Роль ядерно-цитоплазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы
Более 90 % мышиных зигот, у которых микрохирургически удалили треть цитоплазмы, развились в культуре до морфологически нормальных морул и бластоцист. Наблюдалось значительное замедление скоростей дробления и морфогенеза оперированных зародышей по сравнению с контрольными. Оперированные зародыши начи...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1989 |
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155186 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Роль ядерно-цитоплазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы / С.В. Евсиков, Л.М. Морозова, А.П. Соломко // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 5. — С. 87-93. — Бібліогр.: 31 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155186 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Евсиков, С.В. Морозова, Л.М. Соломко, А.П. 2019-06-16T10:33:18Z 2019-06-16T10:33:18Z 1989 Роль ядерно-цитоплазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы / С.В. Евсиков, Л.М. Морозова, А.П. Соломко // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 5. — С. 87-93. — Бібліогр.: 31 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000EB https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155186 591 Более 90 % мышиных зигот, у которых микрохирургически удалили треть цитоплазмы, развились в культуре до морфологически нормальных морул и бластоцист. Наблюдалось значительное замедление скоростей дробления и морфогенеза оперированных зародышей по сравнению с контрольными. Оперированные зародыши начинали образование бластоцели при меньшем числе клеток, чем контрольные, что соответствует гипотезе о влиянии ядерно-цитоплазматического соотношения на запуск кавитации. Сравнение преимплантационных эмбрионов, развивающихся в различных условиях (in vivo, in vitro, с 2-клеточной, 1-клеточной стадий), указывает на то, что запуск кавитации зависит от абсолютного времени, прошедшего с начала развития. Это позволяет предположить, что морфогенез определяется в первую очередь «генетическими часами», запускающими кавитацию относительно независимо от внешних (по отношению к геному) воздействий. Жизнеспособность морул и бластоцист, развившихся в культуре, показана при их пересадках псевдобеременным самкам. Більше 90 % мишачих зигот, у яких мікрохірургічно видалили третину цитоплазми, розвинулися в культурі до морфологічно нормальних морул і бластоцист. Спостерігалося значне уповільнення швидкостей дроблення і морфогенезу оперованих зародків порівняно з контрольними. Оперовані зародки починали утворення бластоцелі за меншої кількості клітин, ніж контрольні, що відповідає гіпотезі впливу ядерно-цитоплазматичного співвідношення на запуск кавітації. Порівняння преімплантаційних ембріонів, які розвиваються за різних умов (in vivo, in vitro, з 2-клітинної, 1-клітинної стадій), вказує на те, що запуск кавітації залежить від абсолютного часу, що пройшов з початку розвитку. Це дозволяє припустити, що морфогенез визначається в першу чергу «генетичним годинником», який запускає кавітацію відносно незалежно від зовнішніх (по відношенню до геному) впливів. Життєздатність морул і бластоцист, що розвинулися в культурі, показано при їхніх пересадженнях псевдовагітним самицям. Following 3 days after microsurgical removal of 1/3 of the cytoplasm volume, more than 90 % of mouse zygotes developed in vitro into morulae and blastocysts. Development of such embryos was considerably delayed. The mean cell number of nascent blastocysts was significantly lower than in control, thus revealing that the start of cavitation somewhat depends upon the nucleocytoplasmic ratio. Comparison of preimplantation embryos developing under different conditions in vivo, in vitro from two-cell OT one-cell stages indicates that start cavitation depends on the absolute time passed from the beginning of the development. These results suggest that the «biological clock» works at the genomic level, while the nucleocytoplasmic .ratio can be considered as a feedback mechanism operating during the preimplantation development. The viability of morulae and blastocysts developed in vitro has been proved by their transplantations to pseudo-pregnant females. Авторы выражают глубокую признательность А.Д. Груздеву (Ин-т цитологии и генетики СО АН СССР) за идею оптической схемы и советы по изготовлению стереомикроскопа. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Клеточная биология Роль ядерно-цитоплазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы Роль ядерно-цитоплазматичного співвідношення у регуляції розвитку ссавців. Розвиток зигот зі зменшеним об’ємом цитоплазми Role of the nucleocytoplasmic ratio in the regulation of the mammal development. Development of zygotes with a decreased cytoplasm volume Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Роль ядерно-цитоплазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы |
| spellingShingle |
Роль ядерно-цитоплазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы Евсиков, С.В. Морозова, Л.М. Соломко, А.П. Клеточная биология |
| title_short |
Роль ядерно-цитоплазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы |
| title_full |
Роль ядерно-цитоплазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы |
| title_fullStr |
Роль ядерно-цитоплазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы |
| title_full_unstemmed |
Роль ядерно-цитоплазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы |
| title_sort |
роль ядерно-цитоплазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы |
| author |
Евсиков, С.В. Морозова, Л.М. Соломко, А.П. |
| author_facet |
Евсиков, С.В. Морозова, Л.М. Соломко, А.П. |
| topic |
Клеточная биология |
| topic_facet |
Клеточная биология |
| publishDate |
1989 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Роль ядерно-цитоплазматичного співвідношення у регуляції розвитку ссавців. Розвиток зигот зі зменшеним об’ємом цитоплазми Role of the nucleocytoplasmic ratio in the regulation of the mammal development. Development of zygotes with a decreased cytoplasm volume |
| description |
Более 90 % мышиных зигот, у которых микрохирургически удалили треть цитоплазмы, развились в культуре до морфологически нормальных морул и бластоцист. Наблюдалось значительное замедление скоростей дробления и морфогенеза оперированных зародышей по сравнению с контрольными. Оперированные зародыши начинали образование бластоцели при меньшем числе клеток, чем контрольные, что соответствует гипотезе о влиянии ядерно-цитоплазматического соотношения на запуск кавитации. Сравнение преимплантационных эмбрионов, развивающихся в различных условиях (in vivo, in vitro, с 2-клеточной, 1-клеточной стадий), указывает на то, что запуск кавитации зависит от абсолютного времени, прошедшего с начала развития. Это позволяет предположить, что морфогенез определяется в первую очередь «генетическими часами», запускающими кавитацию относительно независимо от внешних (по отношению к геному) воздействий. Жизнеспособность морул и бластоцист, развившихся в культуре, показана при их пересадках псевдобеременным самкам.
Більше 90 % мишачих зигот, у яких мікрохірургічно видалили третину цитоплазми, розвинулися в культурі до морфологічно нормальних морул і бластоцист. Спостерігалося значне уповільнення швидкостей дроблення і морфогенезу оперованих зародків порівняно з контрольними. Оперовані зародки починали утворення бластоцелі за меншої кількості клітин, ніж контрольні, що відповідає гіпотезі впливу ядерно-цитоплазматичного співвідношення на запуск кавітації. Порівняння преімплантаційних ембріонів, які розвиваються за різних умов (in vivo, in vitro, з 2-клітинної, 1-клітинної стадій), вказує на те, що запуск кавітації залежить від абсолютного часу, що пройшов з початку розвитку. Це дозволяє припустити, що морфогенез визначається в першу чергу «генетичним годинником», який запускає кавітацію відносно незалежно від зовнішніх (по відношенню до геному) впливів. Життєздатність морул і бластоцист, що розвинулися в культурі, показано при їхніх пересадженнях псевдовагітним самицям.
Following 3 days after microsurgical removal of 1/3 of the cytoplasm volume, more than 90 % of mouse zygotes developed in vitro into morulae and blastocysts. Development of such embryos was considerably delayed. The mean cell number of nascent blastocysts was significantly lower than in control, thus revealing that the start of cavitation somewhat depends upon the nucleocytoplasmic ratio. Comparison of preimplantation embryos developing under different conditions in vivo, in vitro from two-cell OT one-cell stages indicates that start cavitation depends on the absolute time passed from the beginning of the development. These results suggest that the «biological clock» works at the genomic level, while the nucleocytoplasmic .ratio can be considered as a feedback mechanism operating during the preimplantation development. The viability of morulae and blastocysts developed in vitro has been proved by their transplantations to pseudo-pregnant females.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155186 |
| citation_txt |
Роль ядерно-цитоплазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы / С.В. Евсиков, Л.М. Морозова, А.П. Соломко // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 5. — С. 87-93. — Бібліогр.: 31 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT evsikovsv rolʹâdernocitoplazmatičeskogosootnošeniâvregulâciirazvitiâmlekopitaûŝihrazvitiezigotsumenʹšennymobʺemomcitoplazmy AT morozovalm rolʹâdernocitoplazmatičeskogosootnošeniâvregulâciirazvitiâmlekopitaûŝihrazvitiezigotsumenʹšennymobʺemomcitoplazmy AT solomkoap rolʹâdernocitoplazmatičeskogosootnošeniâvregulâciirazvitiâmlekopitaûŝihrazvitiezigotsumenʹšennymobʺemomcitoplazmy AT evsikovsv rolʹâdernocitoplazmatičnogospívvídnošennâuregulâcíírozvitkussavcívrozvitokzigotzízmenšenimobêmomcitoplazmi AT morozovalm rolʹâdernocitoplazmatičnogospívvídnošennâuregulâcíírozvitkussavcívrozvitokzigotzízmenšenimobêmomcitoplazmi AT solomkoap rolʹâdernocitoplazmatičnogospívvídnošennâuregulâcíírozvitkussavcívrozvitokzigotzízmenšenimobêmomcitoplazmi AT evsikovsv roleofthenucleocytoplasmicratiointheregulationofthemammaldevelopmentdevelopmentofzygoteswithadecreasedcytoplasmvolume AT morozovalm roleofthenucleocytoplasmicratiointheregulationofthemammaldevelopmentdevelopmentofzygoteswithadecreasedcytoplasmvolume AT solomkoap roleofthenucleocytoplasmicratiointheregulationofthemammaldevelopmentdevelopmentofzygoteswithadecreasedcytoplasmvolume |
| first_indexed |
2025-11-26T05:11:09Z |
| last_indexed |
2025-11-26T05:11:09Z |
| _version_ |
1850610129226956800 |
| fulltext |
Клеточная
биология
УДК 591
С. В. Евсиков, Л. М. Морозова, А. П. Соломко
РОЛЬ ЯДЕРНО-ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО СООТНОШЕНИЯ
В РЕГУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.
РАЗВИТИЕ ЗИГОТ С УМЕНЬШЕННЫМ ОБЪЕМОМ
ЦИТОПЛАЗМЫ *
Более 90 ','о мышиных зигот, у которых микрохирургически удалили треть цитоплазмы,
развились в культуре до морфологически нормальных морул и бластоцист. Наблюда-
лось значительное замедление скоростей дробления и морфогенеза оперированных за-
родышей по сравнению с контрольными. Оперированные зародыши начинали образо-
вание бластоцели при меньшем числе клеток, чем контрольные, что соответствует гипо-
тезе о влиянии ядерно-цитоплазматического соотношения на запуск кавитации. Сравне-
ние ι ipe ими лактационных эмбрионов, развивающихся в различных условиях (in vivo,
in vitro, с 2-клеточной, 1-клеточной стадий), указывает на то, что запуск кавитации за-
висит от абсолютного времени, прошедшего с начала развития. Это позволяет предпо-
ложить, что морфогенез определяется в первую очередь «генетическими часами», за-
пускающими кавитацию относительно независимо от внешних (по отношению к гено-
му) воздействий. Жизнеспособность морул и бластоцист, развившихся в культуре, по-
казана при их пересадках псевдобеременным самкам.
Введение. Один из предложенных методов клонирования млекопитаю-
щих — пересадка ядер в энуклеированные зиготы. При этом полага-
ется, что цитоплазма зиготы способна изменить дифференцированное
состояние генома, запустить программу развития. Но такие надежды
кажутся обоснованными лишь в случае, если цитоплазма играет сколь-
ко-либо значительную регуляторную роль в раннем эмбриогенезе мле-
копитающих.
На первых этапах развития зародыша каждое деление дробления
уменьшает объем цитоплазмы, приходящейся на диплоидный геном,
вдвое. То есть параллельно репликации Д Н К и цитокинезу увеличива-
ется и ядерно-цитоплазматическое соотношение (ЯЦС). Если механизм
«онтогенетических часов» включает в себя системы взаимодействия
ядра и цитоплазмы, то ЯЦС вполне может оказаться фактором, влия-
ющим на программу развития зародыша.
Правильность предположения о том, что запуск процессов морфо-
генеза осуществляется по достижении определенного ЯЦС, показана
к настоящему времени для земноводных [1, 2]. Для млекопитающих
установлено, что уменьшение ЯЦС отрицательно сказывается на раз-
витии реконструированных зародышей мыши [3]. Выяснение роли ци-
топлазмы и ЯЦС в раннем эмбриогенезе млекопитающих возможно
при анализе развития зародышей, у которых экспериментальное изме-
нение этого соотношения не связано с изменениями на уровне генома.
Подобное изменение может быть достигнуто путем микрохирургическо-
го удаления части цитоплазмы зиготы.
Развитие преимплантационных зародышей в культуре идет медлен-
нее, чем in vivo [4]. Это делает возможным изучение временных пара-
метров реализации программы развития, сравнивая скорости клеточных
делении и морфогенеза зародышей, развивающихся in vivo и in vitro.
Представлена членом редколлегии В. М. Кавсаном.
ISSN 02 VS-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № δ 87
Поскольку основные выводы сделаны нами на основании данных,
полученных в системе in vitro, было необходимо подтвердить примени-
мость морфологического критерия к оценке жизнеспособности зароды-
шей. Для этого морулы и бластоцисты, развившиеся в культуре, пере-
саживали псевдобеременным самкам,
Материалы и методы. В ы д е л е н и е и к у л ь т и в и р о в а н и е з а р о д ы ш е й .
Для синхронизации по времени появления зигот на стадии двух пронуклеусов мышей
линий C57BL/6J и BALB/с содержали при следующем световом режиме: ночь с 19
до 03 ч для C57BL/6J и с 16 до 24 ч для BALB/c. К самцам на ночь подсаживали по
5 самок. Зиготы на стадии двух пронуклеусов вымывали между 10 и 13 ч. Для осво-
бождения от клеток кумулюса зиготы обрабатывали раствором гиалуронидазы
(200 МЕ/мл) , приготовленным на среде Виттена [5], забуференной HEPE1S. Примерно
20 зародышей оставляли в качестве контроля, остальных использовали для экспери-
ментов.
Зародыши культивировали до стадии морул и бластоцист при 37 °С на пластико-
вых чашках Петри (040 мм) в каплях среды Виттена с добавлением 100 мкМ
Ка2-ЭДТА [6] под вазелиновым маслом, при повышенном содержании CO2 (7%)
в воздухе.
Число клеток у морфологически нормальных морул и бластоцист определяли по
методу Тарковского [7]. Достоверность различий между зародышами по скорости кле-
точных делений и стадии начала кавитации вычисляли с использованием критерия
Стьюдента (ί-тест).
М и к р о м а н и п у л я ц и и . Часть цитоплазмы удаляли при помощи микромани-
пуляторов КМ-2 под микроскопом «Amplivab. Микроскоп снабжен системой, позво-
ляющей получать стереоизображение зародыша, что значительно облегчает работу по
микрохирургии (оптическая схема стереомикроскопа была предложена А. Д. Грузде-
вым). Рабочее увеличение микроскопа 180х. Заготовки для микроинструментов вытя-
гивали на микрокузнице MK-1. Присоски для фиксации зародышей имели наружный
диаметр до 100 мкм, внутренний диаметр игл для удаления цитоплазмы— 15—20 мкм.
Цитоплазму удаляли по методу, предложенному МакГратом и Солтером для энукле-
ации зародышей [8]. После операции зародыши фотографировали и объем цитоплазмы
оценивали по фотографиям. Удалялось от 20 до 50% цитоплазмы, в среднем — 3 5 % .
Морулы и бластоцисты, развившиеся в культуре, пересаживали в правый рог мат-
ки самок BALBfc второго дня псевдобеременности, согласно методике [9].
Результаты и обсуждение. В табл. 1 представлены результаты
культивирования и пересадок зародышей двух линий мышей. Процент
морфологически нормальных морул и бластоцист дан без вычисления
ошибок, поскольку нас интересует не морфология зародышей как тако-
вая, а их жизнеспособность. В этом случае ошибка может быть весьма
значительной, но определению не поддается. Например, куда следует
Т а б л и ц а 1
Развитие зародышей мышей, культивируемых на преимплантационной стадии
Development of mouse embryos that were cultured and then transferred
to pseudopregnant females
Развившиеся зародыши
Линия зародышей, стадия
начала культивирования in vitro до морул и
бластоцист, %
in vivo после пересадок культивированных
морул и бластоцист псевдобеременным
самкам BALBJс Линия зародышей, стадия
начала культивирования in vitro до морул и
бластоцист, %
Беременные самки, % Родилось мышат, %
C57BL/6J
1-клеточные
2-клеточныс
BALB/c
1-клеточные
2-клеточные
90(1171/1306)
91(206/227)
31(16/52)
91(10/11)
28 (30*/'109)
36(24/67)
C57BL/6J
1-клеточные
2-клеточныс
BALB/c
1-клеточные
2-клеточные
74(690/938)
88(130/147)
50(13/26)
1/2
32(30/95)
4/8
* Плюс пять мертворожденных.
88 ISSN 02 VS-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № δ 88
отнести морулу с (еще пока?) не включенным бластомером, бласто-
цисту с двумя бластоделями и т. д.?
Лишь 74 % зигот линии BALB/c за три дня в культуре со стадии
двух пронуклеусов доходят до морул и бластоцист. При культивирова-
нии зародышей с двуклеточной стадии уже 88 % зародышей развива-
ются до этих стадий.
Зародыши линии C57BL/6J развиваются в культуре успешнее — с
1-клеточной стадии 90 % доходят до морул и бластоцист. Однако, как
и у линии BALBfcy зародыши развиваются in vitro все же хуже, чем
in vivo: не более 5 % бластоцист, развившихся in vitro с 1-клеточной
стадии, вылупляются из zona pellucida. Зародыши, развивающиеся в
культуре с двуклеточной стадии, вылупляются почти все.
При пересадках морул и бластоцист псевдобеременным самкам
линии BALB/c учитывали процент забеременевших самок и родивших-
ся мышат у них. Лучший результат получен при пересадках зародышей
линии C57BL/6J, культивированных с двуклеточной стадии: 24 мышон-
ка из 67 зародышей, перенесенных 10 забеременевшим самкам-реци-
пиентам.
Всю последующую работу мы вели в основном на зародышах линии
C57BL/6J. Поэтому в дальнейшем, если линия зародышей особо не ого-
варивается, имеются в виду зародыши линии C57BL/6J.
Т а б л и ц а 2
Развитие зародышей мышей линии C57BL/6J к 90-му ч (in vivo — к 80-му ч)
после овуляции
The development of mouse embryos by the 90 h (in vivo — by the 80 h) after ovulation
Условия развития зародышей,
стадия начала культивирования
Среднее число клеток
Морулы и бластс t
цисты (скорость Г
деления)
Ранние бластоцисты
(стадия начала
кавитации)
Бластоцисты, %
(скорость
морфогенеза)
Jn vivo
In vitro
2-клеточные
1-клеточные
Зиготы с уменьшенным
объемом цитоплазмы
2-клеточные BALB/c
32,0+0,5(211)
29,8±0,7(127)
26,1 ± 0 , 4 (326)
21,1±0,6(131)
27,2±0,7(145)
33,64=0,5(116)
30,0+0,5(78)
28,2+0,2(198)
23,0±0,6(72)
31,2±0,7(76)
6 5 ± 3
7 1 + 4
7 2 ± 2
5 9 ± 4
5 4 ± 4
П р и м е ч а н и е . В скобках приведены количества зародышей.
В табл. 2 приведены результаты подсчета клеток у зародышей
на третий день развития. Среднее число клеток, сосчитанное по всем
зародышам данного типа, отражает скорость дробления. В культуре
скорость клеточных делений замедляется (табл. 2, [4]) . Зародыши,
развивающиеся 3 дня in vitro с 1-клеточной стадии, имеют на 20 %
меньше клеток, чем зародыши, развивающиеся in vivo. То есть в куль-
туре около половины клеток зародыша к 90-му ч развития еще не про-
ходит пятого деления.
Показано, что зародыши линии BALB/c in vivo отстают в развитии
от зародышей линии C57BLI6J [10—12]. Межлинейные различия мы на-
блюдали и в культуре: скорость клеточных делений у ВALBjc достоверно
ниже (Р>0 ,99 ) , чем у C57BL/6J. Но это может быть связано и с тем,
что зародыши BALB/c более чувствительны к изменению условий раз-
вития, чем C57BL/QJ.
Зависимость морфогенеза от числа клеточных делений (или цик-
лов репликации ДНК, ЯЦС) неочевидна. Если запуск кавитации опре-
деляется «биологическими часами», отсчитывающими время по клеточ-
ным делениям [13], условия развития не должны влиять на число
клеток у зародышей, начинающих образование бластоцели. Замедление
развития in vitro будет сказываться на времени появления ранних блас-
тоцист, но не на числе клеток у них. Из табл. 2 видно, что при разви-
ISSN 02 VS-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № δ 89
тии in vitro количество клеток у ранних бластоцист заметно уменьша-
ется (Р>>0,999). Предположение о том, что уменьшение числа клеток
у ранних бластоцист, развившихся в культуре, связано с повышенной
клеточной смертностью [13], наши результаты не подтверждают. Ни в
одном случае число пикнотических ядер не превышало 0,2 на зародыш.
Результаты, представленные в табл. 1 и 2, подтверждают гипотезу
_ о том, что уменьшение
числа клеток отрицатель-
но сказывается на пост-
имплантационном разви-
тии зародышей. Но при
этом следует иметь в ви-
ду, что нормальное раз-
витие мышат возможно
даже из бластоцист, раз-
вившихся из отдельных
бластомеров 2-клеточных
зародышей и имеющих
клеток в два раза мень-
ше нормы [14—16].
Р а з в и т и е з и г о т
с у м е н ь ш е н н ы м
к о л и ч е с т в о м ц и т о -
п л а з м ы . После микро-
хирургического удаления
части цитоплазмы (ри-
Получение зигот с увеличен-
ным ядерно-цитоплазматичес-
ким соотношением: а — микро-
хирургическое удаление части
цитоплазмы; б — зиготы до
(слева) и после операции
A method ίο increase the nucle-
ocytoplasmic ratio in mouse
zygotes: a — microsurgical re-
moval of cytoplasm; б — zygo-
tes before (on the left) and af-
ter manipulation.
сунок) 93 % зигот (236 из 253) развились в культуре до морфологи-
чески нормальных морул и бластоцист. Результаты подсчета клеток
представлены в табл. 2.
Поскольку зиготы до и во время операции обрабатывали ингиби-
торами цитоскелета, мы проверили, как влияет двухчасовая обработка
цитохалазином В и колцемидом на развитие зародышей. Обработка
этими препаратами не влияла на скорость развития и стадию начала
кавитации зародышей, что соответствует результатам, полученным ра-
нее для двуклеточных зародышей [17].
Скорость дробления эмбрионов с уменьшенным на треть объемом
цитоплазмы достоверно ниже, чем контрольных ( Р > 0 , 9 9 9 ) . Показано,
что зиготы с уменьшенным объемом цитоплазмы проходят первое де-
ление одновременно с контрольными [18], очевидно, замедление раз-
вития происходит на втором — четвертом делениях дробления.
Следует обратить внимание на то, что удаление цитоплазмы по
методу МакГрата — Солтера происходит без прокалывания плазмати-
ческой мембраны. При этом в тот момент, когда 35 % цитоплазмы ока-
зывается засосанными в иглу, площадь поверхности образовавшейся
структуры в 2,3 раза больше поверхности зиготы. То есть в результате
операции получается зигота с уменьшенным на треть объемом и растя-
нутой в 2,3 раза мембраной (при первом делении мембрана растягива-
ется в 1,2 раза [19]). Поскольку морфогенез зародыша, по-видимому,
90 ISSN 02 VS-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № δ 90
во многом определяется состоянием плазматической мембраны (поля-
ризация мембран бластомеров, взаимодействие клеток при компакти-
зации, образование плотных контактов перед кавитацией [20—24]),
можно предположить, что на развитие оперированной зиготы будет вли-
ять не только отсасывание трети цитоплазмы, но и удаление половины
мембраны.
Результаты нашего эксперимента по удалению части цитоплазмы
допускают интерпретацию с точки зрения регуляторной роли цитоплаз-
мы. В самом деле, ЯЦС, соответствующее стадии запуска кавитации,
при уменьшении объема цитоплазмы будет достигаться после меньшего
числа клеточных делений.
Действуя по принципу reductio ad absurdum, мы увеличили ЯЦС
до максимума, оставив на культивирование кариопласт зиготы. Неко-
торые кариопласты через сутки были двуклеточными, но дальше раз-
витие не пошло. Этот эксперимент, по нашему мнению, особенно наг-
лядно показывает, что основная роль цитоплазмы — это поддержание
жизнедеятельности ядра.
Заключение. К настоящему времени проверены практически все
эпигенетические факторы, предложенные на роль регуляторов разви-
тия. Показано, что ни один из них, взятый в отдельности, не определя-
ет морфогенез преимплантационного эмбриона млекопитающего.
В частности, сообщалось, что образование бластоцели не зависит ни
от абсолютного времени, прошедшего с начала развития, ни от числа
клеток, цитокинеза [13, 25], ни от количества циклов репликации Д Н К
[26], ни от межклеточных взаимодействий [25, 27], а стадиеспецифи-
ческая экспрессия генов не зависит от ЯЦС [28].
Наши результаты позволяют предположить, что морфогенез пре-
имплантационных эмбрионов млекопитающих зависит как от абсолют-
ного времени, прошедшего с начала развития, так и от ЯЦС.
Для объяснения полученных результатов мы предлагаем следую-
щую схему взаимодействия ядра и цитоплазмы в развитии. Не
подлежит сомнению, что онтогенез является реализацией программы,
записанной в геноме зиготы. Для того чтобы оставаться стабильным,
развертывание программы развития должно не зависеть от внешних
по отношению к геному воздействий, идти прежде всего по «генети-
ческим часам», запускаемым при оплодотворении. Репликация ДНК,
кариокинез, цитокинез, морфогенез — это прежде всего результаты реа-
лизации программы развития. Данные, полученные на сегодняшний
день, не противоречат гипотезе о том, что в основе изменений экспрес-
сии генов, определяющих развитие, лежат программируемые изменения
на уровне ДНК [29].
Но для того чтобы оставаться устойчивой, гомеостатическая сис-
тема должна иметь канал обратной связи. На доимплантационной ста-
дии развития обратная связь может осуществляться через механизмы
ядерно-цитоплазматического взаимодействия. Чем более изменчива
ереда, в которой развивается эмбрион, тем большая роль отводится
цитоплазме как механизму приведения ядра в состояние, соответству-
ющее данной стадии развития эмбриона. Полученные на сегодняшний
день результаты позволяют предположить, что у зародышей млекопи-
тающих, развивающихся в среде, стабильность которой является мак-
симально возможной, цитоплазма частично утрачивает регуляторные
функции и выступает в первую очередь как система поддержания жиз-
недеятельности ядра.
Понятно, что любое изменение условий развития зародыша млеко-
питающего может быть только ухудшением. Замедление развития за-
родышей в культуре связано, скорее всего, с неспецифическим пониже-
нием скоростей метаболизма. В первую очередь будут замедляться
процессы, запуск которых в меньшей степени зависит от ядра, посколь-
ку цитоплазма играет роль «буфера» между средой и ядром. Наличие
автономной кортикальной активности указывает на существование «ци-
топлазматических часов» [30], регулирующих цитокинез. Вероятно,
ISSiM 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 5 91
поэтому наиболее заметное влияние экспериментальные воздействия
оказывают на скорость дробления зародышей (см. табл. 2). Транскрип-
ция и трансляция для запуска кавитации заканчиваются лишь за не-
сколько часов до начала образования бластоцели [31]. В таком случае
р^ль ядра в запуске этого процесса может быть значительно большая,
чем в случае деления, — будет наблюдаться относительная независи-
мость кавитации от условий развития.
Тот факт, что зародыши, развивающиеся in vitro, начинают обра-
зовывать бластоцель при меньшем числе клеток, чем in vivo, указы-
вает на независимость запуска кавитации ни от количества циклов
репликации ДНК, ни от ЯЦС. То есть механизмы морфогенеза и ци-
токинеза относительно независимы друг от друга. Результаты, полу-
ченные при изучении развития зародышей с увеличенным ЯЦС, не опро-
вергают эту гипотезу. После удаления части цитоплазмы условия
наиболее неблагоприятны для развития зародышей: на факт культиви-
рования с 1-клеточной стадии накладывается отсутствие трети систем
жизнеобеспечения. В результате, к 90-му ч развития число клеток у
зародыша на треть ниже, чем in vivo. Поэтому неудивительно, что на
столько же уменьшается и число клеток у ранних бластоцист.
Для проверки гипотезы о независимости морфогенеза от ЯЦС мы
предполагаем изучить развитие зародышей с удвоенным объемом
цитоплазмы.
Авторы выражают глубокую признательность А. Д. Груздеву
(Ин-т цитологии и генетики СО АН СССР) за идею оптической схемы
и советы по изготовлению стереомикроскопа.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Newport J., Kirschner Μ. A major developmental transition in early Xenopus embryos.
II. Control of the onset of t ranscr ipt ion/ /Cel l .—1982.—30, N 3 .—P. 687—696.
2. Kobayakawa Y., Kubota H. Temporal pattern of changes and the onset of gastrul'ation
in amphibian embryos developed from eggs with reduced cytoplasm / / J. Embryol.
and Exp. Morphol.— 1981.—62.— P. 83^—94.
3. Howlett S. K., Barton S. C., Surani M. A. Nuclear cytoplasmic interactions follo-
wing nuclear t ransplantat ion in mouse e m b r y o s / / D e v e l o p m e n t — 1987.—101, N 4
P. 9Ί5—925.
4. Bavister B. D. Role of oviductal secretions in embryonic growth in vivo and in vit-
ro / /The r iogeno logy .— 1988.— 29, N 1.—P. 143—154.
5. Whitten W. K. Nutrient requirements for the culture of preimplantation embryos
in vitro Ц Adv. Biosci.— 1971.—6.— P. 129—139.
6. Abramczuk J., Solter D., Koprowski H. The beneficial effect of EDTA on develop-
ment of mouse one-cell embryos in chemically defined medium / / Develop. Biol
1977.—61, -N 2 .—P. 378—Э83.
7. Tarkowski A. K An air-drying method for chromosome preparations from mouse
e g g s / / C y t o g e n e t i c s . — 1966.—5, N 6 .—P. 394—400.
S. McGrath /., Solter D. Nuclear t ransplantat ion in the mouse embryo by microsurgery
and cell fusion / /Sc ience .— 1983.—220, N 4603.—P. 13Ю0—'1802.
9. Hogan BConstantini F., Lacy E. Manipulating the mouse embryo. A laboratory ma-
n u a l - N e w York: Cold Spring Harbor Lab., 11986—332 p.
10. Титенко Η. В. Цитогенетические нарушения и смертность зародышей мышей до
имплантации: Автореф. дис. ... канд. биол. наук.— Киев, 1977.—26 с.
11. Морозова JI. М. Роль генетико-физиологических отношений мать — потомок в ста-
новлении жизнеспособности и плодовитости млекопитающих: Автореф. дис. ... канд.
биол. наук.— Киев, 1978.—22 с.
12. Goldbard S. В., Warner С. М. Genes affect the t iming of early mouse embryo deve-
l o p m e n t / / B i o l . Reprod.— 1982.-27, N 2 .—P. 419—424.
1(3. Smith R., McLaren A. Factors affecting the time of formation of the mouse blastoco-
el / / J. Embryol. and Exp. Morphol.— 1977.—41.— P. 79—92.
14. Tarkowski A. K. Experimental studies on regulation in the development of isolated
blastomeres of mouse e g g s / / A c t a theriol.— 1969—3, N 1 1 — P . 191—267.
15. Rands G. F. Cell allocation in half- and quadruple-sized preimplantation mouse em-
b r y o s / / J . Exp. Zool.—1985.—236, N 1.—P. 67—70.
16. Rands G. F. Size regulation in the mouse embryo. II. The development of half embry-
os / / J . Embryol. and Exp. Morphol.— 1986.—98.— P. 209—217.
17. Siracusa G., Whittingham D. G., De Felici M. The eMect of microtubule- and micro-
fi lament-disrupting drugs on preimplantation mouse e m b r y o s / / I b i d . — 1980.—60.—
P. 71—82.
18. Barton S. H., Surani Μ. A. H. Microdissection of mouse e g g / / E x p . Cell Res.—
Ш83.—146, N 1.—P. 187—191.
92 ISSN 02 VS-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № δ 92
19. Lehtonen Ε. Changes in cell dimensions and intercellular contacts during cleavage-
stage cell cycles in mouse embryonic c e l l s / / J . Embryol. and Exp. Morphol.—11980.—
58.—P. 231—249.
20. Handyside A. H., Ediditi M., Wolf D. E. Polarized distribution of membrane compo-
nents on two-cell mouse embryos / / Roux Arch. Develop. Biol.—1987.—196, N 5
P. 273—279.
21 McClay D., Ettensohn C. A. Cell adhesion in m o r p h o g e n e s i s / / A n n u Rev. Cell Bi-
ol.— 1987.—3.— P. 319—347.
22. Calarco-Gillam P. Cell-cell interactions in mammalian preimplantation development / /
Developmental biology: a comprehensive synthesis / Ed L. W. Browder.— New York:
Plenum press, iI986.— P. 329—371.
23 Takeiehi M. Cadherins: a ,molecular family essential for selective cell-cell adhesion
and animal m o r p h o g e n e s i s / / T r e n d s Genet.— 1987.—3, N 8 .—P. 213—217.
24. Hadijka MHilltnan H. Ultrastructural studies of the mouse blastocyst substages / /
J. Embryol. and Exp. Morphol.— 1975.—32.— P. 675—695.
25. Surani M. A. H., Barton S. C., Burling A. Differentiation of 2-cell and 8-cell mouse
embrvos arrested bv cytoskeletal i n h i b i t o r s / / E x p . Cell Res.— 1980.—125, N 2.—
P. 275—286.
26. Dean W. L.. Rossant J. Effect of del'aying DNA replication on blastocyst formation
in the mouse / /Dif ferent ia t ion .— 1984.—26, N 2,—P. 134—137.
27. Prather R. S., First N. L. Reprogramminor of murine blastocoel f o r m a t i o n / / J . Exp.
Z o o l - iI986,—237, N 3 .—P. 347—350.
28. Petzoldt U., Muggleton-Harris A. The effect of the nucleocytoplasmic ratio on pro-
tein synthesis and expression of a stage-specific antigen in early cleaving mouse
embryos / /Deve lopment .— 1987.—99, N 4 .—P. 481—493.
29. Bolton V. N., Oades P. /., Johnson Μ. H. The relationship between cleavage, DNA
replication, and gene expression in the mouse 2-cell e m b r y o / / J . Embryol. and Exp.
Morphol.— 19'84.—79.—P. 139—163.
30. Autonomous cortical activity in mouse eggs controlled by a cytoplasmic clock /
M. Waksmundzka, E. Krysiak, J. Karasiewich et a l . / / I b i d . — P. 77—96.
31. Kidder G. M., MeLaehlin J. R. Timing of transcription and protein synthesis under-
lying morphogenesis in preimplantation mouse embrvos / / Develop. Biol.— 19'85.—
112, N 2.—P. 265—275.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики Получено 17.04.89
АН УССР, Киев
ROLE OF THE NUCLEOCYTOPLASMIC RATIO
IN THE REGULATION OF THE MAMMAL DEVELOPMENT.
DEVELOPMENT OF ZYGOTES WITH A DECREASED
CYTOPLASM VOLUME
S. V. Evsykov, L. M. Morozova, A. P. Solomko
Institute of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukrainian SiSR, Kiev
S u m m a r y
Following 3 days after microsurgical removal· of '1/3 of the cytoplasm vohime, more than
90 % of mouse zygotes developed in vitro into morulae and blastocysts. Development of
such embryos was considerably delayed. The mean cell number of nascent blastocysts
was significantly lower than in control, thus revealing that the start of cavitation so-
mewhat depends upon the nucleocytoplasmic ratio. Comparison of preimplantation em-
bryos developing under different conditions in vivo, in vitro from two-cell or one-cell
s tages indicates that start cavitation depends on the absolute time passed from the be-
ginning of the development. These results suggest that the «biological clock» works at
the genomic level, while the nucleocytoplasmic ratio can be considered as a feedback
mechanism operating during the preimplantation development. The viability of morulae
and blastocysts developed in vitro has been proved by their t ransplantat ions to pseudo-
pregnant females.
ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА. 1989. Т. 5. № 5 93
|