Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда

Для скрининга к ДНК-библиотеки методом полимеразной цепной реакции осуществлен синтез радиоактивно меченного гибридизационного зонда с высокой удельной активностью (3,5· 109 имп·мин–1·мкг–1), специфичного к тирозил-тРНК синтетазе млекопитающих. Проведен скрининг к ДНК-библиотеки печени быка и получе...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Published in:	Биополимеры и клетка
Date:	1997
Main Authors:	Леванец, О.В., Найденов, В.Г., Вудмаска, М.И., Мацука, Г.Х., Корнелюк, А.И.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1997
Subjects:	Структура и функции биополимеров
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155128
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда / О.В. Леванец, В.Г. Найденов, M.И. Вудмаска, Г.Х. Мацука, А.И. Корнелюк // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 2. — С. 121-126. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1859478743273177088
author	Леванец, О.В. Найденов, В.Г. Вудмаска, М.И. Мацука, Г.Х. Корнелюк, А.И.
author_facet	Леванец, О.В. Найденов, В.Г. Вудмаска, М.И. Мацука, Г.Х. Корнелюк, А.И.
citation_txt	Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда / О.В. Леванец, В.Г. Найденов, M.И. Вудмаска, Г.Х. Мацука, А.И. Корнелюк // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 2. — С. 121-126. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.
collection	DSpace DC
container_title	Биополимеры и клетка
description	Для скрининга к ДНК-библиотеки методом полимеразной цепной реакции осуществлен синтез радиоактивно меченного гибридизационного зонда с высокой удельной активностью (3,5· 109 имп·мин–1·мкг–1), специфичного к тирозил-тРНК синтетазе млекопитающих. Проведен скрининг к ДНК-библиотеки печени быка и получен клон, соответствующий указанному ферменту. Секвенирование к ДНК-вставки показало, что данный клон кодирует С-концевую часть тирозил- тРНК синтетазы из печени быка Обнаружена гомология аминокислотной последовательности С-концевого некаталитического домена тирозил-тРНК синтетазы с новым цитокином – моноцит-активирующим полипептидом П. Для аналізу кДНК-бібліотеки методом полімеразної ланцюгової реакції проведено синтез радіоактивно міченого гібридизаційного зонду з l високою питомою активністю (3,5 ·109 імп·хв · мкг ) , специфічного до тирозил-тРНК синтетази ссавців. Проведено скринінг кДНК-бібліотеки печінки бика та одержано клон, що відповідає вказаному ферменту. Секвенування кДНК показало, що отриманий клон кодує С-кінцеву частину тирозил-тРНК синтетази печінки бика. Виявлена гомологія амінокислотної послідовності С-кінцевого некаталітичного домена тирозил-тРНК синтетази з новим цитокіном – моноцит-активуючим поліпептидом II. Radioactive probe of high activity (3.5·109 cpm/μg) specific to mammalian tyrosyl-tRNA synthetase has been synthesized by polymerase chain reaction. Bovine liver cDNA-library has been screened and specific clone has been detected. Sequencing of cDNA insert shows that the done encodes C-terminal part of bovine tyrosyl-tRNA synthetase. C-terminal non-canalytic domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase shares homology of amino acid sequence with a novel cytokine – endothelial-monocyte activating polypeptide II.
first_indexed	2025-11-24T11:44:45Z
format	Article
fulltext	ISSN 0233-7657 . Биополимеры и клетка. 1997. Т. 13. № 2 Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда О- В. Леванец, В. Г. Найденов, M. И. Вудмаска, Г. Х- Мацука, А. И. Корнелюк Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины 252143, Киев, ул. Академика Заболотного, 150 Для скрининга к ДНК-библиотеки методом полимеразной цепной реакции осуществлен синтез радиоактивно меченного гибридизационного зонда с высокой удельной активностью (3,5 J09 импмин1мкг'1), специфичного к тирозил-тРНК синтетазе млекопитающих. Проведен скрининг к ДНК-библиотеки печени быка и получен клон, соответствующий указанному ферменту. Секвенирование к ДНК-вставки показало, что данный клон кодирует С-концевую часть тирозил- тРНК синтетазы из печени быка Обнаружена гомология аминокислотной последовательности С-концевого некаталитического домена тирозил-тРНК синтетазы с новым цитокином — моно- цит-активирующим полипептидом П. Введение. Аминоацил-тРНК синтетазы (АРСазы, КФ 6. 1. 1) — к л ю ч е в ы е ферменты аппарата био синтеза белка клетки [1 , 2 ] . АРСазы высших эукариот отличаются более сложной структурой по сравнению с их прокариотическими аналогами и обычно имеют N - или С-концевые удлинения по липептидной цепи, обусловленные необходимостью выполнения ими некоторых дополнительных функ ций, например, участием в формировании кодосом [3] . Тирозил-тРНК синтетаза (КФ 6. 1. 1. 1) из печени быка, выделенная и изученная нами ранее [4—6 ], представляет собой димер а 2 - т и п а с моле кулярной массой 2 х 59 к Д а . Наряду с основной формой синтетазы также выделена и охарактеризо вана функционально активная протеолитически модифицированная форма белка, имеющая М г 2 х х 39 кДа [4—6 ]. Несущественное для каталитиче ской активности фермента С-концевое удлинение полипептидной цепи вносит определяющий вклад в сродство тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих к высокомолекулярным Р Н К [5 ]. © О В Л Е В А Н Е Ц , В Г Н А Й Д Е Н О В , М. И. ВУДМАСКА. Г X МАЦУКА, А И К О Р Н Е Л Ю К , 1997 Для дальнейшего структурно-функционального анализа эукариотической тирозил-тРНК синтетазы необходимо знание ее первичной структуры. Ранее нами определена первичная структура N-концевого полипептидного фрагмента бычьей тирозил-тРНК синтетазы, кодирующего нуклеотидсвязывающий домен фермента (свертку Россмана) с помощью ПЦР-амплификации , клонирования и секвенирова- ния соответствующего к Д Н К - ф р а г м е н т а [7 ]. В данной работе нами впервые проведено клонирова ние и секвенирование к Д Н К , кодирующей С-кон цевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопита ющих. В настоящее время используются различные методы получения радиоактивно меченных гибри- дизационных зондов. Чаще всего концевую метку вводят при помощи полинуклеотидкиназы бактери офага Т4 и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I [8—10] . Д Н К также может быть помечена методом ник-трансляции [8, 11 ] или с использованием ста тистических олигонуклеотидных затравок [12] . Метод ник-трансляции наиболее эффективен для фрагментов Д Н К длиной более 1 тыс. п. н., актив ность полученного зонда при этом достигает значе ний до 0 ,5 -10 9 имп 'мин" 1 •мкг - 1 . Метод статистиче- 121 J1EBAHEIJ О В И Д Р ских затравок используется для мечения фрагмен тов Д Н К размером от 0,5 до 2 тыс. п. н., актив ность зонда — до 2 - Ю 9 и м п м и н 1 мкг~1 [13 ]. В последнее время применяется метод введе ния метки в Д Н К с использованием полимеразной цепной реакции ( П Ц Р ) , основанный на введении одного из радиоактивно меченных d N T P s в реак ционную смесь [13] . Мечение гибридизационных зондов с использованием П Ц Р имеет ряд преиму ществ по сравнению с другими методами: высокая э ф ф е к т и в н о с т ь м е ч е н и я фрагментов размером меньше 0,5 тыс. п. н.; возможность легкой регуля ции значений активности зонда и его количества; эффективное мечение зонда при небольших исход ных количествах соответствующей последователь ности; прямое мечение геномной Д Н К [13] . Материалы и методы. В работе использовали клетки Escherichia coli XLl-Blue , плазмидный век тор pBluescript II SK ( + ) и фаговый вектор XZAPII («Stratagene», США) . Для скрининга кДНК-библи- отеки печени быка в фаговом векторе XZAPII в качестве зонда использовали фрагмент размером 638 п. н., полученный при ПЦР-амплификации кДНК печени быка и кодирующий нуклеотидсвя- зывающий домен тирозил-тРНК синтетазы [7 ] — GenBank Асс# Х96373. Синтез зонда, специфичного к тирозил- тРНК синтетазе, и скрининг к ДНК-библиотеки печени быка. П р о в е д е н и е п о л и м е р а з н о й ц е п н о й р е а к ц и и . Реакционная смесь (20 мкл) содержала следующие компоненты: 10 нг матричной Д Н К (фрагмент Х96373), по 20 пмоль каждого из праймеров (Z2(}-npaHMep 5 - AAGAGAAACTGCACCTTATCACCCG-3 ' и Р М ( _ ) - п р а й м е р 5 - G C C T G T T A A T C C T G G A A C C A T A G G - 3 ) , по 4 нмоль d C T P , d G T P , d T T P , 100 мкКи [ 3 2 Р ]dATP с удельной активностью 2000 Ки /ммоль («Радиопрепарат», Ташкент ) , 1 х реакционный бу фер (10 ммоль трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ КС1, 1,5 мМ MgCl 2 , 0,001 % (в/о) желатина и 5 ед. ДНК-полимеразы Taq («Stratagene»). Проведено 25 циклов амплификации по программе: денатурация при 94 °С в течение 45 с; отжиг праймеров при 60 °С в течение 60 с; достройка при 72 °С в течение 90 с. По окончании амплификации синтезирован ный зонд переосаждали этанолом и растворяли в 50 % - м формамиде. Выход реакции определяли по включению [ 3 2 Р ]dATP в ТХУ-осаждаемый продукт на стекло- волокнистых фильтрах [14] . Исходя из выхода реакции и удельной актив ности [ 3 2 Р JdATP определяли удельную активность полученного гибридизационного зонда [14] . П е р в и ч н ы й с к р и н и н г к Д Н К - б и б л и о т е к и п е ч е н и б ы к а с и с п о л ь з о в а н и е м с и н т е з и р о в а н н о г о р а д и о а к т и в н о г о з о н д а . Для выявления клонов к Д Н К , соответствующих тиро- з и л - т Р Н К синтетазе млекопитающих , проведен скрининг кДНК-библиотеки печени быка получен ным зондом. Для этого библиотеку рассевали на чашки со средой LB (10 чашек по 50 000 бляшко- образующих единиц (БОЕ) на каждой) . После инкубации при 37 °С в течение 16 ч фаговую Д Н К переносили на нейлоновые фильтры (Hybond-N, «Amersham», Англия) по общепринятой методике. В качестве положительного контроля на отдельный фильтр были нанесены аликвоты 2 и 0,2 нг Д Н К фрагмента Х96373, в качестве отрицательного — 10 и 1 нг суммарной Д Н К рекомбинантного фага XZAPII библиотеки. Далее Д Н К , связавшуюся с фильтром, денатурировали в течение 7 мин в растворе: 0,5 М N a O H ; 1,5 М NaCl ; затем фильтр нейтрализовали в течение 6 мин в растворе: 1 М трис-HCl, рН 8,0; 1,5 М NaCl . Далее фильтр промывали в 4 х SSC ( l x S S C : 150 мМ NaCl; 15 мМ Na-цитрат, рН 7,0) , Д Н К фиксировали на нем УФ-излучением и фильтр использовали для гибридизации. Предгибридизацию проводили в течение 3—5 ч при температуре 37 °С в растворе следующего состава: 5 х SSC; 5 х раствор Денхардта (1 х : П о 0,02 % поливинилпирролидона, фиколла , БСА); 50 %-й формамид; 0,1 % - й DS-Na. Объем раство ра: по 0,2 мл на 1 см 2 площади фильтра. Затем в предгибридизационную смесь добавля ли полученный меченый зонд, растворенный в 50 % - м формамиде и предварительно денатуриро ванный прогреванием при 65 °С (5 мин) , до кон центрации ( 2 — 5 ) 1 0 ь и м п м и н 1 мл 1 гибридизаци- онной смеси и проводили гибридизацию при 37 °С в течение 16—18 ч на качающейся платформе. По завершении гибридизации каждый фильтр последовательно отмывали: 1) 15 мин при комнат ной температуре в 100 мл раствора 2 х SSC, 0,1 % - й DS-Na; 2) 15 мин в растворе того же состава при 65 °С; 3) 15 мин при 65 °С в растворе 0,2 х SSC, 0,1 %-й DS-Na. После отмывки фильтр помещали на экспози цию с рентгеновской пленкой ( Р М - 1 , «Свема», Украина) на 1—2 сут с использованием интенсифи цирующего экрана при - 7 0 °С. А н а л и з о т о б р а н н ы х в р е з у л ь т а т е п е р в о г о с к р и н и н г а о б р а з ц о в м е т о д а м и д о т-г и б р и д и - з а ц и и и г и б р и д и з а ц и и п о С а у - з е р н у. На чашках в местах, соответствующих 122 положительным сигналам на фильтрах, были выре заны участки среды примерно 1 с м 2 (200—300 фаговых бляшек) и помещены в 1 мл буфера SM для элюции фаговых частиц. Затем отобранными образцами инфицировали культуру Е. coli XLl-Blue , размножали бактерио фаги и выделяли фаговую Д Н К [8 ]. Для последующего анализа отобранные образ цы использовали для дот-гибридизации с тем же зондом. На нейлоновый фильтр наносили Д Н К выбранных образцов (по 100—200 нг в каждую т о ч к у ) , положительный контроль — 2 нг Д Н К фрагмента Х96373, отрицательный — 10 нг сум марной ДНК-библиотеки. Подготовку фильтров, пред гибридизацию, гибридизацию и отмывку осу ществляли так же , как на соответствующих этапах первичного скрининга кДНК-библиотеки. Экспози ция с рентгеновской пленкой (РМ-1 , «Свема») — 2 сут при - 7 0 °С с интенсифицирующим экраном. После дот-гибридизации отобранные образцы фаговой Д Н К рестрицировали по сайту EcoRI (в библиотеке по данному сайту клонированы фраг менты к Д Н К в вектор XZAP1D и использовали для гибридизации по Саузерну [15] . Рестрикцию проводили в течение 2 ч при 37 ° С Каждая реакционная смесь в объеме 50 мкл содержала по 2 мкг ДНК-образца и по 20 ед. акт. EcoRI («BioMaster», Россия) в соответствующем буфере. После завершения реакции образцы пере осаждали и наносили на электрофорез: 1,5 %-я агароза в буфере ТАЕ (40 мМ трис-ацетат, рН 8,3; 1 мМ Э Д Т А ) . В качестве положительного контроля на одну из дорожек нанесено 40 нг Д Н К , кодиру ющей N-концевой фрагмент тирозил-тРНК синте- тазы (последовательность Х96373). После завершения электрофореза для денату рации Д Н К гель в течение 30 мин выдерживали в растворе 0,5 М N a O H , 1,5 М NaCl , а затем 30 мин — в нейтрализующем растворе 1 М трис- НС1, рН 8,0, 1,5 М NaCl . Д Н К с геля на найлоно- вый фильтр переносили по стандартной схеме [8 ] в течение 18 ч, после чего ее фиксировали на фильтре УФ-излучением и проводили те же проце дуры гибридизации, что и в предыдущих случаях. В т о р о й с к р и н и н г о т о б р а н н о г о о б р а з ц а . Для дальнейшей работы был отобран один из проанализированных образцов. Поскольку каждый образец представлял собой смесь примерно 200—300 клонов, существовала необходимость дополнительного скрининга для вы деления индивидуального клона, специфичного к тирозил-тРНК синтетазе. Для этого отобранный образец был раститрован до получения отдельных бляшек (1000 БОЕ на чашку) . К Л О Н И Р О В А Н И Е к Д Н К , К О Д И Р У Ю Щ Е Й Т И Р О З И Л тРНК С И Н Т Е Т А З У Далее перенос фаговой Д Н К на нейлоновые фильтры, подготовку фильтров и гибридизацию проводили так же , как на соответствующих этапах первого скрининга кДНК-библіютеки . Т р е т и й с к р и н и н г о б р а з ц а . В месте, соответствующем положительному сигналу на фильтре, на чашке был вырезан участок среды, содержащий отдельную фаговую бляшку, и поме щен в 1 мл среды SM для элюции фаговых частиц. Затем был определен титр полученной суспензии по стандартной методике [8 ]. Чтобы убедиться в том, что полученный образец содержит индивиду альный клон без посторонних примесей, осуществ ляли еще один скрининг с использованием радио активного зонда, специфичного к тирозил-тРНК синтетазе. На чашку высевали 100 БОЕ образца после второго скрининга и проводили аналогичные про цедуры переноса Д Н К на фильтр и гибридизации. С е к в е н и р о в а н и е Д Н К . Из полученных рекомбинантных клонов выделяли плазмидную Д Н К с использованием колонок Q I A G E N - 1 0 0 («Qiagen», США) . Д Н К секвенировали по методу Сэнгера [16] , использовали Т7 ДНК-полимеразу ( « P h a r m a c i a » , Ш в е ц и я ) , и з о т о п [ a - 3 5 S ] d A T P (> 1000 м К и / м м о л ь , «Amersham»). Для секвениро- вания использовали внешние олигонуклеотидные праймеры М13 и S P T 3 («Pharmacia») , а также синтезированные внутренние праймеры SK1-SK9. Результаты и обсуждение . Результаты скри нинга к ДНК-библиотеки печени быка зондом, спе цифичным к тирозил-тРНК синтетазе. При син тезе радиоактивно меченного зонда в ходе П Ц Р включение изотопа составляло, как правило, 50 %. Исходя из включения и удельной активности ис пользовавшегося препарата [ 3 2 P ] d A T P , удельная активность полученного зонда составляла примерно 3,5- 10 9 импмин 1 мкг 1 , что соответствует литера турным данным [13] для данного метода введения метки в гибридизационный зонд. При первичном скрининге кДНК-библиотеки печени быка с использованием синтезированного зонда получен ряд гибрид и зационных сигналов. Поскольку при первичном скрининге многие сигна лы могут являться неспецифическими, требовался дополнительный анализ отобранных образцов. Кро ме того, из-за большого количества анализируемых клонов к Д Н К выделить после первого скрининга индивидуальный клон невозможно — каждый обра зец представляет собой смесь из 200—300 клонов. Всего в результате первого скрининга было отобра но 28 образцов, соответствующих положительным сигналам. Эффективность гибридизации была проверена 123 Л Е В А Н Е Ц О В И Д Р в контрольных образцах: положительный контроль дал сильные гибридизационные сигналы, в отрица тельном — сигналов не наблюдалось. В дальнейшем использовали выделенную Д Н К отобранных образцов. При дот-гибридизации наи более сильный сигнал дал образец 22. Сигнал упомянутого образца по интенсивности был сопо ставим с таковым положительного контроля. Одна ко для последующего анализа были отобраны еще 11 образцов, дававших менее интенсивные гибри дизационные сигналы, поскольку сила сигнала мог ла быть обусловлена не только специфичностью клона, но и другими причинами: чистотой препара та Д Н К , неточным определением количества Д Н К в препарате. Для более точной проверки результатов дот- гибридизации была осуществлена гибридизация по Саузерну с Д Н К отобранных образцов, расщеплен ной по сайту рестрикции EcoRI, поскольку именно по этому сайту была клонирована к Д Н К печени быка в вектор для данной библиотеки. Кроме того, этот опыт позволял определить, гибридизуется ли зонд со специфическими последовательностями к Д Н К или же имеет место неспецифическая гибри дизация с последовательностями векторной Д Н К , имеющими случайную гомологию с зондом. Результаты гибридизации по Саузерну (рис. 1) Рис. 2. Результат третьего скрининга кДНК-библиотеки печени быка: гибридизация фаговых бляшек клона 22 с радиоактивным зондом Х96373, специфичным к тирозил-тРНК синтетазе мле копитающих 10 11 12 Рис. 1. Результат гибридизации по Саузерну Д Н К образцов, отобранных после первого скрининга кДНК-библиотеки печени быка, с радиоактивно меченным зондом Х96373. Нанесены следующие образцы: 1 — контроль (1 нг Д Н К фрагмента Х96373); 2 — 23; 3 — 22; 4 — 21; 5 — 20; 6 — 18; 7 — 1 6 ; * — 14; 9 — 10; 10 — 7; / / — 3; / 2 — 1 . Слева указаны положения маркеров в тыс. п. н. показали, что положительный сигнал дает действи тельно только клон 22. Сигнал давал один из рестрикционных фрагментов размером примерно 2200 п. н. В ходе второго скрининга образца 22 получе ны отдельные клоны, дающие положительный сиг нал. Третий скрининг показал , что клон 22 являет ся гомогенным, не содержит никаких примесей и дает сильный положительный сигнал в гибридиза ции с радиоактивно меченным зондом, специфич ным к тирозил-тРНК синтетазе млекопитающих (рис. 2) . Секвенированием по Сэнгеру [16] определена нуклеотидная последовательность кДНК-вставки клона 22. На схеме приведена нуклеотидная после довательность к ДНК-фрагмента , соответствующего С-концевой части последовательности бычьей ти- розил-тРНК синтетазы. Наблюдается перекрыва ние нуклеотидной области 1 —135 с последователь ностью секвенированного нами ранее [7 ] фрагмен т а к Д Н К , к о д и р у ю щ е г о N - к о н ц е в о й нуклеотидсвязывающий домен синтетазы (свертку Россмана). Отнесение полученной последователь ности к С-концевой части полипептидной цепи бычьей тирозил-тРНК синтетазы независимо под- 124 К Л О Н И Р О В А Н И Е к Д Н К , К О Д И Р У Ю Щ Е Й Т И Р О З И Л тРНК С И Н Т Е Т А З У 125 Л Е В А Н Е Ц О В. И Д Р тверждается соответствием внутреннего фрагмента MLL...PAG последовательности пептида BrCN-pac- щепления В 1 3 / 9 1 , секвенированного нами ранее (А. И. Корнелюк, неопубликованные данные) . Данный пептид был выделен из BrCN-расщепления основной формы бычьей тирозил-тРНК синтетазы (2 х 59 кДа) , но отсутствовал у протеолитически модифицированной формы фермента (2 х 39 кДа) , т. е. относится к некаталитическому С-концевому фрагменту синтетазы. Анализ гомологии аминокислотной последова тельности бычьей тирозил-тРНК синтетазы с дру гими белками по программе BLASTP обнаружил высокую гомологию С-концевого некаталитическо го домена с С-доменом метионил-тРНК синтетазы бактерий, а также с новым цитокином — моноцит- активирующим полипептидом II [17] . О. В. Леванець, В. Г. Найденов, М. I. Вудмаска, Г. X. Мацука, О. /. Корнелюк Клонування кДНК, що кодує С-кінцеву частину тирозил-тРНК синтетази ссавців, з використання ПЛР-ампліфікованого радіоактивно міченого гібридизаційного зонда Резюме Для аналізу кДНК-бібліотеки методом полімеразної ланцюго вої реакції проведено синтез радіоактивно міченого гібриди заційного зондр з l високою питомою активністю (3,5 10 імпхв • мкг ) , специфічного до тирозил-тРНК син тетази ссавців. Проведено скринінг кДНК-бібліотеки печінки бика та одержано клон, що відповідає вказаному ферменту. Секвенування кДНК показало, що отриманий клон кодує С- кіниеву частину тирозил-тРНК синтетази печінки бика. Ви явлена гомологія амінокислотної послідовності С-кінцевого некаталітичного домена тирозил-тРНК синтетази з новим цитокіном — моноцит-активуючим поліпептидом II. О. V. Levanets, V. G. Naidenov, М. I. Woodmaska, G. Н. Matsuka, А. I. Kornelyuk Cloning of cDNA encoding C-terminal part of mammalian tyrosyl- tRNA synthetase using of PCR-amplified radioactive probe Summary Radioactive probe of high activity (3.5-10 cpm/fiig) specific to mammalian tyrosyl-tRNA synthetase has been synthesized by polymerase chain reaction. Bovine liver cDNA-library has been screened and specific clone has been detected. Sequencing of cDNA insert shows that the clone encodes C-terminal part of bovine tyrosyl-tRNA synthetase. C-terminal non-canalytic domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase shares homology of amino acid sequence with a novel cytokine — endothelial-monocyte activating polypeptide II. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Киселев Л. Л., Фаворова О. О., Лаврик О. И. Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-тРНК.—M.: Наука, 1984.—405 с. 2. Schimmel P. Classes of ARSases and the establishment of the genetic code / / T I B S . — 1 9 9 1 . — 1 6 . — N 1 . — P . l — 3 . 3. Mirande M. Aminoacyl-tRNA synthetase family from proka- ryotes and eukaryotes. Structural domains and their implica tions / / Progr. Nucl. Asid Res. Мої. Biol. —1991 — 4 0 . — P. 95—142 . 4. Корнелюк А. И., Курочкин И. В., Мацука Г. X. Тирозил- тРНК-синтетаза из печени быка. Выделение и физико- химические свойства / / Молекуляр. биология.—1988.—22, № 1.—С. 176—186. 5. Курочкин И. В., Корнелюк А. И., Мацука Г. X. Взаимо действие эукариотической тирозил-тРНК синтетазы с вы сокомолекулярными Р Н К / / Молекуляр. биология.— 1991 — 2 5 , № 3 .—С. 7 7 9 — 7 8 6 . 6. Рибкинска Т. А., Корнелюк А. И., Берестень С. Ф. и др. Иммунохимический подход к изучению структуры тиро- зил-тРНК-синтетазы из печени быка / / Там ж е . — 1 9 9 1 . — 7, № 6 . — С 33—36. 7. Леванец О. В., Найденов В. Г., Вудмаска М. И. и др. П Ц Р - а м п л и ф и к а ц и я , клонирование и секвенирование фрагмента к Д Н К , кодирующего нуклеотидсвязывающий домен тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих / / Там ж е . — 1 9 9 6 . — 1 2 , № 5 .—С. 6 6 — 7 0 . 8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное кло нирование.—М.: Мир, 1988 .—538 с. 9. Richardson С. С. Bacteriophage T4 polynucleotide kinase / / The Enzymes. Nucleic Acids. Pt A / Ed. P. D. Boyer—New York; London: Acad, press, 1981.—Vol. X I V — P . 299—314 . 10. Klenow H., Henningsen I. Selective elimination of the exo- nuclease activity of the deoxyribonucleic acid polymerase from Escherichia coli by limited proteolysis / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1970 — 6 5 , N 2 .—P. 168—175 . 11. Rigby D. W. J., Dieermann M., Rhodes C, Berg P. Labeling DNA high specific activity in vitro by nick-translation with DNA-polymerase I / / J. Мої. B io l .—1977 .—113 .—P. 237— 251. 12. Feinberg A. P., Vogelstein B. A. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity / / Anal. Biochem. — 1 9 8 3 . — 1 3 2 . — P . 6—13 . 13. Schowalter D. В., Sommer S. S. The generation of radio labeled DNA and RNA probes with polymerase chain reaction / / Ib id .—1989 .—177.—P. 9 0 — 9 4 . 14. Остерман Л. А. Исследование биологических макромоле кул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и ра диоизотопными методами.—М.: Наука, 1983 .—356 с. 15. Southern Е. М. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis III. Мої. Biol.— 1975 .—98.—P. 5 0 3 — 5 1 7 . 16. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1977 .—74.—P. 5 4 6 3 — 5 4 6 7 . 17. Kao J., Houck K., Fan Y. et al. Characterization of a novel tumor-derived cytokine. Endothelial-monocyte activating poly peptide II / / J. Biol. Chem.—1994 — 2 6 9 , N 4 0 . — P . 25106— 25119. УДК 577.217 .32 Поступила в редакцию 11.11.96 126
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155128
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	0233-7657
language	Russian
last_indexed	2025-11-24T11:44:45Z
publishDate	1997
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
record_format	dspace
spelling	Леванец, О.В. Найденов, В.Г. Вудмаска, М.И. Мацука, Г.Х. Корнелюк, А.И. 2019-06-16T09:30:02Z 2019-06-16T09:30:02Z 1997 Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда / О.В. Леванец, В.Г. Найденов, M.И. Вудмаска, Г.Х. Мацука, А.И. Корнелюк // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 2. — С. 121-126. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000473 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155128 577.217.32 Для скрининга к ДНК-библиотеки методом полимеразной цепной реакции осуществлен синтез радиоактивно меченного гибридизационного зонда с высокой удельной активностью (3,5· 109 имп·мин–1·мкг–1), специфичного к тирозил-тРНК синтетазе млекопитающих. Проведен скрининг к ДНК-библиотеки печени быка и получен клон, соответствующий указанному ферменту. Секвенирование к ДНК-вставки показало, что данный клон кодирует С-концевую часть тирозил- тРНК синтетазы из печени быка Обнаружена гомология аминокислотной последовательности С-концевого некаталитического домена тирозил-тРНК синтетазы с новым цитокином – моноцит-активирующим полипептидом П. Для аналізу кДНК-бібліотеки методом полімеразної ланцюгової реакції проведено синтез радіоактивно міченого гібридизаційного зонду з l високою питомою активністю (3,5 ·109 імп·хв · мкг ) , специфічного до тирозил-тРНК синтетази ссавців. Проведено скринінг кДНК-бібліотеки печінки бика та одержано клон, що відповідає вказаному ферменту. Секвенування кДНК показало, що отриманий клон кодує С-кінцеву частину тирозил-тРНК синтетази печінки бика. Виявлена гомологія амінокислотної послідовності С-кінцевого некаталітичного домена тирозил-тРНК синтетази з новим цитокіном – моноцит-активуючим поліпептидом II. Radioactive probe of high activity (3.5·109 cpm/μg) specific to mammalian tyrosyl-tRNA synthetase has been synthesized by polymerase chain reaction. Bovine liver cDNA-library has been screened and specific clone has been detected. Sequencing of cDNA insert shows that the done encodes C-terminal part of bovine tyrosyl-tRNA synthetase. C-terminal non-canalytic domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase shares homology of amino acid sequence with a novel cytokine – endothelial-monocyte activating polypeptide II. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда Клонування кДНК, що кодує С-кінцеву частину тирозил-тРНК синтетази ссавців, з використання ПЛР-ампліфікованого радіоактивно міченого гібридизаційного зонда Cloning of cDNA encoding C-terminal part of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase using of PCR-amplified radioactive probe Article published earlier
spellingShingle	Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда Леванец, О.В. Найденов, В.Г. Вудмаска, М.И. Мацука, Г.Х. Корнелюк, А.И. Структура и функции биополимеров
title	Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда
title_alt	Клонування кДНК, що кодує С-кінцеву частину тирозил-тРНК синтетази ссавців, з використання ПЛР-ампліфікованого радіоактивно міченого гібридизаційного зонда Cloning of cDNA encoding C-terminal part of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase using of PCR-amplified radioactive probe
title_full	Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда
title_fullStr	Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда
title_full_unstemmed	Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда
title_short	Клонирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда
title_sort	клонирование кднк, кодирующей с-концевую часть тирозил-трнк синтетазы млекопитающих, с использованием пцр-амплифицированного радиоактивно меченного гибридизационного зонда
topic	Структура и функции биополимеров
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155128
work_keys_str_mv	AT levanecov klonirovaniekdnkkodiruûŝeiskoncevuûčastʹtiroziltrnksintetazymlekopitaûŝihsispolʹzovaniempcramplificirovannogoradioaktivnomečennogogibridizacionnogozonda AT naidenovvg klonirovaniekdnkkodiruûŝeiskoncevuûčastʹtiroziltrnksintetazymlekopitaûŝihsispolʹzovaniempcramplificirovannogoradioaktivnomečennogogibridizacionnogozonda AT vudmaskami klonirovaniekdnkkodiruûŝeiskoncevuûčastʹtiroziltrnksintetazymlekopitaûŝihsispolʹzovaniempcramplificirovannogoradioaktivnomečennogogibridizacionnogozonda AT macukagh klonirovaniekdnkkodiruûŝeiskoncevuûčastʹtiroziltrnksintetazymlekopitaûŝihsispolʹzovaniempcramplificirovannogoradioaktivnomečennogogibridizacionnogozonda AT kornelûkai klonirovaniekdnkkodiruûŝeiskoncevuûčastʹtiroziltrnksintetazymlekopitaûŝihsispolʹzovaniempcramplificirovannogoradioaktivnomečennogogibridizacionnogozonda AT levanecov klonuvannâkdnkŝokoduêskíncevučastinutiroziltrnksintetazissavcívzvikoristannâplramplífíkovanogoradíoaktivnomíčenogogíbridizacíinogozonda AT naidenovvg klonuvannâkdnkŝokoduêskíncevučastinutiroziltrnksintetazissavcívzvikoristannâplramplífíkovanogoradíoaktivnomíčenogogíbridizacíinogozonda AT vudmaskami klonuvannâkdnkŝokoduêskíncevučastinutiroziltrnksintetazissavcívzvikoristannâplramplífíkovanogoradíoaktivnomíčenogogíbridizacíinogozonda AT macukagh klonuvannâkdnkŝokoduêskíncevučastinutiroziltrnksintetazissavcívzvikoristannâplramplífíkovanogoradíoaktivnomíčenogogíbridizacíinogozonda AT kornelûkai klonuvannâkdnkŝokoduêskíncevučastinutiroziltrnksintetazissavcívzvikoristannâplramplífíkovanogoradíoaktivnomíčenogogíbridizacíinogozonda AT levanecov cloningofcdnaencodingcterminalpartofmammaliantyrosyltrnasynthetaseusingofpcramplifiedradioactiveprobe AT naidenovvg cloningofcdnaencodingcterminalpartofmammaliantyrosyltrnasynthetaseusingofpcramplifiedradioactiveprobe AT vudmaskami cloningofcdnaencodingcterminalpartofmammaliantyrosyltrnasynthetaseusingofpcramplifiedradioactiveprobe AT macukagh cloningofcdnaencodingcterminalpartofmammaliantyrosyltrnasynthetaseusingofpcramplifiedradioactiveprobe AT kornelûkai cloningofcdnaencodingcterminalpartofmammaliantyrosyltrnasynthetaseusingofpcramplifiedradioactiveprobe

Institution

Similar Items