Асимметрия субъединиц аспартатаминотрансферазы в растворе
С помощью циркулярно-дихроичного титрования фермента (КФ 2.6.1.1) в области рН 4,3–9,5 и обработки данных с использованием компьютерной техники показано, что кажущееся рК ферментсвязанного пиридоксаль-5'- фосфата субъединиц различаются и составляют рК₁'=5,55±0,20; рK₂' = 6,87±0,14. За...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1987 |
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1987
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155288 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Асимметрия субъединиц аспартатаминотрансферазы в растворе / В.М. Кочкина, Д.А. Кузнецов // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 6. — С. 330-332.— Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859947798758162432 |
|---|---|
| author | Кочкина, В.М. Кузнецов, Д.А. |
| author_facet | Кочкина, В.М. Кузнецов, Д.А. |
| citation_txt | Асимметрия субъединиц аспартатаминотрансферазы в растворе / В.М. Кочкина, Д.А. Кузнецов // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 6. — С. 330-332.— Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | С помощью циркулярно-дихроичного титрования фермента (КФ 2.6.1.1) в области рН 4,3–9,5 и обработки данных с использованием компьютерной техники показано, что кажущееся рК ферментсвязанного пиридоксаль-5'- фосфата субъединиц различаются и составляют рК₁'=5,55±0,20; рK₂' = 6,87±0,14.
За допомогою циркулярно-дихроїчного титрування ферменту (КФ 2.6.1.1) в області рН 4,3–9,5 і обробки даних з використанням комп’ютерної техніки показано, що позірна рК ферментзв’язаного піридоксаль-5'-фосфату субодиниць різняться і становлять рК₁' = 5, 55 ± 0,20; рK₂' = 6,87 ± 0,14.
The apparent pK of enzyme-bound pyridoxal-5'-phosphate of subunits determined by circular dichroismic pH titralion of the pyridoxal form of aspartate aminotransferase (EC 2.6.1.1) amounts to pK₁' = 5.55 ± 0.2, pK₂' = 6.87 ± 0.14.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:15:17Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 577.152.261
АСИММЕТРИЯ СУБЪЕДИНИЦ
АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В РАСТВОРЕ
В. М. Кочкина, Д. А. Кузнецов
Введение. Аспартатаминотрансфераза (AAΤ, KФ 2.6.1.1) представляет собой ди.мер
одинаковых по аминокислотной последовательности субъединиц с молекулярной мас-
сой около 47000. Индивидуальная субъсдиница обладает активным центром, функцио-
нирующим независимо от активного центра соседней субъединицы [1—3]. IIo поводу
каталитической активности центров мнения разделились — одни считают, что они экви-
валентны [1, 2], другими показана неэквивалентность функционирования активных
центров [3, 4]. Для выяснения природы присущей ЛАТ из цитозоля сердца кур неэкви-
валентности субъединпц фермента в данной работе использовали свойство, которым
обладает фермент — цветного рН-пндикатора. Протонированной и непротонировапион
формам альдимпна, образуемого коферментом с остатком лизина в белке, соответ-
ствуют полосы поглощения с максимумом при 430 нм (в кислой среде) и 360 нм
(в щелочной). Если для двух субъединиц димерпой молекулы белка в растворе су-
ществуют два различных значения ρ Kf перехода нротонированная^непротонированная
форма ферментсвязанного пиридоксальфосфата (ПЛФ), то это будет означать, что
субъединицы неэквивалентны, несимметричны. В противном случае должно быть толь-
ко одно значение ρ К ' перехода, возможно, равное ~6,1—6,3, как установлено для
AAT из сердца свиньи ранее [5, 6].
Материалы и методы. Фермент с удельной активностью 70000 ед/мг выделяли
из сердца кур. Спектры кругового дихроизма (КД) снимали на дихрографе Mark III
(«Jobin Ινοη», Франция) в кювете объемом 0,8 мл с длиной светового пути 1 см при
чувствительности прибора 2 · 10~6 единиц экстинкции на 1 мм шкалы дпаї раммы. Изме-
рения проводи ли в 0,3 M калий-фосфатном буфере, рН от 4,3 до 9,5. Концентрация бел-
ка в пробе составляла 1 мг/'мл. Математическую обработку спектров осуществляли
с исполь іоваккем критерия наименьших квадратов. Поиск оптимальных значений про-
изводили методом Розенброка с помлцью ЭВМ «Электроника-70».
Результаты и обсуждение. Уже давно известно, что анионы, связываясь в актив-
ном центре AAT [7], могут влиять на значение рК/ ферментсвязанного ПЛФ. По этой
причине результаты определения значений рК' с использованием различных по аннону
буферных растворов могли быть не достоверными. Поэтому в данном исследовании
использовали только фосфатный буфер во всей области значений рН, так как ранее
независимыми экспериментами было установлено, что фосфат-ион не оказывает влия-
ния на значение ρK r хромофора.
На рисунке, а, представлены спектры КД свободного фермента, полученные в
одном из нескольких экспериментов. Спектры снимали в буферных растворах с рН 4,3—
9,5 и интервалами 0,1—0,7 ед. рН. Видно, что рН-титрование дает серию спектров
с хорошо выраженной изобестической точкой при 387 нм. В спектрах КД наблюдается
положительная полоса дихроического поглощения с максимумами при 430 и 360 нм.
Наибольшая амплитуда полосы с максимумом при 430 нм принадлежит раствору
с рН 4,3, при 360 нм — рН 9,5. Наличие изобестической точки свидетельствует о том,
что только две указанные формы присутствуют в растворе. В связи с тем, что прото-
нированная форма фермента (максимум при 430 нм) при повышении рН раствора
убывает нацело, для математической обработки использовали данные по изменению
спектров именно этой формы фермента. Анализ спектральных данных с применением
компьютерной техники проводили по двум схемам: в первой предполагается наличие
одной, одинаковой для обеих субъединиц титрующейся группы, во второй — двух групп,
различающихся для субъединиц. В качестве критерия укладки использовали стандарт-
ную дисперсию. Обработка данных показала существенный выигрыш при использова-
нии схемы с двумя группами, поскольку различие в дисперсии составляло 2—4 раза.
Для схемы с двумя различными группами теоретическая кривая наилучшим образом
укладывается на экспериментальные точки, чего нельзя сказать о таковой для схемы
с одной титрующейся группой. Набор экспериментальных точек (по убыли поглоще-
ния при 430 нм) и теоретические кривые, соответствующие двух схемам, представле-
ны на рисунке (б). Средние из нескольких экспериментов значения р к [ = 5,55+0,20
330 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1987. — Т. 3, Л« 6
(среднее из значений — 5,54; 5,52; 5,60), рЛ^=6 ,87+0 ,14 (среднее из значений — 6,87;
6,90; 6,84).
Таким образом, впервые для этого класса ферментов установлено, что субъеди-
ницы димерной молекулы AAT из цитозоля сердца кур обладают различающимся
более чем на единицу значением рК' ферментевязанного кофермента. Отсюда с неиз-
бежностью следует, что субъединицы молекулы фермента асимметричны. Поскольку
в данных экспериментах субстраты или их аналоги в реакционной среде не присут-
С п с к т р ы К Д п и р и д о к с а л е в о й ф о р м ы с в о б о д н о г о фср імента (1 м г / м л ) в 0 ,3 M к а л и й -
ф о с ф а т н ы х б у ф е р а х , р Н ( а ) : 1 — 4 ,30 ; 2 — 5 , 1 6 ; 3 — 5.50; 4 — 5 ,75 ; 5 — 6 ,10 ; £ — 6 ,25 ;
7 — 6 ,45 ; Я — 7 , 1 0 ; 9 — 7 ,40 ; 10 — 7 ,90 ; 11 — 9 ,50 ; и (о): / — э к с п е р и м е н т а л ь н ы е т о ч к и ;
— т е о р е т и ч е с к а я к р и в а я к с х е м е 1 ( п а р а м е т р ы с х е м ы : /?/<'' = 6 , 6 1 ± 0 . 3 4 ; rr = - 1 ( U ) ; 3 —
т е о р е т и ч е с к а я к р и в а я к с х е м е 2 ( п а р а м е т р ы с х е м ы : рК\ = 5 , 5 4 + 0 , 2 5 ; pl\2
r--=6,87+0,17;
σ = 13,6)
C i r c u l a r d i c h r o i s m s p e c t r a of t h e p v r i d o x a l f o r m of a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e (1 п іц . 'ml)
in 0 .3 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e , p l i : a ) 7 — 4 .30 ; ^ — 5.16; 3 — 5 .50 · -7 - 5 75· - ' 7 — 6 10;
£ — 6.25; 7 — 6.45; 8 — 7 .10 ; P — 7 .40 : 7(9 — 7 .90 ; / 7 — 9 . 5 0 ; 6) 1 — e x p e r i m e n t a 1 v a l u e s :
2 — a t h e o r e t i c a l c u r v e to s c h e m e 1 ( p a r a m e t e r s of t h e s c h e m e : pK' 6 . 6 1 + 0 3·!; r»--
= 4 9 . 1 ) ; 3 — a t h e o r e t i c a l c u r v e Io s c h e m e 2 ( p a r a m e i c r s of t h e s c b гк•: pK/ = 5 .54 +
± 0 . 2 5 ; p K · / - - - 6 . 8 7 ± ϋ . 1 7 ; σ = 1 3 . ( ) )
ствовали, можно заключить, что установленная асимметрия субъсдинпп является изна-
чальной; она возникает в процессе ассоциации субъединиц в олигомер.
Полученные данные позволяют точнее интерпретировать результаты рентгенов-
ского исследования кристаллов фермента при высоком разрешении.
ASYMMETRY OF SUBUNITS OF ASPARTATE AMINOTRANSFERASE IN SOLUTION
V. Μ. Kochkina, D. A. Kuzneisov
Institute of Molecular Biology, Academy of Sciences of the USSR, Moscow
S u m m a r y
The apparent pK of enzyme-bound pyridoxal-5'-phosphate of subunits determined by
circular dichroismic pH titration of the pyridoxal form of aspartate aminotransferase
(EC 2.6.1.1) amounts to ρΚ1' = 5 . 5 5 + 0 . 2 , ρK2 '= 6.87+0.14.
1. Schlegel H,, Chrislen P. The apo/holo hybrid of cytosolic aspartate aminotransferase
preparation and studies on subunits in te rac t ion / /Biochem. and Biophys. Res. Com-
rnuns. — 1974,— 61, N 1,—P. 117—123.
331 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1987. — Т. 3, Л« 6
2. Boettcher В., Martinez-Carrion Μ. I temizing enzyme ligand interactions in native
and half-active hybrid aspar ta te t ransaminase to probe site-site relationships / / Bioche-
mistry.— 1976.— 15, N 25.— P. 5657—5664.
3. Arrio-Dupont M., Verge D. Binding of substrates to aspar ta te aminotransferase. Evi-
dence for a dissymmetrical b i n d i n g / / E u r . J. Biochem.— 1982.— 125, N 1.— P. 183—
187.
4. Конкина В. M., Кузнецов Д. А. Каталитические свойства аспартатаминотрансфера-
з ы / / Б и о х и м и я . — 1986.—51, № 6.—С. 921—925.
5. Jenkins W., Yphantis D. Α., Sizer / . Ψ. Glutamic aspartic t ransaminase / / J. Biol.
Chem.— 1959.—234, N 1.—P. 51—57.
6. Salerno C., Giartosio A., Fasella P. Transaminases in vitamin B6 pyridoxal phosphate /
Ed. D. Dolphin.— New York : Wiley and Sons. 1986.— P. 117—168.
7. Verge D., Tenu J.-P., Arrio-Dupont M. Inorganic phosphate binding to apoaspar ta te
aminotransferase / / FEBS Lett.— 1979.— 100, N 2.— P. 265—268.
Ин-т молекуляр. биологии АН СССР, Москва Получено 16.02.87
3 3 2 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. — 1987. — Т. 3, Л« 6
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155288 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:15:17Z |
| publishDate | 1987 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Кочкина, В.М. Кузнецов, Д.А. 2019-06-16T15:35:49Z 2019-06-16T15:35:49Z 1987 Асимметрия субъединиц аспартатаминотрансферазы в растворе / В.М. Кочкина, Д.А. Кузнецов // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 6. — С. 330-332.— Бібліогр.: 7 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000209 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155288 577.152.261 С помощью циркулярно-дихроичного титрования фермента (КФ 2.6.1.1) в области рН 4,3–9,5 и обработки данных с использованием компьютерной техники показано, что кажущееся рК ферментсвязанного пиридоксаль-5'- фосфата субъединиц различаются и составляют рК₁'=5,55±0,20; рK₂' = 6,87±0,14. За допомогою циркулярно-дихроїчного титрування ферменту (КФ 2.6.1.1) в області рН 4,3–9,5 і обробки даних з використанням комп’ютерної техніки показано, що позірна рК ферментзв’язаного піридоксаль-5'-фосфату субодиниць різняться і становлять рК₁' = 5, 55 ± 0,20; рK₂' = 6,87 ± 0,14. The apparent pK of enzyme-bound pyridoxal-5'-phosphate of subunits determined by circular dichroismic pH titralion of the pyridoxal form of aspartate aminotransferase (EC 2.6.1.1) amounts to pK₁' = 5.55 ± 0.2, pK₂' = 6.87 ± 0.14. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Краткие сообщения Асимметрия субъединиц аспартатаминотрансферазы в растворе Асиметрія субодиниць аспартатамінотрансферази у розчині Asymmetry of subunits of aspartate aminotransferase in solution Article published earlier |
| spellingShingle | Асимметрия субъединиц аспартатаминотрансферазы в растворе Кочкина, В.М. Кузнецов, Д.А. Краткие сообщения |
| title | Асимметрия субъединиц аспартатаминотрансферазы в растворе |
| title_alt | Асиметрія субодиниць аспартатамінотрансферази у розчині Asymmetry of subunits of aspartate aminotransferase in solution |
| title_full | Асимметрия субъединиц аспартатаминотрансферазы в растворе |
| title_fullStr | Асимметрия субъединиц аспартатаминотрансферазы в растворе |
| title_full_unstemmed | Асимметрия субъединиц аспартатаминотрансферазы в растворе |
| title_short | Асимметрия субъединиц аспартатаминотрансферазы в растворе |
| title_sort | асимметрия субъединиц аспартатаминотрансферазы в растворе |
| topic | Краткие сообщения |
| topic_facet | Краткие сообщения |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155288 |
| work_keys_str_mv | AT kočkinavm asimmetriâsubʺedinicaspartataminotransferazyvrastvore AT kuznecovda asimmetriâsubʺedinicaspartataminotransferazyvrastvore AT kočkinavm asimetríâsubodinicʹaspartatamínotransferaziurozčiní AT kuznecovda asimetríâsubodinicʹaspartatamínotransferaziurozčiní AT kočkinavm asymmetryofsubunitsofaspartateaminotransferaseinsolution AT kuznecovda asymmetryofsubunitsofaspartateaminotransferaseinsolution |