Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов
Исследованы процессы связывания и поглощения клетками Acholeplasma laidlawii PG-8, Mycoplasma fermentans PG-18 и M. pneumoniae FH тиофосфатных, дитиофосфатных и метилфосфонатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных «сигнатурным» последовательностям 16S рРНК. Обнаружены различия в эф...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1997 |
| Main Authors: | , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1997
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155136 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов / О.В. Егоров, Л.П. Панченко, И.Г. Скрипаль, Н.В. Амирханов // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 2. — С. 142-149. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860087951071903744 |
|---|---|
| author | Егоров, О.В. Панченко, Л.П. Скрыпаль, И.Г. Амирханов, Н.В. |
| author_facet | Егоров, О.В. Панченко, Л.П. Скрыпаль, И.Г. Амирханов, Н.В. |
| citation_txt | Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов / О.В. Егоров, Л.П. Панченко, И.Г. Скрипаль, Н.В. Амирханов // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 2. — С. 142-149. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Исследованы процессы связывания и поглощения клетками Acholeplasma laidlawii PG-8, Mycoplasma fermentans PG-18 и M. pneumoniae FH тиофосфатных, дитиофосфатных и метилфосфонатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных «сигнатурным» последовательностям 16S рРНК. Обнаружены различия в эффективности связывания данными клетками тиофосфатных и метилфосфонатных аналогов олигонуклеотидов. Так, уровень сорбции тиофосфатов клетками A. laidlawii PG-8 превышал долю связавшихся с этими клетками метилфосфонатов более чем в 5 раз. Установлен факт значительного накопления клетками молликутов тио- и дитиофосфатных аналогов олигонуклеотидов. Внутриклеточная концентрация этих соединений у всех изученных микроорганизмов превышала внеклеточную в 104–105 раз. На основе полученных экспериментальных данных сделано предположение о существовании в клетках молликутов двух различных механизмов поглощения аналогов олигонуклеотидов, несущих отрицательный заряд в рибозофосфатном остове, неионных аналогов.
Досліджено процеси зв'язування і поглинання клітинами Acholeplasma laidlawii PG-8, Mycoplasma fermentans PG-18 і M. pneumoniae FH тіофосфатних, дитіофосфатних та метил-фосфонатних аналогів олігодезоксирибонуклеотидів, комплементарних «сигнатурним» послідовностям 16S рРНК. Виявлено відмінності в ефективності зв'язування даними клітинами тіофосфатних та метилфосфонатних аналогів олігонуклеотидів. Так, рівень сорбції тіофосфатів клітинами A. laidlawii PG-8 перевищував такий метилфосфонатних аналогів більше ніж в 5 разів. Встановлено факт значного накопичення клітинами молікутів тіо- і дитіофосфатних аналогів вивчених олігонуклеотидів. Внутрішньоклітинна концентрація цих сполук у досліджених штамів молікутів перевищувала позаклітинну в 104–105 разів. На основі отриманих еспериментальних даних зроблено припущення про наявність у клітинах молікутів двох різних механізмів поглинання аналогів олігонуклеотидів, що несуть від'ємний заряд в рибозофосфатному остові, та неіонних аналогів.
Processes of absorption and uptake by cells of Acholeplasma laidlawii PG-8, Mycoplasma fermentans PG-18 and Mycoplasma pneumoniae FH of phosphorothioate, phosphorodithioate and methylphosphonate analogs of oligodeoxynucleotides which are co mplementary to «signature» 16S rRNA sequences have been investigated. Distinctions in efficiency of absorption by given cells of phosphorothioate and methylphosphonate analogs of oligonucleotides are found out. So, the level sorption of thioates by the cells of A. laidlawii PG-8 exceeded a share binding with these cells of methylphosponates more than in 5 times. A fact of significant accumulation by the mollicute cells of thio- and dithioate analogs of oligonucleotides is established. The intracellutar concentration of these compounds at all investigated microorganisms exceeded them extracellular in 104 –105 time. On the basis of received of experimental data the assumption of existence in mollicute cells two of various gears of uptake of analogs of oligonucleotides bearing by negative charge in sugar-phosphate backbone and neutral oligonuc-leotide analogs is stated.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:21:08Z |
| format | Article |
| fulltext |
ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1997. Т. 13. № 2
К Л Е Т О Ч Н А Я Б И О Л О Г И Я
Усвоение клетками молликутов антисмысловых
аналогов олигодезоксирибонуклеотидов
О- В. Егоров, Л- П. Панченко, И. Г. Скрипаль, Н. В- Амирханов1
Институт микробиологии и вирусологии им. Д . К. Заболотного HAH Украины
252143, Киев, ул. Академика Заболотного, 154
*Hnn «Биосан»
630090, Новосибирск, просп. Лаврентьева, 8
Исследованы процессы связывания и поглощения клетками Acholeplasma laidlawii PG-8, Mycoplasma
fermentans PG-J8 и M. pneumoniae FH тиофосфатных, дитиофосфатных и метилфосфонатных
аналогов олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных «сигнатурным» последовательностям
J6S рРНК. Обнаружены различия в эффективности связывания данными клетками тиофосфат
ных и метилфосфонатных аналогов олигонуклеотидов. Так, уровень сорбции тиофосфатов
клетками A. laidlawii PG-8 превышал долю связавшихся с этими клетками метилфосфонатов
более чем в 5 раз. Установлен факт значительного накопления клетками молликутов тио- и
дитиофосфатных аналогов олигонуклеотидов. Внутриклеточная концентрация этих соединений у
всех изученных микроорганизмов превышала внеклеточную в Ю4—Ю5 раз. На основе полученных
экспериментальных данных сделано предположение о существовании в клетках молликутов двух
различных механизмов поглощения аналогов олигонуклеотидов, несущих отрицательный заряд в
рибозофосфатном остове, неионных аналогов.
Введение. При создании эффективных средств ин-
гибирования функций нуклеиновых кислот в ин-
тактных клетках в настоящее время все большее
внимание уделяется использованию не природных
антисмысловых олигонуклеотидов, а их разнооб
разных аналогов. Основная задача сводится к тому,
чтобы синтезировать олигонуклеотидные аналоги,
которые обладали бы: 1) повышенным сродством к
нуклеиновым кислотам с сохранением высокой спе
цифичности при их связывании с участком-ми
шенью; 2) устойчивостью к действию нуклеаз; 3)
высокой проницаемостью через клеточную мембра
ну [1] .
Оптимальным способом отбора аналогов олиго
нуклеотидов, соответствующих перечисленным вы
ше критериям, может быть только испытание та
ких соединений на живых клетках различных ор
ганизмов.
Целью настоящей работы было исследование
способности клеток отдельных представителей
класса Mollicutes связывать и поглощать тиофос-
© О. В Е Г О Р О В , Л. П. П А Н Ч Е Н К О , И. Г. С К Р И П А Л Ь ,
Н. В. А М И Р Х А Н О В , 1997
фатные , дитиофосфатные и метилфосфонатные
аналоги олигодезоксирибонуклеотидов, комплемен
тарные определенным, так называемым «сигнатур
ным», участкам 16S р Р Н К этих микроорганизмов.
Материалы и методы. В работе использовали
клетки микоплазм — Acholeplasma laidlawii PG-8 ,
Mycoplasma fermentans PG-18 и M. pneumoniae
FH, полученные из коллекции культур микоплазм
(г. Орхус, Дания) . Клетки молликутов выращивали
в среде СМ ИМВ-72 с 10 % сыворотки лошади при
температуре 37 °С [2 ].
Для изучения связывания с клетками мико
плазм использовали следующие олигодезоксирибо-
нуклеотидные аналоги (в работе исследованы оли-
гонуклеотиды только дезоксиряда, поэтому пре
фикс «d» перед названием опущен) :
5 ' -BnzNHp*AjpG_pGjpA_pG_pG_pTpSCH 3 -3 '—
реагент I;
5 ' -BnzNHp*ApsGpsGpsApsGpsGpsTpSCH 3 - 3 ' —
реагент II;
5 -BnzNHp*CpsApsTpsTpsGpsTpsGps (Aps) 5 - р
T p s T p S C H 3 - 3 ' — реагент III;
5-BnzNHp*CpssApssTpssTpssGpssTpssGpss-
142
С В Я З Ы В А Н И Е КЛЕТКАМИ М О Л Л И К У Т О В А Н Т И С М Ы С Л О В Ы Х АНАЛОГОВ
(Apss ) 5 TpssTpSCH 3 -3 ' — реагент IV;
5 -p*CpsApsTpsTpsGpsTpsGps (Aps ) 5 TpsTpS-
СН3 -З ' — реагент V;
5 -p*CpssApssTpssTpssGpssTpssGpss (Apss ) 5 -
T p s s T p S C H 3 - 3 ' — реагент VI;
где р* — [ 3 2 Р 1-фосфат; Bnz — С Н 2 С 6 Н 5 ;
О О S
II II II
— О — Р — О — ; — О — Р — О — ; —О—Р—О—
I I I
С Н 3 S" S"
_Р ps pss
Уровень сорбции аналогов олигодезоксирибо
нуклеотидов с клетками молликутов сравнивали с
таковым «нормальных» олигодезоксирибонуклеоти
дов с фосфодиэфирными межнуклеотидными связя
ми, имеющих следующий состав:
5 - B n z N H p * A p G p G p A p G p G p T p S C H 3 - 3 ' — pea
гент VII;
5 - B n z N H p * C p A p T p T p G p T p G p ( A p ) 5 T p T p S C H 3 -
3 ' — реагент VIII.
Реагенты I, II, VII комплементарны последова
тельности Шайна-Дальгарно прокариотической 16S
рРНК; реагенты III—VI, VIII — последовательно
сти 355—368 16S р Р Н К микоплазм, уреаплазм и
спироплазм. В ряде экспериментов использовали
бензиламидное производное метилфосфонатного
а н а л о г а т е т р а д е к а т и м и д и л а т а : 5 ' -
B n z N H p * T _ p ( T _ p ) 1 2 T p S C H 3 - 3 , ~ реагент IX;
Природные олигодезоксирибонуклеотиды син
тезировали твердофазным Н-фосфонатным мето
дом [3 ]; тио- и дитиофосфатные аналоги олигоде
зоксирибонуклеотидов — блочным методом в рас
творе по модифицированной триэфирной методике
[4] с использованием мономеров, защищенных по
межнуклеотидным фосфатам и аминогруппам экзо-
циклических оснований. После удаления всех за
щитных групп целевой тиофосфат выделяли ионо
обменной хроматографией, а дитиофосфат — пре
паративным гель-электрофорезом в 20 % - м ПААГ,
содержащем 7 М мочевину. Наличие межнуклео-
тидной тио- и дитиофосфатных групп в соединени
ях д о к а з а н а методом 3 1 Р - Я М Р спектроскопии.
Спектры записывали на спектрометре АС-200
(«Впдкег», Германия) в 50 % - м метаноле. Метил-
фосфонатные аналоги олигонуклеотидов (реагент I,
IX) синтезировали по аналогии с описанной мето
дикой [5 ] . Синтезированные олигонуклеотиды с
ф о с ф о д и э ф и р н ы м и межнуклеотидными связями
метили 3 2 Р , как описано [6 ] .
Фосфорилирование и введение [ Э 2 Р ]-метки в
метилфосфонатные, тио- и дитиофосфатные анало
ги олигонуклеотидов проводили согласно описан
ной методике [5] . Реакционную смесь объемом
150—500 мкл, содержащую 0,05 М трис-HCl (рН
9,6), 0,01 М M g S 0 4 , 5 мМ дитиотреитол, 20 мкМ
спермидин, 0,1 мМ ЭДТА, 50—150 нМ метилфос-
фонатный или тиофосфатный аналог, 1 нМ [у- 3 2 Р 1-
АТФ (0,5—1 мКи) , 100—300 нМ А Т Ф и 20 ед.
активности Т4-полинуклеотидкиназы, инкубирова
ли в течение 3—4 ч при 37 °С. [ 3 2 Р ]-меченный
продукт выделяли препаративным гель-электрофо
резом в 20 % - м ПААГ, содержащем 7 М мочевину.
5 ' -Бензиламидные производные олигонуклео
тидов и их аналоги получали аналогично описан
ной методике [7 ] по следующей схеме:
P h 3 P , (Pys ) 2 , Melm, B n z N H 2
p-ON-д BnzNH-p-ON-д,
где p-ON-д — 5-фосфорилированный олигонуклео-
тид; P h 3 P — трифенилфосфин; ( P y S ) 2 — 2 , 2 - д и п и -
р и д и л д и с у л ь ф и д ; M e l m — N - м е т и л и м и д а з о л ;
BnzNH 2 — бензиламид.
Исходные природные олигодезоксирибонуклео
тиды и их аналоги переводили вначале в цетавло-
новые соли. Для этого 2 ОЕ каждого из вышеука
занных олигонуклеотидов растворяли в 20 мкл
воды, добавляли 5—8 мкл 8 %-го раствора цетил-
триметиламмонийбромида и осадок триметилаце-
тиловых солей олигонуклеотидов и их аналогов
осаждали центрифугированием. Осадок промывали
20 мкл воды, сушили в вакууме над Р 2 0 5 и раство
ряли в 40 мкл диметилформамида (ДМФА). Затем
последовательно добавляли 5 мкл 0,5 М раствора
2 ,2-дипиридилдисульфида в абсолютном ДМФА,
5 мкл 0,5 М раствора трифенилфосфина в ДМФА.
Через 10 мин в реакционную смесь добавляли
5 мкл 0,5 М раствора бензиламина в ДМФА, вы
держивали 20 мин при 20 °С и осаждали олигонук-
леотидное производное добавлением 1 мл 2 %-го
раствора LiC10 4 в ацетоне, осадок промывали аце
тоном. Полученные таким образом производные
природных олигонуклеотидов и их аналогов очища
ли последовательно ионообменной хроматографией
на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой DE-32 (1,5 *
х 16 см) в градиенте концентрации К Н 2 Р 0 4 , рН 7,5
(0—0,3 М, 600 мл, 30 м л / ч ) , и высокоэффективной
обращеннофазовой хроматографией на колонках с
сорбентом Lichrosorb С18. Выход бензиламидных
производных составил 80—90 % .
Связывание антисмысловых аналогов олиго
нуклеотидов с природной фосфодиэфирной связью
и их аналогов клетками молликутов исследовали,
как описано [8 ]. Кинетические кривые связывания
143
Е Г О Р О В О В И Д Р .
меченых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов
клеткам микоплазм в зависимости от возраста
культур получали по аналогии с описанной мето
дикой [9 ].
Поглощение аналогов олигодезоксирибонукле
отидов клетками микоплазм изучали, сравнивая
содержание меченых реагентов, оставшихся в среде
культивирования, с количеством этих реагентов,
обнаруживаемых в клеточных лизатах. Клетки ми
коплазм после инкубации с мечеными аналогами
олигонуклеотидов трижды отмывали 0,28 М раство
ром NaCl , ресуспендировали в 1/10 объема ТЕ-бу-
фера (0,125 М трис-HCl, рН 8,0, 0,01 М ЭДТА ) и
лизировали, добавляя DS-Na до 1 % . После удале
ния экстракцией хлороформом белков из клеточно
го лизата подсчитывали радиоактивный материал в
органической и водной фазах . Содержание радио
активного материала в водной фазе принимали за
количество меченых реагентов, поглощаемых клет
ками микоплазм.
Результаты и обсуждение . В первых сериях
экспериментов была исследована кинетика сорбции
метилфосфонатных, тиофосфатных и дитиофосфат
ных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов, комп
лементарных определенным участкам 16S рРНК
молликутов с клетками A. laidlawii PG-8 . При этом
установлено, что основная доля из вносимых в
питательную среду реагентов II—IV в концентра
ции 100 нМ связывается с клетками этого молли-
кута при 37 °С в течение 1 ч, тогда как кинетика
связывания реагента I была более длительная и
достигала 3 ч (рис. 1). Уровень сорбции олигонук-
леотидных аналогов клетками A. laidlawii PG-8 был
различен: доля связавшихся тио- и дитиофосфат
ных аналогов олигонуклеотидов клетками этого
молликута значительно превышала количество свя-
30
0 1 2 3 Время, ч
Рис. 1. Кинетика связывания реагентов І (У), II (2) , III (3) , IV
(4) клетками A. laidlawii PG-8
а б в Вид молликутов
Рис. 2. Влияние защиты 5'-концевого меченого фосфата бензи-
ламидной группировкой на уровень связывания тио- и дитио-
фосфатов клетками A. laidlawii P G - 8 (а), М. pneumoniae FH (б),
М. fermentans PG-18 (в): 1 — реагент III; 2 — реагент V; і —
реагент IV; 4 — реагент VI
завшихся метилфосфонатных аналогов. Такая же
закономерность наблюдалась и при инкубации дан
ных реагентов с клетками М. pneumoniae FH и М.
fermentans PG-18 .
Ранее Замечником [10] установлено, что фос-
фомоноэстеразная активность в эукариотических
клетках заметно превосходит эндонуклеазную. У
представителей класса Mollicutes т акже обнаруже
на значительная фосфатазная активность [11 1. По
этому как в приведенных выше экспериментах по
исследованию кинетики сорбции антисмысловых
аналогов олигонуклеотидов, так и во всех последу
ющих мы использовали олигонуклеотидные произ
водные, несущие на 5 ' -конце бензиламидные груп
пировки для защиты 5 '-концевого меченого фосфа
та от действия фосфатаз . Сравнение процессов
сорбции тиоаналогов олигонуклеотидов с бензила-
мидной группой на 5 ' -конце (реагенты III, VI) и
тиоаналогов с обычным фосфолирированным 5 -
концом (реагенты V, VI) продемонстрировало от
сутствие заметных отличий в уровне связывании
этих реагентов клетками молликутов (рис. 2) .
Результаты исследования связывания аналогов
олигодезоксирибонуклеотидов с различными пред
ставителями класса Mollicutes представлены на рис.
3. Нами установлено, что клетки отдельных пред
ставителей класса Mollicutes в различной степени
сорбировали олигонуклеотидные аналоги в зависи
мости от их модификации. Наивысший уровень
связывания олигомеров наблюдался у всех изучен
ных штаммов микоплазм при инкубировании их с
тиофосфатными аналогами. Так , для клеток А.
laidlawii PG-8 он составил 26 нМ на Ю8 КОЕ при
144
С В Я З Ы В А Н И Е КЛЕТКАМИ М О Л Л И К У Т О В А Н Т И С М Ы С Л О В Ы Х АНАЛОГОВ
в Вид молликутов
Рис. 3. Сорбция клетками A. Laidlawii PG-8 (я), М. pneumoniae
FH (б) , М. fermentans P G - 1 8 (в) антисмысловых олигодезокси-
рибонуклеотидов и их аналогов: / — реагент I; 2 — II; 3 — VII;
4 — III; 5 — IV; 6 — VIII; 7 — IX (клетки молликутов, приме
няемые в данном эксперименте, находились в стадии логариф
мического роста, время инкубирования с реагентами составляло
4 ч, концентрация используемых олигонуклеотидов в питатель
ной среде равнялась 100 нМ)
использовании 7-звенных тиоаналогов (реагент II)
и 22 нМ на 10 8 КОЕ в случае использования
14-звенных тиофосфатов (реагент II I ) , что значи
тельно превосходило количество сорбировавшихся
этими же клетками природных олигодезоксирибо-
нуклеотидов (реагенты VII, VIII) , дитиофосфатных
(реагент IV) и метилфосфонатных аналогов олиго
нуклеотидов (реагенты I, IX) (см. рис. 3) . Доля
связавшихся тиофосфатных аналогов олигонуклео
тидов клетками М. fermentans PG-18 и М. pneu
moniae FH практически не отличалась от таковой
природных олигодезоксирибонуклеотидов и лишь
незначительно превосходила уровень связывания
дитиофосфатов (см. рис. 3 ) . Уровень связывания
метилфосфонатных аналогов олигодезоксирибонук
леотидов у всех трех изученных видов молликутов
был незначителен и не превышал 5 нМ на 10 8 КОЕ
при инкубировании клеток как с 7-звенными, так
и с тетрадекатимидилатными метилфосфонатными
аналогами олигонуклеотидов. Увеличение нуклео-
тидной цепи у всех изученных аналогов олигоде
зоксирибонуклеотидов с 7 до 14 нуклеотидных
оснований практически не сказывалось на уровне
их связывания с клетками микоплазм. Нами не
обнаружены различия в уровне сорбции метилфос
фонатных аналогов олигонуклеотидов клетками
молликутов в зависимости от их видовой или род
вой принадлежности, тогда как при исследовании
сорбции тио- и дитиофосфатных аналогов наблюда
ются заметные отличия в связывании этих реаген
тов клетками представителей родов Acholeplasma и
Mycoplasma. Так , количество связавшихся тиоана
логов (реагенты II и III) с клетками A. laidlawii
PG-8 почти в два раза превышало таковое тиофос
фатов клетками М. fermentans PG-18 и М. pneu
moniae FH (см. рис. 3 ) .
Уровень связывания клетками A. laidlawii PG-8
дитиофосфатов и природных олигонуклеотидов был
также значительно выше, чем у М. pneumoniae FH
и М. fermentans PG-18 . Возможно, обнаруженные
различия в связывании антисмысловых тиоанало
гов и природных олигонуклеотидов клетками А.
laidlawii PG-8 и остальными представителями рода
Mycoplasma обусловлены их биохимическими и
физиологическими особенностями. В пользу пред
положения о наличии зависимости между общей
физиологической активностью и уровнем связыва
ния тиоаналогов свидетельствует тот факт , что
интенсивность роста на среде СМ ИМВ-72 у штам
мов, относящихся к роду Mycoplasma, была намно
го ниже, чем у клеток A. laidlawii PG-8 (рис. 4) .
Кроме того, обнаруживаются значительные разли
чия в связывании тиоаналогов клетками моллику
тов в зависимости от их возраста. Наиболее актив
но все изучаемые тио- и дитиоаналоги (реагенты
II—IV) связывались клетками молликутов, находя
щимися в возрасте от 24 до 36 ч, но при достиже
нии этими клетками фазы стационарного роста
уровень сорбции, в частности реагента II, резко
снижался (см. рис. 4) . Т а к а я ж е картина наблюда
лась при связывании клетками молликутов реаген
тов III и IV. Тогда как уровень сорбции метилфос
фонатных аналогов (реагенты I, IX) был одинаков
как для клеток молликутов, находящихся в фазе
логарифмического роста, так и для клеток, находя
щихся в фазе стационарного роста (см. рис. 4) .
24 36 48 60 72
Рис. 4. Зависимость количества связанных с клетками микоп
лазм аналогов антисмысловых олигонуклеотидов от возраста
клеточных культур. Связывание реагентов I и И клетками А.
laidlawii PG-8 (а, б ) , М. pneumoniae FH (в, г) , М. fermentans
PG-18 (д, е). Ростовая активность клеток A. laidlawii PG-8 (У);
М. pneumoniae FH (2); М. fermentans P G - 1 8 ( і )
145
Е Г О Р О В О В. И Д Р
Контроль 5 нМ азид натрия Контроль 5 нМ азид натрия
Рис. 5. Влияние азида натрия на связывание (а) и поглощение (б) метилфосфонатных и тиофосфатных аналогов олигонуклеотидов
(реагенты I и И) клетками A. laidlawii PG-8 (У, 2 ) , М. pneumoniae FH (3, 4 ) , М. fermentans PG-18 (J, 6)
Обнаруженные нами отличия в интенсивности
связывания клетками молликутов тиофосфатов и
метилфосфонатов абсолютно не совпадают с утвер
дившимися представлениями о том, что у олиго-
нуклеотидных аналогов, у которых гидрофильность
снижается за счет уменьшения отрицательного за
ряда в межнуклеотидных фосфатах, повышается
способность связываться с мембранами и проникать
сквозь них. Отметим, что результаты, демонстри
рующие увеличение связывания и проникновения
неионных аналогов олигонуклеотидов, получены в
основном на липосомах [12] или на эукариотиче-
ских клетках [13] . У молликутов из-за отсутствия
механизма синтеза предшественников нуклеино
вых кислот и наличия острой потребности в полу
чении экзогенных источников этих соединений,
вероятно, существует специфический механизм по
глощения как нуклеотидов, так и небольших их
олигомеров. Поэтому прямое сопоставление данных
об усваивании олигонуклеотидов и их разнообраз
ных аналогов клетками эукариот и клетками мол
ликутов неправомерно.
Проведенные нами ранее исследования способ
ности поглощения клетками микоплазм природных
олигонуклеотидов, модифицированных как гидро
фобными, так и гидрофильными группировками по
5' и 3 ' -концам, показали отсутствие различий в
характере и уровне сорбции таких соединений
этими микроорганизмами [6, 8, 9 ] . В отличие от
этого представленные в настоящей работе данные
демонстрируют существенную разницу в процессе
связывания и поглощения клетками молликутов
аналогов олигонуклеотидов с заряженными меж
нуклеотидными фосфатами (тиофосфатных, дитио
фосфатных) и их неионных аналогов (метилфосфо
натных) .
Как известно [14] , основную роль в процессах
облегченной диффузии и активном транспорте че
рез клеточную мембрану органических соединений
играют белки, участующие в рецепции и переносе
этих веществ.
Мы предполагаем, что основополагающим мо
ментом в узнавании клетками микоплазм олиго
нуклеотидов служит именно их заряженный рибо-
зофосфатный остов. Поэтому и столь существенны
различия в связывании клетками молликутов гид
рофобных и гидрофильных аналогов олигонуклео
тидов, которые можно объяснить различными ме
ханизмами связывания этими микроорганизмами
неионных аналогов (метилфосфонатных) и олиго
нуклеотидов, имеющих отрицательный заряд на
фосфатных остатках (тиофосфатов, дитиофосфатов
и олигонуклеотидов с фосфодиэфирными связями) .
Косвенно такое предположение подтверждают дан
ные о неадекватном действии азида натрия на
процессы сорбции и поглощения клетками молли
кутов метилфосфонатных аналогов и тиоаналогов
(рис 5, а, б). При добавлении в среду 5 мМ азида
натрия уровень связывания тиоаналогов с клетками
Л. laidlawii PG-8 уменьшался почти в 5 раз, а доля
связавшихся с клетками М. pneumoniae FH и А/.
fermentans PG-18 тиофосфатов снижалась 19 до
5 %, тогда как уровень сорбции клетками этих
молликутов метилфосфонатных аналогов олигонук
леотидов при внесении в среду культивирования
N a N 3 оставался неизменным для всех используе
мых штаммов молликутов (рис. 5, а). Внесение в
среду культивирования 5 мМ N a N 3 приводит к
полному угнетению поглощения тиофосфатов клет
ками молликутов, но почти не влияет процесс
поглощения ими метилфосфонатных аналогов оли
гонуклеотидов (рис. 5, б). Мы предполагаем, что
146
С В Я З Ы В А Н И Е КЛЕТКАМИ М О Л Л И К У Т О В А Н Т И С М Ы С Л О В Ы Х АНАЛОГОВ
Сравнение концентраций аналогов олигонуклеотидов в среде и в клетках микоплазм
поглощение природных олигодезоксирибонуклеоти-
дов, исследованное нами раннее [8 ], и их тиоана
логов клетками микоплазм осуществляется за счет
активного АТФ-зависимого транспорта, подавляю
щегося, вероятно, при добавлении в инкубацион
ную смесь азида натрия. Проникновение метилфос
фонатных аналогов олигонуклеотидов в клетки
молликутов, возможно, является результатом об
легченной диффузии , а довольно высокий уровень
сорбции клетками этих неионных аналогов можно
объяснить значительной гидрофобностью таких
производных, поэтому уровень связывания и погло
щения данными микроорганизмами метилфосфона-
тов остается практически неизменным как в отсут
ствие, так и в присутствии азида натрия в среде
культивирования.
Отметим, что на наличие различных рецептор-
но-опосредованных механизмов в связывании гид
рофобных аналогов и природных олигонуклеотидов
0 ' і і 1 і і 1
1:0 1:1 1:2 1:4 1:8 1:10
Соотношение тиоаналог : конкурент
Рис. 6. Влияние природных олигонуклеотидов (У) и метилфос
фонатных аналогов (2) на поглощение клетками A. laidlawii
PG-8 тиофосфатов (реагент И)
147
Е Г О Р О В О В. И Д Р
в клетках эукариот указывали Лок с соавт. [15] ,
обнаружившие, что внесение в среду культивиро
вания наряду с природными олигодезоксирибонук-
леотидами их метилфосфонатных аналогов не вли
яло на проникновение природных олигонуклеоти
дов, тогда как добавление тиофосфатных аналогов
снижало поглощение миелоидными клетками оли
гонуклеотидов с фосфодиэфирными связями в ре
зультате их конкурентного ингибирования тиоана-
логами.
Мы также установили факт подавления про
цесса поглощения тиоаналогов клетками A. laid
lawii PG-8 при одновременном внесении в инкуба
ционную среду меченых тиофосфатов и «холодных»
природных олигодезоксирибонуклеотидов: при 10-
кратном избытке последних уровень поглощения
клетками A laidlawii PG-8 меченых тиофосфатов
снижался до 0. Тогда как при добавлении в среду
культивирования одновременно меченых тиофос
фатов и метилфосфонатов не приводило к сниже
нию усваивания тиоаналогов этим микроорганиз
мом (рис. 6) .
Очень важным показателем перспективности
использования тиоаналогов олигодезоксирибонук
леотидов как нового средства борьбы с патогенны
ми молликутами, к которому не может быть адап
тации у таких патогенов, является факт значитель
ного накопления этих соединений в их клетках.
Более 75 % общего количества связавшихся с
клетками молликутов тиофосфатов обнаружива
лось внутриклеточно. В таблице приведены резуль
таты поглощения тиоаналогов клетками A. laidlawii
PG-8 , М. pneumoniae FH, М. fermentans PG-18 .
Мы рассчитали, что объем одной клетки молликута
равен в среднем 0,07 а м 3 (размер клетки моллику
та колеблется от 0,33 до 1 мкм в диаметре [16]) .
Как видно из приведенных данных, внутриклеточ
ная концентрация реагентов II—IV в клетках у
всех изученных штаммов молликутов варьировала
в пределах 1—8 мМ, тогда как концентрация этих
реагентов в окружающей среде колебалась от 100
до 1000 нМ.
Таким образом, концентрация меченых тиоа
налогов олигонуклеотидов в клетке превышала их
концентрацию вне клетки в 10 4 —10 5 раз. Данные,
представленные в таблице, подтверждают наши
предположения о существовании у молликутов ме
ханизма активного транспорта из внешней среды
олигонуклеотидов или их аналогов, имеющих отри
цательный заряд в рибозофосфатном остове. Явле
ние активного транспорта олигонуклеотидов извне
внутрь клетки нехарактерно для всех других орга
низмов, с которыми исследователи работали ранее
т .
Полученные результаты дают основание пред
положить также , что на эффективность активною
поглощения природных олигонуклеотидов или их
аналогов клетками молликутов из окружающей
среды основное влияние оказывает заряд их меж-
нуклеотидных фосфатных групп. Нами обнаружен
факт существенного накопления тиофосфатных
аналогов олигодезоксирибонуклеотидов в клетках
микоплазм, что позволяет надеяться на получение
ощутимых терапевтических эффектов для подавле
ния микоплазмозов при использовании даже нано-
молярных количеств тиофосфатных аналогов оли
гонуклеотидов.
О. В. Егоров, Л. П. Панченко, /. Г. Скрипаль, Н. В. Амірханов
З а с в о є н н я к л і т и н а м и мол ікут ів а н т и с е н с о в и х аналогів
олігодезоксирибонуклеотидів
Резюме
Досліджено процеси зв'язування і поглинання клітинами Acho-
leplasma laidlawii PG-8, Mycoplasma fermentans PG-18 і M.
pneumoniae FH тіофосфатних, дитіофосфатних та метил-
фосфонатних аналогів олігодезоксирибонуклеотидів, компле
ментарних «сигнатурним» послідовностям 16S рРНК. Вияв
лено відмінності в ефективності зв'язування даними
клітинами тіофосфатних та метилфосфонатних аналогів
олігонуклеотидів. Так, рівень сорбції тіофосфатів клітинами
A. laidlawii PG-8 перевищував такий метилфосфонатних ана
логів більше ніж в 5 разів. Встановлено факт значного нако
пичення клітинами молікутів тіо- і дитіофосфатних аналогів
вивчених олігонуклеотидів. Внутрішньоклітинна концентрація
цих сполук у досліджених штамів молікутів перевищувала
позаклітинну в 10—10 разів. На основі отриманих еспери-
ментальних даних зроблено припущення про наявність у клі
тинах молікутів двох різних механізмів поглинання аналогів
олігонуклеотидів, що несуть від'ємний заряд в рибозофосфат-
ному остові, та неіонних аналогів.
О. V. Yegorov, L. P. Panchenko, 1. G. Skripal, N. V. Amirkhanov
U p t a k e the mol l i cute c e l l s of the a n a l o g s of an t i s ense
oligodeoxynucleotides
Summary
Processes of absorption and uptake by cells of Acholeplasma
laidlawii PG-8, Mycoplasma fermentans PG-18 and Mycoplasma
pneumoniae FH of phosphorothioate, phosphorodithioate and me-
thylphosphonate analogs of oligodeoxynucleotides which are со
mplementary to «signature» 16S rRNA sequences have been investi
gated. Distinctions in efficiency of absorption by given cells of
phosphorothioate and methylphosphonate analogs of oligonucleo
tides are found out. So, the level sorption of thioates by the cells of
A. laidlawii PG-8 exceeded a share binding with these cells of
methylphosponates more than in 5 times. A fact of significant
accumulation by the mollicute cells of thio- and dithioate analogs of
oligonucleotides is established. The intracellular concentration of
these compounds a | all investigated microorganisms exceeded them
extracellular in 10 —10 time. On the basis of received of experi
mental data the assumption of existence in mollicute cells two of
various gears of uptake of analogs of oligonucleotides bearing by
negative charge in sugar-phosphate backbone and neutral oligonuc
leotide analogs is stated.
148
С В Я З Ы В А Н И Е КЛЕТКАМИ М О Л Л И К У Т О В А Н Т И С М Ы С Л О В Ы Х АНАЛОГОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ulmann Е., Реутап A. Antisense oligonucleotides: a new
therapeutic principle / / Chem. Revs—1990— 90, N 4.—
P. 5 4 3 — 5 8 4 .
2. Скрипаль И. Г., Малиновская Л. П. Среда СМ ИМВ-72 для
выделения и культивирования фитопатогенных микоплазм
/ / Микробиол. ж у р н . — 1 9 8 4 . — 4 6 , № 2 .—С. 71—75.
3. Froehler В. С, Ng Р. С, Matteucci М. D. Synthesis of DNA
via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates / / Nucl.
Acids Res .—1886 .—14 , N 13.—P. 5399—5407 .
4. Yau E. K., Ma Y. X., Caruthers M. H. Synthesis of inter-
nucleotide phosphate analogues / / Tetrahedron Lett.—1990.—
3 1 , N 14.—P. 1953—1956.
5. Амирханов H. В., Зарытова В. Ф. Реакционноспособные
производные олигонуклеотидов, содержащие метилфосфо-
натные группы. 2. Синтез стереорегуляторных октати-
мидилатов, содержащих алкилирующий остаток 4-(1Ч-ме-
тиламино-Ы-2-хлорэтил)бензиламина и чередующиеся ме-
тилфосфонатные остатки / / Биоорг. химия.—1989.—15,
№ 2 .—С. 267—276 .
6. Егоров О. В., Панченко Л. П., Скрипаль И. Г. Исследо
вание сорбции антисмысловых олигодезоксирибонуклео-
тидов клетками микоплазм / / Микробиол. журн.—1996.—
58, № 3 .—С. 30—37 .
7. Годовикова Т. С, Зарытова В. Ф., Халимская Л. М.
Реакционноспособные фосфамиды моно- и динуклеотидов
/ / Биоорг. химия .—1986 .—12 , № 4 .—С. 475—481 .
8. Панченко Л. П., Егоров О. В., Райт А. С. и др. Взаимо
действие алкилирующих производных олигодезоксирибо-
нуклеотидов и их метилфосфатных аналогов с клетками
микоплазм / / Микробиол. ж у р н . — 1 9 9 1 . — 5 3 , № 4 . —
С. 63—68.
9. Егоров О. В., Панченко Л. П., Скрипаль И. Г. и др.
Эффективность связывания реакционноспособных олигоде-
зоксирибонуклеотидов клетками различных представите
лей класса Mollicutes обусловлена возрастом культур / /
Там ж е . — 1 9 9 2 . — 5 4 , № 2 .—С. 6 5 — 7 0 .
10. Zamecnic Р. С, Goodshild J., Taguchi Y. et at. Inhibition of
replication and expression of human T-cell lymphotropic virus
type III in cultured cells by exogenous synthetic oligo
nucleotides complementary to viral RNA / / Proc. Nat. Acad.
Sci. USA.—1986 .—83 , N 6 .—P. 4 1 4 3 — 4 1 4 6 .
11. Rasin S. The mycoplasmas / / Microbiol. Rev.—1978.—8,
N 2 .—P. 414—470 .
12. Akhtar S., Basu S., Wicksttom E. et at. Penetration of
oligonucleotides into liposomes / / Nucl. Acids Res .—1991 .—
19, N 5 .—P. 5551—5559.
13. Miller P. S. Biochemical and biological effects of nonionic
nucleic acid methylphosphonates / / Oligonucleotides. An
tisense inhibitors of gene expression / Ed. J. S. Cohen.—Lon
don: MacMillan press, 1989 — P . 7 9 — 9 5 .
14. Кагава Я. Биомембраны.—M.: Высш. шк., 1985.—303 с.
15. Loke S. L, Stein С. A, Zhang X. И. et al. Characterization of
oligonucleotide transport into living cells / / Proc. Nat. Acad.
Sci. USA.—1989 .—86, N 5 .—P. 3474—3478 .
16. Maniloff J., Morowitz H. J. Cell biology of the mycoplasmas
/ / Bacter. R e v — 1 9 7 2 . — 3 6 , N 3 — P . 263—290 .
УДК 579.22:577.113.6
Поступила в редакцию 31.07.96
149
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155136 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:21:08Z |
| publishDate | 1997 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Егоров, О.В. Панченко, Л.П. Скрыпаль, И.Г. Амирханов, Н.В. 2019-06-16T09:35:45Z 2019-06-16T09:35:45Z 1997 Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов / О.В. Егоров, Л.П. Панченко, И.Г. Скрипаль, Н.В. Амирханов // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 2. — С. 142-149. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000476 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155136 579.22:577.113.6 Исследованы процессы связывания и поглощения клетками Acholeplasma laidlawii PG-8, Mycoplasma fermentans PG-18 и M. pneumoniae FH тиофосфатных, дитиофосфатных и метилфосфонатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных «сигнатурным» последовательностям 16S рРНК. Обнаружены различия в эффективности связывания данными клетками тиофосфатных и метилфосфонатных аналогов олигонуклеотидов. Так, уровень сорбции тиофосфатов клетками A. laidlawii PG-8 превышал долю связавшихся с этими клетками метилфосфонатов более чем в 5 раз. Установлен факт значительного накопления клетками молликутов тио- и дитиофосфатных аналогов олигонуклеотидов. Внутриклеточная концентрация этих соединений у всех изученных микроорганизмов превышала внеклеточную в 104–105 раз. На основе полученных экспериментальных данных сделано предположение о существовании в клетках молликутов двух различных механизмов поглощения аналогов олигонуклеотидов, несущих отрицательный заряд в рибозофосфатном остове, неионных аналогов. Досліджено процеси зв'язування і поглинання клітинами Acholeplasma laidlawii PG-8, Mycoplasma fermentans PG-18 і M. pneumoniae FH тіофосфатних, дитіофосфатних та метил-фосфонатних аналогів олігодезоксирибонуклеотидів, комплементарних «сигнатурним» послідовностям 16S рРНК. Виявлено відмінності в ефективності зв'язування даними клітинами тіофосфатних та метилфосфонатних аналогів олігонуклеотидів. Так, рівень сорбції тіофосфатів клітинами A. laidlawii PG-8 перевищував такий метилфосфонатних аналогів більше ніж в 5 разів. Встановлено факт значного накопичення клітинами молікутів тіо- і дитіофосфатних аналогів вивчених олігонуклеотидів. Внутрішньоклітинна концентрація цих сполук у досліджених штамів молікутів перевищувала позаклітинну в 104–105 разів. На основі отриманих еспериментальних даних зроблено припущення про наявність у клітинах молікутів двох різних механізмів поглинання аналогів олігонуклеотидів, що несуть від'ємний заряд в рибозофосфатному остові, та неіонних аналогів. Processes of absorption and uptake by cells of Acholeplasma laidlawii PG-8, Mycoplasma fermentans PG-18 and Mycoplasma pneumoniae FH of phosphorothioate, phosphorodithioate and methylphosphonate analogs of oligodeoxynucleotides which are co mplementary to «signature» 16S rRNA sequences have been investigated. Distinctions in efficiency of absorption by given cells of phosphorothioate and methylphosphonate analogs of oligonucleotides are found out. So, the level sorption of thioates by the cells of A. laidlawii PG-8 exceeded a share binding with these cells of methylphosponates more than in 5 times. A fact of significant accumulation by the mollicute cells of thio- and dithioate analogs of oligonucleotides is established. The intracellutar concentration of these compounds at all investigated microorganisms exceeded them extracellular in 104 –105 time. On the basis of received of experimental data the assumption of existence in mollicute cells two of various gears of uptake of analogs of oligonucleotides bearing by negative charge in sugar-phosphate backbone and neutral oligonuc-leotide analogs is stated. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Клеточная биология Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов Засвоєння клітинами молікутів антисенсових аналогів олігодезоксирибонуклеотидів Uptake the mollicute cells of the analogs of antisense oligodeoxynucleolides Article published earlier |
| spellingShingle | Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов Егоров, О.В. Панченко, Л.П. Скрыпаль, И.Г. Амирханов, Н.В. Клеточная биология |
| title | Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов |
| title_alt | Засвоєння клітинами молікутів антисенсових аналогів олігодезоксирибонуклеотидів Uptake the mollicute cells of the analogs of antisense oligodeoxynucleolides |
| title_full | Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов |
| title_fullStr | Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов |
| title_full_unstemmed | Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов |
| title_short | Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов |
| title_sort | усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов |
| topic | Клеточная биология |
| topic_facet | Клеточная биология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155136 |
| work_keys_str_mv | AT egorovov usvoeniekletkamimollikutovantismyslovyhanalogovoligodezoksiribonukleotidov AT pančenkolp usvoeniekletkamimollikutovantismyslovyhanalogovoligodezoksiribonukleotidov AT skrypalʹig usvoeniekletkamimollikutovantismyslovyhanalogovoligodezoksiribonukleotidov AT amirhanovnv usvoeniekletkamimollikutovantismyslovyhanalogovoligodezoksiribonukleotidov AT egorovov zasvoênnâklítinamimolíkutívantisensovihanalogívolígodezoksiribonukleotidív AT pančenkolp zasvoênnâklítinamimolíkutívantisensovihanalogívolígodezoksiribonukleotidív AT skrypalʹig zasvoênnâklítinamimolíkutívantisensovihanalogívolígodezoksiribonukleotidív AT amirhanovnv zasvoênnâklítinamimolíkutívantisensovihanalogívolígodezoksiribonukleotidív AT egorovov uptakethemollicutecellsoftheanalogsofantisenseoligodeoxynucleolides AT pančenkolp uptakethemollicutecellsoftheanalogsofantisenseoligodeoxynucleolides AT skrypalʹig uptakethemollicutecellsoftheanalogsofantisenseoligodeoxynucleolides AT amirhanovnv uptakethemollicutecellsoftheanalogsofantisenseoligodeoxynucleolides |