Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда
Изучена способность РНК I, контролирующей репликацию ColE 1-репликона и имеющей тРНК-подобную структуру, а также гомологичные молекуле TPHKPhe участки, комплементировать термочувствительную фенилаланил-тРНК синтетазу Е. coll in vivo, поскольку известно, что таким свойством обладает молекула тРНКРhе...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1994 |
| Автор: | |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1994
|
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155395 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда / Е.И. Черепенко // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 3-4. — С. 75-78. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860038914923823104 |
|---|---|
| author | Черепенко, Е.И. |
| author_facet | Черепенко, Е.И. |
| citation_txt | Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда / Е.И. Черепенко // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 3-4. — С. 75-78. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Изучена способность РНК I, контролирующей репликацию ColE 1-репликона и имеющей тРНК-подобную структуру, а также гомологичные молекуле TPHKPhe участки, комплементировать термочувствительную фенилаланил-тРНК синтетазу Е. coll in vivo, поскольку известно, что таким свойством обладает молекула тРНКРhе. Показано, что клетки, содержащие термолабильный фермент и трансформированные плазмидами pUC 19 и pBR322, могут расти в непермиссивных условиях (42 °С) при выращивании всех клеток, участвовавших в трансформационной процедуре, в течение ночи с аэрацией в разбавленном мясном бульоне.
Вивчено здатність РНК I, яка контролює репліацію ColEl-реплікона та має тРНК- подібну структуру i гомологічні молекулі тРНКРhе ділянки, комплементувати термочутливу фeнiлaлaнiл-тPHK синтетазу Е. coli in vivo, оскільки відомо, що подібна властивість притаманна молекулі тРНКРhе. Показано також, що клітини, які містять термолабільний фермент i траноформовані iплaзмiдaми pUC19 i pBR322, можуть рости в непермісивних умовах (42°С) при вирощувані вcix клігин, залучених до трансформаційної процедури, протягом ночі з аєрацією в розбавленому м'ясному бульйоні.
Because RNA I controlling ColEl plasmid replication is tRNA-like structure and has consensus and homological sequences of tRNAphe we studied the ability of this molecule to complement thermolabile phenylalanyl-tRNA synthetase in vivo just like tRNAphe can do. We showed that cells containing this enzyme and transformed with pUC19 and pBR322 plasmids could grow at 42 °C when grown overnight with aeration in diluted meat broth incubating all transformants at a once which resulted from transformation procedure being diluted by a factor of 50.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:55:07Z |
| format | Article |
| fulltext |
•УДК 55.721
Е. И. Черепенко
ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ ТЕРМОИНАКТИВАЦИИ
ФЕНИЛАЛАНИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ ESCHERICHIA COLI
С ПОМОЩЬЮ ПЛАЗМИД COLE1 -РЯДА
Изучена способность РНК I, контролирующей репликацию ColE 1-репликона и имею
щей тРНК-подобную структуру, а также гомологичные молекуле TPHKPhe участки,
комплементировать термочувствительную фенилаланил-тРНК синтетазу Е. coll in vivo,
поскольку известно, что таким свойством обладает молекула тРНКРЬе. Показано, что
клетки, содержащие термолабильный фермент и трансформированные плазмидами
pUC 19 и pBR322, могут расти в непермиссивных условиях (42 °С) при выращивании
всех клеток, участвовавших в трансформационной процедуре, в течение ночи с аэра
цией в разбавленном мясном бульоне.
Введение. Аминоацил-тРНК синтетазы (АРСазы) из-за присущей им
способности безошибочного отбора среди множества стереотипных мо
лекул соответствующих партнеров реакции аминоацилирования — мо
лекул тРНК и аминокислоты — стали классическим объектом в моле
кулярной биологии при изучении механизмов молекулярного узнава
ния. В настоящее время доминирующее направление в исследовании
этих механизмов составил поиск с помощью методов генной инжене
рии и рентгеноструктурного анализа отдельных участков — специфи
ческих детерминант структуры молекулы как тРНК, так и фермента,
ответственных за правильное узнавание и гомологическое взаимодей
ствие [1, 2]. Однако и классические биохимические методы позволяют
получить информацию, необходимую при решении проблемы молеку
лярного узнавания [3]. Такую информацию представляет анализ ха
рактера термоинактивации фермента в зависимости от количественно
го и качественного содержания субстрата — молекул тРНК- Впервые
изменение кинетики тепловой инактивации АРСаз in vitro с помощью
тРНК было показано в работе [4], что позволило изучать закономер
ности образования комплекса тРНК — АРСаза. Получение темпера-
турочувствительных мутантов клеток Е. coli с дефектами в АРСазах,
обусловливающими их термолабильность, продемонстрировало, что и
in vivo возрастание содержания в клетке гомологичной тРНК, проис
ходящее в результате увеличения числа копий гена, кодирующего дан
ную тРНК, способно защитить фермент от действия повышенной тем
пературы [5]. Этот факт был успешно использован при клонировании
генов тРНКРЬе [6, 7]. В настоящее время еще неясно, как происходит
восстановление функции фермента в непермиссивных условиях. С од
ной стороны, известно, что конформеры гомологичной тРНКЬеи эука-
риот, неактивные в процессе трансляции, не только не предотвращают
термоинактивации, а, напротив, увеличивают термочувствительность
фермента [8]. С другой стороны, в случае тРНКРЬе Е. coli показано,
что лишь та тРНК активна, у которой G15, G44 и m7G46 не заменены
на А [9]. Следовательно, при изучении механизма температурной за
щиты АРСазы с помощью тРНК важно знать характер точечных вза
имодействий и порог возможности изменения общей пространственной
организации молекулы тРНК. В связи с этим интерес вызывают тРНК-
подобные структуры, обладающие консенсусными с тРНК участками
© Е. И. ЧЕРЕПЕНКО, 1994
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 3 - 4 75
и участками, резко отличающимися. Примером может служить РНК I,
контролирующая репликацию Со/£7-плазмид в клетках Е. coll. Обра
тив внимание на то, что структура РНК I напоминает «клеверный
лист», авторы работы [10] сравнили нуклеотидные последовательнос
ти РНК I и тРНК £. coli и обнаружили большую степень гомологии.
Мы же исходили из того, что имеется 45 % гомологии РНК I и тРНКРЬе
с наличием нескольких консенсусных участков.
Целью данного исследования было изучение возможности роста
клеток Е. coli, содержащих термолабильную ФРС, в непермиссивных
условиях за счет введения в клетки плазмид, реплицирующихся при
участии РНК I, подобной тРНКРЬе.
Материалы и методы. Ш т а м м ы и п л а з м и д ы. В работе ис
пользованы штаммы Е. coli K-12: NP-37 — tonA22, ompF627, pheS6,
(Ts), relAl, pit 10, spoTl, T2r; BD 1838 —tonA2, lacYl, supE44(glnV44),
gal-6, Я- pyrD67, trp-82 tyrS600, his-214, argA52, rpsL185, xyl-7, mtl-2,
thi-1, полученные от Dr. В. Bachman (Коллекционный центр штаммов
Е. coli США).
В работе также использованы коммерческие препараты ДНК
плазмид pBR322 и pUC19 и препараты, получаемые нами методом ки
пячения и щелочным методом [11]. Клетки трансформировали препа
ратами ДНК данных плазмид с помощью обработки СаС12 на холоду
[11] и выращивали в среде LB или разбавленном мясном бульоне, со
держащем 10 мкг/мл тетрациклина или 150 мкг/мл ампициллина со
ответственно. На индикаторных X-gal чашках колонии р£/С7Р-транс-
формантов имели синий цвет.
А м и н о а ц и л и р у ю щ у ю а к т и в н о с т ь ФРС определяли
при 30 и 37 °С в S-30 экстрактах, полученных из трансформирован
ных клеток NP-37, как описано в [7]. Инкубационная смесь (100 мкл)
содержала 100 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl2, 10 мМ КО, 10 мМ
АТР, 0,1 мМ 14C-Phe (ЧССР, 1982 г., удельная активность 20 МБк/
/ммоль), 150 мкг суммарной тРНК. Реакцию проводили в течение
15 мин, осаждали стандартно, наносили на фильтры GF/C и опреде
ляли радиоактивность общепринятым методом.
Результаты и обсуждение. Приступая к экспериментальной про
верке вопроса о том, может ли тРНК-подобная структура типа РНК I
Со/£7-репликона, имеющая гомологию с тРНКРЬе (V или U), компле-
ментировать ts-аллель ФРС штамма NP-37 (т. е., что клетки, содер
жащие такой фермент, смогут расти в непермиссивных условиях), мы
исходили из того, что в обычных при клонировании манипуляциях та
кие события происходят не часто. В противном случае они были бы
замечены в контрольных образцах при клонировании фрагментов ДНК,
содержащих гены ФРС оперона или гены TPHKPhe(V, U). Действитель
но, рассевая р£/С75-трансформированные клетки соответственно с ts
ФРС или ТирРС, мы заметили, что при эффективности трансформации
105 на 1 мкг ДНК в случае ТирРС трансформанты при 42 °С никогда
не появлялись. В случае же ФРС они появлялись с вероятностью 10~4.
Для удобства мы перестали работать с твердыми средами и после 2 ч
экспозиции в LB-среде без ампициллина при 30 °С [И] всю пробу
переносили в 50 мл мясного бульона, разведенного в три раза физио
логическим раствором и содержащего 150 мкг/мл ампициллина. Клет
ки инкубировали в течение ночи с аэрацией при 42 °С. Результаты мно-
Характер роста клеток Е. coll, содержащих соответственно термолабильные
ФРС и ТирРС и трансформированных плазмидами pUC19 и pBR322
в непермиссивных условиях
Штамм АРСаза Рост клеток кон-1 Рост рГ/С/Р-трансфо-
троля(42 °С) рмантов (42°С), кл/мл
Рост pBR322- транс -
формантов (42 °С),
кл/мл
NP-37 ФРС — 5-108 5-108
BD 183:8 ТирРС — — —
76 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 3 - 4
гократно проверенного и хорошо воспроизводимого эксперимента в
такой типичной форме представлены в таблице. Если при внесении
одинакового количества контрольных и трансформированных клеток
в условиях двойной селекции (антибиотик и высокая температура) в
контрольных пробах не наблюдалось никакого роста клеток, то pUC19-
трансформи.рованные клетки с термолабильной ФРС достигали мак
симальной плотности при аэрации в течение ночи при 42 °С. (Объем
жидкой среды за время инкубации при такой температуре снижался
значительно.) Однако при
инкубации риС19-транс-
формированных клеток, со
держащих ТирРС, в течение
ночи аналогично клеткам с
термолабильной ФРС рост
клеток также не отмечался.
(Учитывая сильно выражен
ную ауксотрофность штам-
Температурная инактивация фе-
нилаланил-тРНК синтетазы в S-
ЗО-экстрактах, полученных из
р UC19-vp ан сформированных кле
ток NP-37 и выращенных в тече
ние ночи дри 42 °С
ма с температурочувствительной ТирРС, проверяли способность данно
го штамма расти при использованных разведениях мясного бульона
при пермиссивной температуре.)
Изучение аминоацилирующей активности ФРС в S-30-экстрактах,
полученных из NP-37-трансформантов, выросших при 42 °С, показало,
что фермент своих свойств не изменил и по-прежнему активен лишь
при 30 °С (рисунок).
Следует отметить, что /?£/С79-трансформанты клеток NP-37, выра
щенные в течение ночи- при 42 °С с аэрацией, легко пассировались в
таких же условиях, и на протяжении трех пассажей не было замечено
замедления скорости их роста. Однако при посеве штрихом максималь
но плотных культур на твердой среде рост наблюдался только в пер
вом секторе, во втором — лишь отдельные колонии. При втором пас
саже колонии не появлялись вообще.
Наряду с плазмидой pUC19 наш типичный эксперимент был про
веден с плазмидой pBR322, репликация которой также связана с
РНК I. Несмотря на то, что для этих плазмид характерна различная
копийность, действие плазмиды pBR322 на рост клеток штамма NP-37
при 42 °С и отсутствие такового на рост клеток штамма BD 1838 были
полностью аналогичны плазмиде pUC19. Возможно, замеченное свой
ство данных плазмид комплементировать термолабильную АРСазу не
определяется копийностью в данных рамках. (Действительно, в рабо
те [5] показан эффект защиты термочувствительной АРСазы в случае
дупликации гена, кодирующего гомологичную тРНК.) Скорее всего, в
этом случае оказывают влияние гв/Л-фенотип штамма NP-37 и эмпи
рически сложившаяся концентрация в использованном мясном бульо
не таких аминокислот, как гистидин, треонин, лейцин, аргинин, от ко
торых зависит амплификация плазмиды pBR322 (10].
Итак, проведенные феноменологические опыты по изучению воз
можности комплементации термолабильной ФРС с помощью РНК I,
контролирующей репликацию Со/£7-репликона и, относящейся к клас
су тРНК-подобных структур, а также имеющей участки гомологии с
тРНКРЬе, выявили условия, при которых можно наблюдать такую ком
плементацию. Отсутствие эффекта действия указанных плазмид, спо
собствующих росту при непермиссивных температурах клеток с термо
лабильной ТирРС, может служить доказательством специфичности об-
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 3 -4 77
наруженной комплементации. Ясно, что приведенные здесь данные вы
зывают интерес к изучению подобной комплементации с использова
нием индивидуальных молекул АРСазы и РНК I как на уровне целых
молекул, так и их частей.
О. Я. Черепенко
ЗАПОБ1ГАННЯ ТЕРМОШАКТИВАЦН ФЕШЛАЛАШЛ-тРНК СИНТЕТАЗИ
ESCHERICHIA COLI ЗА ДОПОМОГОЮ ПЛАЗМГД С01Е1-РЯДУ
Р е з ю м е
Вивчено здатшсть РНК I, яка контролюе решпкащю ColEl-реплнсона та мае тРНК-
под^бну структуру i гомолопчш молекул! тРНКРНе д1лянки, комплементувати термо-
чутливу фeнiлaлaнiл-тPHK синтетазу Е. coli in vivo, осюльки вщомо, що лод1бна
властив1сть притаманна молекул! тРНКРЬе. Показано також, що клгтини, яю М1*стять
термолаб1льний фермент i транофор,мо,ваш iплaзмiдaми pUC19 i pBR322, можуть рости
в непермкивних умовах (4'2°С) при вирощувант Bcix клггин, залучених до трансфор-
мащйно!" процедури, протягом H04i з аеращею в розбавленому м'ясному бульйош.
Е. I. Cherepenko
ColEl PLASMIDS CAN PREVENT THERMOINACTIVATION
OF PHENYLALANYL-tRNA SYNTHETASE IN ESCHERICHIA COLI
S u m m a r y
Because RNA I controlling ColEl plasmid replication is tRNA-like structure and
has consensus and homological sequences of tRNAphe we studied the ability of this
molecule to complement thermolabile phenylalanyl-tRNA synthetase in vivo just like
tRNAPhe can do.
We showed that cells containing this enzyme and transformed with pUCp9 and
pBR322 plasmids could grow at 42 °C when grown overnight with aeration in diluted
meat broth incubating all transformants at a once which resulted from transformation
procedure being diluted by a factor of 50.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Черепенко Е. И., Мацука Г. X. Гены аминоацил-тРНК-синтетаз прокариот и эука-
риот//Успехи биол. химии.—'1989.—30.— С. 67—105.
2. Schimmel P. Functional analysis of RNA and protein determinats for aminoacyla-
t i o n / / 1 5 t h International tRNA Workshop (1993, May 30 —June 4).—Cap d'Agde,
1993.—P. 150.
3. Петрушенко З. М., Тукало М. А., Гудзера О. И. и др. Определение участков взаи
модействия TPHKLeu из молочной железы коров с гомологичной аминаацил-тРНК-
синтетазой методом химической модификации//Биоорг. хими.—1990.—16, № Ш.—
С. 1647—1652.
4. Фаворова О. О., Гречко В. В., Киселев Л. Л., Сахарова Н. К. Изучение кинетики
термоинактивации аминоацил-тРНК синтетаз in vitro // Докл. АН СССР.—1966.—
171.—С. 742—745,
5. Morgan S., Korner N., Low К, Soil D. Regulation of biosynthesis of aminoacyl-tRNA
synthetases and of tRNA in Escherichia coli. I. Isolation and characterization of a
mutant with elevated levels of tRNAi G l n / / J . Mol. Biol.—1977.—117.—P. 1073.
6. Schwartz I., Klotsky P., Elseviers D. et al. Molecular cloning and seguencing of
pheU, a gene for Escherichia coli /RNA p h e / / Nucl. Acids Res.—1983.—11.—P. 4379—
4389.
7. Caillet J., Plumbridge J., Springer M. Evidence that pheV, a gene for tRNAPhe of
E. coli is transcribed from tandem promoters//Ibid.—1985.—13, N 10.— P. 3699.
8. Негруцкий Б. С, Ельская А. В. Особенности тепловой инактивации лейцил-тРНК-
синтетазы из печени кролика в присутствии различных конформероз тРНК/ /Мо-
лекуляр. биология.—1984.—18, № 5.—С. 1297—1300.
9. Delamarche Ch., Vacher J., Buckingham R. Mutants affecting tRNAPhe from Esche
richia coli / /Eur . J. Biochem.—1987.—168.— P. 365—369.
10. Yavachev L., Ivanov I. What does homology between E. coli tRNAs and RNas con
trolling ColEl plasmid replication mean?/ / J . Theor. Biol.—1988.—131.—P. 235.
11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.— М. : Мир,
1984.—443 с.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики НАН Украины, Киев Получено 31.01.94
78 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. Л» 3-4
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155395 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:55:07Z |
| publishDate | 1994 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Черепенко, Е.И. 2019-06-16T19:06:53Z 2019-06-16T19:06:53Z 1994 Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда / Е.И. Черепенко // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 3-4. — С. 75-78. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0003B1 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155395 55.721 Изучена способность РНК I, контролирующей репликацию ColE 1-репликона и имеющей тРНК-подобную структуру, а также гомологичные молекуле TPHKPhe участки, комплементировать термочувствительную фенилаланил-тРНК синтетазу Е. coll in vivo, поскольку известно, что таким свойством обладает молекула тРНКРhе. Показано, что клетки, содержащие термолабильный фермент и трансформированные плазмидами pUC 19 и pBR322, могут расти в непермиссивных условиях (42 °С) при выращивании всех клеток, участвовавших в трансформационной процедуре, в течение ночи с аэрацией в разбавленном мясном бульоне. Вивчено здатність РНК I, яка контролює репліацію ColEl-реплікона та має тРНК- подібну структуру i гомологічні молекулі тРНКРhе ділянки, комплементувати термочутливу фeнiлaлaнiл-тPHK синтетазу Е. coli in vivo, оскільки відомо, що подібна властивість притаманна молекулі тРНКРhе. Показано також, що клітини, які містять термолабільний фермент i траноформовані iплaзмiдaми pUC19 i pBR322, можуть рости в непермісивних умовах (42°С) при вирощувані вcix клігин, залучених до трансформаційної процедури, протягом ночі з аєрацією в розбавленому м'ясному бульйоні. Because RNA I controlling ColEl plasmid replication is tRNA-like structure and has consensus and homological sequences of tRNAphe we studied the ability of this molecule to complement thermolabile phenylalanyl-tRNA synthetase in vivo just like tRNAphe can do. We showed that cells containing this enzyme and transformed with pUC19 and pBR322 plasmids could grow at 42 °C when grown overnight with aeration in diluted meat broth incubating all transformants at a once which resulted from transformation procedure being diluted by a factor of 50. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда Запобігання термоінактивацн фенілаланіл-тРНК синтетази Escherichia coli за допомогою плазмгд ColE1-ряду ColEl plasmids can prevent thermoinactivation of phenylalanyl-tRNA synthetase in Escherichia coli Article published earlier |
| spellingShingle | Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда Черепенко, Е.И. |
| title | Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда |
| title_alt | Запобігання термоінактивацн фенілаланіл-тРНК синтетази Escherichia coli за допомогою плазмгд ColE1-ряду ColEl plasmids can prevent thermoinactivation of phenylalanyl-tRNA synthetase in Escherichia coli |
| title_full | Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда |
| title_fullStr | Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда |
| title_full_unstemmed | Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда |
| title_short | Предотвращение термоинактивации фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli с помощью плазмид ColE1-ряда |
| title_sort | предотвращение термоинактивации фенилаланил-трнк синтетазы escherichia coli с помощью плазмид cole1-ряда |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155395 |
| work_keys_str_mv | AT čerepenkoei predotvraŝenietermoinaktivaciifenilalaniltrnksintetazyescherichiacolispomoŝʹûplazmidcole1râda AT čerepenkoei zapobígannâtermoínaktivacnfenílalaníltrnksintetaziescherichiacolizadopomogoûplazmgdcole1râdu AT čerepenkoei colelplasmidscanpreventthermoinactivationofphenylalanyltrnasynthetaseinescherichiacoli |