Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда

Изучена способность РНК I, контролирующей репликацию ColE 1-репликона и имею­щей тРНК-подобную структуру, а также гомологичные молекуле TPHKPhe участки, комплементировать термочувствительную фенилаланил-тРНК синтетазу Е. coll in vivo, поскольку известно, что таким свойством обладает молекула тРНКРhе...

Повний опис

Збережено в:
Бібліографічні деталі
Опубліковано в: :Биополимеры и клетка
Дата:1994
Автор: Черепенко, Е.И.
Формат: Стаття
Мова:Російська
Опубліковано: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1994
Онлайн доступ:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155395
Теги: Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда / Е.И. Черепенко // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 3-4. — С. 75-78. — Бібліогр.: 11 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
_version_ 1860038914923823104
author Черепенко, Е.И.
author_facet Черепенко, Е.И.
citation_txt Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда / Е.И. Черепенко // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 3-4. — С. 75-78. — Бібліогр.: 11 назв. — рос.
collection DSpace DC
container_title Биополимеры и клетка
description Изучена способность РНК I, контролирующей репликацию ColE 1-репликона и имею­щей тРНК-подобную структуру, а также гомологичные молекуле TPHKPhe участки, комплементировать термочувствительную фенилаланил-тРНК синтетазу Е. coll in vivo, поскольку известно, что таким свойством обладает молекула тРНКРhе. Показано, что клетки, содержащие термолабильный фермент и трансформированные плазмидами pUC 19 и pBR322, могут расти в непермиссивных условиях (42 °С) при выращивании всех клеток, участвовавших в трансформационной процедуре, в течение ночи с аэра­цией в разбавленном мясном бульоне. Вивчено здатність РНК I, яка контролює репліацію ColEl-реплікона та має тРНК- подібну структуру i гомологічні молекулі тРНКРhе ділянки, комплементувати термочутливу фeнiлaлaнiл-тPHK синтетазу Е. coli in vivo, оскільки відомо, що подібна властивість притаманна молекулі тРНКРhе. Показано також, що клітини, які містять термолабільний фермент i траноформовані iплaзмiдaми pUC19 i pBR322, можуть рости в непермісивних умовах (42°С) при вирощувані вcix клігин, залучених до трансформаційної процедури, протягом ночі з аєрацією в розбавленому м'ясному бульйоні. Because RNA I controlling ColEl plasmid replication is tRNA-like structure and has consensus and homological sequences of tRNAphe we studied the ability of this molecule to complement thermolabile phenylalanyl-tRNA synthetase in vivo just like tRNAphe can do. We showed that cells containing this enzyme and transformed with pUC19 and pBR322 plasmids could grow at 42 °C when grown overnight with aeration in diluted meat broth incubating all transformants at a once which resulted from transformation procedure being diluted by a factor of 50.
first_indexed 2025-12-07T16:55:07Z
format Article
fulltext •УДК 55.721 Е. И. Черепенко ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ ТЕРМОИНАКТИВАЦИИ ФЕНИЛАЛАНИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ ESCHERICHIA COLI С ПОМОЩЬЮ ПЛАЗМИД COLE1 -РЯДА Изучена способность РНК I, контролирующей репликацию ColE 1-репликона и имею­ щей тРНК-подобную структуру, а также гомологичные молекуле TPHKPhe участки, комплементировать термочувствительную фенилаланил-тРНК синтетазу Е. coll in vivo, поскольку известно, что таким свойством обладает молекула тРНКРЬе. Показано, что клетки, содержащие термолабильный фермент и трансформированные плазмидами pUC 19 и pBR322, могут расти в непермиссивных условиях (42 °С) при выращивании всех клеток, участвовавших в трансформационной процедуре, в течение ночи с аэра­ цией в разбавленном мясном бульоне. Введение. Аминоацил-тРНК синтетазы (АРСазы) из-за присущей им способности безошибочного отбора среди множества стереотипных мо­ лекул соответствующих партнеров реакции аминоацилирования — мо­ лекул тРНК и аминокислоты — стали классическим объектом в моле­ кулярной биологии при изучении механизмов молекулярного узнава­ ния. В настоящее время доминирующее направление в исследовании этих механизмов составил поиск с помощью методов генной инжене­ рии и рентгеноструктурного анализа отдельных участков — специфи­ ческих детерминант структуры молекулы как тРНК, так и фермента, ответственных за правильное узнавание и гомологическое взаимодей­ ствие [1, 2]. Однако и классические биохимические методы позволяют получить информацию, необходимую при решении проблемы молеку­ лярного узнавания [3]. Такую информацию представляет анализ ха­ рактера термоинактивации фермента в зависимости от количественно­ го и качественного содержания субстрата — молекул тРНК- Впервые изменение кинетики тепловой инактивации АРСаз in vitro с помощью тРНК было показано в работе [4], что позволило изучать закономер­ ности образования комплекса тРНК — АРСаза. Получение темпера- турочувствительных мутантов клеток Е. coli с дефектами в АРСазах, обусловливающими их термолабильность, продемонстрировало, что и in vivo возрастание содержания в клетке гомологичной тРНК, проис­ ходящее в результате увеличения числа копий гена, кодирующего дан­ ную тРНК, способно защитить фермент от действия повышенной тем­ пературы [5]. Этот факт был успешно использован при клонировании генов тРНКРЬе [6, 7]. В настоящее время еще неясно, как происходит восстановление функции фермента в непермиссивных условиях. С од­ ной стороны, известно, что конформеры гомологичной тРНКЬеи эука- риот, неактивные в процессе трансляции, не только не предотвращают термоинактивации, а, напротив, увеличивают термочувствительность фермента [8]. С другой стороны, в случае тРНКРЬе Е. coli показано, что лишь та тРНК активна, у которой G15, G44 и m7G46 не заменены на А [9]. Следовательно, при изучении механизма температурной за­ щиты АРСазы с помощью тРНК важно знать характер точечных вза­ имодействий и порог возможности изменения общей пространственной организации молекулы тРНК. В связи с этим интерес вызывают тРНК- подобные структуры, обладающие консенсусными с тРНК участками © Е. И. ЧЕРЕПЕНКО, 1994 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 3 - 4 75 и участками, резко отличающимися. Примером может служить РНК I, контролирующая репликацию Со/£7-плазмид в клетках Е. coll. Обра­ тив внимание на то, что структура РНК I напоминает «клеверный лист», авторы работы [10] сравнили нуклеотидные последовательнос­ ти РНК I и тРНК £. coli и обнаружили большую степень гомологии. Мы же исходили из того, что имеется 45 % гомологии РНК I и тРНКРЬе с наличием нескольких консенсусных участков. Целью данного исследования было изучение возможности роста клеток Е. coli, содержащих термолабильную ФРС, в непермиссивных условиях за счет введения в клетки плазмид, реплицирующихся при участии РНК I, подобной тРНКРЬе. Материалы и методы. Ш т а м м ы и п л а з м и д ы. В работе ис­ пользованы штаммы Е. coli K-12: NP-37 — tonA22, ompF627, pheS6, (Ts), relAl, pit 10, spoTl, T2r; BD 1838 —tonA2, lacYl, supE44(glnV44), gal-6, Я- pyrD67, trp-82 tyrS600, his-214, argA52, rpsL185, xyl-7, mtl-2, thi-1, полученные от Dr. В. Bachman (Коллекционный центр штаммов Е. coli США). В работе также использованы коммерческие препараты ДНК плазмид pBR322 и pUC19 и препараты, получаемые нами методом ки­ пячения и щелочным методом [11]. Клетки трансформировали препа­ ратами ДНК данных плазмид с помощью обработки СаС12 на холоду [11] и выращивали в среде LB или разбавленном мясном бульоне, со­ держащем 10 мкг/мл тетрациклина или 150 мкг/мл ампициллина со­ ответственно. На индикаторных X-gal чашках колонии р£/С7Р-транс- формантов имели синий цвет. А м и н о а ц и л и р у ю щ у ю а к т и в н о с т ь ФРС определяли при 30 и 37 °С в S-30 экстрактах, полученных из трансформирован­ ных клеток NP-37, как описано в [7]. Инкубационная смесь (100 мкл) содержала 100 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl2, 10 мМ КО, 10 мМ АТР, 0,1 мМ 14C-Phe (ЧССР, 1982 г., удельная активность 20 МБк/ /ммоль), 150 мкг суммарной тРНК. Реакцию проводили в течение 15 мин, осаждали стандартно, наносили на фильтры GF/C и опреде­ ляли радиоактивность общепринятым методом. Результаты и обсуждение. Приступая к экспериментальной про­ верке вопроса о том, может ли тРНК-подобная структура типа РНК I Со/£7-репликона, имеющая гомологию с тРНКРЬе (V или U), компле- ментировать ts-аллель ФРС штамма NP-37 (т. е., что клетки, содер­ жащие такой фермент, смогут расти в непермиссивных условиях), мы исходили из того, что в обычных при клонировании манипуляциях та­ кие события происходят не часто. В противном случае они были бы замечены в контрольных образцах при клонировании фрагментов ДНК, содержащих гены ФРС оперона или гены TPHKPhe(V, U). Действитель­ но, рассевая р£/С75-трансформированные клетки соответственно с ts ФРС или ТирРС, мы заметили, что при эффективности трансформации 105 на 1 мкг ДНК в случае ТирРС трансформанты при 42 °С никогда не появлялись. В случае же ФРС они появлялись с вероятностью 10~4. Для удобства мы перестали работать с твердыми средами и после 2 ч экспозиции в LB-среде без ампициллина при 30 °С [И] всю пробу переносили в 50 мл мясного бульона, разведенного в три раза физио­ логическим раствором и содержащего 150 мкг/мл ампициллина. Клет­ ки инкубировали в течение ночи с аэрацией при 42 °С. Результаты мно- Характер роста клеток Е. coll, содержащих соответственно термолабильные ФРС и ТирРС и трансформированных плазмидами pUC19 и pBR322 в непермиссивных условиях Штамм АРСаза Рост клеток кон-1 Рост рГ/С/Р-трансфо- троля(42 °С) рмантов (42°С), кл/мл Рост pBR322- транс - формантов (42 °С), кл/мл NP-37 ФРС — 5-108 5-108 BD 183:8 ТирРС — — — 76 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 3 - 4 гократно проверенного и хорошо воспроизводимого эксперимента в такой типичной форме представлены в таблице. Если при внесении одинакового количества контрольных и трансформированных клеток в условиях двойной селекции (антибиотик и высокая температура) в контрольных пробах не наблюдалось никакого роста клеток, то pUC19- трансформи.рованные клетки с термолабильной ФРС достигали мак­ симальной плотности при аэрации в течение ночи при 42 °С. (Объем жидкой среды за время инкубации при такой температуре снижался значительно.) Однако при инкубации риС19-транс- формированных клеток, со­ держащих ТирРС, в течение ночи аналогично клеткам с термолабильной ФРС рост клеток также не отмечался. (Учитывая сильно выражен­ ную ауксотрофность штам- Температурная инактивация фе- нилаланил-тРНК синтетазы в S- ЗО-экстрактах, полученных из р UC19-vp ан сформированных кле­ ток NP-37 и выращенных в тече­ ние ночи дри 42 °С ма с температурочувствительной ТирРС, проверяли способность данно­ го штамма расти при использованных разведениях мясного бульона при пермиссивной температуре.) Изучение аминоацилирующей активности ФРС в S-30-экстрактах, полученных из NP-37-трансформантов, выросших при 42 °С, показало, что фермент своих свойств не изменил и по-прежнему активен лишь при 30 °С (рисунок). Следует отметить, что /?£/С79-трансформанты клеток NP-37, выра­ щенные в течение ночи- при 42 °С с аэрацией, легко пассировались в таких же условиях, и на протяжении трех пассажей не было замечено замедления скорости их роста. Однако при посеве штрихом максималь­ но плотных культур на твердой среде рост наблюдался только в пер­ вом секторе, во втором — лишь отдельные колонии. При втором пас­ саже колонии не появлялись вообще. Наряду с плазмидой pUC19 наш типичный эксперимент был про­ веден с плазмидой pBR322, репликация которой также связана с РНК I. Несмотря на то, что для этих плазмид характерна различная копийность, действие плазмиды pBR322 на рост клеток штамма NP-37 при 42 °С и отсутствие такового на рост клеток штамма BD 1838 были полностью аналогичны плазмиде pUC19. Возможно, замеченное свой­ ство данных плазмид комплементировать термолабильную АРСазу не определяется копийностью в данных рамках. (Действительно, в рабо­ те [5] показан эффект защиты термочувствительной АРСазы в случае дупликации гена, кодирующего гомологичную тРНК.) Скорее всего, в этом случае оказывают влияние гв/Л-фенотип штамма NP-37 и эмпи­ рически сложившаяся концентрация в использованном мясном бульо­ не таких аминокислот, как гистидин, треонин, лейцин, аргинин, от ко­ торых зависит амплификация плазмиды pBR322 (10]. Итак, проведенные феноменологические опыты по изучению воз­ можности комплементации термолабильной ФРС с помощью РНК I, контролирующей репликацию Со/£7-репликона и, относящейся к клас­ су тРНК-подобных структур, а также имеющей участки гомологии с тРНКРЬе, выявили условия, при которых можно наблюдать такую ком­ плементацию. Отсутствие эффекта действия указанных плазмид, спо­ собствующих росту при непермиссивных температурах клеток с термо­ лабильной ТирРС, может служить доказательством специфичности об- ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 3 -4 77 наруженной комплементации. Ясно, что приведенные здесь данные вы­ зывают интерес к изучению подобной комплементации с использова­ нием индивидуальных молекул АРСазы и РНК I как на уровне целых молекул, так и их частей. О. Я. Черепенко ЗАПОБ1ГАННЯ ТЕРМОШАКТИВАЦН ФЕШЛАЛАШЛ-тРНК СИНТЕТАЗИ ESCHERICHIA COLI ЗА ДОПОМОГОЮ ПЛАЗМГД С01Е1-РЯДУ Р е з ю м е Вивчено здатшсть РНК I, яка контролюе решпкащю ColEl-реплнсона та мае тРНК- под^бну структуру i гомолопчш молекул! тРНКРНе д1лянки, комплементувати термо- чутливу фeнiлaлaнiл-тPHK синтетазу Е. coli in vivo, осюльки вщомо, що лод1бна властив1сть притаманна молекул! тРНКРЬе. Показано також, що клгтини, яю М1*стять термолаб1льний фермент i транофор,мо,ваш iплaзмiдaми pUC19 i pBR322, можуть рости в непермкивних умовах (4'2°С) при вирощувант Bcix клггин, залучених до трансфор- мащйно!" процедури, протягом H04i з аеращею в розбавленому м'ясному бульйош. Е. I. Cherepenko ColEl PLASMIDS CAN PREVENT THERMOINACTIVATION OF PHENYLALANYL-tRNA SYNTHETASE IN ESCHERICHIA COLI S u m m a r y Because RNA I controlling ColEl plasmid replication is tRNA-like structure and has consensus and homological sequences of tRNAphe we studied the ability of this molecule to complement thermolabile phenylalanyl-tRNA synthetase in vivo just like tRNAPhe can do. We showed that cells containing this enzyme and transformed with pUCp9 and pBR322 plasmids could grow at 42 °C when grown overnight with aeration in diluted meat broth incubating all transformants at a once which resulted from transformation procedure being diluted by a factor of 50. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Черепенко Е. И., Мацука Г. X. Гены аминоацил-тРНК-синтетаз прокариот и эука- риот//Успехи биол. химии.—'1989.—30.— С. 67—105. 2. Schimmel P. Functional analysis of RNA and protein determinats for aminoacyla- t i o n / / 1 5 t h International tRNA Workshop (1993, May 30 —June 4).—Cap d'Agde, 1993.—P. 150. 3. Петрушенко З. М., Тукало М. А., Гудзера О. И. и др. Определение участков взаи­ модействия TPHKLeu из молочной железы коров с гомологичной аминаацил-тРНК- синтетазой методом химической модификации//Биоорг. хими.—1990.—16, № Ш.— С. 1647—1652. 4. Фаворова О. О., Гречко В. В., Киселев Л. Л., Сахарова Н. К. Изучение кинетики термоинактивации аминоацил-тРНК синтетаз in vitro // Докл. АН СССР.—1966.— 171.—С. 742—745, 5. Morgan S., Korner N., Low К, Soil D. Regulation of biosynthesis of aminoacyl-tRNA synthetases and of tRNA in Escherichia coli. I. Isolation and characterization of a mutant with elevated levels of tRNAi G l n / / J . Mol. Biol.—1977.—117.—P. 1073. 6. Schwartz I., Klotsky P., Elseviers D. et al. Molecular cloning and seguencing of pheU, a gene for Escherichia coli /RNA p h e / / Nucl. Acids Res.—1983.—11.—P. 4379— 4389. 7. Caillet J., Plumbridge J., Springer M. Evidence that pheV, a gene for tRNAPhe of E. coli is transcribed from tandem promoters//Ibid.—1985.—13, N 10.— P. 3699. 8. Негруцкий Б. С, Ельская А. В. Особенности тепловой инактивации лейцил-тРНК- синтетазы из печени кролика в присутствии различных конформероз тРНК/ /Мо- лекуляр. биология.—1984.—18, № 5.—С. 1297—1300. 9. Delamarche Ch., Vacher J., Buckingham R. Mutants affecting tRNAPhe from Esche­ richia coli / /Eur . J. Biochem.—1987.—168.— P. 365—369. 10. Yavachev L., Ivanov I. What does homology between E. coli tRNAs and RNas con­ trolling ColEl plasmid replication mean?/ / J . Theor. Biol.—1988.—131.—P. 235. 11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.— М. : Мир, 1984.—443 с. Ин-т молекуляр. биологии и генетики НАН Украины, Киев Получено 31.01.94 78 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. Л» 3-4
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155395
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn 0233-7657
language Russian
last_indexed 2025-12-07T16:55:07Z
publishDate 1994
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
record_format dspace
spelling Черепенко, Е.И.
2019-06-16T19:06:53Z
2019-06-16T19:06:53Z
1994
Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда / Е.И. Черепенко // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 3-4. — С. 75-78. — Бібліогр.: 11 назв. — рос.
0233-7657
DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0003B1
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155395
55.721
Изучена способность РНК I, контролирующей репликацию ColE 1-репликона и имею­щей тРНК-подобную структуру, а также гомологичные молекуле TPHKPhe участки, комплементировать термочувствительную фенилаланил-тРНК синтетазу Е. coll in vivo, поскольку известно, что таким свойством обладает молекула тРНКРhе. Показано, что клетки, содержащие термолабильный фермент и трансформированные плазмидами pUC 19 и pBR322, могут расти в непермиссивных условиях (42 °С) при выращивании всех клеток, участвовавших в трансформационной процедуре, в течение ночи с аэра­цией в разбавленном мясном бульоне.
Вивчено здатність РНК I, яка контролює репліацію ColEl-реплікона та має тРНК- подібну структуру i гомологічні молекулі тРНКРhе ділянки, комплементувати термочутливу фeнiлaлaнiл-тPHK синтетазу Е. coli in vivo, оскільки відомо, що подібна властивість притаманна молекулі тРНКРhе. Показано також, що клітини, які містять термолабільний фермент i траноформовані iплaзмiдaми pUC19 i pBR322, можуть рости в непермісивних умовах (42°С) при вирощувані вcix клігин, залучених до трансформаційної процедури, протягом ночі з аєрацією в розбавленому м'ясному бульйоні.
Because RNA I controlling ColEl plasmid replication is tRNA-like structure and has consensus and homological sequences of tRNAphe we studied the ability of this molecule to complement thermolabile phenylalanyl-tRNA synthetase in vivo just like tRNAphe can do. We showed that cells containing this enzyme and transformed with pUC19 and pBR322 plasmids could grow at 42 °C when grown overnight with aeration in diluted meat broth incubating all transformants at a once which resulted from transformation procedure being diluted by a factor of 50.
ru
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Биополимеры и клетка
Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда
Запобігання термоінактивацн фенілаланіл-тРНК синтетази Escherichia coli за допомогою плазмгд ColE1-ряду
ColEl plasmids can prevent thermoinactivation of phenylalanyl-tRNA synthetase in Escherichia coli
Article
published earlier
spellingShingle Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда
Черепенко, Е.И.
title Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда
title_alt Запобігання термоінактивацн фенілаланіл-тРНК синтетази Escherichia coli за допомогою плазмгд ColE1-ряду
ColEl plasmids can prevent thermoinactivation of phenylalanyl-tRNA synthetase in Escherichia coli
title_full Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда
title_fullStr Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда
title_full_unstemmed Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда
title_short Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда
title_sort предотвращение термоинактивации фенилаланил-трнк синтетазы escherichia coli с помощью плазмид cole1-ряда
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155395
work_keys_str_mv AT čerepenkoei predotvraŝenietermoinaktivaciifenilalaniltrnksintetazyescherichiacolispomoŝʹûplazmidcole1râda
AT čerepenkoei zapobígannâtermoínaktivacnfenílalaníltrnksintetaziescherichiacolizadopomogoûplazmgdcole1râdu
AT čerepenkoei colelplasmidscanpreventthermoinactivationofphenylalanyltrnasynthetaseinescherichiacoli