Выделение серил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilis НВ-27
Описан метод выделения высоко очищенного препарата серил-тРНК синтетазы из Т. thermophilus. Использовали высаливание сульфатом аммония, хроматографию на ДЭАЭ-сефарозе, оксиапатите, гепарин-сефарозе и гидрофобную хроматографию на поливиниловом сорбенте Toyopearl HW-65. Выход очищенного фермента соста...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1989 |
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155185 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Выделение серил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilis НВ-27 / А.Д. Яремчук, Μ.А. Тукало, А.В. Коноваленко, С.П. Егорова, Г.X. Мацука // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 5. — С. 83-86. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860173817374048256 |
|---|---|
| author | Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. Коноваленко, А.В. Егорова, С.П. Мацука, Г.Х. |
| author_facet | Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. Коноваленко, А.В. Егорова, С.П. Мацука, Г.Х. |
| citation_txt | Выделение серил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilis НВ-27 / А.Д. Яремчук, Μ.А. Тукало, А.В. Коноваленко, С.П. Егорова, Г.X. Мацука // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 5. — С. 83-86. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Описан метод выделения высоко очищенного препарата серил-тРНК синтетазы из Т. thermophilus. Использовали высаливание сульфатом аммония, хроматографию на ДЭАЭ-сефарозе, оксиапатите, гепарин-сефарозе и гидрофобную хроматографию на поливиниловом сорбенте Toyopearl HW-65. Выход очищенного фермента составил 4 мг из 1 кг клеток Т. thermophilus. Серил-тРНК синтетаза является димером α2-типа. Молекулярная масса фермента 90000.
Описано метод виділення високоочищеного препарату серил-тРНК синтетази з Т. thermophilus. Використано висолювання сульфатом амонію, хроматографію на ДЕАЕ-сефарозі, оксіапатиті, гепарин-сефарозі і гідрофобну хроматографію на полівініловому сорбенті Toyopearl HW-65. Вихід очищеного ферменту становив 4 мг з 1 кг клітин Т. thermophilus. Серил-тРНК синтетаза є димером α₂-типу. Молекулярна маса ферменту 90000.
A method to isolate seryl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus is described. It includes ammonium sulfate fractionation, chromatography on DEAE-sepharose, hydroxyapatite, heparine-sepharose and hydrophobic chromatography on poliyvinyl sorbent Toyopearl HW-65. The yield of highly purified enzyme was 4 mg from 1 kg of T. thermophilus cells. Seryl-tRNA synthetase is a dimer protein (α₂ type) with molecular mass of 90 kDa.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:59:13Z |
| format | Article |
| fulltext |
4. Масколюнас Р. КЛекис А. В., Коваленко М. И. Биосинтез белка в бесклеточных
белоксинтезирующих системах из миокарда кролика при тотальной ишемии / / Био-
полимеры и клетка.— 1989.—5, № 1.— С. 84—86.
5. Масколюнас Р. К. Структурно-функциональные изменения в пуле рибосом миокар-
диальных клеток кроликов при тотальной и ш е м и и / / С б . науч. тр. 1-ой респ. конф.
молодых ученых медиков ЛитССР.— Каунас, 1988.— С. 54—57.
6. Morphological and biochemical changes in autolyzing dog heart muscle / L. C. Armi-
ger, R. N. Seelye, V. M. Carnell et a l . / / L a b . Invest.— 1976.—34, N 4 . — P . 357—362.
7. Явич Μ. П., Лерман Μ. И. Бесклеточная система белкового синтеза из сердечной
мышцы к р о л и к а / / В о п р . мед. химии.— 1976.— JVb 3.— С. 307—327.
8. Берман А. Е. Метод выделения полирибосом, свободных и связанных с мембрана-
ми цитоплазматической с е т и / / С о в р е м , методы в биохимии.— М . : Медицина, 1977.—
С. 300—303.
9. Изучение молекулярных механизмов гипоальбуминемии на модели эксперименталь-
ного инфаркта миокарда / А . В. Лекис, Л. Ю. Лукошявичюс, М. И. Коваленко,
О. В. Булдакова / /Биополимеры и клетка.— 1985.— 1, № 6.— С. 322—327.
10. Laemmli U. К. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage Tl / / Nature.— 1970.—227, N 5259 .—P. 680—685.
Ии-т молекуляр. биологии и генетики Получено 20.03.89
АН УССР, Киев
ELECTROPHORETICAL ANALYSIS OF TRANSLATION
PRODUCTS IN THE CELL-FREE SYSTEMS
FROM NORMAL AND ISCHEMIC RABBIT MYOCARDIUM
R. K. Maskoliunas
Institute of Molecular Biology and Genetics, Academy of Sciences
of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
The rate of radioactive amino acid incorporation into translational product in the re-
constructed protein-synthesizing cell-free systems, consist ing of cytosol and polyribo-
somes from normal and ischemic myocardium is compared. The alteration in protein-
synthesizing activity is shown to depend mainly on the properties of polyribosomal pre-
parations. Electrophoretical analysis of the translational products with subsequent fluo-
rography has revealed redistribution of some protein fractions in the system from ische-
mic myocardium.
УДК 577.112.088.3
А. Д. Яремчук, Μ. А. Тукало, А. В. Коноваленко,
С. П. Егорова, Г. X. Мацука
В Ы Д Е Л Е Н И Е СЕРИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ
ИЗ THERMUS THERMOPHILUS НВ-27
Описан метод выделения высоко очищенного препарата серил-тРНК синтетазы из T. ther-
mophilus. Использовали высаливание сульфатом аммония, хроматографию на ДЭАЭ-
сефарозе, оксиапатите, гепарин-сефарозе и гидрофобную хроматографию на поливини-
ловом сорбенте Toyopearl HW-65. Выход очищенного фермента составил 4 мг из 1 кг
клеток Т. thermophilus. Серил-тРНК синтетаза является димером а2-типа. Молекуляр-
ная масса фермента 90000.
А м и н о а ц и л - т Р Н К синтетазы и т Р Н К являются уникальными о б ъ е к т а м и
для изучения молекулярных механизмов белково-нуклеинового взаимо-
действия. В настоящее время достигнуты определенные успехи в ис-
следовании структуры т Р Н К — а м и н о а ц и л - т Р Н К синтетазного комп-
лекса [1] . Однако подобные работы проводились с т Р Н К первого клас-
са, имеющими короткую вариабельную петлю. Экспериментальные ж е
данные по изучению взаимодействия а м и н о а ц и л - т Р Н К синтетаз с т Р Н К
второго класса (с длинной вариабельной петлей) крайне ограниченны.
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. JVb 5 6 *
Важнейшим этапом на пути к пониманию механизма специфического
взаимодействия тРНК и аминоацил-тРНК синтетаз являются структур-
ные исследования этих макромолекул.
В данном сообщении описан метод выделения высокоочищенного
препарата с е р и л - т Р Н К синтетазы из Т. thermophilus НВ-27. тРНК ука-
занной специфичности относится ко второму классу, а аминоацил-тРНК
синтетазы из этого объекта обладают высокой термостабильностью,
что позволяет использовать физические методы при изучении струк-
туры этих ферментов.
Пострибосомный супернатант Т. thermophilus любезно предостав-
лен М. Б. Гарбер (Ин-т белка АН СССР). Суммарный препарат тРНК
Escherichia coli получен из ВНИИ прикл. биохимии (Олайне,
ЛатвССР). Серил-тРНК синтетазную активность определяли по на-
чальной скорости образования аминоацил-тРНК. Инкубационная смесь
в 0,05 мл содержала 100 мМ трис-НС1-буфер, рН 8,0, 10 мМ MgCl2,
5 мМ АТР, 10 мМ KCl, 0,3 мМ 14С-серин, 5 мг/мл суммарного препа-
рата тРНК Е. coli, 0,2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА)
и от 0,05 до 10 мкг белка (в зависимости от степени очистки фермен-
та). Смесь инкубировали в течение 30 с при 55 °С. Реакцию останав-
ливали добавлением 200 мкл охлажденной 10 %-ной трихлоруксусной
кислоты (ТХУ). Образовавшиеся осадки отмывали на миллипоровых
фильтрах 50 мл 5 %-ной ТХУ. Радиоактивность проб определяли на
сцинтилляционном счетчике SL-30 фирмы «Intertechnique» (Франция).
Молекулярную массу серил-тРНК синтетазы устанавливали методом
электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в нативных условиях
при разных концентрациях геля [2], молекулярную массу субъеди-
ниц — с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии DS-Na. За
единицу активности серил-тРНК синтетазы принимали количество фер-
мента, катализирующее аминоацилирование 1 нмоль TPHKser за 1 мин
при 55 °С.
В таблице представлены данные, характеризующие степень очист-
ки серил-тРНК синтетазы на каждой стадии выделения. На первой ста-
дии очистки использовали высаливание пострибосомного супернатанта
сульфатом аммония (45 % насыщения). Полученный осадок диализо-
вали против 50 мМ трис-НС1-буфера, рН 7,8), содержащего 5 мМ
MgCl2, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 0,1 мМ азид натрия, 0,1 мМ фенилме-
тилсульфонилфторид (ФМСФ) (буфер А) и наносили на колонку
((5x50 см) с ДЭАЭ-сефарозой («Pharmacia», Швеция), уравновешен-
ной буфером А. Элюцию проводили в этом же буфере в градиенте кон-
центрации NaCl от 0,03 до 0,3 M (объем градиента 2,5 л). Фракцию
с ДЭАЭ-сефарозы, обладающую серил-тРНК синтетазной активностью,
высаливали сульфатом аммония (45 % насыщения) и хроматографиро-
вали на колонке (2,5X60 см) с поливиниловым сорбентом Toyopearl
HW-65 («Тоуо Soda», Япония) в буфере А в обратном градиенте кон-
центрации сульфата аммония от 40 до 10 % насыщения (объем гради-
Очистка серил-тРНК синтетазы Т. thermophilus НВ-27
Purification of seryl-tRNA synthetase from Т. thermophilus HB-27
Основные стадии очистки
Общий
белок,
мг
Общая
актив-
ность,
ед. акт.
Удельная
актив-
ность,
ед.
акт./мг
Степень
очистки
Вы-
ход,
%
Высаливание пострибосомного супер-
натанта сульфатом аммония, 45 % на-
сыщения
Хроматография на ДЭАЭ-сефарозе
Гидрофобная хроматография на Toyo-
pearl HW-65
Хроматография на оксиапатите
Рехроматография на Toyopearl HW-65
Хроматография на гепарин-сефарозе
23690 18952 0,8 1,0 100
2936 19378 6,6 8,3 102
740 9324 12,6 15,7 40
218 7521 34,5 43,1 40
77 7423 96,4 120,5 39
4 6004 1501 1876 32
;84 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. JVb 5 6*
ента 1,8 л) . Фракцию, содержащую серил-тРНК синтетазу, диализова-
ли в течение 20 ч против 10 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,8, со-
держащего 5 мМ β-меркаптоэтанол, 0,1 мМ азид натрия, 0,1 мМ
ФМСФ (буфер Б) и наносили на колонку (2,5X55 см) с оксиапатитом
(«Віо-Rad», США), уравновешенным этим же буфером. Фермент элю-
ировали в градиенте концентрации калий-фосфатного буфера от 0,01
Я280 Имп/мин-10~3
Рис. 1. Хроматография серил-тРНК синтетазы T. thermophilus на гепарин-сефарозе
Fig. 1. Chromatography of seryl-tRNA synthetase from T. thermophilus on heparin-sepna-
rose
Рис. 2. Электрофорез в ПААГ в присутствии DS-Na: / —
смесь стандартных белков; 2 — серил-тРНК синтетаза
Т. thermophilus после хроматографии на гепарин-сефарозе
Fig. 2. Polyacrylamide gel electrophoresis in the presence
of sodium dodecyl sulfate: 1 — molecular mass markers; 2 —
seryl-tRNA synthetase of T. thermophilus after chromato-
graphy on heparin-sepiharose column
до 0,2 M (объем градиента 3 л) . Серил-тРНК синтетазу высаливали
сульфатом аммония и проводили рехроматографию на Toyopearl
HW-65 в тех же условиях, что и первичную хроматографию. Оконча-
тельная очистка серил-тРНК синтетазы была осуществлена на гепарин-
сефарозе (рис. 1). Белок после диализа хроматографировали на колон-
ке (0,5X15 см) с гепарин-сефарозой («Pharmacia», Швеция), уравно-
вешенной буфером А, в градиенте концентрации KCl от 0 до 0,25 M
(объем градиента 0,5 л) .
Таким образом, из 1 кг бактериальной массы получено 4 мг пре-
парата серил-тРНК синтетазы — практически в индивидуальном состо-
янии, судя по данным электрофореза (рис. 2). О высокой степени чис-
тоты полученного препарата фермента свидетельствуют также данные
об отсутствии примесей других аминоацил-тРНК синтетаз, содержание
которых определяли, используя смесь 14С-аминокислот гидролизата
хлореллы и избыток 12С-серина.
Изучена также температурная зависимость скорости реакции ами-
ноацилирования, катализируемой серил-тРНК синтетазой Т. thermop-
hilus. Установлено, что температурный оптимум находится в области
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. JVb 5 6*
70 °С. Значение удельной активности полученного препарата серил-
тРНК синтетазы при оптимальных условиях реакции аминоацилирова-
ния и при использовании в качестве субстрата гомологичной тРНК из
Т. thermophilus составляет 2552 ед/мг. Молекулярная масса фермента
по данным электрофореза в ПААГ в нативных условиях — 90 ООО. Се-
рил-тРНК синтетаза представляет собой структурный димер, состоящий
из двух идентичных субъединиц с молекулярными массами 46 000
(рис. 2). Аналогичная олигомерная структура и близкие молекуляр-
ные массы показаны для серил-тРНК синтетаз из других прокариоти-
ческих объектов [4, 5].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
]. Киселев Л. Л., Фаворова О. ОЛаврик О. И. Биосинтез белка от аминокислот до
аминоацил-тРНК.— М. : Наука, 1984.—480 с.
2. Hedrick / . L., Smith A. J. Estimation of molecular weight by polyacrylamide gel
electrophoresis / / Arch. Biochem. and Biophys.— 1968.—126, N 1.—P. 155—164.
3. Weber K., Osborti M. The reability of molecular weight by dodecylsulfate-polvacrylami-
de gel e lectrophores is / /J . Biol. Chem.— 1969.—244, N 16,—P. 4406—4412."
4. Katze / . R., Konigsberg W. Purification and properties of seryl transfer ribonucleic
acid synthetase from Escherichia coli// Ibid.— 1970.—245, N 5 .—P. 923—930.
5. Samuelsson T., Lundvik L. Purification and some properties of asparagine, serine and
valine: tRNA ligases from Bacillus stearothermophilus / / Ibid.— 1978.—253, N ,10.—
P. 7033—7039:
Ин-т молекуляр. биологии и генетики Получено 10.03.89
АН УССР, Киев
ISOLATION OF SERYL-tRNA SYNTHETASE FROM
THERMUS THERMOPHILUS HB-27
A. D. Yaremchuk, M. A. Tukalo, Α. V. Konovalenko, S. P. Egorova,
G. Kh. Matsuka
Institute of Molecuiar Biology and Genetics Academy
of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m а г у
A method to isolate seryl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus is described.
It includes ammonium sulfate fractionation, chromatography on DEAE-sepharose, hydro-
xyapatite, heparine-sepharose and hydrophobic chromatography on polyvinyl sorbent
Toyopearl HW-65. The yield of highly purified enzyme was 4 m g from 1 kg of T. ther-
mophilus cells. Seryl-tRNA synthetase is a dimer protein (a 2 type) with molecular mass
of 90 kDa.
86 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1989. Т . 5. JVb 5 6*
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155185 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:59:13Z |
| publishDate | 1989 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. Коноваленко, А.В. Егорова, С.П. Мацука, Г.Х. 2019-06-16T10:32:46Z 2019-06-16T10:32:46Z 1989 Выделение серил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilis НВ-27 / А.Д. Яремчук, Μ.А. Тукало, А.В. Коноваленко, С.П. Егорова, Г.X. Мацука // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 5. — С. 83-86. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000EA https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155185 577.112.088.3 Описан метод выделения высоко очищенного препарата серил-тРНК синтетазы из Т. thermophilus. Использовали высаливание сульфатом аммония, хроматографию на ДЭАЭ-сефарозе, оксиапатите, гепарин-сефарозе и гидрофобную хроматографию на поливиниловом сорбенте Toyopearl HW-65. Выход очищенного фермента составил 4 мг из 1 кг клеток Т. thermophilus. Серил-тРНК синтетаза является димером α2-типа. Молекулярная масса фермента 90000. Описано метод виділення високоочищеного препарату серил-тРНК синтетази з Т. thermophilus. Використано висолювання сульфатом амонію, хроматографію на ДЕАЕ-сефарозі, оксіапатиті, гепарин-сефарозі і гідрофобну хроматографію на полівініловому сорбенті Toyopearl HW-65. Вихід очищеного ферменту становив 4 мг з 1 кг клітин Т. thermophilus. Серил-тРНК синтетаза є димером α₂-типу. Молекулярна маса ферменту 90000. A method to isolate seryl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus is described. It includes ammonium sulfate fractionation, chromatography on DEAE-sepharose, hydroxyapatite, heparine-sepharose and hydrophobic chromatography on poliyvinyl sorbent Toyopearl HW-65. The yield of highly purified enzyme was 4 mg from 1 kg of T. thermophilus cells. Seryl-tRNA synthetase is a dimer protein (α₂ type) with molecular mass of 90 kDa. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Выделение серил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilis НВ-27 Виділення серил-тРНК синтетази з Thermus thermophilis НВ-27 Isolation of seryl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus HB-27 Article published earlier |
| spellingShingle | Выделение серил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilis НВ-27 Яремчук, А.Д. Тукало, М.А. Коноваленко, А.В. Егорова, С.П. Мацука, Г.Х. Структура и функции биополимеров |
| title | Выделение серил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilis НВ-27 |
| title_alt | Виділення серил-тРНК синтетази з Thermus thermophilis НВ-27 Isolation of seryl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus HB-27 |
| title_full | Выделение серил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilis НВ-27 |
| title_fullStr | Выделение серил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilis НВ-27 |
| title_full_unstemmed | Выделение серил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilis НВ-27 |
| title_short | Выделение серил-тРНК синтетазы из Thermus thermophilis НВ-27 |
| title_sort | выделение серил-трнк синтетазы из thermus thermophilis нв-27 |
| topic | Структура и функции биополимеров |
| topic_facet | Структура и функции биополимеров |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155185 |
| work_keys_str_mv | AT âremčukad vydelenieseriltrnksintetazyizthermusthermophilisnv27 AT tukaloma vydelenieseriltrnksintetazyizthermusthermophilisnv27 AT konovalenkoav vydelenieseriltrnksintetazyizthermusthermophilisnv27 AT egorovasp vydelenieseriltrnksintetazyizthermusthermophilisnv27 AT macukagh vydelenieseriltrnksintetazyizthermusthermophilisnv27 AT âremčukad vidílennâseriltrnksintetazizthermusthermophilisnv27 AT tukaloma vidílennâseriltrnksintetazizthermusthermophilisnv27 AT konovalenkoav vidílennâseriltrnksintetazizthermusthermophilisnv27 AT egorovasp vidílennâseriltrnksintetazizthermusthermophilisnv27 AT macukagh vidílennâseriltrnksintetazizthermusthermophilisnv27 AT âremčukad isolationofseryltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27 AT tukaloma isolationofseryltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27 AT konovalenkoav isolationofseryltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27 AT egorovasp isolationofseryltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27 AT macukagh isolationofseryltrnasynthetasefromthermusthermophilushb27 |