Хлоропластная ДНК-топоизомераза I типа из листьев гороха
Из полученных на ступенчатом градиенте изоосмотического перколла хлоропластов из листьев гороха выделена фракционированием в двухфазной системе сульфат аммония I полиэтиленгликоль-6000 с дальнейшей очисткой хроматографией на колонках хлоропластная ДНК-топоизомераза. Зависимость релаксирующей активно...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1991 |
| 1. Verfasser: | |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1991
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155244 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Хлоропластная ДНК-топоизомераза I типа из листьев гороха / Л.А. Ситайло // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 4. — С. 97-103. — Бібліогр.: 24 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859991266911059968 |
|---|---|
| author | Ситайло, Л.А. |
| author_facet | Ситайло, Л.А. |
| citation_txt | Хлоропластная ДНК-топоизомераза I типа из листьев гороха / Л.А. Ситайло // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 4. — С. 97-103. — Бібліогр.: 24 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Из полученных на ступенчатом градиенте изоосмотического перколла хлоропластов из листьев гороха выделена фракционированием в двухфазной системе сульфат аммония I полиэтиленгликоль-6000 с дальнейшей очисткой хроматографией на колонках хлоропластная ДНК-топоизомераза. Зависимость релаксирующей активности фермента от ионов Mg²⁺, блокирование ее бромистым этидием, отсутствие стимуляции релаксирующей активности полиаминами: спермидином, спермином, кадаверином, а также характер распределения топоизомеров в геле позволяют охарактеризовать топоизомеразу как прокариотическую I типа. Исследовано действие различных кофакторов на релаксирующую активность фермента.
Із одержаних на ступінчатому градієнті ізоосмотичного перколу хлоропластів листя гроху виділена фракціюванням у двофазній системі сульфат амонію/поліетиленгліколь6000 с наступним очищенням хроматографією на колонках хлоропластна (хл) ДНК- топоізомераза. Залежність релаксуючої активності фермента від іонів Mg²⁺ , блокування її бромистим етидієм, відсутність стимуляції релаксуючої активності поліамінами: спермідином, сперміном, кадаверином, а також характер розподілу топоізомерів у гелі дозволяють визнати топоізомеразу як прокаріотичну І типу. Досліджено дію різних кофакторів па релаксуючу активність фермента.
Chloroplasts of pea leaves were isolated by step gradient isoosmotic percoll, chloroplast DNA-topoisomerase. was isolated from them by fractionation in two-phase system ammonium sulfate/polyethylenglycol-6000 with the following purification by using column chromatography. The some properties of DNA-topoisomerase was searched. The dependence of relax activity of the enzyme from Mg²⁺ ions, its blocking by ethydium bromide, the absence of relax activity stimulation by polyamines: spermidine, spermin, cadaverine and the character of distribution of the topoisomers in the gels allow us to characterise the topoisomerase as prokaryotic type I.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:31:35Z |
| format | Article |
| fulltext |
revisiae into mammalian c e l l s / V . Pachnis, L. Pevny, R Rothstein, F. Cos lant in i / /
Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1990,—87, N 13 — P. 5109—5113.
.3. Pavan W. I., Hieter Ph., Reeves R. H. Modification and transfer into an embryonal
carcinoma cell line of a 360-kilobase human-derived yeast artificial chromosome/ /Mo] ,
and Cell. Biol.— 1990,— 10, N 8 — P . 4163—4169.
4. Ganal M. Wr, Tanksley S. D. Analysis of tomato DNA by pulsed field gel electropho-
resis // Plant Мої. and Biol. Rep — 1989 — 7 , N 1 — P. 17—27
Ин-т клеточ. биологии и генет. инженерии АН УССР, Получено 14.01.91
Киев
У Д К 577.152.5
Л. А. Ситайло
ХЛОРОПЛАСТНАЯ ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗА I ТИПА
ИЗ ЛИСТЬЕВ ГОРОХА
Из полученных на ступенчатом градиенте изоосмотического перколла хлоропластов из
листьев гороха выделена фракционированием в двухфазной системе сульфат аммония /
полиэтиленгликоль-6000 с дальнейшей очисткой хроматографией на колонках хлоро-
пластная ДНК-топоизомераза. Зависимость релаксирующей активности фермента от
ионов Mg2+, блокирование ее бромистым этидием, отсутствие стимуляции релаксирую-
щей активности полиаминами: спермидином, спермином, кадаверином, а также харак-
тер распределения топоизомеров в геле позволяют охарактеризовать топоизомеразу
как прокариотическую I типа. Исследовано действие различных кофакторов на релак-
сирующую активность фермента.
Введение. Суперспирализация Д Н К в клетках вызывает много тополо-
гических проблем, которые должны разрешаться клеткой для обеспече-
ния протекания нормальных процессов репликации, транскрипции, ре-
комбинации и в конечном итоге экспрессии генетической информации
[1, 2]. Ферменты, контролирующие топологические состояния Д Н К ,
ДНК-топоизомеразы,— играют ключевую роль в выполнении физиоло-
гических функций ДНК- В эу- и прокариотических клетках топологиче-
ские состояния Д Н К регулируют два класса ферментов: ДНК-топоизо-
меразы I и II типов; топоизомеразы I типа — с помощью механизма,
включающего введение одноцепочечного разрыва в одну из цепей Д Н К ,
проведение нативной цепи через разрыв и восстановление нативности
разорванной цепи [3, 4]. Хотя ДНК-топоизомеразы I типа не строго
необходимы для жизнеспособности эукариотических клеток [5], они,
тем не менее, существенно важны для организации хроматина [6], ми-
тоза [7], репликации Д Н К [8], рекомбинации [9], транскрипции [10].
ДНК-топоизомеразы II типа изменяют топологию Д Н К с помощью
механизма, обеспечивающего введение двухцепочечного разрыва в
Д Н К , проведение сегмента Д Н К через разрыв и восстановление раз-
рыва [3]. В отличие от топоизомераз I типа они необходимы для жиз-
неспособности эукариотической клетки [11]. Исследования, проведен-
ные за последние несколько лет, показали, что оба типа ферментов яв-
ляются первичными клеточными мишенями для действия различных
антибиотиков, обладающих противоопухолевой активностью [12]. То-
поизомеразы I типа — для цитотоксического алкалоида камптотецина
[13]; топоизомеразы II типа — для широкого круга химиотерапевтиче-
ских антибиотиков, включающего адриамицин, эллиптицин, амсакрин,
этопозид и тенипозид, а также их различные производные [14, 15].
ДНК-топоизомеразы из растительных организмов изучены слабо.
Н а сегодняшний день имеется несколько работ по выделению и физи-
ко-химическим характеристикам этого класса ферментов [16—18]. Сов-
сем мало среди них исследований, посвященных изучению ДНК-топо-
изомераз из хлоропластов [19, 20].
€> Л . А. Ситайло. 1991.
ISSN 0233-7667. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 4 7 — 1-284 97
Растительная клетка объединяет в себе три различные генетиче-
ские системы: ядро, хлоропласты и митохондрии, тесно взаимодей-
ствующие между собой. Каждая такая система обладает собствен-
ным ферментативным аппаратом, обеспечивающим его функциони-
рование. ДНК-топоизомераза — один из основных ферментов этого
аппарата.
Материалы и методы. В ы д е л е н и е - и о ч и с т к а х л о р о -
п л а с т н о й ( х л ) Д H К-т о π о и з о м е ρ а з ы I т и п а и з л и с т ь -
е в г о р о х а . Хлоропласты гороха выделяли согласно работе [21] с
некоторыми модификациями. Лизис их осуществляли в гомогенизаторе
(«Daunce», США) в буфере состава: 30 мМ трис-HCl, рН 8,0, 2 M NaCl1
5 мМ MgCk, 1 мМ ФМСФ, 1 мМ бензамидин, 5 мМ ε-аминокапроновая
кислота, 10 % глицерина в течение 20 мин. Лизат центрифугировали со
скоростью 20 тыс. об/мин, 30 мин. Осадок отбрасывали, к супернатанту
(фракция I) при слабом помешивании добавляли сухой полиэтиленгли-
коль-6000 (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 10 % и раствор пере-
мешивали в течение 20 мин. Нуклеиновые кислоты хлоропластов оса-
ждали при 15 тыс. об/мин 20 мин. К супернатанту (фракция II) при
помешивании добавляли порошок сульфата аммония до конечной кон-
центрации 55 % и в течение 1 ч высаливали белки. После центрифу-
гирования (20 тыс. об/мин, 20 мин) образовывалась двухфазная систе-
ма ПЭГ/сульфат аммония, на границе которой находилась пленка бел-
ка. Эту пленку осторожно собирали и суспендировали в минимальном
количестве буфера А: 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 30 мМ KCl, 0,5 мМ
ЭДТА, 0,5 мМ ДДТ, 1 мМ ФМСФ, 1 мМ бензамидин, 5 мМ є-аминокап-
роновая кислота, 10 %-ный глицерин, быстро диализовали против этого
буфера и вносили на колонку (7ХІ см) с ДЭАЭ-52 (фракция I I I ) . Бел-
ки с колонки элюировали линейным градиентом концентрации KCl
(30 мМ — 0,5 М) в буфере А. Фракции, содержащие топоизомеразную
активность, объединяли и отдиализовывали против буфера А. Диали-
зат (фракция IV) вносили на колонку с КМ-сефадексом Ц-25 (ЭХ|
X l см). Белки с колонки элюировали линейным градиентом концентра-
ции KCl (30 м М — 1,5 М) в буфере А. Фракции, содержащие топоизо-
меразную активность, объединяли, отдиализовывали против буфера Г
(буфер А, включающий 0,1 M K C l ) — ф р а к ц и я V и вносили на ко-
лонку с гепарин-сефарозой (6X1 см). Элюцию белков с колонки осу-
ществляли линейным градиентом концентрации KCl (0,1—1,5 М) в бу-
фере Г. Фракции, содержащие топоизомеразную активность, объединя-
ли и отдиализовывали против буфера П: 20 мМ калий-фосфат, рН 7,5,
0,1 M NaCl, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ФМСФ, 5 мМ є-аминокап-
роновая кислота, 10 %-ный глицерин (фракция VI) и вносили на ко-
лонку (4X1 см) с гидроксилапатитом (ГАП). Белки элюировали ли-
нейным градиентом концентрации (20 мМ — 0,5 М) калий-фосфата в
буфере П. Фракции, содержащие топоизомеразную активность, объеди-
няли, доводили концентрацию калий-фосфата до 0,2 M и вносили на
колонку с гидроксилапатитом ( 2 x 0 , 5 см). Белки с колонки элюировали
0,32 M калий-фосфатом в буфере П. Пул фракций, содержащий топо-
изомеразную активность, объединяли и отдиализовывали против буфе-
ра состава: 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, ЗО мМ KCl, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ
2-меркаптоэтанол, 1 мМ ФМСФ, 20 %-ный глицерин, распределяли на
аликвоты и сохраняли при —20 °С.
О п р е д е л е н и е р е л а к с и р у ю щ е й а к т и в н о с т и Д H K-
т о п о и з о м е р а з I т и п а и з х л о р о п л а с т о в л и с т ь е в го -
р о х а . Релаксирующую активность ДНК-топоизомеразы I из хлоро-
пластов листьев гороха определяли в объеме 20 мкл стандартной ин-
кубационной смеси, содержащей 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgCb,
20 мМ KCl, 1 мМ ДДТ, 60 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина
(БСА) и 0,2 мкг отрицательно суперспирализованной Д Н К с добавле-
нием 10—40 иг фермента, и инкубировали смесь при 37 °С в течение
1 ч. Реакцию релаксации останавливали добавлением DS-Na до конеч-
ной концентрации 0,5%, затем ЭДТА — до 30 мМ. После этого добав-
98 ISSN 0233-7667. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 4 7 — 1-284 98
ляли 1 мкл протеииазы К (1 мг/мл) и инкубировали смесь еще в те-
чение 30 мин.
Результаты и обсуждение. В ы д е л е н и е и о ч и с т к а χ л Д H K-
т о п о и з о м е р а з ы I т и п а и з л и с т ь е в г о р о х а . С в о й с т в а
Д H К-т о п о и з о м е р а з ы .
Данные по выделению и очистке хлДНК-топоизомеразы представ-
лены в таблице.
Схема очистки хлДНК-топоизомеразы I типа из листьев гороха
Фракция
Б е л о к ,
мг
Активность
фермента,
е д . акт*
Специфиче-
ская актив-
ность, е д / м г
Степень
очистки
Выход ,
%
Лизат хлоропластов 692** 34600' 50' — 100
Лизат IO1 %-ного ПЭГ 37 34000' 919 19 98
ДЭАЭ-целлюлоза 32 33500 1047 22 97
КМ-сеф а декс-Ц-2'5 14 30000 2143' 50 86,6
Гепарин-сефароза 8 20С001 2500 88 57,7
ΓΑΠ-Ι 1 IOOOOi 10000 704 28,9
ГАП-11 (нанесение на колонку) 0,15 8000 53333 4·6ΘΘ 23,1
ΓΑΠ-1Ι (выход с колонки) 0,050 6000' 120000' 14080 17,4
* За единицу активности фермента принято такое его количество, которое способно
релаксировать 0,5 мкг суперспиральной плазмидной Д Н К за 1 ч в стандартном реак-
ционном буфере; ** количество хлорофилла (а + в) в 1 мл лизата.
Нами замечено, что в исходном (2 M NaCl) лизате хлоропластов
релаксирующая активность фермента детектировалась слабо из-за вы-
сокой активности нуклеаз. Однако от значительной части нуклеазной
активности удавалось освободиться после хроматографии хлоропласт-
ного лизата на колонке с ДЭАЭ-52-целлюлозой. После второй хрома-
тографии на колонке с КМ-сефадексом Ц-25 релаксирующая актив-
ность топоизомеразы детектировалась довольно хорошо. Концентрация
соли (KCl) в этих фракциях составляла 0,2—0,23 М. Фракции с KM-
сефадекса Ц-25 также анализировали для выявления релаксирующей
активности топоизомераз в присутствии АТФ. При этом не обнаружили
дополнительной АТФ-зависимой релаксирующей активности и не заме-
тили изменений активности уже локализованных фракций АТФ-неза-
висимой ДНК-топоизомеразы. Результаты такого анализа свидетельст-
вуют об отсутствии АТФ-зависимой релаксирующей активности, то
есть об отсутствии активности эукариотической топоизомеразы II типа.
Имеются косвенные данные о наличии в экстрактах из хлоропластов
ДНК-гиразной активности [19]. Однако выделить данный фермент в
чистом виде пока никому не удалось. Мы тоже исследовали фракции с
КС-сефадекса Ц-25, пытаясь выявить гиразную (суперспирализующую)
активность. Д л я этого использовали в качестве субстрата релаксиро-
занную плазмидную Д Н К , но обнаружить данную активность не уда-
лось. Поскольку имеются сообщения об АМФ-зависимой релаксиру-
ющей активности некоторых лигаз [22], то эти же фракции тестирова-
ли и с целью обнаружения такой активности. Результат был отрица-
тельным.
Определение релаксирующей активности хлДНК-топоизомеразы во
фракциях с колонки с гепарин-сефаразой затруднялось тем, что в них
частично попадал гепарин, который как известно, сам является инги-
битором прокариотических топоизомераз. В связи с этим данные фрак-
ции перед реакцией релаксации разбавляли буфером, чтобы умень-
шить ингибирующее действие гепарина. С гидроксилапатита хлоро-
пластная топоизомераза элюировалась в интервале концентраций 260—
300 мМ калий-фосфата, рН 7,5, что аналогично элюции хлоропластной
топоизомеразы из листьев шпината [20]. Окончательная очистка фер-
мента и одновременно его концентрирование достигались при повтор-
ной хроматографии на ГАП. Препарат фермента после этой хромато-
графии и анализа его электрофорезом в 10% ном полиакриламидном
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Xs 4 99
геле (ПААГ) є DS-Na представлен одной полосой, молекулярная мас-
са которой составляла 110 000 (рис. 1: электрофорез препарата очищен-
ной хлДНК-топоизомеразы I типа в 10%-ном ПААГ с DS-Na (фрак-
ция с ΓΑΠ-ΙΙ колонки): 1, 2 — ф р а к ц и и с ΓΑΠ-ΙΙ, содержащие очищен-
ную хлДНК-топоизомеразу I типа; M — маркеры молекулярной массы
(сверху вниз — фосфорилаза Б — 94 000, БСА — 67 000, овальбумин —
43 000, карбоангидраза — 30 000, трипсиновый ингибитор —
Ш 20 100, α-лактальбумин — 14 400)) .
Щ Были изучены некоторые ферментативные свойства хло-
* ропластной топоизомеразы, доказывающие ее прокариотиче-
скую природу. Известно, что основным отличие прокариотиче-
ских топоизомераз I типа от эукариотических, является зави-
симость активности первых от ионов Mg2+. Нами был прове-
ден всесторонний анализ зависимости релаксирующей актив-
ности фермента от различных катионов одно- и двухвалент-
ных металлов. На рис. 2 приведены данные по зависимости
релаксирующей активности хлДНК-топоизомеразы от при-
сутствия MgCl 2 (мМ): 1—1; 2 — 3; 3 — 5; 4 — 10; 5 — 1 5 ;
6 — 20; 7 — 25; 8 — 40; 9 — 10 мМ Э Г Т А + 1 0 мМ MgCl2 ; 10 —
контрольный препарат плазмиды pUC19. Релаксирующая ак-
тивность хлДНК-топоизомеразы при отсутствии в бу-
фере ионов Mg2+ не обнаруживалась. Это является веским ар-
гументом в пользу прокариотической природы фермента. Релаксиру-
ющая активность фермента не выявлялась и при замене ионов Mg2+
на ионы Mn2+ или Ca2+. Однако в работе [23] наблюдали 20%-ную от
оптимума релаксирующую активность в отсутствие ионов Mg2+. Нам
кажется, что в этом случае авторам просто не удалось исключить весь
Mg2+ из реакционной смеси из-за сильного сязывания его молекулами
фермента. Нами было обнаружено, что релаксирующая активность
ДНК-топоизомеразы лучше проявляется при наличии в буфере релакса-
ции ионов KCl, чем ионов NaCl. С другой стороны, ингибирующая кон-
центрация активности ДНК-топоизомеразы для ионов NaCl составляла
100 мМ, а для ионов K C l — 1 2 0 мМ (рис. 3: зависимость релаксиру-
ющей активности хлДНК-топоизомеразы от присутствия KCl (мМ):
/ — 10; 2 — 30; 5 — 50; 4 —70; 5 — 90; 6 — 1 1 0 ; 7 — 120; 8— 150; 9 —
170; 10 — 190; 11 — 210; 12 — контрольный препарат Д Н К плазмиды
pBR322; 13 — контрольная релаксация плазмидной Д Н К топоизомера-
зой; 14 — релаксирующая активность в присутствии 10 мМ ЭДТА и
15 — 20 мМ ЭДТА; рис. 4: зависимость релаксирующей активности
хлДНК-топоизомеразы от одно- и двухвалентных катионов: 1 — 50, 100,
150 мМ NaCl; 2 — 50, 100, 150 мМ CsCl; 3 — 50, 100, 150 мМ RbCl;
4 — 50, 100, 150 мМ LiCl; 5 — 5, 10, 20 мМ CaCl2; 6 — 5, 10, 20 мМ
MnCh; 7 — релаксация плазмидной Д Н К топоизомеразой в отсутствие
ионов M g C h ; 8 — контрольная релаксация плазмидной Д Н К топоизо-
меразой; 9 — контрольная Д Н К плазмиды pUC19). Фермент в интерва-
ле концентраций NaCl от 30 до 80 мМ действовал по процессивному
механизму, с повышением ионной силы буфера — по дистрибутивному
(рис. 5: кинетика релаксации плазмидной Д Н К хлДНК-топоизомеразой
в буфере, содержащем 30 (а) и 80 (б) мМ NaCl: / — 0; 2—1; 3 — 3;
4 — 5 ; 5 — Ю; 6— 15; 7 — 30 мин; 8— 1 ч). Изменение механизма дей-
100 ISSN 0233-7.·»;. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛГ'ТКА. 19:п. Т. 7. А" 4
ствия фермента при изменении концентрации соли в буфере релакса-
ции указывает на то, что при взаимодействии фермент — Д Н К важную
роль играют ионные силы. Релаксирующая активность хлоропластной
тоиоизомеразы наблюдалась при наличии в буфере релаксации ионов
Cs+, Rb+, Li+ (см. рис. 4) . Их оптимальная концентрация составляла
50 мМ. При наличии в буфере релаксации ионов Mg2+ с концентрацией
выше 25 мМ релаксирующая активность хлоропластной тоиоизомеразы
ингибировалась (см. рис. 2) . Оп-
тимум концентрации ионов
M g 2 + — 1 0 — 2 0 мМ. Определен
интервал термоустойчивости фер-
мента (рис. 6: кинетика релакса-
ции плазмидной Д Н К х л Д Н К -
топоизомеразой при температуре
буфера релаксации 40 °С: 1—0;
1; 3 — 2; 4 — 5; 5 — 1 0 ; 6 —
15; 7 — 2 0 ; 5 — 30; 5 — 40 мин).
Релаксирующая активность то- Р и с · 4
поизомеразы наблюдалась в те-
чение 30 мин при 40 °С.
ХлДНК-топоизомераза имела довольно широкий диапазон величи-
ны рН буфера, в котором проявлялась ее активность (рис. 7: зависи-
мость релаксирующей активности хлДНК-топоизомеразы от величины
рН буфера релаксации: 1 — рН 6,2; 2 — 6,8; 5 — 7,4; 4 — 8,0; 5 — 9,0;
Р и с . 5
6 — контрольный препарат плазмиды pUC19). Релаксирующую актив-
ность фермента выявляли в интервале рН буфера от 6,2 до 9,0.
Известно, что активность эукариотических топоизомераз в несколь-
ко раз стимулируется поликатионами (в частности, полиаминами: спер-
мином, спермидином, кадаверином) [24]. Хлоропластная же топоизо-
мераза оказалась нечувствительной к действию полиаминов спермидина
и спермина (0,5—3 мМ), кадаверин (1—3 мМ) оказывал даже некото-
рое ингибирующее действие (рис. 8: зависимость релаксирующей ак-
тивности хлДНК-топоизомеразы от —SH-реагента N-этилмалеимида
(I: 1 — 0 , 5 ; I I — 1; I I I — 2 ; I V — 5 м М ) и п о л и а м и н о в с п е р м и д и н а (2:
/ — 0,5; II — 1; III — 3 мМ); спермина (3: / — 0,5; / / — 1; / / / — 3 мМ);
кадаверина (4: / — 0,5; II— 1; III — 3 мМ); 5 — контрольная релакса-
ция плазмидной Д Н К ; 6 — контрольный препарат Д Н К плазмиды
PUC19).
Действие на активность хлоропластной топоизомеразы —SH-реа-
гента N-этилмалеимида неоднозначно. В работе [23] отмечено ингиби-
рование им (2 мМ) активности фермента. Мы же такого иигибирова-
ния не наблюдали в интервале концентраций N-этилмалеимида от 0,5
до 5 мМ (см. рис. 8). В этой связи можно отметить, что прокариотиче-
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 4 101
екая топоизомераза I типа из Escherichia coli также нечувствительна к
действию N-этилмалеимида.
Хлоропластная топоизомераза оказалась неспособной релаксиро^
вать положительно суперсппрализованную плазмидную Д Н К . Актив-
ность ее ингибировалась бромистым этидием в интервале концентраций
от 1 до 5 мкг/мл (рис. 9: зависимость релаксирующей активности
хлДНК-тогюизомеразы от бромистого этидия (1: I — 1 ; I I — 2,5; I I I —
5 мкг/мл); гепарина (2: I— 1;
II — 2,5; III — 5 мкг/мл); ди-
аминодифенилиндола (3: I —
5; / / — 1 0 мкМ Д А Ф Н ) ;
4 — контрольная релаксация
плазмидной Д Н К ; 5 — конт-
рольный препарат плазмиды
pUC19). В то же время Д А Ф И
(неинтеркалирующий в Д Н К
антибиотик) слабо ингибиро-
вал релаксирующую актив-
ность топоизомеразы (см.
рис. 9). Гепарин, который име-
ет свойство связываться с од-
ноцепочечными участками в
Д Н К , ингибировал активность
хлоропластной топоизомеразы
в концентрации 5 мкг /мл (см.
рис. 9) .
Анализ продуктов реакции
релаксации Д Н К , полученных
при действии хлДНК-топоизо-
меразы и ДНК-топоизомеразы
I из эритроцитов цыпленка на
одном и том же геле, позволяет заключить, что хлоропластная топо-
изомераза изменяет порядок зацепления Д Н К на величину, кратную
единице (результат не приведен).
Таким образом, по изученным свойствам выделенная хлДНК-топо-
изомераза во многом аналогична прокариотическим топоизомеразам
1 типа.
Р е з ю м е
Із одержаних на ступінчатому градієнті ізоосмотичного перколу хлоропластів листя
гроху виділена фракціюванням у двофазній системі сульфат амонію/поліетиленгліколь-
6000 с наступним очищенням хроматографією на колонках хлоропластна (хл) ДНК-
топоізомераза. Залежність релаксуючої активності фермента від іонів M g 2 + , блокуван-
ня її бромистим етидієм, відсутність стимуляції релаксуючої активності поліамінами:
спермідином, сперміном, кадаверином, а також характер розподілу топоізомерів у
гелі дозволяють визнати топоізомеразу як прокаріотичну І типу. Досліджено дію різ-
них кофакторів па релаксуючу активність фермента.
S u m m а г у
Chloroplasts of pea leaves were isolated by step gradient isoosmotic percoll, chloroplast
DNA-topoisomerase was isolated from them by fractionation in two-phase system ammo-
nium sulfate / polyethylenglycol-6000 with the fo l lowing purification by using column
chromatography. The some properties of DNA-topoisomerase w a s searched. The depen-
dence of relax activity of the enzyme from Mg 2 + ions, its blocking by ethydium bromide,
the absence of relax activity stimulation by polyamines: spermidine, spermin, cadaverine
and the character of distribution of the topoisomers in the gels allow us to characterise
the topoisomerase as prokaryotic type I.
102 ISSN 0233-7667. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 4 7 — 1-284 102
ОПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Botchan P., Wang I. С., Echols Η. Effect of circularity and superhelicity on transcrip-
tion from bacteriophage D N A / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA.— 1973,—76, N 12 —
P. 6110—6114.
2. Champoux J, J., Been M. D. Topoisomerases and the swivel problem // Mechanistic
studies of DNA replication and genetic recombination.— New York : Acad, press,
1980,—P. 809—815.
3. Maxwell A., Gellert M. Mechanistic aspects of DNA topo i somerases / /Adv . protein
chem.— 1985,—38,— P. 69—107.
4. Wang / . C. Type 1 DNA topoisomerases // Enzymes.— 1981,— 14, N 1 — P. 331—344.
5. Thrash C., Noelkel K. Identification of Saccharomyces cerevisiae mutants deficient in
DNA topoisomerase I ac t iv i ty / /J . Biol. C h e m — 1984,—259, N 3 , — P . 1375—1377.
6. Uemura T., Yanagida M. Isolation of type I and II DNA topoisomerase mutants from
fussion yeast; s ingle and double mutants show different phenotypes in cell growth
and chromatin o r g a n i z a t i o n / / E M B O J.— 1984,—3, N 2 , — P . 1737—1744.
7. Topoisomerase I identified by scleroderma 70 antisera: enrichment of topoisomerase
I at the centromere in mouse mitotic cells before anaphase / G. G. Maul, B. T. Franch,
W. J. van Venrooij et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. U S A — 1986,—83, N 10.—
P. 5145—5149.
8. Roles of DNA topoisomerases in simian virus 40 DNA replication in vitro / L. Yang,
M. S. Wold, J. J. Li et al. / /Proc . Nat. Acad. Sci. USA.— 1987,—84, N 1 ,—P. 950—954.
9. McCoubrey W. K.. Champoux J. J. The role of single-strand breaks in the catenation
reaction catalysed by the rat type I topoisomerase / /J . Biol. Chem.— 1986.— 261,
N 9,— P. 5130—5137."
10. Need for DNA topoisomerase activity as swivel for DNA replication and transcription
of ribosomal R N A / S . J. Brill, S. di Nardo, K Voekel-Meiman et a l . / / Nature.—
1987 — 326, N 6 0 8 1 — P . 414—416.
11. DNA topoisomerase II is requered at the time oif mitosis in yeast / C. Holm, T. Goto,
J. C. Wang, D. Bot s t e in / /Ce l l .— 1985,—41, N 2 — P . 553—563.
12. Ross W. E. DNA topoisomerases as targets for cancer therapy // Biochem. Pharm.—
1985,— 34, N 15 — P . 4191—4195.
13. Characterization of a camptotecin resistant human DNA topoisomerase I / E K.jeld-
sen, B. J. Bonven, T. Andoh et a l . / / J . Biol. Chem — 1988,—263, N 6 — P. 3912—3916.
14. Effects of DNA intercalating agents on topoisomerase II induced DNA strand cleava-
ge in isolated mammalian cells n u c l e i / Y Pommier, R. E. Schwartz, L. A. Zwell ing
et a l . / /Biochemistry .— 1989,—24, N 20 ,—P. 6406—6410.
15. Intercalative antitumor drugs interfere with the breakage-reunion reaction of mam-
malian DNA topoisomerase I I / К . M. Tewey, G. L. Chen, Ε. M. Nelson et a l . / /
J. Biol. Chem — 1984,—259, N 15,— P. 9182—9187.
16. Thompson R. I., Moslg G. ATP-dependent supercoiling topoisomerase of Chlamydo-
monas reinhardtii affects accumulation of specific chloroplast transcr ipts / /Nucl .
Acids Res.— 1985,— 13, N 3 , — P . 873—891.
17. Purification and characterization of wheat germ DNA topoisomerase I (nicking-
closing enzyme) / W . S. Dynan, J. J. Jendrisak, D. A. Hager et al. / / J . Biol. Chem.—
1981.—256, N 11,—P. 5860—5865.
18. Fukata H., Ohgami K-, Fukasawa H. Isolation and characterization of DNA topoiso-
merase II from cauliflower in f lorescences / /P lant Mol Biol.— 1986.— 6, N 1.—
P. 137—144.
19. Lam E., Chua N.-H. Chloroplast DNA gyrase and in vitro regulation of transcription
by template topology and novobioc in / / Ib id .— 8, N 2.— P. 415—424.
20. Siedlecki /., Zimmermann W., Weissbach A. Characterization of a prokaryotic to-
poisomerase I activitv in chloroplast extracts from sp inach / /Nuc l . Acids Res.— 1983.—
11, N 5 , — P . 1523—1537.
21. In vitro transcription of chloroplast protein genes / Ε. M. Orozco, J E Mullet,
L. Hanley-Bowdin, N.-H. Chua/,/Metb. Enzymol.— 1986,— 118,— P. 232—240.
22. Montecucco A.. Ciarrochi G. AMP-dependent DNA relaxation catalyzed by DNA ligase
occures by a nicking-closing mechan i sm/ /Nuc l . Acids Res.— 1988,— 16, N 15.—·
P. 1369—1381.
23. Nielsen B., Tewari K.. K. Pea chloroplast topoisomerase I: purification, characteriza-
tion, and role in repl icat ion/ /Plant MoL Biol.— 1988,— 11, N 1 ,—P. 3—12.
24. Карпенчук К. Г., Руденко Г. Η. Ядерная ДНК-топоизомераза зародышей кукуру-
зы//Биополимеры и клетка — 1987,— 3, № 2 ,—С. 77—82.
Ин-т клеточ. биологии и генет. инженерии АН УССР, Получено 14.01.91
Киев
ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Xs 4 1 0 3
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155244 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:31:35Z |
| publishDate | 1991 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Ситайло, Л.А. 2019-06-16T14:35:44Z 2019-06-16T14:35:44Z 1991 Хлоропластная ДНК-топоизомераза I типа из листьев гороха / Л.А. Ситайло // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 4. — С. 97-103. — Бібліогр.: 24 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002E9 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155244 577.152.5 Из полученных на ступенчатом градиенте изоосмотического перколла хлоропластов из листьев гороха выделена фракционированием в двухфазной системе сульфат аммония I полиэтиленгликоль-6000 с дальнейшей очисткой хроматографией на колонках хлоропластная ДНК-топоизомераза. Зависимость релаксирующей активности фермента от ионов Mg²⁺, блокирование ее бромистым этидием, отсутствие стимуляции релаксирующей активности полиаминами: спермидином, спермином, кадаверином, а также характер распределения топоизомеров в геле позволяют охарактеризовать топоизомеразу как прокариотическую I типа. Исследовано действие различных кофакторов на релаксирующую активность фермента. Із одержаних на ступінчатому градієнті ізоосмотичного перколу хлоропластів листя гроху виділена фракціюванням у двофазній системі сульфат амонію/поліетиленгліколь6000 с наступним очищенням хроматографією на колонках хлоропластна (хл) ДНК- топоізомераза. Залежність релаксуючої активності фермента від іонів Mg²⁺ , блокування її бромистим етидієм, відсутність стимуляції релаксуючої активності поліамінами: спермідином, сперміном, кадаверином, а також характер розподілу топоізомерів у гелі дозволяють визнати топоізомеразу як прокаріотичну І типу. Досліджено дію різних кофакторів па релаксуючу активність фермента. Chloroplasts of pea leaves were isolated by step gradient isoosmotic percoll, chloroplast DNA-topoisomerase. was isolated from them by fractionation in two-phase system ammonium sulfate/polyethylenglycol-6000 with the following purification by using column chromatography. The some properties of DNA-topoisomerase was searched. The dependence of relax activity of the enzyme from Mg²⁺ ions, its blocking by ethydium bromide, the absence of relax activity stimulation by polyamines: spermidine, spermin, cadaverine and the character of distribution of the topoisomers in the gels allow us to characterise the topoisomerase as prokaryotic type I. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Клеточная биология Хлоропластная ДНК-топоизомераза I типа из листьев гороха Хлоропластна ДНК-топоізомераза І типу з листя гороху Chloroplast DNA topoisomerase I from pea leaves Article published earlier |
| spellingShingle | Хлоропластная ДНК-топоизомераза I типа из листьев гороха Ситайло, Л.А. Клеточная биология |
| title | Хлоропластная ДНК-топоизомераза I типа из листьев гороха |
| title_alt | Хлоропластна ДНК-топоізомераза І типу з листя гороху Chloroplast DNA topoisomerase I from pea leaves |
| title_full | Хлоропластная ДНК-топоизомераза I типа из листьев гороха |
| title_fullStr | Хлоропластная ДНК-топоизомераза I типа из листьев гороха |
| title_full_unstemmed | Хлоропластная ДНК-топоизомераза I типа из листьев гороха |
| title_short | Хлоропластная ДНК-топоизомераза I типа из листьев гороха |
| title_sort | хлоропластная днк-топоизомераза i типа из листьев гороха |
| topic | Клеточная биология |
| topic_facet | Клеточная биология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155244 |
| work_keys_str_mv | AT sitailola hloroplastnaâdnktopoizomerazaitipaizlistʹevgoroha AT sitailola hloroplastnadnktopoízomerazaítipuzlistâgorohu AT sitailola chloroplastdnatopoisomeraseifrompealeaves |