Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине

В статье представлены первые результаты анализа нуклеотидных последовательностей генов ВИЧ-1, полученных с помощью полимеразной цепной реакции на ДНК из крови украинских пациентов. Два из девяти исследованных образцов отнесены к подтипу А, остальные – к подтипу В. Обнаружен редковстречающийся вариан...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Published in:	Биополимеры и клетка
Date:	1998
Main Authors:	Гребенюк, В.А., Аноприенко, О.В., Скороход, А.С., Маричев, И.Л., Кавсан, В.М.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1998
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155406
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине / В.А. Гребенюк, О.В. Аноприенко, А.С. Скороход, И.Л. Маричев, В.М. Кавсан // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 4. — С. 277-285. — Бібліогр.: 35 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1859636100762435584
author	Гребенюк, В.А. Аноприенко, О.В. Скороход, А.С. Маричев, И.Л. Кавсан, В.М.
author_facet	Гребенюк, В.А. Аноприенко, О.В. Скороход, А.С. Маричев, И.Л. Кавсан, В.М.
citation_txt	Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине / В.А. Гребенюк, О.В. Аноприенко, А.С. Скороход, И.Л. Маричев, В.М. Кавсан // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 4. — С. 277-285. — Бібліогр.: 35 назв. — рос.
collection	DSpace DC
container_title	Биополимеры и клетка
description	В статье представлены первые результаты анализа нуклеотидных последовательностей генов ВИЧ-1, полученных с помощью полимеразной цепной реакции на ДНК из крови украинских пациентов. Два из девяти исследованных образцов отнесены к подтипу А, остальные – к подтипу В. Обнаружен редковстречающийся вариант района V3 гена env ВИЧ-І Из двух показаний на путь передачи инфекции подтверждено одно Представлено перші результати аналізу нуклеотидних послідовностей генів вірусу імунодефіциту людини типу І (ВІЛ-І), отриманих за допомогою полімеразної ланцюгової реакції на ДНК з крові українських пацієнтів. Два з дев'яти досліджених зразків віднесено до підтипу А, інші — до підтипу В, Знайдено варіант ділянки V3 гена env ВІЛ-І; цей варіант зустрічається рідко. З двох показань щодо шляху передачі інфекції підтверджено одне. Here we report first results on genetic characterization of HIV-I samples from Ukraine using polymerase chain reaction (PCR) and viral genes sequencing. PCR was done on DNA from uncultured peripheral blood mononuclear cells of 7 male (all homosexual) and 2 female (one heterosexual and one injection drug user, IDV) HIV-1 seropositive individuals. After the PCR products cloning partial sequencing of HIV-1 gag gene (0.56 kb, p17-p24), HIV-I env gene (1.1 kb, CS-C5), and HIV-1 nef gene were performed. Nucleotide and deduced amino acid sequences were aligned to reference strains of different HIV-1 subtypes by CLUSTAL method and phylogenetic neighbor-joining trees were generated. By the results of phylogenetic analysis two HIV-1 samples (one from IDV and one from male homosexual) belonged to subtype A while others were clustered to subtype B by nucieotide as welt as by amino acid sequences. Most closely related env sequences wen; found in samples from a couple of homosexual partners. One rare V3 tip tetramer (RPGR) was found in subtype B env sequence. All three sequenced samples of HIV-I nef genes belonged to the subtype R. One nef sequence contains unusually long insert in Hie N-terminal region
first_indexed	2025-12-07T13:16:32Z
format	Article
fulltext	ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1998. Т. 14. № 4 Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине В. А. Гребенюк, О. В. Аноприенко, А. С Скороход, И. Л. Маричев1, В- М. Кавсан Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины 252143, Киев, ул. Академика Заболотного, 150 Институт эпидемиологии и инфекционных заболеваний МОЗ Украины 252038, Киев, ул. Протасов яр, 4 В статье представлены первые результаты анализа нуклеотидных последовательностей генов ВИЧ-1, полученных с помощью полимеразной цепной реакции на ДНК из крови украинских пациентов. Два из девяти исследованных образцов отнесены к подтипу А, остальные — к подтипу В. Обнаружен редкостречающийся вариант района V3 гена env ВИЧ-L Из двух показаний на путь передачи инфекции подтверждено одно Введение. Пандемия синдрома приобретенного им мунодефицита человека (СПИД) к середине 90-х годов охватила практически весь мир. По оценке Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), к середине 1996 гсща число случаев заражения виру сом иммунодефицита человека (ВИЧ) достигло 27,9 миллионов 11]. В Украине после периода относительного благополучия было отмечено стре мительное распространение ВИЧ инфекции. Так., на конец 1994 года количество ВИЧ инфицирован ных граждан составило 183 человека, к концу 1995 года— 1490 человек [2], а за первые 8 месяцев 1996 года зарегистрировано 9720 новых случаев заражения 13 ]. Возбудитель СПИДа — вирус иммунодефицита человека \|4 \| проявляет необычно высокую степень генетического разнообразия in vivo. Источником генетического разнообразия ВИЧ является высокий уровень мутаций [5], быстрый оборот вируса [6] к явления рекомбинации [7 ]. Исследования структу ры генома региональных вариантов вируса ведутся во многих странах не только в рамках националь ных программ, но и по международным грантам Существуют два основных типа этого вируса: ВИЧ- 1, распространенный повсеместно, и ВИЧ-2, менее патогенный и встречающийся значительно реже. На основании соотношений гомологии генов gag и env изоляты ВИЧ-1 разделены на две группы: М © В. А. Г Р Е Б Е Н К Ж , О. F-. А Н О П Р И В Н К О , А. С С К О Р О Х О Д . И. Л МАРИЧ15В, В. М. КАВСАН, 1998 (main) и О (outgroup) [8 ]. Группа М содержит восемь подтипов (групп гомологии) для гена env, называемых в соответствии с латинским алфавитом А—Н [8 ]. Кроме того, есть сведения о выделении еще двух подтипов, I и J [9, 10]. Для гена gag определены семь подтипов: А—D, F, G и Н [8]. Распределение изолятов по гомологии генов gag в основном соответствует таковому по гену env. Вы деленная позже группа О, по-видимому, не менее вариабельна, чем М. Изоляты рекомбинантной природы [8 ] и не классифицированные образцы свидетельствуют о существовании еще не охаракте ризованных подтипов. Интерес к известным вариантам ВИЧ-1 вызван прежде всего тем, что беспрецедентная вариабель ность вируса считается основным препятствием для создания вакцины. Мутации в геноме вируса при водят к существенным изменениям биологических [11] и антигенных свойств [12, 13]. Последнее может стать проблемой для диагностики иммуноло гическими средствами, поскольку, несмотря на то, что большинство антигенов вирусов одного подтипа так или иначе связывается с антителами против вирусов других подтипов, существует высокая ве роятность возникновения новых подтипов и даже новых штаммов ВИЧ-1 с отличающимися иммуно- генными свойствами, которые не распознаются применяемыми тест-системами. Так, некоторые ва рианты антигенов вирусов подгруппы О либо инду цируют продукцию антител, не определяемых рас пространенными иммунологическими тест-система- 277 Г Р Е Б Е Ш О К П А. И Д Р ми, либо дают нетипичную картину при «western blot» анализе, не подтверждая, таким образом, данные первичного теста на антитела к ВИЧ [14]. Так же очевидны проблемы, порожденные вариа бельностью, при диагностике ВИЧ с помощью по- лимеразной цепной реакции (ПЦР): праймеры, гомологичные участкам генома одного подтипа, не всегда гомологичны тем же участкам другого под типа. Частота встречаемости подтипов ВИЧ-1 геогра фически неравномерна и изменяется со временем. В странах Европы и Северной Америки в подавля ющем большинстве случаев встречаются изоляты подтипа В. Другие подтипы обычно привносятся ь результате недавней эмиграции из стран Африки и встречаются значительно реже. В странах Африки спектр вариантов значительно шире, большинство принадлежит к не В-подтипам [151. В странах Южной Америки преобладает подтип В, но значи тельная часть изолятов принадлежит и к подтипу F [161. В Юго-Восточной Азии распространены в основном В- и Е-подтипы [17]. В странах СНГ (за исключением Украины) и Балтии при общей мало численности случаев инфекции ВИЧ-1, выявлены шесть подтипов (А—D, G и Н) [18]. На сегодняшний день доказательства связи между принадлежностью изолятов к определенно му подтипу и такими биологическими свойствами, как способность к передаче преимущественно тем или иным способом, ь основном, статистические, Так. характерно, что подтип В в Европе и Америке встречается преимущественно среди мужчин-гомо сексуалистов, а впоследствии распространился сре ди инъекционных наркоманов. В то же время в странах Африки вирусом в равной степени пораже ны как мужчины, так и женщины, которые, как упоминалось выше, инфицированы не В-подтипа- ми. Объяснение этих статистических данных может быть как биологическим (если есть тропизм опре деленных подтипов к вагинальной передаче), так ш эпидемиологическим. Последнее предположение кажется более вероятным и подтверждается тем. что в Таиланде подтип Е до определенного времени был ассоциирован с гетеросексуальным путем пере дачи, а подтип В — с внутривенным использовани ем наркотических средств [19]. В дальнейшем ВИЧ-1 подтипа Е проник в среду инъекционных наркоманов. Косвенным доказательством того, что подтип F хуже передается при гетеросексуальном контакте, являются данные о том, что в Бразилии число случаев заражения подтипом F среди жен щин значительно ниже, чем среди их половых партнеров — инъекционных наркоманов [20 ]. Экс периментальным подтверждением статистической корреляции между принадлежностью изолятов к определенному подтипу и способностью к передаче преимущественно тем или иным способом является сообщение [21 ] о большем тропизме ВИЧ-1 изоля тов подтипа Е и С по сравнению с подтипом В к клеткам Лангерганса (макрофаги эпителиальных тканей), которые предположительно являются ос новной мишенью для ВИЧ-1 при гетеросексуаль ном контакте. Вариабельность генома ВИЧ-1 позволяет при менять сравнение нуклеотидных последовательно стей изолятов для определения путей передачи инфекции как между отдельными пациентами, так и в небольших популяциях [22 ]. В литературе широко обсуждались несколько случаев использо вания для этой цели молекулярно-биологических методов [23—26 ]. Цель нашей работы состояла в изучении гете рогенности генома ВИЧ-1, распространенного на территории Украины. Здесь мы представляем пер вые результаты анализа нуклеотидных последова тельностей фрагментов генов gag, env и nef ВИЧ-1, полученных с помощью ПЦР на ДНК из крови украинских пациентов. Материалы и методы. Кровь из вены отбирали у ВИЧ-1 ссропозитивных пациентов, находящихся под наблюдением в Институте эпидемиологии и инфекционных заболеваний МОЗ Украины (табли ца). ДНК выделяли из ядер лейкоцитов перифери ческой крови (ЛПК). Препараты свежей крови (5—10 мл) собирали в гепаринизированные про бирки. Ядра получали, добавляя к цельной крови 9 объемов раствора следующего состава: 0,32 М саха роза, 10 мМ трис-НСІ, рН 7,6, 5 мМ MgCl2, 1 % Triton Х-100, аккуратно перемешивали и выдержи вали в течение 5 мин при 4 °С, после чего центрифугировали при 3000 об/мин (1500 g) в течение 15 мин. Осадок промывали фосфатно-соле- вым буфером (PBS) (г/л): NaCl — 8, КС1 — 0,2, N a 2 H P 0 4 — 1,15, К Н 2 Р 0 4 — 0,2, рН 7,2, переосаж дали и ресуспендировали в 400 мкл PBS. ДНК из ядер выделяли стандартным методом [27]. Выход ДНК из 1 мл цельной крови составлял 10—15 мкг. ПЦР проводили в приборе «DNA Thermal Сусіег» («Регкіп Еітег», США) с использованием реактивов фирмы «USB» (США) и «Регкіп El тег». Фрагменты провируса ВИЧ-1 амплифицировали по методу «nested» ПЦР [28 ]. ПЦР осуществляли в 50 мкл реакционной смеси следующего состава: 50 мМ КС1, 10 мМ трис-НСІ, рН 9,0 (25 °С), 0,1 % Triton Х-100, 2 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, 1 ед. Год-ДНК-полимеразы «AmpliTaq, Perkin Еітег»; количество праймеров указано ниже. В качестве 278 Г Е Н Е Т И Ч Е С К И Й А Н А Л И З В А Р И А Н Т О В ВИЧ-1 В У К Р А И Н Е Клонированные фрагменты генома ВИЧ-1 украинских пациентов Предпслагаемый способ заражения: гетеро — гетеросексуальный, гомо — гомосексуальный, нарк — внутривенное употребление наркотических веществ. Генерализованная лимфоаденопатия. матрицы для первого этапа «nested» ПЦР исполь зовали 1 мкг ДНК из ядер ЛПК, для второго — 1 мкл 10-кратного разведения первой реакции. Для первого этапа амплификации района СЗ- С5 гена env (около 1,1 тыс. п. н.) использовали внешние праймеры — env6430 (5-TGTCCAAAGG- T(A/G)(T/A)CCTTTGA-3') (6192—6211) (здесь и: далее указаны позиции ираймеров в соответствии с: геномом HTVBH102), 50 пмоль на реакцию, и: env7578 <5'-TAGGTATCTTTCCACAGCCA-3') (7340—7321), 20 пмоль на реакцию; для второго этапа — RA6430 (5'-atcgaatl£CCATACATTATTG- Т-3') (6219—6233) (здесь и далее строчными бук вами выделены участки, содержащие сайты ре стрикции и не комплементарные вирусной последо валельности), 20 пмоль на реакцию, и RA7578 (5'-ccagaa1.tcTTGCCTGGAGCTG-3') (7314—7302), 20 пмоль на реакцию. Температурный режим для первого этапа ПЦР: 94 °С — 1 мин; 5 циклов: 94 °С — 30 с, 55 °С — 1 мин, 72 °С — 2 мин; 10 циклов: 94 °С — 30 с, 54 °С — 1 мин, 72 °С — 2 мин; 30 циклов: 94 °С — 30 с, 53 °С — 1 мин, 72 °С — 1 мин + 2 с. Температурный режим для второго этапа амплификации: 5 циклов: 94 °С — 30 с, 51 °С — 1 мин, 72 °С — 2 мин; 25 циклов: 94 °С — 30 с, 55 °С — 30 с, 72 °С — 1 мин + 2 с. Амплификацию района р17-р24 гена gag (око ло 0,56 тыс п. н.) проводили с использованием внешних праймеров: MaXba (5'-ACCAAGGAAG- CliTAjQACAAGATAG AGGAA-3') (400 — 429) и RvSal (5'-GGAAGCACelcgacCTGATATCTAATC- CCTGGTG-3') (2356—2323) и внутренних прайме ров: MaXba и SK39 (5'-TTTGGTCCTTGTCTT- ATGTCCAGAATGC-3') (980—953). Количество 279 Г Р В Б Е Н Ю К В. А. И Д Р . каждого прайм ера 20 пмоль на реакцию. Темпера турный режим для первого этапа амплификации: 94 °С — 1 мин; 5 циклов: 94 °С — 30 с, 58 °С — 1 мин, 72 °С — 2 мин; 10 циклов: 94 °С — 30 с, 57 °С — I мин 72 °С — 2 мин; 30 циклов: 94 °С — 30 с, 56 °С — 30 с, 72 °С — 2 мин + 1 с. Темпера турный режим для второго этапа амплификации: 5 циклов: 94 °С — 30 с, 56 °С — 30 с, 72 °С — 1 мин; 25 циклов: 94 °С — 30 с, 55 °С — 30 с, 72 °С — 1 мин + 1 с. Амплификацию полного гена nef ВИЧ-1 (около 0,65 тыс. п. н.) проводили с использованием внеш них ираймеров: ENVend (5-GCC(A/G)CAGC- (А/С/Т) (A/G)TAGCAGTA(A/G) (G/C)-3'J (8028— 8047) и Oligol (5'-TCAGCAGTTCTTGAAGTACT- З') (8772 — 8746) и внутренних праймеров: NEFATGn (5 , -gc^Uc^TGGGTGGCAAGTGGTC- АААА-3') (8152—8172) и Oligol. Количество каж дого праймера 20 пмоль на реакцию. Температур ный режим для первого этапа амплификации; 94 °С — 1 мин; 5 циклов: 94 °С — 30 с, 58 °С - 1 мин, 72 °С — 2 мин; 10 циклов: 94 °С — 30 с, 57 °С — 1 мин, 72 °С — 2 мин; 30 циклов: 94 °С — 30 с, 56 f С — 30 с, 72 °С — 1 мин + 1 с. Темпера турный режим для второго этапа: 5 циклов: 94 °С — 30 с, 56 °С - 30 с, 72 °С — 1 мин; 25 циклов: 94 °С — 30 с, 55 °С — 30 с, 72 °С - 1 мин + 2 с. При клонировании продуктов ПЦР использо вали ферменты и буферные растворы фирмы «Во- ehringer Mannheim» (ФРГ). Продукты ПЦР после окрашивания бромистым этидием выделяли из ага- розного геля с помощью набора «Geneclean II» («ВЮ 101 Тпс», США) и клонировали в составе вектора pBluescriptll SK+ («Stratagene» США) с использованием сайтов рестрикции, введенных в прайм еры: EcoRI для гена env, Xbal для гена gag и ВатН 1 для гена nef. Продукты ПЦР генов gag и nef для затупления концов обрабатывали ДНК- полимеразой I Escherichia coli, а затем рестрициро- вали соответствующими эндонуклеазами и клони ровали в pBluescriptll SK+. Продукты ПЦР гена nef клонировали сходным образом, но с использовани ем рестрикционной эндонуклеазы ВатН L Лигиро- вание проводили в течение ночи при 16 °С. Лигаз- ную смесь использовали для трансформации ком петентных клеток Е. соИ XLI-Blue («Stratagene») полученных, как описано [29 ]. Плазмидную ДНК выделяли методом кипячения [30]. Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера, используя набор «Sequenase version 2.0 DNA Sequencing Kil» («USB») и [a- 3 5 S]dATP («Amersham», Англия). Для редактирования нуклеотидных последова тельностей использовали программу SEQMAN (DNAStar, Madison, Wisconsin, США). Для вырав нивания, сравнения и определения филогенетиче ских соотношений последовательностей ВИЧ-1 применяли программу Megalign (DNAStar) и CLUSTAL V [31 ], филогенетические деревья рас считывали по методу ближайших соседей (nei ghbor-joining). Расчет длин ветвей (дивергенции) осуществляли с учетом транзиций/трансверсий для нуклеотидных последовательностей и с использова нием таблицы РАМ250 для экстраполированных аминокислотных последовательностей. В качестве фонового набора использовали 2—4 соответствую щие последовательности каждого из подтипов ВРЇЧ-1 и последовательность SIV-l c p z g a b , рекомен дованные для этих целей [8 ]. Определенные в этой работе нуклеотидные по следовательности были введены в базу данных EMBL под следующими номерами: Y16071, Y16072, Y16073, Y16074, Y16075, Y16076, Y16077, Y16078, Y16079, Y16080, Y16081, Y16082, Y16083, Y16084, Y16085, Y16086, Y16087. Результаты и обсуждение. Для анализа вари антов ВИЧ-1, распространенных в Украине, с ис пользованием «nested» ПЦР на ДНК из крови девяти пациентов были выделены и клонированы район р17-р24 (около 560 п. н.) гена gag, район СЗ-С5 (около 1100 п. н.) гена env и ген nef (около 650 п. н.) (см. таблицу). Были определены нукле отидные последовательности фрагмента гена gag ВИЧ-1 шести пациентов, фрагмента гена env ВИЧ- 1 семи пациентов и гена nef ВИЧ-1 трех пациен тов. Все полученные нуклеотидные последователь ности содержат открытую рамку считывания. Оп ределение нуклеотидной последовательности соответствующего фрагмента гена env лабораторно го штамма ВИЧ-1—NL4-3 [32] показало, что уровень ошибок, вносимых Taq-Tvonviмеразой в ус ловиях эксперимента, составляет 0,19 %, что прак тически не влияет на результаты филогенетическо го анализа. По результатам филогенетического анализа фрагментов гена gag ВИЧ-1, распространенного на территории Украины, один из образцов (Uklgag) был отнесен к подтипу А, остальные — к подтипу В (рис. 1). Дивергенция между украинскими лини ями ВИЧ-1 одного подтипа в этом районе составля ет от 3,6 до 7,3 % (в среднем 6,2 %) по нуклео- тидным и от 3,9 до 9,2 % (в среднем 6,2 %) по аминокислотным последовательностям. Диверген ция между линиями разных подтипов составляет от 14,3 до 15,8 % по нуклеотидным (в среднем 14,9 %) и от 11,2 до 13,8 % (в среднем 12,5 %) по аминокислотным последовательностям. 280 Г Е Н Е Т И Ч Е С К И Й А Н А Л И З В А Р И А Н Т О В ВИЧ 1 В У К Р А И Н Е Рис. 1. Филогенетические соотношения нуклеотидных последовательностей гена gag ВИЧ-1. Процент дивергенции между отдельными последовательностями может быть определен с помощью шкалы как суммарная длина соединяющихся горизонтальных ветвей. Вертикальные линии служат исключительно для удобства представления. Названия нуклеотидных последовательностей, определенных в этой работе, выделены жирным шрифтом Рис. 2. Филогенетические соотношения нуклеотидных последовательностей гена env ВИЧ-1. Пояснения к рисунку те же , что и для рис. 1 281 ГРЕБЕШОК В. А И ДР В результате аналогичного анализа фрагментов гена env ВИЧ-1, распространенного на территории Украины, один из образцов (UA8<?w) был отнесен к подтипу А, остальные — к подтипу В (рис. 2), Дивергенция между украинскими линиями ВИЧ-1 одного подтипа в этом районе составляет от 3,2 до 13,1 % (в среднем 10,9 %) по нуклеотидным и от 6,2 до 20,7 % (в среднем 16,5 %) по аминокислот ным последовательностям. Дивергенция между ли ниями разных подтипов составляет от 18,1 до 19,2 % по нуклеотидным (в среднем 18,7 %) и от 23,1 до 26,8 % (в среднем 25,1 %) по аминокис лотным последовательностям. Во всех исследованных нами образцах сохране ны консервативные остатки цистеина (рис. 3). В каждой последовательности содержится от 14 до 19 потенциальных сайтов N-гликозилирования, рас пределение которых в целом соответствует харак терному для данных подтипов, за исключением одного сайта в третьей «константной» петле образ- Рис. 3. Сравнение экстраполированных аминокислотных последовательностей фрагментов СЗ—С5 гена env ВИЧ-1 украинских пациентов и референсных последовательностей подтипа A (U455) и подтипа В (NL4-3) . Консервативные остатки цистеина отмечены звездочками (). Потенциальные сайты N-гликозилирования обозначены символом / v / v ^ . Границы консервативных (С) и вариабель ных (V) районов указаны стрелками. Положительно заряженные аминокислотные остатки района V3, определяющие SI/NSI генотип, выделены жирным шрифтом. Сайты связывания с CD4 рецептором и сайт протеолиза g p l 6 0 обозначены вертикальными линиями (!) 282 Г Е Н Е Т И Ч Е С К И Й А Н А Л И З В А Р И А Н Т О В ВИЧ-1 В У К Р А И Н Е ца, относящегося к подтипу A (UASenv). Эта пози ция встречается в подтипах В (1,1 % ) , F (20,0 %) и G (12,5 %) и отсутствует во всех известных аминокислотных последовательностях подтипа А, Генотип одного из образцов подтипа В (UASenv). по результатам анализа аминокислотной последо вательности УЗ-петли, относится к синцитийобра- зующим (SI генотип) [33]. Этот образец также содержит наибольшее количество сайтов N-глико- зилирования. Длина V3-петли в шести образцах составляет 35 аминокислотных остатков (ак) и в одном образ це — 34 ак. Пять образцов подтипа В содержат GPGR-тетрамер верхушки УЗ-петли, наиболее ха рактерный для этого подтипа. Один из образцов подтипа В (\JA2env) содержит необычный тетра- мер, RPGR, ранее обнаруженный в единственном образце из Уругвая [34]. Образец подтипа А содер жит тетрамер GPGQ — наиболее общий для этого подтипа. Октамеры верхушки УЗ-петли трех образ цов подтипа В содержат последовательность, наи более общую для этого подтипа — HIGPGRAF. Два других образца подтипа В (\JA4env и UASenv) содержат октамеры, встречающиеся реже и только в этом подтипе. Один из образцов подтипа В (\JA2env) содер жит последовательность HIRPGRAF, не представ ленную в базе данных [8 ]. Образец подтипа А (U AS env) содержит последовательность RIGPGQTF, чаще встречающуюся в подтипе С, но также представленную в части линий ВИЧ-1 под типа А (27 из 138 известных). По результатам филогенетического анализа ге на nef ВИЧ-1, распространенного на территории Украины, все три образца отнесены к подтипу В (рис 4). Дивергенция между нуклеотидными по следовательностями составляет от 9,8 до 12,6 % (в среднем 10,7 %) и от 14,6 до 19,9 % (в среднем 18,1 %) между аминокислотными последователь ностями. В экстраполированной аминокислотной после довательности UAlnef консервативный остаток ци- стеина в позиции 61 заменен на валин (рис. 5). Интересно, что такая замена (на Vat или Не) есть в четырех из 75 последовательностей Nef (две из них относятся к подтипу В), представленных в базе данных [8]. В то же время последовательность UAlnef содержит Cys в позиции 145, где он обна ружен только в трех (все подтипа В) из 75 после довательностей 18 ]. Наличие Cys в этом положе нии связывают с длительным инкубационным пе риодом и неразвитием СПИД [35]. Кроме того, во всех последовательностях Nef украинских образцов ВИЧ-1 присутствует Cys в позиции 170, где он представлен у 18 последовательностей подтипа В (28 %) и двух из трех последовательностей подти па D. Вставка в N-концевой части Nef, обнаружен ная нами в \JA2nef, вообще характерна для белков Nef ВИЧ-1. Так, 9 последовательностей (12 %) 22,1 20 " Т " 15 Р и с 4. Филогенетические соотношения нуклеотидных последовательностей генов nef ВИЧ-1 . Пояснения к рисунку те же, что и для рис. 1 283 file:///JA2env file:///JA4env file:///JA2env file:///JA2nef Г Р Е Б Е Ш О К В. А. И Д Р . Рис. 5. Сравнение экстраполированных аминокислотных последовательностей генов nef ВИЧ-1 украинских пациентов и референсной последовательности подтипа В (NL4-3) . Консервативные остатки цистеина отмечены звездочками (*). Сайты связывания с SHS-доменом протеинкиназ класса С обозначены вертикальными линиями (I) содержат в этом районе вставку размером более 9 ак и 23 последовательности (36 %) имеют вставку размером 6 ак. Необычен размер вставки у UA2nef — 12 ак. Более длинная вставка присутст вует только у одной последовательности — HIVBRVA. Интересно отметить, что большая часть белков Nef, содержащих длинную вставку, отно сится к «старым» случаям заражения ВИЧ-1. В том числе и образец (HIVIU23487), полученный на материале пациента, известного как Manchester Sailor (1958 год). Три сайта связывания с 8НЗ-доменом протеин киназ класса С присутствуют во всех белках Nef украинских образцов ВИЧ-1. Процент дивергенции между украинскими ли ниями ВИЧ-1 не превышает значений, характер ных для рассматриваемых участков генома, и вме сте с тем достаточно высок, что указывает на множественные источники заражения в Украине. Наблюдающаяся в других странах ассоциация подтипа В с гомосексуальным путем передачи, видимо, характерна и для Украины. Распростра ненный в основном в Африке подтип А ассоцииро ван с гетеросексуальным путем передачи. Обнару жение ВИЧ-1 этого подтипа у UA8, возможно, объясняется профессией пациента — моряк дальне го плавания. Характерно, что наиболее гомологичные после довательности ВИЧ-1 обнаружены у двух пациен тов (UA6 и UA7), указавших на гомосексуальную связь друг с другом как на источник заражения. В то же время указание пациента UA8 на связь с UA4 в качестве источника заражения не верно, так как обнаруженные у них линии ВИЧ-1 весьма дивергентны и относятся к разным подтипам. Работа частично финансировалась грантом 93/8 Национального комитета по борьбе с заболе ванием СПИД при президенте Украины. В. А. Гребенюк, О. В. Ліюпрієнко, Л. С. Скороход, I. Л. Марічев, В. М. Кавсан Генетичний аналіз варіантів ВІЛ-І в Україні Резюме Представлено перші результати аналізу нуклеотидних послідовностей генів вірусу імунодефіциту людини типу І (ВІЛ-І), отриманих за допомогою полімеразної ланцюгової реакції на ДНК з крові українських пацієнтів. Два з дев'яти досліджених зразків віднесено до підтипу А, інші — до підтипу В, Знайдено варіант ділянки V3 гена env ВІЛ-J; цей варіант зустрічається рідко. З двох показань щодо шляху передачі інфекції підтверджено одне. V. A. Grebenjuk, О. V. Anoprienko, A. S. Skorokhod, I. L. Marichev, V. М. Kavsan Genetic characterization of HIV-1 variants in Ukraine Summary Here we report first results on genetic characterization of HIV-1 samples from Ukraine using polymerase chain reaction (PCR) and viral genes sequencing. PCR was done on DNA from uncultured peripheral, blood mononuclear cells of 7 male (all homosexual) and 2 female (one heterosexual and one injection drug user, IDV) HIV-1 seropositive individuals. After the PCR products cloning partial sequencing of HIV-1 gag gene (0.56 kb> p!7-p24), HIV-1 env gene (1.1 kb, C3-C5), and HIV-1 nef gene were performed. Nucleotide and deduced amino acid sequences were aligned to reference strains of different HIV-J subtypes by CLUSTAL method and phylogenetic neighbor-joining trees were generated. By the results of phylogenetic analysis two HIV-1 samples (one from IDV and one from male homosexual) belonged to subtype A while others were clustered to subtype В by nucleotide as well as by amino acid sequences. Most closely related env sequences were found in samples from a couple of homosexual partners. One rare V3 tip tetramer 284 (RPGR) was found in subtype В env sequence. All three sequenced samples of HIV-1 nef genes belonged to the subtype B. One nef sequena' contains unusually long insert, in the N-terminal region. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. HIV/AIDS: The Global Epidemic. Fact sheet.—Geneva: UN AIDS and WHO І996. 2. Кобища Юу Мухарська Л., Бочкова Л. та ін. В І Л - І н ф е к ц І 5 г на Україні. Інформаційний бюлетень № 9.—Київ, 1996. 3. Івасюк В., Кобища Ю., Кордюм В. пш ін, Епідемія СНІДу в Україні і С Е І Т І . Аналітичний огляд.—Київ, 1996. 4. Popovic М., Sarngadharan М. G., Read Е., Gallo R. С Detection, isolation, and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-'Ш) from patients with AIDS and pre- AIDS / / Science. — 1 9 8 4 . — 2 2 4 . — P . 497—500 . 5. Preston B. D, Poiesz B. J., Loeb L. A. Fidelity of HIV-1 reverse transcriptase / / Ibid. — 1 9 8 8 . — 2 4 2 . — P . 1168—1171 . 6. Но IX, Neumann A. U., Perelson A. S., Chen W. et. al. Rapid turneover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection / / Nature (London). — 1995 .—373 .—P. 123—126. 7. Sharp P. A/., Robertson IX E, Gao R, Hahn В. H. Origins and diversity of Human Immunodeficiency Viruses / / AIDS.— 1 9 9 4 . - 8 . — P . 27—42 . 8. Muers G., Kcbert В., Hahn В. H. et. al. Human retroviruses and AIDS 1995.— New Mexico: Los Alamos Nat. Lab. publ., 1995. 9. Kostrikis L. G , Bagdadcs В., Cao V. et a I. Genetic analysis of human immunodeficiency virus type 1 strains from patients in Cyprus: Identification of a new subtype, designated subtype :[ / / J. Virol. — 1995.—69. —P. 6122—6130 . 10. Leitner Т., Alliens A., Marquina S. et al. Yet another subtype of HIV type 1? / / AIDS Res. Hum. Retroviruses. —1995.— 11.—N 8.— P 995—997 . 11. de Wolf R., Hogervorst E'.} Goudsmit J., Renyo E. A/., and the WHO Network for HIV isolation and characterization. Syn cytium-inducing and noi -syncytium-inducing capacity of hu man immunodeficiency virus type 1 subtypes other than B: Phenotypic and genotypic characteristics / / Ibid .—1994.— 10.—P. 1401 — 1408. 12. Раи C. P., Kai M., Holloman-Candal D. E et al. and the WHO Network for HIV isolation and characterization. An tigenic variation and serotyping of HIV type 1 from four World Health Organization-sponsored HIV vaccines sites / / Ibid.— P. 1369—1377. 13. Cheingsong-Popov R., Eister S., Callow IX et al. and the WHO Network for HIV isolation and characterization. Sero typing HIV type 1 by antibody binding to the V3 loop Relationship to viral genotype / / Ibid.—P. 1379—1386. 14. Umssert-Ataka I., Ly T. D., Chaix M. E. et al. H I V - 1 / H I V - 2 seronegativity in HIV-1 subtype О infected patients / / Lan cet.— 1994 .—343.—P. 1393—194. 15. WHO Network for НІУ isolation and charactezation HIV type: 1 variation in World Health organization-sponsored vaccine evaluation sites: Genetic screening, sequence analysis, and preliminary biological characterization of selected viral strains; / / AIDS Res. Hum. Retroviruses.—1994.—10.—P. 1327— 1343. 16. Louwague J., Delwart E. L, Mullins J. 1. et al. Genetic- analysis of HIV-1 isolates from Brasil reveals presence of two distinct genetic subtypes / / Ibid.—P. 561—567 . 17. Grez M., Dietrich U., Balfe P. et al. Genetic analysis of human immunodeficiency virus type 1 and 2 (HIV-1 and HIV-2) mixed infection in India reveals a recent spread of HIV-1 and HIV-2 from a single ancestor for each of these viruses / / J. Virol. — 1994 .—68.—P. 1261—2168. Г Е Н Е Т И Ч Е С К И Й А Н А Л И З В А Р И А Н Т О В ВИ 4-І В У К Р А И Н Е 18. Eukashov V. К, Cornelissen М.у Goudsmit J. et al. Simul taneous introduction of distinct HIV-1 subtypes into different risk groups in Russia, Byelorussia, and Lithuania / / AIDS.— 1995 .—9.—P. 4 3 5 — 4 3 9 . 19. Kalish M. L, їмо С. С , Weniger В. G. et al. Early HIV type І strains in Thailand were not responsible for the current epidemic / / AIDS Res. Hum. Retrovirus.—1994.—10.— P. 1573—1575 . 20. Brigido E. R., Rossini M., Santos I. et al HIV-1 subtypes in female sexual partners of IDU at the San Paulo / / X I Int. Conf. on AIDS.—Vancouver, 1996.—Ти. C. 220. 21. Soto-Ramirez E. E.t Renjifo В., Marlink R. et al. Differential growth of HIV-1 subtypes in Langerhans cells. Relation to transmission route / / Ibid.—Tu. A. 370. 22. Hills D. M., Huelsenbeck J. P., Cunningham C. W. Applica tion and accuracy of molecular phylogenesis / / Science.— 1994 — 2 6 4 . — P . 671—677 . 23. Ou С. У., Ciesielski C. A., Myers G. et al. Molecular epidemiology of HIV transmission in a dental practice / / Ibid. — 1992 .—256 .—P. 1 1 6 5 — 1 1 7 1 . 24. Holmes E. C, Zhang E Q., Simmonds P. et al. Molecular investigation of human immunodeficiency virus (HIV) infection in a patient of an HIV-infected surgeon / / J . Infect. Dis .— 1993. — 1 6 7 . — P . 1411 — 1444. 25. Albert J., Wahlberg J., Leitner T. et al. Analysis of rope case by direct sequencing of human immunodeficiency virus type 1 pol and gag genes / / J. V iro l .—1994 .—68.—P. 5918—5924 . 26. Jaffe H. W., McCurdy J. M., Kalish M. E. et al. Lack of HIV transmission in the practice of a dentist with AIDS / / Ann. Int. Med. — 1 9 9 4 . — 1 2 1 . — P . 8 5 5 — 8 5 9 . 27. Maniatis Т., Rritsch E. P., Sambrook J. Molecular cloning: A laboratory manual.—New York: Cold Spring Harbor Lab., 1982. 28. Rogers M., Ou C.-Y., Ray field А/. Polymerase chain reaction for early detection of HIV proviral sequence in infants born to seropositive mothers / / N. Engl. J. Med. — 1 9 8 9 . — 3 2 0 . — P. 1649—1654. 29. Nishimura A., Morita M., Nishimura J., Sugino J. A rapid and highly efficient method for preparation of competent E. coli cells / / Nucl. Acids Res .— 1990 .—18 .—P. 6169. 30. Holmes D. S., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids / / Anal. Biochem.— 1981 .— 114.—P. 193. 31. Higgius D. G., Bleasby A. J., Ruc/is R. CLUSTAL V improved softwere for multiple sequence alignment / / Comput. Appl. Biosci.— 1992 .—8.—P. 189—191 . 32. Adachi A., Gendelman S., Koenig S. et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-assosiated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone / / J. Viro l .—1986 .—59.—P. 2 8 4 — 2 9 1 . 33 . Jong de J. J., Ronde de A., Keulen W. et al Minimal requirements for the human immunodeficiency virus type I domain to support the syncytium-inducing phenotype: Analysis by single amino acid substitution / / Ib id .—1992.—66.— P. 6777—6780 . 34. Medina P. R. D., Jansson M.t Halapi E. et al. Genetic analysis of V3 domain sequences obtained from Uruguayan HIV type 1-infected individuals / / AIDS Res. Hum. Ret roviruses.—1996.—12, N 15 .—P. 1491 — 1493. 35. Premkumar D., Ma X., Maitra R. K. et al. The nef gene from a long-term HIV type 1 nonprogressor / / Ibid.—N 4 .— P. 337—345 . Поступила в редакцию 19.01.98 285
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155406
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	0233-7657
language	Russian
last_indexed	2025-12-07T13:16:32Z
publishDate	1998
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
record_format	dspace
spelling	Гребенюк, В.А. Аноприенко, О.В. Скороход, А.С. Маричев, И.Л. Кавсан, В.М. 2019-06-16T19:18:35Z 2019-06-16T19:18:35Z 1998 Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине / В.А. Гребенюк, О.В. Аноприенко, А.С. Скороход, И.Л. Маричев, В.М. Кавсан // Биополимеры и клетка. — 1998. — Т. 14, № 4. — С. 277-285. — Бібліогр.: 35 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0004D9 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155406 В статье представлены первые результаты анализа нуклеотидных последовательностей генов ВИЧ-1, полученных с помощью полимеразной цепной реакции на ДНК из крови украинских пациентов. Два из девяти исследованных образцов отнесены к подтипу А, остальные – к подтипу В. Обнаружен редковстречающийся вариант района V3 гена env ВИЧ-І Из двух показаний на путь передачи инфекции подтверждено одно Представлено перші результати аналізу нуклеотидних послідовностей генів вірусу імунодефіциту людини типу І (ВІЛ-І), отриманих за допомогою полімеразної ланцюгової реакції на ДНК з крові українських пацієнтів. Два з дев'яти досліджених зразків віднесено до підтипу А, інші — до підтипу В, Знайдено варіант ділянки V3 гена env ВІЛ-І; цей варіант зустрічається рідко. З двох показань щодо шляху передачі інфекції підтверджено одне. Here we report first results on genetic characterization of HIV-I samples from Ukraine using polymerase chain reaction (PCR) and viral genes sequencing. PCR was done on DNA from uncultured peripheral blood mononuclear cells of 7 male (all homosexual) and 2 female (one heterosexual and one injection drug user, IDV) HIV-1 seropositive individuals. After the PCR products cloning partial sequencing of HIV-1 gag gene (0.56 kb, p17-p24), HIV-I env gene (1.1 kb, CS-C5), and HIV-1 nef gene were performed. Nucleotide and deduced amino acid sequences were aligned to reference strains of different HIV-1 subtypes by CLUSTAL method and phylogenetic neighbor-joining trees were generated. By the results of phylogenetic analysis two HIV-1 samples (one from IDV and one from male homosexual) belonged to subtype A while others were clustered to subtype B by nucieotide as welt as by amino acid sequences. Most closely related env sequences wen; found in samples from a couple of homosexual partners. One rare V3 tip tetramer (RPGR) was found in subtype B env sequence. All three sequenced samples of HIV-I nef genes belonged to the subtype R. One nef sequence contains unusually long insert in Hie N-terminal region Работа частично финансировалась грантом 93/8 Национального комитета по борьбе с заболеванием СПИД при президенте Украины. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине Генетичний аналіз варіантів ВІЛ-І в Україні Genetic characterization of HIV-1 variants in Ukraine Article published earlier
spellingShingle	Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине Гребенюк, В.А. Аноприенко, О.В. Скороход, А.С. Маричев, И.Л. Кавсан, В.М.
title	Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине
title_alt	Генетичний аналіз варіантів ВІЛ-І в Україні Genetic characterization of HIV-1 variants in Ukraine
title_full	Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине
title_fullStr	Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине
title_full_unstemmed	Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине
title_short	Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине
title_sort	генетический анализ вариантов вич-1 в украине
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155406
work_keys_str_mv	AT grebenûkva genetičeskiianalizvariantovvič1vukraine AT anoprienkoov genetičeskiianalizvariantovvič1vukraine AT skorohodas genetičeskiianalizvariantovvič1vukraine AT maričevil genetičeskiianalizvariantovvič1vukraine AT kavsanvm genetičeskiianalizvariantovvič1vukraine AT grebenûkva genetičniianalízvaríantívvílívukraíní AT anoprienkoov genetičniianalízvaríantívvílívukraíní AT skorohodas genetičniianalízvaríantívvílívukraíní AT maričevil genetičniianalízvaríantívvílívukraíní AT kavsanvm genetičniianalízvaríantívvílívukraíní AT grebenûkva geneticcharacterizationofhiv1variantsinukraine AT anoprienkoov geneticcharacterizationofhiv1variantsinukraine AT skorohodas geneticcharacterizationofhiv1variantsinukraine AT maričevil geneticcharacterizationofhiv1variantsinukraine AT kavsanvm geneticcharacterizationofhiv1variantsinukraine

Генетический анализ вариантов ВИЧ-1 в Украине

Institution

Similar Items