторные системы, содержащие сильный промотор и сильный терминатор транскрипции, позволяющие прямо наблюдать экспрессию коротких гибридных м Р Н К в клетках ки- шечной палочки. Использование таких векторов дает возможность ре- шать вопросы, связанные с эффективностью работы промоторов и тер- минаторов транскрипции и стабильностью образующихся м Р Н К в клетке. Материалы и методы. В р а б о т е использовали ш т а м м ы Е. coli К12, ΔΗ1, At rp [1 ] , НВ101 , J M 1 0 3 [2] , э н д о н у к л е а з ы рестрикции BamHI, PstI, EcoRI, Hindlll, Xbal, полу- ченные из В Н И И прикл. энзимологии (Вильнюс) или Н И К Т И Б А В ( Н о в о с и б и р с к ) , ф р а г м е н т К л е н о в а Д Н К - п о л и м е р а з ы I из Е. coli ( « P L P h a r m a c i a » , Ш в е ц и я ) ; ампицил- лин и р и ф а м п и ц и н («Serva» , Ф Р Г ) , [ a - 3 2 P ] d N T P с удельной активностью более 37 Т Б к / м м о л ь и 3 2 Р - о р т о ф о с ф о р н у ю кислоту п р о и з в о д с т в а В О «Изотоп» , Т а ш к е н т , отд-ние . П л а з м и д ы pCL47 и pLK53 получены от М. З а б о , Ф Р Г [1] . Б а к т е р и и в ы р а щ и в а л и в среде LB или М 9 с д о б а в л е н и е м а м п и ц и л л и н а д о кон- ц е н т р а ц и и 100 м к г / м л и в отдельных экспериментах 3 2 Р - о р т о ф о с ф а т а д о концентрации 3,7 М Б к / м л . Генетическую т р а н с ф о р м а ц и ю , аналитическое вы д еле ние п л а з м и д н о й Д Н К кипячением, электрофоретическое ра зделение ф р а г м е н т о в Д Н К и определение разме - ров сконструированных п л а з м и д в а г а р о з н о м геле проводили, к а к описано в [2 ] . П р е - п а р а т и в н о е выделение п л а з м и д осуществляли по м е т од у [3] . Н у к л е о т и д н у ю последова - т е л ь н о с т ь Д Н К определяли по методу М а к с а м а — Гилберта [4] . Д л я в ы д е л е н и я мече- ной Р Н К клетки лизировали , д о б а в л я я р а в н ы й о б ъ е м горячего р а с т в о р а (100 м М NaCl , 8 м М Э Д Т А , 1 %-ный D S - N a , р Н 7,0) , в течение 2 мин при 100 °С. Л и з а т д в а ж д ы об- р а б а т ы в а л и фенолом, н а с ы щ е н н ы м водой, Р Н К о с а ж д а л и спиртом [5 ] . Т р а н с к р и п т ы а н а л и з и р о в а л и при помощи э л е к т р о ф о р е з а в 8 %-ном п о л и а к р и л а м и д н о м геле ( П А А Г ) в присутствии 8 Μ мочевины. Д л я определения нуклеотидной последовательности Р Н К в ы д е л я л и из геля , де- ф о с ф о р и л и р о в а л и щелочной ф о с ф а т а з о й Е. coli («Serva» , Ф Р Г ) . 5 ' - К о н ц е в у ю метку в в о д и л и при помощи [ γ - 3 2 Ρ ] Α Τ Ρ и п о л и н у к л е о т и д к и н а з ы ф а г а Т4 ( « P L P h a r m a c i a » , Ш в е ц и я ) . М е ч е н у ю м Р Н К очищали э л е к т р о ф о р е з о м в 8 % - н о м П А А Г в присутствии БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1987.—Т. 3, № 5 263 8 Μ мочевины, элюировали из геля и подвергали частичному расщеплению Р Н К а з а м и Ті, U2 , PhyM и Bacillus cereus («PL Pharmacia», Швеция) по методу [12]. Количество копий м Р Н К в клетке определяли сравнением суммарной радиоактив- ности зон из ПААГ р Р Н К и зоны м Р Н К при мечении Р Н К Е. coli in υίνο [ 3 2 Р]-орто- фосфатом в пересчете на один нуклеотидный остаток РНК. Результаты и обсуждение. К о н с т р у и р о в а н и е п л а з м и д. При изучении экспрессии чужеродной генетической информации в виде гибридных генов в бактериальных клетках неизбежно возникает ряд во- Рис. 1. Схема конструирования плазмиды рММ24 и нуклеотидная последовательность участков плазмид рММ24 и pVR4J, кодирующих гибридные пептиды с N-концевым геп- тапептидом белка Хсго Fig. 1. Construct ion of the plasmid pMM24 and nucleotide sequence of the regions of the plasmids pMM24 and pVR41 coding for the hybrid peptides which contain N-terminal hep- tapeptide from the cro-protein просов, касающихся эффективности транскрипции и стабильности моле- кул м Р Н К , а т а к ж е эффективности трансляции и стабильности белко- вого продукта. В настоящее время неясно, какая из стадий является определяющей при накоплении белка в штаммах-продуцентах. Д л я изу- чения первого этапа экспрессии—транскрипции гена и стабильности полученных м Р Н К в клетках — нами были сконструированы рекомби- нантные плазмиды, содержащие промоторный район PR бактериофага λ с областями инициации транскрипции и инициации трансляции репрес- сора Хсго, а т а к ж е участок терминации транскрипции бактериофага fd (два тандемно расположенных терминатора) (рис. 1). Промотор выде- ляли из плазмиды pCL47 (фрагмент Psil-BamHI, содержащий N - k o h - цевую часть гена β -лактамазы и XPR-промотор); терминирующие струк- туры взяты из плазмиды pLK53 (фрагмент BamHI-PstI, содержащий С-концевую часть β -лактамазы, участок начала репликации огі плаз- 264 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1987.—Т. 3, № 5 264 миды pBR322 и тандем терминаторов) [1]. На рис. 1 представлена структура полученной плазмиды рММ24. Так как плазмида , получен- ная в результате лигирования этих двух фрагментов Д Н К , должна со- держать помимо искусственного мини-гена интактный природный ген β-лактамазы, то селекцию штаммов, содержащих рекомбинантные плаз- миды, можно было проводить на среде с ампициллином. Согласно ре- зультатам анализа первичной структуры, полученный мини-ген кодирует м Р Н К длиной около 130 нуклеотидных остатков (н. о.) . При трансля- ции такой м Р Н К должен синтезироваться олигопептид длиной 14 ами- нокислотных остатков, из которых первые 7 соответствуют N-концу белка его (рис. 1). При выращивании на средах с радиоактивным ; 3 2Р-ортофосфатом нами было действительно обнаружено, что в клетках наряду с т Р Н К и р Р Н К накапливается значительное количество Р Н К длиной 129—131 н. о. В аналогичных экспериментах с клетками, не со- держащими плазмиду, такого транскрипта обнаружено не было. Пря- мой анализ нуклеотидной последовательности этой Р Н К подтвердил, что она является транскриптом сконструированного мини-гена; ее ^ - к о - нец совпадает с точкой инициации транскрипции с ЯРд-промотора, а З '-конец локализован в пределах последовательности олиго-U /d-терми- патора. Нуклеотидная последовательность Д Н К , заключенная между инициирующим ATG- и терминирующим TAG-кодонами, содержит уча- стки узнавания рестриктаз BamHI, HindiII и Xbal. Это дает возмож- ность использовать данную конструкцию для создания генов, кодирую- щих гибридные полипептиды, содержащие N-конец белка его и любой другой белок в той ж е рамке трансляции. Однако при экспрессии чужеродных белков часто возникает по- требность в трансляции белка с собственного инициирующего кодона. Д л я этой цели нами была сконструирована плазмида pVR41, в которой присоединением синтетического адаптора был образован стоп-кодон пе- ред последовательностью полилинкера (рис. 1). Полученная плазмида pVR41 под контролем λΡη-промотора определяла синтез короткого гранскрипта размером 149 н. о., стабильного в клетках Е. coli. Таким образом, сконструированы векторные системы, индуцирую- щие в клетках синтез коротких м Р Н К , легко идентифицируемых элект- рофорезом в ПААГ. Такие системы дают возможность исследовать не только транскрипцию, но и стабильность м Р Н К . Наличие полилинкера позволяет встраивать в мини-ген фрагменты Д Н К , кодирующие струк- турные области других генов. Кроме того, эти плазмиды могут быть использованы для изучения промоторной или терминаторной функций фрагментов Д Н К при встраивании их в полилинкер мини-гена. Э к с п р е с с и я к о р о т к и х м Р Н К в к л е т к а х Е. c o l i . Д л я изучения влияния транскрипта мини-гена на жизнеспособность клеток были использованы системы конститутивного либо индуциро- ванного синтеза Р Н К с λΡΗ-πρ0Μ0Τ0ρ3. Известно, что транскрипция с промотора %РЯ регулируется с/-репрессором бактериофага λ. Поэто- му при трансформации плазмидами, содержащими XPR-промотор, штам- ма Е. coli, имеющего в геноме интегрированный профаг λ с температу- рочувствительным репрессором СІ857, можно регулировать транскрип- цию, изменяя температуру. При 28 °С λΡΗ-промотор репрессирован, с повышением температуры до 42 °С происходит инактивация с/-репрес- сора, в результате чего начинается транскрипция с ЯР я -промотора (данный прием удобен для накопления плазмид, несущих гены, экспрес- сия которых препятствует нормальному развитию клеток) . Сравнение скорости роста штаммов Е. coli ΔΗ1, содержащего сІ557-репрессор, и НВ101, не содержащего репрессора, трансформированных плазмидами рММ24 и pVR41, показало, что накопление в клетках коротких м Р Н К не влияет на жизнеспособность полученных штаммов. Таким образом, исследование транскрипции и стабильности мини-мРНК могло быть проведено в штамме с конститутивным синтезом этого транскрипта, например штамм НВ101. 265 БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. —1987.—Т. 3. № 5 На рис. 2 показана динамика синтеза м Р Н К длиной 149 н. о. (МРНК149) в клетках Е. coli НВ101: синтез этой м Р Н К происходит конститутивно. Д л я сравнения приведена динамика синтеза р Р Н К в тех ж е клетках. В конце логарифмической фазы роста содержание м Р Н К ш составляет около 3 % по отношению к количеству рибосом в клетке. Следует отметить, что на любой стадии роста культуры относи- тельное количество МРНК149 на клетку примерно одинаково — несколь- ко сотен молекул. Д л я выяснения причины такого высокого уровня Рис. 2. Кинетика синтеза Р Н К и э в клетках Е. coli: радиоактивные зоны, соответствую- щие Р Н К м э ( / ) и р Р Н К (2), вырезали из 8 % - н о г о ПААГ и просчитывали в сцинтилля- дионном счетчике по Черенкову. Аликвоты клеточной суспензии подвергали лизису [5] . Пунктиром представлена кривая роста клеток Е. coli Fig. 2. Accumula t ion of RNA149 in the E. coli cells. Aliquots of the cell suspens ions were lysed [5] and the total cel lular RNA were subjected to e lect rophoresis in a 8 % gel. The b a n d s co r re spond ing to R N A H 9 and rRNA were excised f rom the gel and counted in a sc int i l la t ion counter . The g rowth curve is shown by a dot ted line Рис. 3. Стабильность транскрипта плазмиды pVR41 (149 и .о . ) в клетках Е. coli НВ101: клетки выращивали 3 ч (см. кривую роста на рис. 2) на среде LB с добавлением 3 2 Р - ортофосфата ( / ) , затем добавляли рифампицин и отбирали аликвоты через 2 (2), 4 ( з ) ; 6 (4) И 20 мин (5) Fig . 3. The s tabi l i ty of the t ranscr ip t (RNA,49) f rom the pVR41 p lasmid in E. coli HB101 cells. The cells were g r o w n for three hours in a LB medium with the addi t ion of 3 2 P-pho- spha te (see the g rowth curve in Fig . 2) ( / ) ; a f t e r the addi t ion of the r i fampic in a l iquots were selected each 2 min (2)t 4 min (5), 6 min (4) and 20 min (5) м Р Н К в клетке — за счет эффективной работы промотора или повы- шенной устойчивости гибридных м Р Н К в клетке — изучена скорость деградации полученных матриц. Транскрипцию в клетках останавлива- ли добавлением рифампицина и следили за исчезновением зоны МРНК149 после разделения клеточных Р Н К электрофорезом в ПААГ. Рис. 3 показывает, что время полужизни Р Н К ш составляет 4—6 мин. Это незначительно отличается от обычной скорости деградации молекул м Р Н К в клетках Е. coli, например м Р Н К β-лактамазы, транскрибируе- мой с плазмиды pBR322 [6]. Вероятно, наблюдаемый нами уровень мРНКнэ в клетках поддерживается эффективной работой промотора λΡη на всех фазах роста культуры. Не исключено, что несколько боль- шая стабильность м Р Н К ш определяется ее небольшими, по сравнению с другими м Р Н К , размерами. Так, для коротких гибридных м Р Н К дли- ной 170—200 н. о., транскрибируемых с промоторов генов рибосомных 264 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1987.—Т. 3, № 5 266 белков, отмечалось возрастание стабильности по сравнению с исходны- ми м Р Н К [7]. К л о н и р о в а н и е т е р м и н а т о р а т р а н с к р и п ц и и о п е - р о н а р Р Н К и з а р х е б а к т е р и и Н. h a l o b i u m . Получен- ные в работе векторы можно использовать для сравнения эффективно- Рис. 4. Схема конструирования плазмид рММ40 и рММ72 и структура участков м Р Н К плазмиды рММ72, содержащих стоп-кодон и терминаторную шпильку Н. halobium (Н.Іг.) Fig. 4. Construct ion of the pMM40 and pMM72 plasmids. The s t ruc ture of the pMM72 mRNA conta in ing the stop-codon and the terminator hairpin f rom H. halobium is shown in the bottom of the f igure сти различных промоторов и клонирования последовательностей, терми- нирующих транскрипцию. Ранее при определении первичной струк- туры рибосомного оперона архебактерий Н. cutirubrum [8], Η. volcanii [9] и Η. halobium [10, 11] было обнаружено, что после гена 5S р Р Н К находится структура, похожая на r/го-независимый терминатор транс- крипции бактерий. Хотя механизм терминации транскрипции архебак- БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1987.—Т. 3, № 5 267 термальных РНК-полимераз неизвестен, было высказано предположе- ние, что именно эта структура может терминировать транскрипцию опе- рона р Р Н К . Более того, аналогичная структура найдена и после гена 7S Р Н К Я. halobium [10]. Нами сконструированы плазмиды рММ40 и рММ72 на основе плазмид рММ24 и pVR41 с этой последовательностью, встроенной по полилинкерному участку (рис. 4) . Терминатор Я. halo- bium выделяли из репликативной формы фага М13тр8, в котором был клонирован 110-членный Mspl-фрагмент оперона р Р Н К Я. halobium [11]. Правильность ориентации клонирован- ных фрагментов Д Н К определяли при помо- щи секвенирования плазмид по методу Мак- сама — Гилберта [4]. Структура предполагае- мого транскрипта, кодируемого плазмидой рММ72, приведена на рис. 4. При анализе транскриитов, синтезируемых в клетках Е. co- li (штамм НВ101), трансформированных пла- змидой рММ72 (производной pVR41), оказа- лось, что синтез мини-мРНК терминируется Рис. 5. Р а з д е л е н и е в 8 %-ном П А А Г в присутствии 8 Μ мочевины Р Н К из клеток, т р а н с ф о р м и р о в а н н ы х плазми- д а м и рММ24 ( / ) ; рММ40 (2); pVR41 (3) и рММ72 (4). Клетки Е. coli в ы р а щ и в а л и на среде М9 в присутствии 3 2 Р - о р т о ф о с ф а т а . П о л о ж е н и е р Р Н К и размеры основных м и н и - м Р Н К отмечены стрелками Fig . 5. E l e c t r o p h o r e s i s in a d e n a t u r i n g 8 % gel of the to ta l ce l lu la r RNA f r o m cells t r a n s f o r m e d by p l a s m i d s j) Μ Μ 24 (1), j) Μ.WW (2), ρ VR41 (3) and pMM72 (4). The s ize of the m a i n p l a smid encoded m i n i - m R N A s and r R N A s is ind ica ted . The cel ls w e r e g r o w n in a M 9 m e d i u m in the p resence of 3 2 P - p h o s p h a t e как на архебактериальном, так и на ^/-терминаторах (рис. 5). При этом на архебактериальном терминаторе завершается синтез около 30 % транскриитов с ЯР І Гпромотора. Терминация транскрипции в случае рММ40 происходит только на терминаторе фага fd. Обнаруженные раз- личия можно объяснить тем, что в мини-гене плазмиды рММ40 откры- тая рамка трансляции перекрывает всю последовательность терминато- ра и рибосома, транслирующая м Р Н К , синтезируемую РНК-полимера- зоп, может препятствовать образованию структуры терминаторной шпильки. Так как архебактериальная терминирующая шпилька энерге- тически не менее стабильна, чем терминатор бактериофага fd, неполная терминация на плазмиде рММ72, возможно, также связана с близостью терминатора к стоп-кодону пептида; трансляция останавливается перед полилинкерноп последовательностью и препятствует образованию тер- минаторной шпильки. Следовательно, клонированные архебактериальные терминаторы синтеза р Р Н К могут эффективно останавливать транскрипцию, осуще- ствляем у ю эу б а ктери а л ьной Ρ Η К-пол и мер азой. Таким образом, сконструированные векторы и система их экспрес- сии на основе Е. coli позволяют прямо исследовать процесс транскрип- ции и эффективность работы регуляторных областей генов, а также изучать сопряжение между тоанскрипцией и трансляцией. 264 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1987.—Т. 3, № 5 268 VECTORS FOR CLONING AND ACTIVITY DETERMINATION OF THE E L E M E N T S OF THE BACTERIAL TRANSCRIPTION SYSTEM: CLONING THE TRANSCRIPTION TERMINATOR OF THE rRNA O P E R O N OF THE ARCHAEBACTERIUM HALOBACTER1UM HALOBIUM E. A. Skripkin, A. S. Mankin, A. M. Коруlου, Y и. Ε. Khudyakov State University, Moscow D. I. Ivanovsky Inst i tute of Virology, Academy of Medical Sciences of the USSR, Moscow S u m m a г у The pBR322 vector was used for const ruct ing recombinant p lasmids pMM24 and pVR41, conta ining the promoter region Pr of the bacter iophage λ including the t ranscr ipt ion and t rans la t ion s ta r t ing points of the cro-repressor, the polylinker with the restriction sites for several restr ictases and the tandem of the te rminators of the fd phage. The constructed mini-gene is transcribed in E. coli cells into the corresponding mini-mRNA. The t ranscr ip- tion of this gene could occur either consti tut ively or under the conduction of the СІ857 repressor of the phage λ. The polylinker sequence in the gene body could be used to introduce various regula tor s t ructures between the promoter and the terminators . A puta- tive t ranscript ion terminator of the rRNA operon from the archaebacter ium H. halobium was cloned inside the mini-gene. This archaebacterial sequence was shown to funct ion as an effective terminator in the eubacterial system. 1. Zabeau M., Stanley К. К. Enhanced expression of cro-galactosidase fusion proteins under the control of the Ρ promoter of b a c t e r i o p h a g e / / E M B O J.— 1982.—1, N 10.— P. 1217—1224. 2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование.— М. : Мир, 1984.— 479 с. 3. Muk/iopadht/au Μ., Manual Лг. С. A simple procedure for large-scale preparat ion of pure plasm id DNA from b a c t e r i a / / A n a l . Biochem.— 1983,—133, N 20 ,—P. 265—270. 4. Maxam A. M., Gilbert W. Sequencing end-labelled DNA with base-specific chemical c leavages / / M e t h . Enzymol.— 1980,—65,—P. 499—560. 5. Jinks-Robertson S., Gourse R. L., Nomura M. Expression of rRNA and tRNA genes in Escherichia coli: evidence for feedback regulat ion by products of rRNA operon / / Cell.— 1983,—33, N 3 , — P . 865—876. 6. Decay of mRNA in Escherichia coli: invest igat ion of the fa te of specific segments of t ranscr ip ts / A. von Gabian, J. G. Belasco, J. L. Schottel et a l . / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA.— 1983,—80, N 3 , — P . 653—657. 7 Isolation and characterizat ion of stable hybrid mRNA molecules t ranscribed f rom ri- bosomal promoters in E. coli / T. Ikemura, S. Itoh, L. E. Post , M. Nomura / / Cell.—· 1979,—18, N 3 , — P . 895—903. 8. Hui L, Dennis P. P. Character izat ion of the ribosomal RNA gene cluster in Halobacte- rium cutirubrum / / J . Biol. Chem.— 1985.—260, N 2 , — P . 899—906. 9. Sequence of 5S ribosomal RNA gene regions and their products in the archaebacte- rium Halobacterium volcanii / C. J. Daniels, J. D. Hofman , J. G. MacWill iam / / Мої. and Gen. Genet.— 1985.—198, N 2 , — P . 270—274. 10. Common s t ructural features of the genes for two stable RNAs from Halobacterium halobium / A. Moritz, B. Lankat-But tgere i t , H. J. Gross, W. G o e b e l / / N u c l . Acids Res.— 1985,—13, N 1 .—P. 31—43. 11. Mankin A. S., Kagramanova V. K. A complete nucleotide sequence of the single ri- bosomal RNA operon of Halobacterium halobium. A secondary s t ructure of the archa- ebacterial 23S r R N A / / М о ї . and Gen. Genet.— 1986,—202, N 1 ,—P. 152—161. 12. Donis-Keller H., Maxam A. M.f Gilbert W. Mapp ing adenines, guanines and pyrimidi- nes in R N A / / N u c l . Acids Res.— 1977,—4, N 8 , — P . 2527—2539. МГУ им. Μ. В. Ломоносова Ин-т вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР. Москва Получено 08.04.86 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.—1987.—Т. 3, № 5 269

Institution

Ähnliche Einträge