Виявлення вірусу класичної чуми свиней за допомогою обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції та молекулярної гібридизації
Для виявлення методом обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції геномної РНК вірусу класичної чуми свиней (КЧС) у патматеріалах, отриманих від тварин з різним клінічним проявом та перебігом захворювання КЧС, було використано олігонуклеотидні затравки, що фланкують фрагмент (846 п. н.)...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1997 |
| Hauptverfasser: | , , , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1997
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155204 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Виявлення вірусу класичної чуми свиней за допомогою обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції та молекулярної гібридизації / С.Д. Кириленко, О.M. Дерябін, О.Г. Дерябіна, О.Л. Кириленко, Ю.О. Чередник, Л.П. Гришок, О.Т. Шиков // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 3. — С. 239-244. — Бібліогр.: 14 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155204 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Кириленко, С.Д. Дерябін, О.М. Дерябіна, О.Г. Кириленко, О.Л. Чередник, Ю.О. Гришок, Л.П. Шиков, О.Т. 2019-06-16T10:57:07Z 2019-06-16T10:57:07Z 1997 Виявлення вірусу класичної чуми свиней за допомогою обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції та молекулярної гібридизації / С.Д. Кириленко, О.M. Дерябін, О.Г. Дерябіна, О.Л. Кириленко, Ю.О. Чередник, Л.П. Гришок, О.Т. Шиков // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 3. — С. 239-244. — Бібліогр.: 14 назв. — укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000485 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155204 619:616:575.11-072.2 Для виявлення методом обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції геномної РНК вірусу класичної чуми свиней (КЧС) у патматеріалах, отриманих від тварин з різним клінічним проявом та перебігом захворювання КЧС, було використано олігонуклеотидні затравки, що фланкують фрагмент (846 п. н.) гена структурного білка гп51–55 цього вірусу. Обговорюються можливості використання розроблених праймерів для диференціації високо- та низьковірулентних ізолятів вірусу КЧС та в проведенні молекулярно-епізоотичних досліджень. Для выявления методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции геномной РНК вируса классической чумы свиней (КЧС) в патматериалах, полученных от животных с различными клиническими проявлениями и протеканием заболевания КЧС, использованы олигонуклеотидные затравки, фланкирующие фрагмент (846 п. о.) гена структурного белка гп51-55 этого вируса- Обсуждаются возможности использования разработанных праймеров для дифференциации высоко- и низковирулентных изолятов вируса КЧС и в проведении молекулярно-эпизоотических исследований. Oligonucleotide primers flanking 846 bp fragment of gp5l-55 structural gene of classical swine fever virus (CSFV) have been used in polymerase chain reaction for detection of genomic RNA of CSFV in pathological specimens taken from animals with different clinical signs and disease running. The possibility of their use in the differentiation of high- and low virulent CSFV isolates and in molecular epidemiologicat investigations is discussed. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Вирусы и клетка Виявлення вірусу класичної чуми свиней за допомогою обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції та молекулярної гібридизації Выявление вируса классической чумы свиней с помощью обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции и молекулярной гибридизации Detection of classical swine fever virus by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and molecular hybridization Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Виявлення вірусу класичної чуми свиней за допомогою обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції та молекулярної гібридизації |
| spellingShingle |
Виявлення вірусу класичної чуми свиней за допомогою обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції та молекулярної гібридизації Кириленко, С.Д. Дерябін, О.М. Дерябіна, О.Г. Кириленко, О.Л. Чередник, Ю.О. Гришок, Л.П. Шиков, О.Т. Вирусы и клетка |
| title_short |
Виявлення вірусу класичної чуми свиней за допомогою обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції та молекулярної гібридизації |
| title_full |
Виявлення вірусу класичної чуми свиней за допомогою обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції та молекулярної гібридизації |
| title_fullStr |
Виявлення вірусу класичної чуми свиней за допомогою обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції та молекулярної гібридизації |
| title_full_unstemmed |
Виявлення вірусу класичної чуми свиней за допомогою обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції та молекулярної гібридизації |
| title_sort |
виявлення вірусу класичної чуми свиней за допомогою обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції та молекулярної гібридизації |
| author |
Кириленко, С.Д. Дерябін, О.М. Дерябіна, О.Г. Кириленко, О.Л. Чередник, Ю.О. Гришок, Л.П. Шиков, О.Т. |
| author_facet |
Кириленко, С.Д. Дерябін, О.М. Дерябіна, О.Г. Кириленко, О.Л. Чередник, Ю.О. Гришок, Л.П. Шиков, О.Т. |
| topic |
Вирусы и клетка |
| topic_facet |
Вирусы и клетка |
| publishDate |
1997 |
| language |
Ukrainian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Выявление вируса классической чумы свиней с помощью обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции и молекулярной гибридизации Detection of classical swine fever virus by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and molecular hybridization |
| description |
Для виявлення методом обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції геномної РНК вірусу класичної чуми свиней (КЧС) у патматеріалах, отриманих від тварин з різним клінічним проявом та перебігом захворювання КЧС, було використано олігонуклеотидні затравки, що фланкують фрагмент (846 п. н.) гена структурного білка гп51–55 цього вірусу. Обговорюються можливості використання розроблених праймерів для диференціації високо- та низьковірулентних ізолятів вірусу КЧС та в проведенні молекулярно-епізоотичних досліджень.
Для выявления методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции геномной РНК вируса классической чумы свиней (КЧС) в патматериалах, полученных от животных с различными клиническими проявлениями и протеканием заболевания КЧС, использованы олигонуклеотидные затравки, фланкирующие фрагмент (846 п. о.) гена структурного белка гп51-55 этого вируса- Обсуждаются возможности использования разработанных праймеров для дифференциации высоко- и низковирулентных изолятов вируса КЧС и в проведении молекулярно-эпизоотических исследований.
Oligonucleotide primers flanking 846 bp fragment of gp5l-55 structural gene of classical swine fever virus (CSFV) have been used in polymerase chain reaction for detection of genomic RNA of CSFV in pathological specimens taken from animals with different clinical signs and disease running. The possibility of their use in the differentiation of high- and low virulent CSFV isolates and in molecular epidemiologicat investigations is discussed.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155204 |
| citation_txt |
Виявлення вірусу класичної чуми свиней за допомогою обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції та молекулярної гібридизації / С.Д. Кириленко, О.M. Дерябін, О.Г. Дерябіна, О.Л. Кириленко, Ю.О. Чередник, Л.П. Гришок, О.Т. Шиков // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 3. — С. 239-244. — Бібліогр.: 14 назв. — укр. |
| work_keys_str_mv |
AT kirilenkosd viâvlennâvírusuklasičnoíčumisvineizadopomogoûobernenotranskriptaznoípolímeraznoílancûgovoíreakcíítamolekulârnoígíbridizacíí AT derâbínom viâvlennâvírusuklasičnoíčumisvineizadopomogoûobernenotranskriptaznoípolímeraznoílancûgovoíreakcíítamolekulârnoígíbridizacíí AT derâbínaog viâvlennâvírusuklasičnoíčumisvineizadopomogoûobernenotranskriptaznoípolímeraznoílancûgovoíreakcíítamolekulârnoígíbridizacíí AT kirilenkool viâvlennâvírusuklasičnoíčumisvineizadopomogoûobernenotranskriptaznoípolímeraznoílancûgovoíreakcíítamolekulârnoígíbridizacíí AT čerednikûo viâvlennâvírusuklasičnoíčumisvineizadopomogoûobernenotranskriptaznoípolímeraznoílancûgovoíreakcíítamolekulârnoígíbridizacíí AT grišoklp viâvlennâvírusuklasičnoíčumisvineizadopomogoûobernenotranskriptaznoípolímeraznoílancûgovoíreakcíítamolekulârnoígíbridizacíí AT šikovot viâvlennâvírusuklasičnoíčumisvineizadopomogoûobernenotranskriptaznoípolímeraznoílancûgovoíreakcíítamolekulârnoígíbridizacíí AT kirilenkosd vyâvlenievirusaklassičeskoičumysvineispomoŝʹûobratnotranskriptaznoipolimeraznoicepnoireakciiimolekulârnoigibridizacii AT derâbínom vyâvlenievirusaklassičeskoičumysvineispomoŝʹûobratnotranskriptaznoipolimeraznoicepnoireakciiimolekulârnoigibridizacii AT derâbínaog vyâvlenievirusaklassičeskoičumysvineispomoŝʹûobratnotranskriptaznoipolimeraznoicepnoireakciiimolekulârnoigibridizacii AT kirilenkool vyâvlenievirusaklassičeskoičumysvineispomoŝʹûobratnotranskriptaznoipolimeraznoicepnoireakciiimolekulârnoigibridizacii AT čerednikûo vyâvlenievirusaklassičeskoičumysvineispomoŝʹûobratnotranskriptaznoipolimeraznoicepnoireakciiimolekulârnoigibridizacii AT grišoklp vyâvlenievirusaklassičeskoičumysvineispomoŝʹûobratnotranskriptaznoipolimeraznoicepnoireakciiimolekulârnoigibridizacii AT šikovot vyâvlenievirusaklassičeskoičumysvineispomoŝʹûobratnotranskriptaznoipolimeraznoicepnoireakciiimolekulârnoigibridizacii AT kirilenkosd detectionofclassicalswinefevervirusbyreversetranscriptasepolymerasechainreactionandmolecularhybridization AT derâbínom detectionofclassicalswinefevervirusbyreversetranscriptasepolymerasechainreactionandmolecularhybridization AT derâbínaog detectionofclassicalswinefevervirusbyreversetranscriptasepolymerasechainreactionandmolecularhybridization AT kirilenkool detectionofclassicalswinefevervirusbyreversetranscriptasepolymerasechainreactionandmolecularhybridization AT čerednikûo detectionofclassicalswinefevervirusbyreversetranscriptasepolymerasechainreactionandmolecularhybridization AT grišoklp detectionofclassicalswinefevervirusbyreversetranscriptasepolymerasechainreactionandmolecularhybridization AT šikovot detectionofclassicalswinefevervirusbyreversetranscriptasepolymerasechainreactionandmolecularhybridization |
| first_indexed |
2025-11-27T03:17:01Z |
| last_indexed |
2025-11-27T03:17:01Z |
| _version_ |
1850796660798521344 |
| fulltext |
jfSSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1997. Т. 13. № 3
ВИРУСЫ И К Л Е Т К А
Виявлення вірусу класичної чуми свиней
за допомогою обернено-транскриптазної
полімеразної ланцюгової реакції
та молекулярної гібридизації
С Д. Кириленко, О- M. Дерябін1, О. Г. Дерябіна1, О. Л. Кириленко,
Ю. О. Чередник, Л. П. Гришок1, О. Т. Шиков1
Інститут молекулярної біології та генетики HAH України
252143, Київ, вул. Академіка Заболотного, 150
1
Інститут ветеринарної медицини УААН
252151 , Київ, вул. Донецька, ЗО
Для виявлення методом обернено-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції геномної РНК
вірусу класичної чуми свиней (КЧС) у патматеріалах, отриманих від тварин з різним клінічним
проявом та перебігом захворювання КЧС, було використано олігонуклеотидні затравки, що
фланкують фрагмент (846 п. н.) гена структурного білка гп51—55 цього вірусу. Обговорюються
можливості використання розроблених праймерів для диференціації високо- та низьковірулентних
ізолятів вірусу КЧС та в проведенні молекулярно-епізоотичних досліджень.
Вступ. Сучасна діагностика пестивірусів (ПВ), збу
дників небезпечних хвороб овець, свиней та вели
кої рогатої худоби (ВРХ), що призводять до вели
ких економічних збитків у тваринництві в усіх
країнах світу, грунтується на використанні серо
логічних методів. Референтним, згідно з рекомен
даціями Міжнародного епізоотичного бюро, визна
но метод флюоресцентних антитіл (МФА) в кріо-
зрізах, відбитках та з виділенням вірусу в культурі
клітин (КК) . Поступово, як не менш чутливі і
дешевші, набувають розповсюдження імуноперок-
сидазний тест в КК та імуноферментний аналіз
(ІФА) [1 , 2 ] , Принципове значення має викори
стання у цих реакціях моноклональних антитіл
(МКА) для підвищення їх специфічності у зв 'язку
з наявністю перехресних взаємодій та випадками
виділення від свиней вірусу вірусної діареї ВРХ
[3] .
Проблеми моніторингу циркуляції збудника
серед свійських та диких тварин, прояви інфекції в
© С. Д . К И Р И Л Е Н К О , О . М. Д Е Р Я В І Н , О . Г. Д Е Р Я Б І Н А ,
О . Л . К И Р И Л Е Н К О , Ю . О. Ч Е Р Е Д Н И К , Л. П. Г Р И Ш О К .
О. Т. Ш И К О В , 1997
атиповій формі, привнесення в дику популяцію ПВ
вірусу у складі живих вакцин вимагають викори
стання методів, спрямованих на аналіз геному
вірусу та здатних диференціювати високо- і низь-
ковірулентні, вакцинні та дикі ізоляти і штами,
вивчати характер тенденцій еволюційного процесу.
Визначення та аналіз первинної послідовності ге
номної Р Н К , рекомбінантне відтворення структур
них білків віріону, отримання МКА і вивчення за
їх допомогою антигенної мінливості у штамів та
ізолятів вірусу класичної чуми свиней (ВКЧС)
різного п о х о д ж е н н я є основними н а п р я м к а м и
вирішення проблеми боротьби з цим небезпечним
захворюванням.
Метою н а ш и х досл іджень було виявлення
ВКЧС у патматеріалах та інфікованих культурах
клітин за допомогою обернено-транскриптазної
полімеразної ланцюгової реакції (ОТ-ШІР) з пе
ревіркою специфічності отриманих фрагментів ме
тодом молекулярної гібридизації з відповідним
фрагментом геному контрольного штама ВКЧС Ші-
Минь.
Матеріали та методи. Штами та культури, В
239
К И Р И Л Е Н К О С. Д . ТА Ш
роботі використано контрольний (вірулентний)
штам ВКЧС Ші-Минь, репродукований в пере-
вивній культурі клітин нирки свині РК-15 ; патма-
теріали у вигляді 20 %- ї суспензії органів від
загиблих або вимушено забитих свиней із різних
областей і господарств України з різним клінічним
проявом і перебігом захворювання; отримана нами
раніше [4 ] рекомбінантна плазміда pUC18-llb, що
несе фрагмент гена структурного білка Е1 ВКЧС.
Метод флюоресцентных антитіл. Д л я лабо
раторної діагностики К Ч С і проведення експертизи
патматеріалів на наявність ВКЧС застосовували
прямий варіант методу імунофлюоресценції . Д л я
виявлення антигена ВКЧС на покривних скельцях
готували мазки-відбитки із органів і тканин: се
лезінки, нирок, л імфатичних вузлів, мигдаликів,
легенів, червоного кісткового мозку. Після фіксації
в холодному ацетоні мазки-відбитки інкубували з
кон'югатом Ф І Т Ц — імуноглобулін К Ч С з «Набору
препаратів для імунофлюоресцентної діагностики
КЧС» (ТУ 4 6 2 0 - Ь 8 4 ) , виготовленого ВНДіВВ
(м. Покров, Росія). Д л я виділення вірусу викори
стовували культуру клітин Р К - 1 5 , вирощену на
покривних скельцях в поживному середовищі Ігла
(MEM) з додаванням 10 % ембріональної сироват
ки ВРХ. Мікроскопію проводили у відображеному
синьому світлі на люмінесцентному мікроскопі
ЛЮМАМ із збуджуючими фільтрами ФС-1-2 , С С -
15-2, БС-8-2 і замикаючим N1 або Ш / Ж - 1 8 .
Виділення віріонної Р Н К , О Т - П Л Р та рест-
рикційний аналіз здійснювали, як у роботі [4 ]. Д л я
О Т - П Л Р використовували олігонуклеотидні прай-
мери, підібрані і синтезовані нами раніше [4] .
Прямий праймер (Chum-A) має послідовність 5 ' -
T T A C C C A C T T C C G T G A C A T T C G - 3 ' , о б е р н е н и й
(Chum-B) — 5 - T A T C T T C C T C C C A A C A G T G C C - 3 ' .
Молекулярна гібридизація. Після електрофоре
зу в ТБЕХ0.5 , фарбування бромистим етидієм та
фотографування фрагменти Д Н К переносили та
імобілізували на нітроцелюлозній мембрані Ну-
bond-C Extra фірми «Amersham» (Велика Бри
танія) за методикою [5 ] у відповідності з методич
ними рекомендаціями цієї ж фірми. Мічення дид-
жоксидженіном (DIG) фрагментів Д Н К , виділених
з агарозного геля за методом [6 ], молекулярну
гібридизацію та обробку результатів гібридизації
виконували за допомогою DIG DNA Labelling and
Detection Kit фірми «Boehringer Mannheim» (ФРГ)
в жорстких умовах у відповідності з рекомен
даціями виробника.
Результати та обговорення. Нами підібрано та
синтезовано оригінальну пару олігонуклеотидних
праймерів Chum-A та Chum-B, за допомогою яких
можливо ампліфі кувати фрагмент гена Е1 ВКЧС
довжиною 846 п. н. Перелік та характеристики
інфекційних матеріалів, використаних у дослід
женні , наведено в таблиці.
Д л я виділення та очищення віріонної РНК
було використано простий метод [7 ] лізису за
допомогою DS-Na та протеїнази К з наступною
фенольною екстракцією. В результаті одержано
препарати сумарної фракці ї нуклеїнових кислот,
придатні для використання в О Т - П Л Р навіть після
продовженого зберігання під етиловим спиртом
протягом 6 місяців при - 2 0 °С або 2 діб при
кімнатній температурі (даних не наведено). При
сутність геномної Д Н К свині або хромосомної Д Н К
культур клітин не призводила до хибного від
творення О Т - П Л Р з праймерами Chum-A та Chum-
В в контрольних експериментах (даних не наведе
но) .
На стадії оберненої транскрипції для побудови
к Д Н К в реакційну суміш вносили обидва прайме-
ри, хоча для затравлювання РНК-залежного синте
зу першого ланцюга к Д Н К на позитивному ланцю
гу Р Н К необхідний тільки обернений праймер.
Відомо, що присутність прямого праймера ста
білізує вихід к Д Н К . Окрім того, додавання обох
праймерів доречно з точки зору мінімізації по
тенційних похибок піпетування.
На мал. 1 наведено типову картину електрофо
ретичного розподілення фрагментів О Т - П Л Р з пра
ймерами Chum-A та Chum-B та препаратами нук
леїнових кислот. На доріжці 3 спостерігається сму
жка , що відповідає за своїм розміром фрагменту,
близькому за величиною до 846 п. н. Цей матеріал
(експертиза 67, таблиця) був взятий від загиблої
дорослої вакцинованої тварини. Клінічна та пато-
морфологічна картина протікання була сильно ви
раженою та нагадувала таку африканської чуми
свиней.
На доріжках 2, 4У 5 (див. мал. 1) фрагментів
Д Н К очікуваного розміру не спостерігалося. Ці
матеріали дали негативні результати виявлення.
Цікаво, що на доріжку 2 з негативним результатом
було нанесено продукт ампліфікаці ї препарату,
виділеного з суспензії л імфовузла , взятого від за
гиблої 7-місячної тварини, перпарат селезінки якої
виявився позитивним у цій же системі (мал. 2, а).
Подібні результати було відмічено в роботі [8 ]. Не
виключено також, що зразок л імфовузла було на
правлено з порушенням вимог відбору патмате
ріалів для експертизи. Хоча можливі такі варіант*
вірусу, при яких праймери можуть бути недостат
ньо комплементарні геномній Р Н К вірусу, що мож<
призвести до хибнонегативних результатів, але ;
випадку експертизи 95 (лімфовузол) негативниї
результат було підтверджено і в МФА.
240
В И Я В Л Е Н Н Я В І Р У С У К Л А С И Ч Н О Ї Ч У М И С В И Н Е Й
Перелік зразків інфекційних матеріалів, використаних в роботі. Подано короткі характеристики та результати тестувань
різними методами
р и м і т к а. «+» — позитивний результат; «-» — негативний результат; « + / - » — неявно виражений результат; «+/=» —
зподілення смужок на гель-електрофорезі, що відрізнялося від позитивного контролю та повторювалося на деяких зразках; СВ —
гбковиражені ознаки; НВ — не визначали; Н Д — немає даних.
При виявленні ВКЧС методом О Т - П Л Р було
мічено, що в деяких зразках спостерігається
типове розподілення фрагментів на електрофо-
грамах (див. мал. 2, а). Так , наприклад, на
ріжці 3 (експертиза 104) відмічено три смужки
іної інтенсивності, які не відповідали за своїми
змірами характеристичному фрагментові 846 п.
(приблизно 650, 400 та 300 п. н.) і в той же час
являли собою типової картини негативного ре-
тьтату (відсутність будь-яких смужок на фоні
жого шлейфу) . Такі результати в таблиці позна-
ю як «+/=». Ампліфікація матеріалу, виділеного
зразка вакцинного препарату ЛК, обумовлювала
їлогічне розподілення смужок (доріжки 4У 6).
Електрофоретичні фрагменти з геля, поданого
на мал. 2, а, переносили на нітроцелюлозну мемб
рану та гібридизували з фрагментом величиною
776 п. н. гена Е1 штама Ші-Минь вірусу КЧС
(SacJ-EcoRI-фрагмент п л а з м і д и pUC18-llb),
міченим DIG. Результати гібридизації наведено на
мал. 2, б. Видно, що всі три коротші фрагменти
(650, 400 та 300 п. н.) не гібридизуються з фраг
ментом гена Еї В К Ч С у жорстких умовах на
відміну від характеристичного фрагмента розміром
846 п. н., який добре гібридизується (доріжка 2,
експертиза 95) . Можна дійти висновку, що неха
рактерні фрагменти не мають вираженої гомології
з фрагментом гена гп5\-55 ВКЧС.
241
КИРИЛЕНКО С. Д. ТА IH.
п. н.
п. н.
<^846
Рис. 1. Електрофореграма продуктів О Т - П Л Р з праймерами
Churn-A та Chum-B та препаратами нуклеїнових кислот: ./ —
маркер величини фрагментів Д Н К (гідроліз Д Н К фага X ре-
стриктазою PstI (розміри фрагментів вказані л іворуч) ; 2 — 5 —
продукти О Т - П Л Р з препаратами нуклеїнових кислот із зразків
патматеріалів (2 — експертиза 95 , суспензія л імфовузла; З —
експертиза 67 , суспензія селезінки; 4 — експертиза 89 , сус
пензія селезінки; 5 — експертиза 96, суспензія селез інки) . Елек
трофорез було проведено в 1 % - й агарозі та в буфері 0 ,5 * ТВЕ
На мал. 2 приведені дот-нанесення для контро
л ю с п е ц и ф і ч н о с т і т а ч у т л и в о с т і м е т о д і в
гібридизації і детекції. У верхньому рядку нанесено
розбавлення контрольного міченого зонда (конт
роль детекції) , у нижньому — п 'ятикратні розбав
лення контрольної мішені (pU С J 8-176), починаючи
з 1 нг. Видно, що чутливість методу була на рівні
одиниць пікограмів. Цього достатньо для виявлення
нез начної гомології.
Синтезована пара олігонуклеотидних затравок
б у л а с п р о е к т о в а н а п о п о с л і д о в н о с т і Р Н К
вірулентного штама Brescia та використана для
клонування фрагмента гена гп51-55 контрольного
вірулентного штама Ші-Минь ВКЧС довжиною $4£
п. н. [4] . Дослідження патматеріалів методом ОТ-
ПЛР показали, що у випадках гострої форми КЧС
(експертизи 67, 95) розміри продуктів ампліфікаці
не відрізнялися від фрагмента контрольного штам;
Ші-Минь, експертиза 41 (даних не наведено). Прі
І І І І І І І І
Рис . 2. Електрофореграма в 1 У ^ - й агарозі та буфері 0 ,5 х т
рестриктних фрагментів рекомбшантних плазмід та продук
О Т - П Л Р (а) та гібридизація по Саузерну з матеріалом, переї
сеним з геля А, та D I G - м і ч е н и м фрагментом (776 п.
плазміди pUC 18-116, гідролізованої Sad та EcoRI (б): /
фрагменти гідролізу ендонуклеазами рестрикці ї Sad та Есе
рекомбінантної плазміди pUC 18-116; 2—ІЗ — продукти С
П Л Р з праймерами Chum-A та Chum-B та препаратами н;
леїнових кислот (2 — експертиза 95 ; 3, 10 — експертиза 104:
6 — вакцинний препарат Л К ; 5 — патматеріал від тварині-
експертизи 107; 7, 8} 9 — патматеріали експертизи 107
тварин 3 , 2, 1 відповідно; / / — експертиза 103; 12 — 4
пасаж В К Ч С штама Ш і - М и н ь на культурі клітин Р К - 1 5 ; ІЗ
експертиза 98) ; М — маркер величини фрагментів ДІ-ІК (
роліз Д Н К фага X рестриктазою PstI (розміри фрагме/
вказано праворуч) ; в — контрольні дот-нанесення для контре
специфічності та чутливості методів гібридизації та детек
Пояснення в тексті
242
цьому результати виявлення ВКЧС методом О Т -
П Л Р збігалися з такими референтного методу
( М Ф А ) ; а м п л і ф і к о в а н і ф р а г м е н т и д о б р е
г і б р и д и з у в а л и с я з EcoRI-SacI-фрагмттом
плазміди pUCJS-116 (див. р и с 2, б).
Результати виявлення ВКЧС методом О Т - П Л Р
при дослідженні патматеріалів з нечітко вираже
ним протіканням хвороби (експертизи 89, 96, 98)
були негативними та не збігалися з результатами
виявлення референтним методом (у відбитках). На
наш погляд, подібні розбіжності можуть бути вик
ликані кількома причинами: використана пара пра-
ймерів була відпрацьована на високовірулентні фо
рми ВКЧС і, можливо, не здатна ампліфікувати
атипові форми вірусу; переживанням вакцинних
форм вірусу (повторний аналіз в МФА з ви
діленням в КК був негативним) [9 ]; персистенцією
гетерологічного пестивірусу (вірусу діареї ВРХ)
Г10 J.
Особливу увагу привертають результати вияв
лення ВКЧС за матеріалами експертиз 103, 104,
107. Позитивні в МФА ці зразки дали нетипову
картину розподілення в О Т - П Л Р (див. мал. 2, а).
Замість фрагмента розміром 846 п. н. спостері
галися три нехарактеристичні фрагменти розміром
близько 650, 400 та 300 п. н., які не гібри
дизувалися з фрагментом гена гп5\-55 ВКЧС (див.
мал. 2, б). Цікаво, що аналогічні фрагменти були
отримані при відтворенні О Т - П Л Р з Р Н К , ви
діленою із зразка вакцинного препарату «ЛК»;
вони також не виявляли гомології з фрагментом
штама Ші-Минь при гібридизації.
Ці результати потребують додаткових дослід
жень, пов 'язаних з визначенням первинної нукле-
отидної послідовності отриманих фрагментів, ана
лізу різних вакцинних препаратів та, можливо,
окремих серій вакцин. Крім того, на наш погляд,
для аналізу результатів, що припускають неодно
значне тлумачення, необхідним є використання
додаткової пари праймерів на висококонсервативні
ділянки геному, загальних для усіх пестивірусів,
що виконували б роль позитивного контролю на
пестивіруси [11, 12 ].
При проведенні досліджень різних пестивірусів
методом О Т - П Л Р перспективною є можливість ви
вчення рестрикційного поліморфізму вірусного ге
ному [13, 14]. Так , нами було виявлено [4] , що у
висоховірулентного польового ізоляту ВКЧС (екс
пертиза 95) стосовно референтного штама Brescia
та контрольного штама Ші-Минь спостерігається
втрата сайту пізнавання ендонуклеази рестрикції
EcoRI (даних не наведено). Рестрикційний аналіз є
досить інформативним та значно дешевшим, ніж
визначення нуклеотидної послідовності, і може бу-
В И Я В Л Е Н Н Я В І Р У С У К Л А С И Ч Н О Ї Ч У М И С В И Н Е Й
ти використаний для початкових етапів молекуляр
но-епізоотичного дослідження пестивірусів в Ук
раїні.
С. Д. Кириленко, О. М. Дерябин, О. Г. Дерябина,
О. Л. Кириленко, Ю. О. Чередник, Л. П. Гришок, А. Т. Шиков
Выявление вируса классической чумы свиней с помощью
обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции
и молекулярной гибридизации
Резюме
Для выявления методом обратно-транскриптазной полиме
разной цепной реакции геномной РНК вируса классической
чумы свиней (КЧС) в патматериалах, полученных от живо
тных с различными клиническими проявлениями и протекани
ем заболевания КЧС, использованы олигонуклеотидные за
травки, фланкирующие фрагмент (846 п. о.) гена структур
ного белка гп51-55 этого вируса- Обсуждаются возможности
использования разработанных праймеров для дифференциации
высоко- и низковирулентных изолятов вируса КЧС и в прове
дении молекулярно-эпизоотических исследований.
Sergij D. Kirilenko, Oleg М. Deriabin, Olena G. Deriabina,
Olga L. Kirilenko, Jurij O. Cherednik, Ljudmila P. Grishok,
Oleksandr T. Shikov
Detection of classical swine fever virus by reverse transcriptase-
polymerase chain reaction and molecular hybridization
Summary
Oligonucleotide primers flanking 846 bp fragment of gp5l-55
structural gene of classical swine fever virus (CSFV) have been used
in. polymerase chain reaction for detection of genomic RNA of CSFV
in pathological specimens taken from animals with different clinical
signs and disease running. The possibility of their use in the
differentiation of high- and low virulent CSFV isolates and in
molecular epidemiological investigations is discussed.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Horner G. W., Tham Kok-Mun., Orr D. et al. Comparison of
an antigen capture enzyme-linked assay with reverse transcrip-
tion-polymerase chain reaction and cell culture immunope-
roxidase tests for the diagnosis of ruminant pestivirus infections
/ / Vet. Microbiol. — 1995 .—43.—P. 7 5 — 8 4 .
2. Moser C, Ruggli /V., Tratschin J. D., Hofnwnn M. A.
Detection of antibodies against classical swine fever virus in
swine sera by indirect ELISA using recombinant envelope
glycoprotein E2 II Immunobiology of viral infections: 3rd
Congr. Eur. Soc. Vet. Virol.—Interlaken, 1995.—P. 327—
330.
3. Paton D. J., Sands J. J., Lowings J. P. et al A proposed
division of the pestivirus genus using monoclonal antibodies,
supported by cross-neutralisation assays and genetic sequenc
ing / / Vet. Res .—1995 .—26 . -P. 9 2 — 1 0 3 .
4. Кириленко С. Д., Дерябін О. М., Кириленко О. Л. та in.
Клонування та надекспресія фрагмента гена структурного
білка El штаму Ші-Минь вірусу класичної чуми свиней / 7
Біополімери та клітина.—1996.—12, № 5 .—С. 93—99.
5. Southern Е. М. Detection of specific sequences among DNA
fragments separated by gel electrophoresis / / J. Мої. Biol.—
1 9 7 5 . _ 9 8 . _ p . 5 0 3 - 5 1 7 ,
6. Hojman F. A novel electrophoretic strategy allows detection of
very low amounts of circular retroviral DNA by PCR / / Meth.
Мої. and Cell. B io logy .—1990 .—2.—P. 66—69.
243
http://1975._98._p
КИРИЛЕНКО с:, д. ТА Ш.
7. Rasschaert D. Etude d'un coronavirus, le virus de la gastro
enteric transmissible du pore; identification des genes struc-
turaux et non-structuraux et localization d'un site antigenique
majeur sur la sequence de la glycoprotcine de spicule E2 II
These de docteur en sciences.—Paris: Universite de Paris-
Sud., 1988.—P.18.
8. Shih-Tung L., Shui-Nin L., Ding-Cheng W. et ai Rapid
detection of hog cholera virus in tissues by the polymerase
chain reaction / / J. Virol. Methods. —1991 . — 3 5 . — P . 227—
236.
9. Семенихин А. Л., Вишняков И. Ф. Состояние и перс
пективы мер борьбы с классической чумой свиней / /
Материалы, мауч.-практ. конф. ВНИИВВиМ.—Покров,
1995.—С. 29—35.
10. Afshar A., Dulac G. С , Bouffard A. Application of peroxidase
labelled antibodies to hog cholera and bovine viral diarhea
viruses / / J. Virol. Methods .—1989 .—23.—P. 2 5 3 — 2 6 2 .
11. Katz J. В., Ridpath J. F.t Bolin S. R. Presumptive diagnostic
differentiation of hog cholera virus from bovine viral diarrhea
and border disease viruses by using a cDNA Nested-amplifica
tion approach / / J. Clin. Microbiol .—1993.—31, N 3 . —
P. 5 6 5 — 5 6 8 .
12. Sullivan D. G., Akkina R. K. A nested polymerase chain
reaction assay to differentiate pestiviruses / / Vir. Res.—
1995 .—38 — P. 231— 239 .
13. Vilcek S., Herring A. J., Herring J. A. et ai Pestiviruses
isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at
least three genogroups using polymerase chain reaction and
restriction endonuclease analysis / / Arch. Virol.—1994.—
136 .—P. 3 0 9 — 3 2 3 .
14. Harding M,, Lutze-Wallace L., Prud'homme I. et ai Reverse
transcriptase-PCR assay for detection of hog cholera virus / /
J. Clin. Microbiol .—1994.—32, N 10 .—P. 2600—2602 .
УДК 619:616:575.11-072.2
Надійшла до редакції 09 .12.96
244
|