1M- и 2М-¹Н-ЯМР-исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе
Методом ПМР-спектроскопии (500 МГц) изучено равновесие самокомплементарных дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов 5'-d(GpCpGpC), 5'-d(CpGpCpG), 5'-d(ApGpCpT) и 5'-d(ApCpGpT) в водном растворе. Произведено полное отнесение сигналов протонов тетрануклеотидов по измеренным 2M-COSY- и...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1991 |
| Main Authors: | , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1991
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155251 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | 1M- и 2М-¹Н-ЯМР-исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе / А.Н. Веселков, Л.Н. Дымант, Д. Дэвис, Х. Паркес, Д. Шипп // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 5. — С. 15-22. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859649729829273600 |
|---|---|
| author | Веселков, А.Н. Дымант, Л.Н. Дэвис, Д. Паркес, Х. Шипп, Д. |
| author_facet | Веселков, А.Н. Дымант, Л.Н. Дэвис, Д. Паркес, Х. Шипп, Д. |
| citation_txt | 1M- и 2М-¹Н-ЯМР-исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе / А.Н. Веселков, Л.Н. Дымант, Д. Дэвис, Х. Паркес, Д. Шипп // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 5. — С. 15-22. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Методом ПМР-спектроскопии (500 МГц) изучено равновесие самокомплементарных дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов 5'-d(GpCpGpC), 5'-d(CpGpCpG), 5'-d(ApGpCpT) и 5'-d(ApCpGpT) в водном растворе. Произведено полное отнесение сигналов протонов тетрануклеотидов по измеренным 2M-COSY- и 2M-NOESY-спектрам. Исследованы концентрационные и температурные зависимости протонных химических сдвигов, на основании которых по предложенным моделям рассчитаны равновесные константы и термодинамические параметры самоассоциации молекул.
Методом ПМР-спектроскопії (500 МГц) вивчено рівноважне поводження самокомплементарних дезокситетрарибонуклеозидтрифосфагів 5'-d(GpCpGpC), 5'-d(CpGpCpG), 5'-D(ApGpCpT) та 5'-D(ApCpGpT) у водному розчині. Здійснено повне віднесення сигналів протонів тетрануклеотидів по виміряних 2M-COSY- та 2M-NOESY-cneKTpax. Досліджені концентраційні та температурні залежності протонних хімічних зсувів дезокситетрануклеотидів. Розраховані рівноважні константи самоасоціації та значення протонних зсувів в мономірній і дуплексній формах тетрамірів з використанням моделі двох станів. Запропоновано методику розрахунку та визначено термодинамічні параметри реакції самоасоціації молекул. Проведено порівняльний аналіз розрахованих характеристик для самоасоціації тетрануклеотидів різної послідовності.
Equilibrium behaviour of self-complementary deoxytetranucleoside triphosphates 5'-d(GpCpGpC), 5'-d(CpGpCpG), 5'-d(ApGpCpT) and 5'-d(ApCpGpT) in aqueous solution have been studied by the method of PMR spectroscopy (500 MHz). Assignments of the tetranucleotides protons have been obtained from both two-dimensional homo-nuclear COSY and NOESY experiments. Concentration and temperature dependences of proton chemical shifts have been investigated. Equilibrium association constants and thermodynamical parameters of molecules self-association have been calculated using theoretical models and regression equations based on experimental results.
|
| first_indexed | 2025-12-07T13:32:21Z |
| format | Article |
| fulltext |
Структура
и функция
биополимеров
УДК 577.113
А. Н. Веселков, Д. Дэвис, Л. Н. Дымант, X. Паркес, Д. Шинп
1M- и 2М-Н-ЯМР-ИССЛЕДОВАНИЕ САМОАССОЦИАЦИИ
ДЕЗОКСИТЕТРАРИБОНУКЛЕОЗИДТРИФОСФАТОВ
РАЗЛИЧНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ОСНОВАНИЙ
В ВОДНОМ РАСТВОРЕ
Методом ΠМР-спектроскопии (500 МГц) изучено равновесие самокомплементарных
дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов 5' -d(GpCpGpC), 5f-d(CpGpCpG), 5 ' -
d(ApGpCpT) и 5'-d(ApCpGpT) в водном растворе. Произведено полное отнесение сиг-
налов протонов тетрануклеотидов по измеренным 2M-COSY- и 2M-NOESY-спектрам.
Исследованы концентрационные и температурные зависимости протонных химических
сдвигов, на основании которых по предложенным моделям рассчитаны равновесные
константы и термодинамические параметры самоассоциации молекул.
Введение. Известно, что многие биологически активные ароматические
соединения при взаимодействии с Д Н К преимущественно связываются
с определенными последовательностями оснований в цепи. Однако
сложность строения и конформационная изменчивость полимерных мо-
лекул нуклеиновых кислот ограничивают возможности детального ана-
лиза роли тех или иных физических взаимодействий в стабилизации
молекулярных структур в растворе. Вместе с тем экспериментально
установлено, что специфичность связывания ароматических лигандов
проявляется уже на коротких нуклеотидных последовательностях,
включающих в себя соответствующий сайт. Так, іантибиотик актино-
мицин D преимущественно взаимодействует с GC-сайтом, в то время
как бромистый этидий и профлавин — с пиримидин-пуриновой после-
довательностью оснований [1—4]. Следовательно, важные энергетиче-
ские и структурные характеристики комплекса лигандов с нативной
Д Н К могут быть выявлены путем изучения их взаимодействия с малы-
ми фрагментами нуклеиновых кислот — самокомплементарными олиго-
нуклеотидами заданной последовательности оснований. При интерпре-
тации экспериментальных результатов следует учитывать, что в раст-
воре, особенно в случае коротких олигоиуклеотидов, имеет место слож-
ное равновесие взаимодействующих молекул, включіающее в себя и
различные конформационные состояния олигонуклеотидных цепей.
В связи с этим важным представляется непосредственное исследова-
ние поведения в растворе самокомплементарных олигоиуклеотидов с
различными последовательностями оснований в цепи, нахождение
структурных и энергетических характеристик их самоассоциации.
Наиболее эффективным экспериментальным методом исследования
конформации олигоиуклеотидов в растворе является ЯМР-спектроско-
пия. Развитие в последнее время методик двухмерного (2М) Я М Р от-
крыло новые возможности для изучения в растворе молекулярных
структур олигоиуклеотидов как в дуплексной, так и мономерной фор-
© А. Н. ВЕСЕЛКОВ, д . ДЭВИС, Л. Н. ДЫМАНТ, X. ПАРКЕС, Д . ШИПП, 1991
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 15
мах [5—7]. Следует отметить, что количественная интерпретация
структурных характеристик олигомеров по данным 2М-ЯМР связана
с проблемой конформационной чистоты в растворе. Обычно в работах
предполагается, что олигонуклеотид существует в растворе только в
дуплексной форме в виде единственного конформера. Однако это да-
леко не очевидно, особенно для рассматриваемых коротких нуклеотид-
ных последовательностей.
2D NOESY d<ACGT>
В настоящей работе проведено исследование самоассоциации в
водном растворе дезокситетрануклеотидов d (GpCpGpC) , d ( C p G p C p G ) ,
d (ApGpCpT) и d (ApCpGpT) , имеющих различную локализацию GC- и
CG-сайтов в цепи. Изучены концентрационные и температурне зависи-
мости протонных химических сдвигов дезокситетрануклеотидов для оп-
ределения равновесных констант и термодинамических параметров са-
моїассоциации молекул в водном растворе. Данные гомоядерной кор-
реляционной двухмерной ЯМР-спектроскопии (2M-C0SY и 2M-N0ESY)
использованы для полного отнесения сигналов в спектре 1 H-HMP оли-
гонуклеотидов.
Материалы и методы. Дезокситетрарибонуклеозидтрифосфаты
d ( G p C p G p C ) , d ( C p G p C p G ) , d (ApGpCpT) , d(ApCpGpT) синтезирова-
ны компанией «OSWEL DNA SERVICE» (Великобритания) . Образцы
16 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 2* 19
использовали без дополнительной очистки, трижды лиофилизовали из
D2O с изотопной чистотой 99,95 % и растворяли в 0,1 M фосфатном
буфере в D2O (pD 6,6). Спектры Ή - Я М Р измерены на импульсном
спектрометре J E O L GSX-500 с резонансной частотой 500 МГц в маг-
нитном поле сверхпроводящего соленоида 11,7 Тл с применением
фурье-преобразования. Остаточный сигнал H O D насыщался в период
детектирования. Химический сдвиг определяли относительно внутрен-
него стандарта DSS. Д л я контроля использовали т а к ж е сигнал TMA
(бромидтетраметил аммония) , так как он меньше других стандартов
зависит от t и р Н в водных растворах нуклеотидов. Измерения вели
в стандартных ампулах с внешним диаметром 5 мм, минимальный объем
раствора 0,5 мл. Образцы предварительно дегазировали продувкой азо-
том (20—30 мин). Отнесение сигналов в спектрах 1 H-HMP, отожде-
ствление химических и пространственных связей проводили с помощью
двухмерных 2М-С05У-спектроскопии корреляции химических сдвигов
через гомоядерное скалярное спин-спиновое взаимодействие и 2М-
NOESY-спектроскопии корреляции химических сдвигов через гомоядер-
ную кросс-релаксацию соответственно. Спектры 2M-NOESY регистри-
ровали с использованием стандартной последовательности импульсов
при ширине спектра SW7=IOOOO ГЦ, 2048 точек в период детектирова-
ния (4 ) , 512 приращений времени эволюции (Zi) и при фиксированном
времени смешивания T w = 300 мс. Спектры 2M-COSY измеряли, исполь-
зуя 2048 точек в t2 и 256 приращений в Zi. Период восстановления со-
ставлял 1 с для 2M-COSY и 3 с для 2M-NOESY-cneKTpoci\onHH. Д л я
увеличения чувствительности импульсную последовательность при каж-
дом значении повторяли 16 и 32 раза для 2M-COSY и 2M-NOESY экс-
периментов соответственно. Температуру образцов поддерживали с по-
мощью J E O L NM-GVTS-терморегулятора.
Результаты и обсуждение. Отнесение сигналов в спектре ПМР тет-
рануклеотидов проведено на основании двухмерных гомоядерных
COSY- и NOESY-экспериментов. На рис. 1 представлен полученный на-
ми 2M-NOESY-cneKT,p для ApCpGpT последовательности (0,1 M фосфат-
ный буфер в D2O при T = 293 К) . Спектры 2M-COSY использовали для
выявления протонов, связанных /-взаимодействием и принадлежащих
отдельному дезоксирибозному кольцу, а т акже для идентификации не-
обменивающихся протонов по 7(Н5, Н6)- и / ( C H 3 , Н6) -корреляциям
в основаниях цитозинов и тиминов. Известно, что 2M-COSY не позво-
ляет определить, какие сигналы протонов сахарного кольца и нуклео-
тидного основания относятся к отдельному нуклеозиду и в каком по-
рядке углеводные остатки связаны в олигомерную цепь. Т а к а я инфор-
мация получена из анализа 2M-NOESY-cneKTpoB путем рассмотрения
кросс-пиков между ароматическими протонами оснований и сигналами
H Г , Н 2 ' и Н2" дезоксирибозы. Связи между различными протонами
показаны на рис. 1 и 2 пунктирными линиями. Отнесение протонов
Н 2 ' и Н2" сделано из NOESY-спектров на основании того факта , что
интенсивность H Г — Н 2 " кросс-пиков выше, чем интенсивность соот-
ветствующих H Г — Н2 / пиков [8]. В табл. 1 представлены получен-
ные в результате отнесения сигналов значеьия химических сдвигов для
всех необменивающихся протонов анализируемых тетр;ануклеотидоз.
В работе [4] имеются данные по химическим сдвигам !арома-
тических протонов последовательности d (ApGpCpT) , в [9] сде-
лано отнесение сигналов необменивающихся протонов в октамере
5 ' - d ( A p C p G p C p G p C p G p T ) , в котором первые три нуклеотида соответ-
ствуют рассматриваемому тетрамеру 5'-d (ApCpGpT) , а концевой ти-
мидин примыкает, так же как и в тетрамере, к гуанозину. Сравнение
значений протонных химических сдвигов, приведенных в табл. 1, с дан-
ными работ [4] и [9] показывает их хорошее соответствие. Величины
химических сдвигов протонов тетрамера 5 ' -d (GpCpGpC) согласуются
с опубликованными ранее результатами для соответствующих прото-
нов гексамера d (GpCpApTpGpC) [10], Ε котором внешние гуанозин и
цитозин находятся в аналогичных условиях с рассматриваемым тет-
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 2 — 1-438
17
рануклеотидом, а внутренний цитозин фланкирован двумя пуринови-
ми основаниями (GCA) и соответствующий гуанин — двумя пиримиди-
новыми основаниями (TGC), как в d (GpCpGpC) . Что касается отне-
сения сигналов протонов для тетрануклеотида d ( C p G p C p G ) , то она
практически совпадает с результатами, приведенными в работе [ И ]
для аналогичного олигонуклеотида.
На рис. З в качестве примера представлены концентрационные за-
висимости химических сдвигов ароматических протонов и протонов H l '
дезоксирибози тетрануклеотида 5'-d (GpCpGpC) при температуре T=
= 278 К. Д л я большинства протонов исследованных тетрануклеотидов
наблюдается смещение химического сдвига в область сильного поля
при увеличении концентрации тетрануклеотидов. Более выраженная за-
висимость меет место для протонов внутренних нуклеозидов.
Полученные в [8] методохм спектрофотометрии экспериментальные
результаты свидетельствуют о кооперативном плавлении олигомеров
подобного типа. Отметим, что H M P дает, в отличие от других спектро-
скопических методов, информацию о каждом основании в олигонуклео-
тидной цепи. Однако для получения ЯМР-сигнала достаточной интен-
сивности требуются относительно высокие концентрации образца, при
Т а б л и ц а 1
Отнесение flMP-сигналсб прстст в сссснсип.спрорисснуклсозисфосфатов 5'-d
ApCpGpT), 5'-d (ApGpCpT) (Τ=293 К, С=2,4-10~3 моль нитей/л) и 5'-d (GpCpGpC)
(Τ=298 К, С=5,4· 10~~ъмоль нитей/л)
Химический сдвиг, м. д.»
Нуклео- I I
З и д j Н8 j Н6/Н2 H Hl Н2 H 2 нз Н4 Н5 Н 5 CH3
5 ' -А 8 , 2 0 8 , 0 9
С — 7 , 4 8
G 7 , 9 4 —
T • — 7 , 5 0
5 ' -А 8 , 0 5 8 , 0 4
G 7 , 9 4 —
С — 7 , 5 9
T — 7 , 6 0
5 ' -G 7 , 9 4 —
С — 7 , 4 3
G 7 , 9 1 —
С — 7 , 3 9
— 6 , 2 8 2 , 6 8
5 , 6 8 5 , 9 2 1 , 9 5
— 6 , 0 7 2 , 7 0
— 6 , 2 3 2 , 2 8
— 6 , 2 5 2 , 3 2
— 6 , 0 9 2 , 4 2
5 , 6 2 5 , 9 0 2 , 6 6
— 6 , 1 8 2 , 2 6
— 5 , 9 9 2 , 6 4
5 , 4 4 5 , 8 2 2 , 0 6
— 5 , 9 7 2 , 6 2
5 , 3 0 6 , 1 7 1 ,89
2 , 7 2 4 , 8 7 4 , 2 9
2 , 3 7 4 , 8 7 4 , 2 0
2 , 7 4 4 , 9 6 4 , 3 7
2 , 3 1 4 , 5 7 4 , 0 5
2 , 5 3 4 , 5 6 4 , 1 1
2 , 6 4 4 , 8 6 4 , 2 4
2 , 7 0 5 , 0 1 4 , 4 0
2 , 5 2 4 , 7 7 4 , 3 0
2 , 7 7 4 , 8 6 4 , 2 7
2 , 4 2 4 , 8 8 4 , 2 4
2 , 7 2 5 , 0 0 4 , 3 8
2 , 2 4 4 , 5 1 4 , 0 7
3 , 7 8 3 , 7 8 —
4 , 1 2 4 , 1 2 —
4 , 1 2 4 , 1 2 —
4 , 0 8 4 , 0 8 1 , 9 5
3 , 7 2 3 , 7 2 —
3 , 7 2 3 , 7 2 —
4 , 1 4 4 , 1 4 —
4 , 0 7 4 , 0 7 1 , 7 8
3 , 7 3 3 , 7 3 —
4 , 1 6 4 , 1 6 —
4 , 1 3 4 , 1 3 —
4 , 2 7 4 , 2 3 —
^Химические сдвиги приведены относительно стандарта DSS.
I S S N 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 2* 19
где δm — протонные химические сдвиги в дуплексе и мономерной
форме соответственно. Величины Sd, δ™, Дл, неизвестные a priori, мо-
гут быть найдены как параметры модели [2] по экспериментальным
концентрационным зависимостям наблюдаемых химических сдвигов
протонов из условия минимизации взвешенной суммы квадратов невя-
зок δ ЗІ и б/, где ЬЗІ — экспериментальные, 6г· — рассчитанные по [2]
значения химических сдвигов при і-й концентрации соответствующего
тетрануклеотида [13, 14]. Подобные расчеты выполнены для всех не-
обменивающихся протонов оснований и протонов H l ' дезоксирибозных
колец тетрануклеотидов.
Согласно модели реакции (1), параметр Да является равновесной
константой образования дуплекса и должен быть одинаковым для всех
протонов каждого тетрануклеотида. Усредненные значения этого па-
раметра для исследованных тетрануклеотидов приведены в табл. 2. По-
лученные значения констант реакции для 5 '-d (GpCpGpC) и
5 ' -d (CpGpCpG) примерно на два порядка превышают величины KA
самоассоциации динуклеотидов S r-GC и S7-CG [15]. Д л я тетрануклео-
тидов, имеющих менее стабильные концевые пары (А — Т), константа
самоассоциации значительно ниже, чем Д л для тетрамеров, имеющих
в последовательности только G — С-пары. Оценки показывают, что при
таких значениях KA И концентрациях тетрануклеотидов ~ 1 0 ~ 3 моль /л
доля молекул в растворе в дуплексной форме составляет ~ 5 0 % для
первых двух тетрамеров и ~ 2 0 % для А — Т-содержащих тетрануклео-
тидов (см. табл. 2) .
Д л я определения термодинамических параметров реакций само-
ассоциации тетрануклеотидов проведены исследования зависимостей
протонных химических сдвигов от температуры. На рис. 4 приведены
температурные зависимости химических сдвигов 5 ' -d (CpGpCpG) при
C= 1,93· 10-3 моль нитей/л для различных протонов (1 — Н6 (СЗ) ;
2 — Н6 ( C l ) ; 3 — H l ' ( С 3 ) ; 4 — Н Г ( C l ) ; 5 — H l ' (G2); 6 — Н5 (СЗ) ) .
В расчетной схеме зависимость наблюдаемого химического сдвига δ
Т а б л и ц а 2
Значения равновесных констант Ka и термодинамических параметров AG, Δ H и AS
реакции само ассоциации тетрануклеотидов при температуре T=293 К
Нуклеозид К А , Л / М О Л Ь дупле-
кса
AGF ккал/моль
дуплекса
АН, ккал/моль
дуплекса
AS, ккал/
(К-моль дупле-
кса)
d (GpCpGpC) 1 1 5 0 + 1 2 0 — 4 , 1 0 - 3 0 , 0 — 8 8
d (CpGpCpG) 1 3 0 0 + 1 6 0 - 4 , 1 7 — 4 1 , 4 — 127
d (ApGpCpT) 1 6 0 + 30 — 2 , 9 5 — 3 1 , 7 — 9 8
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 2* 19
которых повышается вероятность агрегации молекул в растворе. По-
скольку агрегация усложняет интерпретацию ЯМР-спектра, целесооб-
разно проводить эксперимент при условиях, когда она оказывает пре-
небрежимо малое влияние на значения химических сдвигов протонов.
Известно, что вероятность агрегации зависит от ионной силы, темпера-
туры раствора, концентрации и молекулярной массы олигомера. Иссле-
дования, проведенные в [12], дают основание считать, что при исполь-
зованных в настоящей работе концентрациях тетрануклеотидов и ион-
ной силе 0,1 M N a + агрегация несущественна. Таким образом, взаимо-
действие молекул тетрануклеотидов можно рассматривать в соответ-
ствии с моделью двух состояний:
В таком случае зависимость наблюдаемого химического сдвига
протонов тетрануклеотидов от концентрации С представляется в форме:
( і )
(2)
от температуры T была представлена в виде
( 3 )
где f m ( T j ) и U ( T j ) — р а в н о в е с н ы е мольные доли тетрануклеотида при
температуре Tj в мономерной и дуплексной формах ( f m + / d = l ) .
В соотношении (3) предполагается , что б т является функцией тем-
пературы. Действительно, расчеты по концентрационным зависимостям
химических сдвигов протонов тетрануклеотида SR-CL(GpCpGpC), изме-
ренным при температурах 278 и 298 К, показали заметное изменение
величин Ь т при вариации температуры. Это подтверждается т а к ж е
Рис. 4 Рис. 5
сравнением расчетных значений б т с экспериментальными значения-
ми протонного химического сдвига при высокой температуре ( Г = 3 5 3 ч -
-^358 К ) , когда можно считать, что все молекулы в растворе находят-
ся в мономерной форме. Т а к а я зависимость б т от температуры сви-
детельствует о конформационных изменениях молекул тетрануклеоти-
дов в мономерной форме, связанных, в частности, с изменением внутри-
молекулярного стэкинга. Следует отметить, что температурная зави-
симость бт н а б л ю д а л а с ь и для динуклеотидных последовательностей
S y -GC и 5 ' -CG [16]. Что касается химического сдвига δd, то эта ве-
личина, как показали расчеты, практически неизменна в исследован-
ном диапазоне температур.
Д л я описания температурной зависимости fm(T) использовано
регрессионное уравнение второго порядка относительно темпе-
ратуры [16]
20 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5
B котором fm и f)n — известные значения мольных долей мономера в
растворе при заданных температурах T0 и T1. Мольную долю f)n опре-
деляли по расчетному значению KA, найденному из концентрационных
зависимостей при Tι = 293 К, f°m полагалась равной 1 при Г 0 = 3 5 3 К,
когда можно считать, что произошло полное расхождение нитей тет-
рануклеотидов. П а р а м е т р а находили из условия минимизации функ-
ции невязки экспериментальных и рассчитанных значений химическо-
го сдвига при различных температурах . При проведении расчетов ис-
пользована линейная аппроксимация δ т ( Т ) по известным значениям
ёщ при двух температурах , как это обычно делается в подобных слу-
чаях [8, 16, 17]. Численную процедуру минимизации функции невязки
выполняли с помощью симплексного метода Не лде р а — Мида [18] .
Равновесные константы KA при различных температурах определяли
по значениям мольных долей f m ( T j ) :
(4)
(5)
Определенные таким образом значения термодинамических пара-
метров Δ Я , AG1 AS см. в табл . 2. Сравнение результатов подтверждает
роль состава и последовательности оснований в олигонуклеотидной це-
пи в стабилизации спиральных структур. Наиболее стабильным дуплек-
сом среди исследованных тетрануклеотидных последовательностей яв-
ляется SR-CL(CpGpCpG)2. Если использовать калориметрические данные
по термической стабильности пар — известные значения AHat И AHQC
с учетом зависимости АН от ионной силы раствора [19, 20], то д л я
тетрануклеотидов d (GpCpGpC) и d ( A p G p C p T ) изменения энтальпии
при реакции самоассоциации и участии всех пар в образовании ду-
плекса («идеальный» дуплекс) д о л ж н ы быть по абсолютной величине
несколько выше найденных в настоящей работе значений АН. Одна из
причин такого расхождения между экспериментально найденными зна-
чениями АН и соответствующими расчетными значениями для «идеаль-
ного» дуплекса может быть связана с плавлением концевых пар в столь
коротком дуплексе, а т а к ж е со «скольжением» комплементарных ни-
тей относительно друг друга, так что в растворе в равновесном состоя-
нии находятся различные спиральные структуры (рис. 6: вероятные
спиральные структуры в растворе д л я тетрануклеотидов 5 ' -d (ApGpCpT)
и S ' - d ( G p C p G p C ) : «—» — сахарофосфагные цепи, « · » — водородные
связи между парами оснований) . Д л я тетрануклеотида S ^ d ( C p G p C p G )
ввиду его большей стабильности образование подобных структур ме-
нее вероятно, о чем свидетельствуют и высокие абсолютные значения
АН и AS.
Полученные нами ранее [15] значения АН для самоассоциации
Sx-GC и S7-CG динуклеотидов составили ~ — 1 4 к к а л / м о л ь . При само-
ассоциации тетрануклеотидов величины АН изменяются более чем в
два ріаза по сравнению с динуклеотидами, что свидетельствует о появ-
лении дополнительных факторов, в частности, стэкинг-взаимодейсТвия
и конформационных изменений.
Р е з ю м е
М е т о д о м П М Р - с п е к т р о с к о п і ї (500 М Г ц ) вивчено р і в н о в а ж н е п о в о д ж е н н я самокомп-
лементарних д е з о к с и т е т р а р и б о н у к л е о з и д т р и ф о с ф а г і в 5 ' - d ( G p C p G p C ) , 5 ' - d ( C p G p C p G ) ,
5 ' -D (ApGpCpT) та 5 ' - D ( A p C p G p T ) у в о д н о м у розчині. Зд ійснено повне в іднесення
сигналів протонів т е т р а н у к л е о т и д і в по виміряних 2M-COSY- та 2M-NOESY-cneKTpax.
Д о с л і д ж е н і концентраційні та температурн і з а л е ж н о с т і протонних хімічних зсувів де-
зокситетрануклеотид ів . Р о з р а х о в а н і р і в н о в а ж н і константи самоасоц іац і ї та з н а ч е н н я
протонних зсувів в мономірній і дуплексній ф о р м а х тетрамір ів з в и к о р и с т а н н я м моде-
лі д в о х станів . З а п р о п о н о в а н о методику р о з р а х у н к у та визначено термодинамічн і па-
р а м е т р и реакці ї самоасоц іац і ї молекул . П р о в е д е н о пор івняльний анал і з р о з р а х о в а -
них х а р а к т е р и с т и к д л я самоасоц іац і ї т е т р а н у к л е о т и д і в різної послідовност і .
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 21
Н а рис. 5 приведены зависимости В а ь т — Гофф.а I n / ( Л = г |)(1/Г), ис-
пользованные д л я оценки энтальпии АН и энтропии AS реакций обра-
зования дуплексов тетрануклеотидов (1 — 5 ' -d ( G p C p G p C ) ; 2 —
5'-d ( C p G p C p G ) ; 3 — 5 ' -d ( A p G p C p T ) ) . Д а н н ы е достаточно хорошо ап-
проксимируются прямыми линиями, что свидетельствует о пренебрежи-
мо малом изменении теплоемкости в рассмотренном температурном ин-
тервале . Энтальпии реакций рассчитывали по величине тангенсов уг-
лов наклонов аппроксимирующих прямых в соответствии с соотноше-
нием Вант — Гоффа
Изменение энтропии AS находили из свободной энергии Гиббса
ΔG = — R T l l n K A И найденного значения АН:
(6)
(7)
S u m τη а г у
Equil ibr ium behaviour of self-complementary deoxytetranucleoside t r iphosphates 5 ' -
d (GpCpGpC) , 5 ' - d ( C p G p C p G ) , 5 ' -d (ApGpCpT) and 5 ' - d (ApCpGpT) in aqueous solu-
tion have been studied by the method of PMR spectroscopy (500 M H z ) . Ass ignments
of the te tranucleot ides protons have been obtained f rom both two-dimensional homo-
nuclear COSY and NOESY experiments. Concentrat ion and temperature dependences of
proton chemical shif ts have been invest igated. Equilibrium association cons tants and
thermodynamical parameters of molecules self-association have been calculated us ing
theoretical models and regression equations based on experimental results.
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Krugh Т. R., Reinhardt С. G. Evidence for sequence preferences in the intercalat ive
b inding of ethidium bromide to dinucleoside m o n o p h o s p h a t e s / / J . Мої. Biol.— 1075.—
97, N 1 ,—P. 133—162.
2. Patel D. /., Canuel L. L. Sequence specificity of mutagen-nucleic acid complexes in
s o l u t i o n / / P r o c . Nat. Acad. Sci. USA. — 1977,—74.—P. 2624—2628.
3. ] H and 3 1P NMR invest igat ions of actinomycin D binding selectivity with oligodeo-
xyribonucleotides conta in ing multiple adjacent d (GC) sites / Ε. V. Scott, R. L. Jo-
nes, D. L. Banvil le et a l . / /B iochemis t ry .— 1988,—27, N 3 . — P . 915—923.
4. Reid D. G., Salisburg S. A., Williams D. H. Proton nuclear Overhausei- effect s tudy
of the s t ructure of an actinomycin D complex with a self-complementary te t ranuc-
leoside t r i phospha t e / / I b id .— 1983,—22, N 6.— P. 1377—1385.
5. Clore G. M., Grotienborn A. M. Internal mobility in a double-stranded B DNA he-
xamer and u n d e c a m e r / / F E B S Lett.— 1984.— 172, N 2 . — P . 219—225.
6. Sequence-dependent s t ructura l variat ion in single-helical DNA proton NMR studi-
es of d-(T-A-T-A) and d-(A-T-A-T) in aqueous s o l u t i o n / M . R. Mellema, J. M. L. Pi-
eters, G. A. van der Marei et a l . / / E u r . J. Biochem.— 1984.— 143—P. 285—301.
7. Conformational studies of d - (m 5 CpGpm 5 CpG) and d- (CpGpCpG) 1H and 3 1 P N M R /
M. Delepierre, B. L. Destaintot , J. Igolen, B. P. Roques / / I b id .—1986 ,— 161.—P.
571—577.
8. Petersheim MTurner D. H. Base-s tacking and base-pair ing contributions to helix
stabil i ty: thermodynamics of double-helix format ion with CCGG, CCGGAp, ACCGGp,
CCGGUp, and ACCGGUp/ /B iochemis t ry .—1983 ,—22 , N 2 . — P . 256—263.
9. Gronenborn A. MClore G. MKimber B. J. An invest igat ion into the solution
s t ructures of two self-complementary DNA oligomers, 5 ' -d(C-G-T-A-C-G) and 5 ' -
d(A-C-G-C-G-C-G-T), by means of nuclear-Overhauser-enhancement measu remen t s / /
Biochem. J.— 1984,—221.—P. 723—736.
10. Refinement of the solution s t ructure of the DNA hexamer 5 ' - d ( G C A T G C ) 2 : combi-
ned use of nuclear magnet ic resonance and restrained molecular d y n a m i c s / M . Mil-
ges, G. M. Clore, A. M. Gronenborn et a l . / /Biochemis t ry .— 1987.—2.6, N 12.—
P. 3718—3733.
11. Reassesment of s t ructura l characterist ics of the d ( C G C G ) 2 : Actinomycin D comp-
lex f rom complete 1H and 3 1P NMR / M Delepierre, С. V. Heijenoort , J. Igolen et
al. / /B iomol . Struct , and D y n . - 1989,—7, N 3 . — P . 557—589.
12. Preier S. M., Albergo D. D., Turner D. H. Solvent effects on the dynamics of (dG-
dC) з // J. Biopolymers.— 1983.—22, N 5 . — P . 1107—1131.
13. Веселков A. H., Дымант JJ. H., Куликов Э. JJ. Применение вариационных методов
обработки экспериментальных данных при исследовании агрегации молекул акри-
диновых красителей методом Я М Р высокого р а з р е ш е н и я / / Х и м . физика.— 1984.—
№ 8.—С. 1101—1108.
14. investigation of the aggrega t ion of acridine dyes in aqueous solution by proton
NMR / A. N. Veselkov, L. N. Djimant , L. S. Karawajew, E. L. K u l i k o v / / S t u d , bio-
phys.— 1985.— 106, N 3 . — P . 171 — 180.
15. Дымант JJ. H., Веселков Α. Η. Межмолекулярные взаимодействия в комплексах
ароматических лигандов с динуклеотидами в растворе и кристалле / /Биофизика .—
1988.— 33, № 4,—С. 728.
16. Веселков A. H., Дымант JJ. H., Барановский С. Ф. Определение термодинамиче-
ских параметров взаимодействия профлавина с рибодинуклеозидмонофосфатами
CpG и GpC в водном растворе по данным протонного магнитного р е з о н а н с а / / M o -
лекуляр. биология,— 1987,—21, № 4.—С. 1110—1116.
17. Thermodynamics of (dG-dC) 3 double-helix format ion in water and deuterium ox ide /
D. D. Albergo, L. A. Markv, K. J. Breslauer, D. H. Turne r / /B iochemis t ry .—1981 .—
20, N ().— P. 1409—1413.
18. Минимизация в инженерных расчетах на ЭВМ / С. Ю. Гуснин, Г. А. Омельянов,
Г. В. Резников, В. С. С и р о т к и н / / Б - к а программ.— M., 1981.— 120 с.
19. Marky L. A., Breslauer /(. I. Calorimetric determination of base-s tacking enthalpies
in double-helical DNA molecules // Biopolymers.— 1982,— 21, N 10,— P. 2185—2194.
20. Wada A., Yabuki S., J-Jusimi Y. Fine s t ructure m the thermal denaturat ion of DNA:
high temperature-resolut ion spectrophotometrie studies // CRC Crit. Revs. Biochem.—
1980,—9, N 2 , — P . 87—144.
Севастоп. приборостроит. ин-т, Получено 08.02.91
Лондон, ун-т, Беркбек колледж
22 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 2* 19
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155251 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T13:32:21Z |
| publishDate | 1991 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Веселков, А.Н. Дымант, Л.Н. Дэвис, Д. Паркес, Х. Шипп, Д. 2019-06-16T14:42:46Z 2019-06-16T14:42:46Z 1991 1M- и 2М-¹Н-ЯМР-исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе / А.Н. Веселков, Л.Н. Дымант, Д. Дэвис, Х. Паркес, Д. Шипп // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 5. — С. 15-22. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002EC https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155251 577.113 Методом ПМР-спектроскопии (500 МГц) изучено равновесие самокомплементарных дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов 5'-d(GpCpGpC), 5'-d(CpGpCpG), 5'-d(ApGpCpT) и 5'-d(ApCpGpT) в водном растворе. Произведено полное отнесение сигналов протонов тетрануклеотидов по измеренным 2M-COSY- и 2M-NOESY-спектрам. Исследованы концентрационные и температурные зависимости протонных химических сдвигов, на основании которых по предложенным моделям рассчитаны равновесные константы и термодинамические параметры самоассоциации молекул. Методом ПМР-спектроскопії (500 МГц) вивчено рівноважне поводження самокомплементарних дезокситетрарибонуклеозидтрифосфагів 5'-d(GpCpGpC), 5'-d(CpGpCpG), 5'-D(ApGpCpT) та 5'-D(ApCpGpT) у водному розчині. Здійснено повне віднесення сигналів протонів тетрануклеотидів по виміряних 2M-COSY- та 2M-NOESY-cneKTpax. Досліджені концентраційні та температурні залежності протонних хімічних зсувів дезокситетрануклеотидів. Розраховані рівноважні константи самоасоціації та значення протонних зсувів в мономірній і дуплексній формах тетрамірів з використанням моделі двох станів. Запропоновано методику розрахунку та визначено термодинамічні параметри реакції самоасоціації молекул. Проведено порівняльний аналіз розрахованих характеристик для самоасоціації тетрануклеотидів різної послідовності. Equilibrium behaviour of self-complementary deoxytetranucleoside triphosphates 5'-d(GpCpGpC), 5'-d(CpGpCpG), 5'-d(ApGpCpT) and 5'-d(ApCpGpT) in aqueous solution have been studied by the method of PMR spectroscopy (500 MHz). Assignments of the tetranucleotides protons have been obtained from both two-dimensional homo-nuclear COSY and NOESY experiments. Concentration and temperature dependences of proton chemical shifts have been investigated. Equilibrium association constants and thermodynamical parameters of molecules self-association have been calculated using theoretical models and regression equations based on experimental results. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров 1M- и 2М-¹Н-ЯМР-исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе 1М- і 2М-¹Н-ЯМР-дослідження самоасоціації дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатів різної послідовності основ у водному розчині 1D- and 2D-¹H NMR investigation of self-association of deoxytetraribonucleoside triphosphates of different base sequence in aqueous solution Article published earlier |
| spellingShingle | 1M- и 2М-¹Н-ЯМР-исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе Веселков, А.Н. Дымант, Л.Н. Дэвис, Д. Паркес, Х. Шипп, Д. Структура и функции биополимеров |
| title | 1M- и 2М-¹Н-ЯМР-исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе |
| title_alt | 1М- і 2М-¹Н-ЯМР-дослідження самоасоціації дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатів різної послідовності основ у водному розчині 1D- and 2D-¹H NMR investigation of self-association of deoxytetraribonucleoside triphosphates of different base sequence in aqueous solution |
| title_full | 1M- и 2М-¹Н-ЯМР-исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе |
| title_fullStr | 1M- и 2М-¹Н-ЯМР-исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе |
| title_full_unstemmed | 1M- и 2М-¹Н-ЯМР-исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе |
| title_short | 1M- и 2М-¹Н-ЯМР-исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе |
| title_sort | 1m- и 2м-¹н-ямр-исследование самоассоциации дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе |
| topic | Структура и функции биополимеров |
| topic_facet | Структура и функции биополимеров |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155251 |
| work_keys_str_mv | AT veselkovan 1mi2m1nâmrissledovaniesamoassociaciidezoksitetraribonukleozidtrifosfatovrazličnoiposledovatelʹnostiosnovaniivvodnomrastvore AT dymantln 1mi2m1nâmrissledovaniesamoassociaciidezoksitetraribonukleozidtrifosfatovrazličnoiposledovatelʹnostiosnovaniivvodnomrastvore AT dévisd 1mi2m1nâmrissledovaniesamoassociaciidezoksitetraribonukleozidtrifosfatovrazličnoiposledovatelʹnostiosnovaniivvodnomrastvore AT parkesh 1mi2m1nâmrissledovaniesamoassociaciidezoksitetraribonukleozidtrifosfatovrazličnoiposledovatelʹnostiosnovaniivvodnomrastvore AT šippd 1mi2m1nâmrissledovaniesamoassociaciidezoksitetraribonukleozidtrifosfatovrazličnoiposledovatelʹnostiosnovaniivvodnomrastvore AT veselkovan 1mí2m1nâmrdoslídžennâsamoasocíacíídezoksitetraribonukleozidtrifosfatívríznoíposlídovnostíosnovuvodnomurozčiní AT dymantln 1mí2m1nâmrdoslídžennâsamoasocíacíídezoksitetraribonukleozidtrifosfatívríznoíposlídovnostíosnovuvodnomurozčiní AT dévisd 1mí2m1nâmrdoslídžennâsamoasocíacíídezoksitetraribonukleozidtrifosfatívríznoíposlídovnostíosnovuvodnomurozčiní AT parkesh 1mí2m1nâmrdoslídžennâsamoasocíacíídezoksitetraribonukleozidtrifosfatívríznoíposlídovnostíosnovuvodnomurozčiní AT šippd 1mí2m1nâmrdoslídžennâsamoasocíacíídezoksitetraribonukleozidtrifosfatívríznoíposlídovnostíosnovuvodnomurozčiní AT veselkovan 1dand2d1hnmrinvestigationofselfassociationofdeoxytetraribonucleosidetriphosphatesofdifferentbasesequenceinaqueoussolution AT dymantln 1dand2d1hnmrinvestigationofselfassociationofdeoxytetraribonucleosidetriphosphatesofdifferentbasesequenceinaqueoussolution AT dévisd 1dand2d1hnmrinvestigationofselfassociationofdeoxytetraribonucleosidetriphosphatesofdifferentbasesequenceinaqueoussolution AT parkesh 1dand2d1hnmrinvestigationofselfassociationofdeoxytetraribonucleosidetriphosphatesofdifferentbasesequenceinaqueoussolution AT šippd 1dand2d1hnmrinvestigationofselfassociationofdeoxytetraribonucleosidetriphosphatesofdifferentbasesequenceinaqueoussolution |