Регуляторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома

В обзоре кратко изложены данные научных публикаций по изучению роли вспомогательных регуляторных генов nef, vpu, vpr, vif, tat и rev ВИЧ-1 в его репродукции. Основное внимание уделено генам tat и rev и их продуктам как важнейшим регуляторам активности ВИЧ и других представителей лентивирусов, а та...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Опубліковано в: :	Биополимеры и клетка
Дата:	1994
Автори:	Кухаренко, А.П., Швед, А.Д.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1994
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155416
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Регуляторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома / А.П. Кухаренко, А.Д. Швед // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 5. — С. 5-30. — Бібліогр.: 135 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155416
record_format	dspace
spelling	Кухаренко, А.П. Швед, А.Д. 2019-06-16T19:51:34Z 2019-06-16T19:51:34Z 1994 Регуляторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома / А.П. Кухаренко, А.Д. Швед // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 5. — С. 5-30. — Бібліогр.: 135 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0003B9 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155416 578.286 В обзоре кратко изложены данные научных публикаций по изучению роли вспомогательных регуляторных генов nef, vpu, vpr, vif, tat и rev ВИЧ-1 в его репродукции. Основное внимание уделено генам tat и rev и их продуктам как важнейшим регуляторам активности ВИЧ и других представителей лентивирусов, а также белку Nef. Рассмотрены возможные механизмы их влияния на экспрессию провируса с участием факторов клетки-хозяина и на цитофизиологические процессы, протекающие в ВИЧ- инфицированных клетках. В огляді наведено відомості щодо наукових публікацій з вивчення ролі та функції допоміжних регуляторних генів nef, vpu, vpr, vif, tat та rev ВІЛ-1 в його репродукції. Увагу переважно приділено генам tat, rev i ix продуктам як найвпливовішим регуляторам активности ВІЛ-1 та інших представниюв групи лентивірусів, а також гену nef. Розглянуто можливі механізми впливу цих генів на експресію провірусу за участю факторів клітин-хазяїна та на фізіологічні процеси, що відбуваються у BIЛ-інфікованих клітинах. Review summarises recent data related to the role and function of the auxiliary regulatory genes nef, vpu, vpr, vif, tat and rev of HIV-1 in viral replication. We devoted attention rather to the tat, rev, nef and their products as to the main regulators of the realization of HIV-1 lentiviral genome. Possible mechanisms of influence of these viral products on proviral activity in couple with host-cellular factors are considered. Cytopathophysiological effections of some viral regulatory proteins upon HIV-1 persistention of permissible cells are also shortly reviewed. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Регуляторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома Регуляторні гени ВІЛ та ix роль у реалізації геному HIV-1 regulatory genes and their role in the viral genome realization Article published earlier
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
title	Регуляторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома
spellingShingle	Регуляторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома Кухаренко, А.П. Швед, А.Д.
title_short	Регуляторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома
title_full	Регуляторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома
title_fullStr	Регуляторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома
title_full_unstemmed	Регуляторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома
title_sort	регуляторные гены вич и их роль в реализации генома
author	Кухаренко, А.П. Швед, А.Д.
author_facet	Кухаренко, А.П. Швед, А.Д.
publishDate	1994
language	Russian
container_title	Биополимеры и клетка
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format	Article
title_alt	Регуляторні гени ВІЛ та ix роль у реалізації геному HIV-1 regulatory genes and their role in the viral genome realization
description	В обзоре кратко изложены данные научных публикаций по изучению роли вспомогательных регуляторных генов nef, vpu, vpr, vif, tat и rev ВИЧ-1 в его репродукции. Основное внимание уделено генам tat и rev и их продуктам как важнейшим регуляторам активности ВИЧ и других представителей лентивирусов, а также белку Nef. Рассмотрены возможные механизмы их влияния на экспрессию провируса с участием факторов клетки-хозяина и на цитофизиологические процессы, протекающие в ВИЧ- инфицированных клетках. В огляді наведено відомості щодо наукових публікацій з вивчення ролі та функції допоміжних регуляторних генів nef, vpu, vpr, vif, tat та rev ВІЛ-1 в його репродукції. Увагу переважно приділено генам tat, rev i ix продуктам як найвпливовішим регуляторам активности ВІЛ-1 та інших представниюв групи лентивірусів, а також гену nef. Розглянуто можливі механізми впливу цих генів на експресію провірусу за участю факторів клітин-хазяїна та на фізіологічні процеси, що відбуваються у BIЛ-інфікованих клітинах. Review summarises recent data related to the role and function of the auxiliary regulatory genes nef, vpu, vpr, vif, tat and rev of HIV-1 in viral replication. We devoted attention rather to the tat, rev, nef and their products as to the main regulators of the realization of HIV-1 lentiviral genome. Possible mechanisms of influence of these viral products on proviral activity in couple with host-cellular factors are considered. Cytopathophysiological effections of some viral regulatory proteins upon HIV-1 persistention of permissible cells are also shortly reviewed.
issn	0233-7657
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155416
citation_txt	Регуляторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома / А.П. Кухаренко, А.Д. Швед // Биополимеры и клетка. — 1994. — Т. 10, № 5. — С. 5-30. — Бібліогр.: 135 назв. — рос.
work_keys_str_mv	AT kuharenkoap regulâtornyegenyvičiihrolʹvrealizaciigenoma AT švedad regulâtornyegenyvičiihrolʹvrealizaciigenoma AT kuharenkoap regulâtornígenivíltaixrolʹurealízacíígenomu AT švedad regulâtornígenivíltaixrolʹurealízacíígenomu AT kuharenkoap hiv1regulatorygenesandtheirroleintheviralgenomerealization AT švedad hiv1regulatorygenesandtheirroleintheviralgenomerealization
first_indexed	2025-11-25T22:47:30Z
last_indexed	2025-11-25T22:47:30Z
_version_	1850573645797130240
fulltext	УДК 578.286 А. П. Кухаренко, А. Д. Швед РЕГУЛЯТОРНЫЕ ГЕНЫ ВИЧ И ИХ РОЛЬ В РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНОМА В обзоре кратко изложены данные научных публикаций по изучению роли вспомога тельных регуляторных генов nef, vpu, vpr, vif, tat и rev ВИЧ-1 в его репродукции. Основное внимание уделено генам tat и rev и их продуктам как важнейшим регуля торам активности ВИЧ и других представителей лентивирусов, а также белку Nef. Рассмотрены возможные механизмы их влияния на экспрессию провируса с участием факторов клетки-хозяина и на цитофизио логические процессы, протекающие в ВИЧ- инфицированных клетках. Введение. Общей способностью, характеризующей всех представителей семейства ретровирусов, является обратная транскрипция их однонит- чатого РНК-генома в двунитчатую ДНК. Последняя способна интегри- фовать в геном хозяина и длительное время пребывать в нем в виде провируса. Последующие фазы внутриклеточного цикла ретровирусов определяются факторами и условиями клетки-хозяина. Многим изучен ным ретровирусам для репликации и осуществления полного инфекци онного цикла достаточно наличия трех собственных структурных ге нов — gag, pol и env. Лентивирусы, представляющие обширную группу внутри семейства ретровирусов, кроме трех перечисленных генов, име ют в своем геноме открытые рамки считывания, кодирующие вспомога тельные регуляторные белки. Геному вируса иммунодефицита челове ка типа 1 (ВИЧ-1), относящегося к лентивирусам, присуще наиболее сложное строение среди всех известных ретровирусов; он кодирует ге ны, по крайней мере, шести вспомогательных белков — nef, vpu, vpr, vif, tat и rev. В предлагаемом обзоре кратко отражены результаты совре менных исследований молекулярно-генетических свойств этих вирусных генов и их белковых продуктов, а также предпринята попытка обоб щения существующих гипотез и научных взглядов на роль и значение вспомогательных генов ВИЧ-1 в реализации его генома. Рассмотрены также возможные механизмы патогенетического воздействия продуктов указанных генов на клетки хозяина. Поскольку к настоящему времени в научной литературе нет обзо ров, где были бы представлены данные обо всех регуляторных генах ВИЧ-1, мы решили предложить читателю эти обобщенные сведения следующим образом. Каждый отдельный ген охарактеризован по воз можности в соответствии с некоторой схемой. Но приоритетное изуче ние наиболее важных регуляторных генов вируса и специфика каждо го из них нередко заставляют отступать от шаблона при анализе всех вспомогательных генов ВИЧ-1. Свойства некоторых указанных генов даны в сравнении с гомологичными генами представителей лентиви русов HTLV-группы (Human T-Cell Leukemia Virus), генеалогически наиболее близких к ВИЧ. Следуя задаче представить наиболее сущест венные сведения о свойствах вирусных продуктов и их взаимодействии со структурами клетки-хозяина, мы не останавливались на характерис тике последних, чтобы не отнимать внимание читателя на отдельные ракурсы клеточной биологии. По этой причине подачу такого объема информации, специализированной для молекулярной генетики, трудно адресовать широкому кругу исследователей, работающих в области ге- © А. П. КУХАРЕНКО, А. Д. ШВЕД. 1994 ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 5 нетики вирусов или только вирусологам, работающим с ретровирусами иммунодефицитов. Надеемся, что обзор заинтересует вирусологов а также молекулярных биологов и генетиков, изучающих ВИЧ и лен'ти- вирусы nlLV-группы. Ген nef расположен на З'-конце генома ВИЧ и является последней рамкой считывания всех мРНК вируса (рис. 1). Длина пептидной цепи К. Рис. 1. Геномная организация ВИЧ-1: А - генетическая карта вируса (блоками пока заны кодирующие участки и концевые повторы (LTR) в пределах провирусной ДНК); о карта сплайсинга ВИЧ-1-транскриптов (показаны все экспрессирующиеся в ин фицированной клетке экзоны а также группы малых множественно спланированных " 2 К - кодирующих Rev и Таг); С-продукты альтернативного сплайсинга, кодиру ющие гибридные и укороченные формы рамок считывания Tax/Rev Nef у разных изолятов ВИЧ неизменна и белок имеет молекулярную массу 27 000. Эта открытая рамка считывания есть только у лентиви- русов иммунодефицита человека и не обнаружена у их близкородствен ных ретровирусов. При сравнении последовательностей различных изо лятов ВИЧ-1 выявлена высокая консервативность нуклеотидной после довательности этого гена в центральной части рамки считывания со ответствующей функциональным доменам белка. Такая консерватив- 6 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 ность считается эволюционным критерием и отражает значимость nef для репликации вируса [1—3]. Белок Nef появляется в клетке на ранних стадиях, но максимум его накопления наблюдается на третьи сутки после инфицирования одно временно с белками оболочки вириона Gag и Env [2]. Анализ состава ВИЧ-специфических мРНК в инфицированной клетке (амплификация, клонирование и сиквенс кДНК клонов) выявил наибольшую избыточ ность /zef-специфических матриц, составляющих 79 % всех множествен но сплайсированных малых мРНК (в соответствии с классификацией продуктов сплайсинга транскриптов ВИЧ, предложенной Muesing [4],— это мРНК, не имеющие интронов). Подобное соотношение по стоянно для всех изолятов вируса и всех пермиссивных клеток [4]. Первые 16 N-концевых аминокислотных остатков белка составля ют сигнальный пептид, локализующийся в цитоплазматической мемб ране, и 80 % клеточного пула Nef ассоциировано с мембранными струк турами. Кроме основной формы Nef, ассоциированной с мембранами, экспрессируется укороченный на 16 аминокислот Nef, транслируемый с внутреннего инициатора Met-17. У двух форм могут быть разные функции — трансдукторная и регуляторная [5], Показано также, что в инфицированных клетках зрелый белок меристилирован [5]. Nef — типичный фосфопротеин — активен только в фосфорилиро- ванном состоянии. Этот белок содержит домен связывания GTP и об ладает ОТРазной активностью. Он связывает GTP подобно белкам G- семейства сигнальных трансдукторов и является фосфокиназой, спо собной эффективно аутофосфорилироваться после активации [6J. Ак тиватором Nef служит протеинкиназа С. Рекомбинантный Nef, полу ченный в Escherichia coli, также способен аутофосфорилироваться в присутствии GTP или АТР [7]. Для репликации ВИЧ in vitro нет необходимости в Nef. Первые сведения, касающиеся продукта открытой рамки считывания на З'-кон- це генома ВИЧ, свидетельствовали о том, что он ингибирует LTR-на- правленную транскрипцию [6] и таким путем определяет латентность провируса. По этой причине вирусный ген и его продукт названы NEF (Negative Element Factor) — производное от названия области LTR (Negative Regulation Elements, NRE)—предполагаемая аффекторная область воздействия Nef. Другие авторы опровергают репрессивное действие Nef на ВИЧ [8, 9], по крайней мере, для некоторых изолятов вируса и отдельных клеточных систем. Так, в клетках, условно пермис сивных для ВИЧ, влияние Nef на LTR ВИЧ не реализуется, что, воз можно, указывает на тканеспецифичность взаимодействующих с ним клеточных факторов [10]. Эксперименты по изучению влияния Nef на репликацию ВИЧ в зрелых Т-клетках и первичных лимфоцитах чело века выявили активацию транскрипции вирусного генома в последних и отсутствие влияния в покоящихся Т-лимфоцитах [11]. Интересно, что в ряде опытов по мутагенезу гена nef-2 ВИЧ-2 установлено, что его инактивация приводит к усилению репликации в Т-клетках, но не вли яет на репликацию вируса в первичных макрофагах. Похоже, что ген nef у ВИЧ-2 играет более важную роль для утверждения латентности инфекции, чем у ВИЧ-1. Тканеспецифический характер действия nef ВИЧ-1 проявлялся при его экспрессии в трансгенных мышах — его био логическое действие на CD4+ Т-лимфоциты тимуса отлично от дейст вия на периферические Т-лимфоциты трансгенного животного [12]. В этих работах также обнаружено, что при трансформации nef ВИЧ-1 в мышиные клетки отмечается активация некоторых цитокинов. Однако в том случае, если Nef оказывает репрессивное действие на промотор ВИЧ-1, его влияние не критическое, и даже избыток функ ционального Nef в клетке не может полностью подавить транскрипции генов вируса. Но при этом существенно задерживается его репликация (в 2—4 раза) по отношению к вирусу с неактивным nef. Клоны ВИЧ, мутантные по nef, реплицируются эффективнее в сравнении с «диким» типом, у них более высокий уровень экспрессии антигенов gpl20 на J.SSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 7 поверхности инфицированной клетки. Известен пример, когда ^нерегу лируемая экспрессия Nef in trans по отношению к мутанту nef почти полностью подавляла синтез антигенов Env [5, 13]. Ряд авторов счи тает, что мутации nef могут менять культуральные свойства вируса от «медленного» типа к «быстрому» (более крутой временной профиль уровня вирусных антигенов и синцитийобразования в культуре клеток после инфицирования). Исходя из представленных на VIII Международном конгрессе по СПИД (1992 г.) результатов и опубликованных данных принято отно сить nef к преимущественно ранним регуляторным генам ВИЧ-1 и счи тать его усилителем экспрессии структурных белков вириона. Cis-элемент для J\fef-влияний в пределах LTR ВИЧ-1 не локализо ван, поскольку непосредственно с ним белок не^ взаимодействует [5]. Косвенно установленно, что областью его воздействия на 5'-LTR мо жет быть NRE (рис. 2). Некоторые мутации в этой области прерывают влияние Nef in trans на вирус так же, как LTR провирусов некоторых U3 R U5 Рис 2 Структура LTR ВИЧ-1 и расположение основных генетических сигналов в его пределах. Блоками показаны сайты узнавания ДНК LTR клеточными факторами. Участок, обозначенный NRE,— Negative Regulators Element; ENH—элемент ядерного фактора NF-карра-р (стимулирует транскрипцию гена бета-субъединицы каппа-цепи иммуноглобулинов) — главный энхансер промотора ВИЧ-1; 1А1 А —по следовательность промотора; NFAT - Nucleic Factor in Activated T-cells (считывает- ся репрессором LTR-транскрипции); URS —Upstream Repressive Sequence; USF — элемент Upstream Stimulating Factor; SP-1 —Stimulator of Promoter (элемент ба- зального фактора транскрипции). Цифры отвечают расстоянию в нуклеотидах выше точки старта транскрипции (сайт кэпирования мРНК ВИЧ). изолятов ВИЧ-1 (NRE вариабелен) не отвечают на такое воздействие [14, 15]. Клоны ВИЧ-1, выделенные из периферической крови больных с выраженным иммунодефицитом, часто не реагируют на влияние Nef in trans, что, возможно, в какой-то мере является дополнительным фак тором в патогенезе вирусоносительства [5]. Функциональные свойства Nef сходны с таковыми у ядерного фак тора р21 продукта гена ras, от которого косвенно зависит связывание с ДНК 'транскрипционного фактора АР-1 (комплекс продуктов гена c-jun и др.), влияющего на транскрипцию через ci's-элемент в области выше ТАТА-промоторов. Очевидно, что Nef модулирует активность транскрипционных факторов, подобных АР-1 [7], через каскад хими ческих модификаций клеточных регуляторов транскрипции. Некоторые авторы приписывали nef онкогенные свойства, сходные с sarc, но экс перименты не подтверждают этого [14, 16]. Установлено, что Nef влияет на экспрессию клеточных генов — он подавляет транскрипцию с промотора гена интерлейкина-2 (iL-2) в Т- лимфоцитах, интерферируя с сигналами, идущими от рецепторного ком плекса цитоплазматической мембраны Т-клеток [15]. Другими слова ми, Nef угнетает трансформирующие воздействия на инфицированную клетку извне. При таком воздействии Nef на Т-лимфоцит последний от вечает на внешние стимулы только синтезом альфа-цепи рецептора ин- терлейкина — iL-2R,a, и не индуцируется (как в норме) синтез iL-2. Для деления лимфоцита после индукции необходимо, чтобы iL-2 свя зался с высокоаффинным iL-2R на поверхности активированного лим фоцита. Это приводит к клонированию антигенузнающих лимфоцитов. Если в клетке экспрессируется Nef, то она может активироваться после 8 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 индукции антигеном только за счет iL-2 других клеток. По мере уве личения количества Л^/-экспрессирующих Т-клеток, т. е. уменьшения числа лимфоцитов с функциональной сигнал-индуцибельной системой, уменьшается тканевый пул доступного и необходимого для деления Т- клеток iL-2. Доказана также способность Nef подавлять синтез Т-кле- точного рецептора CD4, необходимого Т-хелперам и Т-киллерам для их функционирования (поддержания иммунотолерантности организма и эффективных «ответов» гуморального иммунитета на внедрение анти генов) [5]. Учитывая такие биологические механизмы воздействия Nef на Т-клетки, считают, что этому вирусному продукту может принадле жать значимая роль в разрушении CD4+ Т-клеточного звена иммунной системы наряду с другими цитопатологическими действиями вируса. Таким образом, Nef может влиять на экспрессию всего вирусного генома через транскрипционные факторы в определенных типах клеток, а также на экспрессию некоторых генов клетйи. Оба воздействия помо гают вирусу в некотором смысле избегать реагирования иммунной сис темы. Биохимический механизм такого влияния не расшифрован, хотя показана способность Nef фосфорилировать отдельные белки гетеро генного клеточного лизиса in vitro (однако отношение этого к цито-фи- зиологическим эффектам Nef не установлено) [16]. Сравнение аминокислотной последовательности Nef с данными бан ков белковых последовательностей выявило определенное соответствие его протяженного участка с пептидами яда скорпиона, взаимодейству ющими с калиевыми каналами клеточных мембран. Это структурное соответствие в некоторой мере подтверждено in vitro функциональным сходством: Nef слабо усиливал токи в калиевых каналах мембран ней ронов, взаимодействуя с последними [17]. Мы полагаем, что такой биофизический механизм цитопатичности ВИЧ-инфекции посредством Nef маловероятен. Также показано частичное соответствие нуклеотид- ной и аминокислотной последовательностей Nef последовательности ре цептора тиротропина человека. Антитела к этому рецептору проявляли кросс-реактивность к Nef [18]. В целом для ретровирусных геномов показано наличие подпоследовательностей, гомологичных известным генам клетки. Структурные белки ВИЧ включают короткие аминокис лотные мотивы, схожие с пептидами рецепторного аппарата лимфоци тов. В указанном случае в рамке считывания Nef также обнаружена хозяин-специфическая подпоследовательность. ВИЧ-1 не относят к «го рячим» ретровирусам, которые, встраиваясь в геном хозяина, активно рекомбинируют и «захватывают» внешние последовательности в состав своего генома. Но каждый случай гомологии вирусной последователь ности с клеточными генами может отражать отдаленную эволюцион ную связь ВИЧ с рекомбинационно-активными ретровирусами. Отсутствие сведений о клеточном аффекторе для Nef среди белко вых молекул клетки позволяет лишь рассуждать о гипотетическом суб страте для «Nef-кяназы». Но очевидным результатом действия этого вирусного белка на уровне Т-лимфоцитарной иммунной системы (как человеческой, так и мышиной) является элиминирование перифериче ских С04+-лимфоцитов и прежде всего ВИЧ-инфицированной их части. Ген vpu и его продукт. Белок Vpu — фосфопротеин с молекулярной массой 16 000, состоящий из 81 аминокислотного остатка. Рамка счи тывания vpu у всех клонов ВИЧ-1 перекрывается на несколько нуклео- тидов с N-концом рамки гена env [19]. Этот ген отсутствует в геноме ВИЧ-2 и других лентивирусов человека и приматов. Некоторые инфек ционные изоляты ВИЧ-1 (НХВ2, ВНЮ, Mai, Z6) утратили способность его экспрессировать. Белок имеет гидрофобный N-конец и ассоцииро ван за счет последнего с мембранами клетки. При экспрессии vpu в клетках in vitro значительные количества белка Vpu обнаруживаются в перинуклеарном пространстве, что характерно и для ВИЧ-инфициро ванных периферических лимфоцитов [19]. ^ Мутанты ВИЧ по vpu обладают в 5—10 раз меньшей репликатив- ной способностью и дают меньше зрелых вирионов. Анализ вирионов ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 9 мутанта одного изолята выявил нарушение процессинга коровых бел ков в них [20], при этом в другой работе показана продукция мутан том вирионов с нормальным по зрелости составом белков [19]. Клетки, зараженные мутантным по vpu ВИЧ, удерживают на кле точной мембране незрелые вирионы [21]. Экспрессия Vpu in trans no отношению к мутанту резко усиливает формирование синцитиев и ус коряет гибель инфицированных клеток [22]. Количество ассоциирован ных с клеткой вирионов при этом уменьшается, а их экспорт в среду возрастает. Эти in trans эффекты vpu, очевидно, и дали название его продукту — от Virion Pubertation. В публикациях сообщается также о взаимодействии Vpu с gpl20 внутри клетки. Считается, что Vpu может способствовать транспорту или встраиванию gpl20 в капсид вириона [6]. Мы же предполагаем наличие у этого белка свойств шаперонов (белков, определяющих про межуточные конформационные состояния у других незрелых белков в ходе их процессинга и модификации химическими группировками их аминокислотных остатков) или транспортных белков. Хотя имеющиеся на сегодня сведения о его компартментализации в клетке не подтверж дают такой гипотезы. Таким образом, функции Vpu связаны с созреванием и эффектив ным высвобождением инфекционных вирионов, из чего следует, что этот ген косвенным образом способствует межклеточной трансмиссии ВИЧ. Vpu синтезируется с матрицы, кодирующей также Env, поэтому его уровень в клетке регулируется Rev [22]. На основании этого vpu от носят к поздним вспомогательным генам ВИЧ-1. Ген vpr. В геноме ВИЧ-1 рамка считывания Vpr перекрывается слева с С-концом vif (рис. 1). Длина белка составляет 96 аминокислот ных остатков; первичная структура его гена высококонсервативна сре ди изолятов ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV. Ген Vpr относится к поздним белкам ВИЧ и синтезируется с собственной (моноцистронной) мРНК. Экспрес сия этой мРНК регулируется белком Rev. Пик уровня Vpr в клетке соответствует пику ревертазы. Последние два условия — основа для отнесения данного гена к поздним. Но белок является вирион-ассоции- рованным [24] и, таким образом, может выступать первым регулятор- ным белком в самом начале цикла репликации ВИЧ в клетке до тех пор, пока белки Tat и Rev не синтезируются de novo [25]. Некоторые клоны изолята HTLV 111В утратили функциональный vpr, но цитопатичность их нарушена слабо. Эксперименты с мутация ми ВИЧ-1 по vpr показали, что этот белок вполне заменим для репли кации ВИЧ [26], хотя все представители группы лентивирусов, коди рующие этот ген с функциональным фенотипом, реплицируются гораз до быстрее, чем мутантные по нему. Так, мутанты ВИЧ-1 по vpr отста ют в проявлениях цитопатичности и профиле активности ревертазы во времени от дикого вируса на 7—10 дней (в культуре клеток). Кроме того, они не способны продуктивно инфицировать первичные моноцит/ макрофаги. Однако при дифференцировке последних в миеломонобласт- ные линии вирус реплицируется. В этом случае правомочной выглядит гипотеза о поддержании активности вируса на ранней стадии инфек ции (иначе — индуцирование пермиссивности клетки) индукцией изме нений в клетке за счет вирион-ассоциированного Vpr. Тогда становятся объяснимыми отличия вирионов с нефункциональным фенотипом Vpr от «диких» и более «медленные» культуральные характеристики му тантов ВИЧ по этому гену. Установлено, что LTR ВИЧ-1 в отсутствие Vpr в три раза слабее отвечает на трансактивацию [25]. Вероятно, влияние белка на транскрипцию ВИЧ-1 не прямое, а опосредуется кас кадными регуляторными системами клетки. Подтверждением возможности влияния Vpr на течение клеточных процессов стало изучение его влияния на дифференцировку пролифе- рирующих клеток человека [27]. В этой работе показано, что вирус посредством Vpr может индуцировать дифференцировку клеток. Тогда при инфицировании лимфоцитов на пермиссибельной (образно говоря — 10 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 предпермиссибельной) для ВИЧ стадии их созревания будет отмечать ся истощение прогениторной части их популяции. Это наблюдается в некоторых случаях у ВИЧ-инфицированных на однойиз стадий виру- соносительства в форме высокого или нормального титра незрелых Т- лимфоцитов тимуса при дефиците их зрелых форм в периферической крови. Такая гипотеза о «лимфоцитопатичности» продукта vpr ВИЧ-1 выглядит правдоподобно. Считается, что этот ген необходим для репликации вируса в неко торых типах клеток. Аффекторная цепь действия Vpr с участием опре деленных клеточных регуляторных факторов неизвестна. Конечной ми шенью такой цепи, скорее всего, служат транскрипционные и энхан- серные сигналы промоторов лентивирусов или некоторых генов клетки. Ген vif. Молекулярная масса белкового продукта гена vif состав ляет 23 000, а его аминокислотная последовательность консервативна не только среди изолятов ВИЧ-1, но и ВИЧ-2, SIV и даже лентивиру- са Висны, что указывает на важность этой рамки считывания для мно гих лентивирусов, вызывающих иммунодефицита [28]. Белок Vif не обходим вирусу для эффективной трансмиссии свободных вирионов из среды в клетки CD4+. Отсюда пошло название продукта гена — белка Vif (Viral Infectivity Factor). На прямую трансдукцию вируса при меж клеточном контакте белок Vif не влияет [6, 30]. Vif не является струк турным вирион-ассоциированным элементом ВИЧ и не связан с мемб ранами клетки. Его относят к поздним регуляторным белкам. Белок синтезируется с собственной мРНК (рис. 1). Провирус клона ВИЧ-1, утративший vif, синтезирует то же количе ство белков и в той же мере цитопатичен, что и дикий клон. Продук ция и почкование его вирионов на поверхности инфицированной клет ки не нарушены, как и процессинг белковых продуктов структурных ге нов gag и env вируса. Но бесклеточные вирионы мутанта с нефункцио нальным фенотипом vif- в 1000 раз менее эффективно инфицируют клетки, чем вирионы дикого клона vif+, то есть характеризуются мед ленной кинетикой инфицирования клеток и, следовательно, репликации при незатронутой активности промотора [29]. Зрелые В-клетки не пер- миссивны для ВИЧ с генотипом vif-. Очевидно, Vif влияет на созревание и морфогенез вирионов [30] и, возможно, определяет клеточную специфичность вируса. Принято счи тать его, как и Vpr, важным для экспрессии структурных белков виру са в лимфоцитах на определенной стадии их развития. Ген rev. Последовательность открытой рамки считывания Rev кон сервативна среди изолятов ВИЧ-1 и составляет 116 аминокислотных остатков. Молекулярная масса белка 20 000. Все лентивирусы иммуно- дефицитов приматов и человека, а также HTLV-группа ретровирусов и вирус бычьего лейкоза (BLV) имеют в своем геноме эту открытую рам ку считывания. В 80-е годы, в самом начале изучения структуры гено мов лентивирусов, область, кодирующая неструктурные вирусные бел ки, была условно обозначена, как Х-район. Открытые рамки считыва ния этого района, кодирующие «витально» важные для вируса белки Rev и Tat, называли в зависимости от их протяженности X-SOR и X-LOR (Small Open Reading Frame, Large ORF). Взаимное располо жение экзонов, кодирующих эти рамки, и наличие интрона в них ха рактерно для всех перечисленных лентивирусов. Мутации в последних, приводящие к появлению нефункционального фенотипа белка, леталь- ны, и перечисленные вирусы в этом случае не способны эффективно ре ализовать свой инфекционный цикл. Rev — один из самых ранних белков ВИЧ. В первые часы после инфекции все транскрипты вируса в клетках практически полностью сплайсируются до малых безынтронных мРНК длиной .1,8—2,1 тыс. ос нований, кодирующих Nef, Tat и Rev. Позже в наборе вирусных транс- криптов происходит сдвиг в сторону несплайсированных и превалируют мРНК Gag и Env—наступает период продукции вирионов в остроин- фицированных клетках. Этот сдвиг определяется функцией регулятора fSSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 11 Rev [31, 32]. Пик синтеза Rev в клетке отмечен через 12 ч после ин фекции. Это критическое время перехода в цикле вирусной инфекции: на остропродуктивную стадию за счет сдвига сплайсинга и активации транскрипции вирусным трансактиватором [4]. У мутантов ВИЧ по гену rev этого перехода в фазе синтеза структурных белков из-за ре версии образцов сплайсинга не происходит. Такие провирусы дефектны и не дают продуктивной инфекции. Они также почти не проявляют ре- вертазной активности, нецитопатичны и синтезируют очень мало анти генов Gag и Env [32, 34]. Из всех мутантов ВИЧ по регуляторным бел кам мутанты по Rev наиболее дефектны в репликации вируса и уровне синтеза продуктов его гена gag [34]. Rev имеет доменную структуру и является фосфопротеином, хотя состояние фосфорилирования не определяет критически его регулятор- ной активности (мутации в области сайтов фосфорилирования не вли яли заметно на функции этого регулятора [35, 36]). Первый домен — N-концевая область белка — отвечает за связывание Rev с его cis-сай- том в РНК ВИЧ-1 —Rev Responsive Element (RRE). RRE — является районом мРНК в пределах рамки считывания гена env. Этот РНК-уз- нающий домен белка Rev лежит между 14-м и 56-м аминокислотным остатком [37]. Мутации в этой области приводят к появлению белка с рецессивно-негативным (неактивным) фенотипом [39]. Подобный функ циональный домен есть и у белка Tat ВИЧ. Эти два вирусных белка вместе с гомологичными у других лентивирусов образуют новое семей ство РНК-связывающих белков. В пределах этого же домена сущест вует аргинин-богатый мотив — с 35-го по 50-й аминокислотный оста ток, представляющий собой сигнал локализации в ядрышке [39, 40]. Мутации в этом районе гена rev также дают нефункциональный белок. Последовательности, фланкирующие остатки 35—50, отвечают за мультимеризацию Rev в присутствии RRE. Второй домен, или вто рая консервативная область Rev,— С-конец. Удаление 11 С-концевых аминокислот белка не влияет на его активность. Дальнейшее делетиро- вание С-конца гена дает нефункциональный Rev [41]. Под действием мутаций в этом районе возникает доминантно-негативный (неактивный) фенотип белка, который эффективно конкурирует in trans с Rev дико го вируса [37, 42—45]. В другой работе при делеции 14 С-концевых аминокислот способ ность Rev к гомодимеризации несколько изменялась, хотя он оставался функциональным и формировал димер в присутствии RRE [46]. Район, содержащий аминокислотные остатки 75—83, обусловливает взаимо действие Rev с клеточными факторами, влияющими на транспорт, ло кализацию или сплайсинг мРНК ВИЧ [47]. Этот домен определяется- как Rev Activation Domain. Хотя Rev локализуется в ядрышке, он не связан с процессами транскрипции и является посттранскрипционным регулятором экспрес сии структурных белков вирионов ВИЧ и других лентивирусов [48]. Фактически провирус с нефункциональным фенотипом rev~ синтезирует нормальное количество мРНК Gag и Env и на их соотношение в ядре не влияет. Но у 90 % клеток культуры, несущей такой провирус, вся £>ш-мРНК удерживается в ядре. У остальных 10 % клеток плотность этого транскрипта градиентно убывает от ядра к цитоплазме, и ни в одной из них не обнаружено диффузного распределения несплайсиро- ванных мРНК в отсутствие Rev. При котрансфекции в такие клетки функционального гена rev in trains в цитоплазме резко возрастает ко личество Env- и Gag-мРНК, а в культуральной среде в десятки раз увеличивается уровень вирусных антигенов — производных Env- и Gag- полипротеинов [49—51]. Транспорт несплайсированных мРНК в обход системы Rev — RRE слабодетектируем только на уровне антигенов Gag и Env. Для эффек тивного функционирования этой системы и нормального синтеза струк турных белков вируса необходим определенный уровень Rev в клетке. При низкой экспрессии Rev его функция как бы репрессирована. За- 12 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 висимость функции этого регулятора от его концентрации не линейна и существует критический порог, ниже которого влияние Rev ступен чато снижается [47]. Этот факт объясняет резкий временной переход от латентной фазы вирусного цикла к продуктивной фазе. В экспериментах по индукции экспрессии ВИЧ в культуре хрони чески инфицированных промоноцитов и Т-клеток установлено, что пе реход из относительно латентного состояния к интенсивной продукции вирионов происходит в меньшей мере из-за повышения уровня транс крипции с LTR-промотора, но в большей мере за счет сдвига в сплай синге [4]. Так, уровень общей транскрипции возрастал после индукции SL5 150 &А/ сл и с GA L SL4 4CY "41 J ~AAcA rue»?* g 'О A Jt§ 90 t I 8 &L2 i &0 .•Рис. 3. Предсказанная вторичная структура RRE ВИЧ-1 (изолят SF-2). Нуклеотиды от 1 до 240 отвечают нуклеотидам от 7770 до 8009 провирусной последовательности ВИЧ-1 изолята SF-2. SL (Stem-Loop structure) —субэлементы структурированной РНК; В и Л — части SL2. в 4—5 раз, тогда как количество несплайсированных мРНК — в 25— 30 раз и во столько же — продукция вирионов в клетках. При этом уровень множественно сплайсированных (не имеющих интронов) РНК увеличивался всего в 2—3 раза. При нормализации количества ВИЧ- транскриптов разных классов в клетке оказалось, что на одну копию несплайсированной мРНК ВИЧ в неактивированной клетке приходится 18 копий сплайсированных по первой ступени и по 9 копий двухкрат но сплайсированных молекул. При химической индукции клеток извне цифры становятся соответственно 25, 36 и 24. Таким образом, налицо действие Rev на несплайсированные РНК (усиление транспорта в ци топлазму или защита от сплайсинга), как и эффект порогового уровня Rev в клетке, так как многократное усиление его стабилизирующей роли превосходит трехкратное увеличение копий ^^-специфических мРНК. Действие Rev специфично в отношении мРНК ВИЧ за счет кон сервативности RRE. Этот чрезвычайно структурированный район РНК консервативен среди всех изолятов ВИЧ-1 [52—54], ВИЧ-2, а также SIV (рис. 3). Более того, гомологичные белки группы вирусов HTLV (7?ел;-регуляторы), как и белки-регуляторы SIV и ВИЧ-2 [44], узнают RRE ВИЧ-1, и такие гетерологичные системы отчасти функциональны [25, 45, 55, 56]. Однако здесь и далее следует подчеркнуть, что c/s-элементы (RRE-X) в мРНК эволюционно близ ких BLV или HTLV смещены в правый конец вирусного генома в района З'-LTR и не принадлежат кодирующим участкам или нитро нам, как в случае ВИЧ. Таким образом, Rev не влияет на экспрессию или сплайсинг кле точных мРНК. Учитывая неполное соответствие нуклеотидных после- ISSN 0233-7657, БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 13 довательностей RRE и аминокислотных последовательностей Rev меж ду группами ВИЧ-1, ВИЧ-2, BLV, HTLV и SIV, но в то же время воз можность функционирования гетерологичных систем (Rex — Rev или Rev — RxRE), предполагалось, что RRE узнается на уровне вторичной структуры РНК [57]. В дальнейших исследованиях структуры RRE в его полноразмерной последовательности (длина свыше 240 нуклеоти- дов) был вычленен более короткий структурированный участок РНК (88 оснований) с очень высокой аффинностью к Rev, функционально активный in vivo [58, 59]. Две тандемные копии этого укороченного RRE в составе мРНК функционировали как полноразмерный элемент. Детерминирован минимальный сайт RRE размером в несколько нук- леотидов, узнаваемый Rev на уровне первичных последовательностей РНК in vitro [60—62]. Он представляет собой неспаренный участок («выпячивание») — дисторцию — по ходу двухспиральной структуры РНК с парами оснований G — G и G — А [63]. Атомные группы ами нокислотных остатков Rev узнают рибозный остов и основания внутри главного расширенного желобка двойной спирали. Замена нуклеоти- дов в этом сайте более существенно сказывается на функции RRE, чем мутации в других районах структурированной РНК. RRE расположен в пределах интрона мРНК ВИЧ, а знание роли Rev для лентивирусов обнаруживает его причастность к процессам сплайсинга и транспорта их транскриптов. Взаимодействие факторов сплайсинга с транскриптами не приводит к мгновенному высвобожде нию зрелых мРНК, и такие промежуточные продукты удерживаются в ядре в виде детектируемых сплайсом. Опыты по внедрению RRE в гетерологичные гены с последующей их трансфекцией в клетки выяви ли явное блокирование их экспрессии в цитоплазме и задержку в ядре. То есть RRE может нести в себе элементы, отвечающие за блок транс порта мРНК в цитоплазму. RRE использован рядом авторов в созда нии генноинженерных конструкций для экспрессии генетической инфор мации под контролем белка Rev как вирусного продукта (патентные разработки анти-ВИЧ генотерапии). Это позволило авторам реализо вать принцип обратной связи при экспрессии рекомбинантных генов (гены иммуноцитотоксинов и дифтерийного токсина, «помогающие» им мунной системе узнавать пораженные вирусом Т-клетки и бороться с инфекцией в инфицированной клетке) с уровнем вирусных продуктов в этой клетке. В пределах геномных транскриптов ВИЧ известно, по крайней ме ре, три участка, критически влияющих на их транспорт из ядра в ци топлазму в несплайсированном виде. Участки расположены в границах интрона +5600... +7900. Это два негативных элемента, определяющих удерживание мРНК в ядре (+5700...+7330 и +7740.. .+7920), и позитивный (RRE, +7330... +7700) (номера нуклеотидов соответству ют ДНК целого провируса клона НХВ2). После удаления этих элемен тов в составе интронов в ходе сплайсинга мРНК легко транспортирует ся в цитоплазму без участия Rev. Но механизм действия Rev, похоже, не определяется сигналами сплайсинга и осуществляется параллельно самому процессу сплайсирования. В одних случаях удаление 5'-сигна- ла сплайсинга вместе с акцепторным нуклеотидом не влияло на функ ционирование комплекса Rev—RRE. Известно, что предсплайсинговый комплекс формируется и в отсутствие 5'-сайта за счет связывания с З'-сайтом в области донора. Такой транскрипт не может быть сплайси- рован. Поэтому следовало ожидать для мРНК ВИЧ, содержащей ука занные интроны и не имеющей акцептора, удерживания в ядре. Rev за счет RRE высвобождал такие мРНК из блока в ядре и способствовал их транспорту в цитоплазму и экспрессии. В других же случаях отсут ствие 5'-сайта влияло на функцию Rev [64]. Есть сообщения об узна вании З'-сайта сплайсинга белком Rev [65, 66]. Установлено также, что регулятор Rev косвенно продлевает пери од жизни несплайсированных мРНК ВИЧ в ядре независимо от нали чия сайтов сплайсинга (это имеет место и в случае BLV). 14 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 Но, с другой стороны, возникает вопрос, не являются ли негатив ные элементы в интронах сайтами для сплайсомных белков (эти^ эле менты расположены близко к сайтам сплайсинга). Кинетика сплайсин га не слишком высока, и сам его процесс может определять долю та кого блока экспрессии вирусных мРНК. А «сброс» транскриптов в ци топлазму в обход сплайсинга при посредстве Rev, возможно, обеспе чивает их стабильность и способствует экспрессии структурных белков. Есть сообщения о влиянии Rev на трансляцию RRE-содержащих мРНК (мессинджеров для белков Vif, Vpr, Env/Vpu) [22]. В работе [22] получены данные, отличающиеся от предыдущих по регуляторной роли Rev. В отличие от традиционно использованных ранее субгеном ных конструкций авторы исследовали экспрессию перечисленных RRE- содержащих мРНК на целом недефектном клоне ВИЧ в лимфоидных клетках. От Rev зависело цитоплазматическое накопление несплайси- рованной РНК, но он почти не влиял на однократно сплаисированные РНК. Однако Vif, Vpr, Env/Vpu не транслировались в отсутствие Rev в цитоплазме и не формировали полисом. Так или иначе, экспрессия геномной и субгеномной РНК ВИЧ блокировалась без Rev. Если не учитывать второстепенной регуляторной роли Rev на уровне трансля ции, противоречивым кажется отсутствие его влияния на мРНК, сплаи сированные по первой ступени и содержащие интрон с RRE. Подобные свойства этого регуляторного белка установлены для BLV. Здесь от сутствие функционального Rex не нарушало синтеза полипротеинов Епи этого вируса, транслируемых с однократно сплайсированного транс крипта, однако при этом снижался синтез антигенов gag, транслируе мых с геномного полноразмерного транскрипта. Но у BLV и вирусов группы HTLV crs-элемент лежит в Ш/^-области З'-LTR транскриптов и не принадлежит интронам. Перечисленные факты свидетельствуют больше в пользу экранирующе-транспортной роли /?еи-регулятора. Это же подтверждают наиболее поздние исследования структурных особен ностей rev — RRE-комплекса. Rev функционирует в виде димера или мультимера — более сложной четвертичной структуры, взаимодействуя в такой форме с клеточными белками [67]. Солидным антагонистом- репрессором функции дикого Rev является Rev-белок с поврежденным Rev Activation Domain, отвечающим за узнавание клеточных белков, но способный к мультимеризации в присутствии RRE, что косвенно указывает на взаимодействие мультимера с белками клетки. Такие функции Rev, как связывание с RRE и мультимеризация, можно раз граничить для разных структурных участков аминокислотной последо вательности регулятора. Хотя присущие ему свойства усиливаются в присутствии RRE [68]. Мультимер белка связывается с центральными петлями RRE и его флангами и формирует протяженные филаменты нуклеопротеина, что, вероятно, определяет недоступность транскрипта сплайсомам и влияет на его прохождение через поры ядра [61]. Счи тается, что мультимеризация Rev факультативна, хотя ^е^-мономеры менее активны [46]. Учитывая здесь «пороговый» эффект количества регулятора в клетке для его воздействия, а также молярное соотноше ние Rev/RRE, большее единицы в высокоаффинном комплексе, можно предположить кооперативное связывание глобул Rev на RRE (т. е. вто рая молекула белка усиливает прочность комплекса). Возможно, Rev не способен прямо влиять на факторы сплайсинга, но для формирова ния им нуклеосом с RRE-содержащими транскриптами важна их про тяженность и месторасположение его m-сайта в их пределах. Наряду с указанной ролью акцептора и 5'-сайта второй главной ступени сплайсинга РНК ВИЧ показана роль малых ядерных РНК в работе комплекса Rev — RRE, в частности Ш мяРНК, принимающих участие в сплайсинге [69]. Следовательно, хотя прЯхМое влияние Rev на сплайсинг не доказано, очевидны некоторая функциональная бли зость этого процесса и механизма действия Rev и то, что он сосредо точивает мРНК на себе в виде нуклеосом и, таким образом, делает транскрипты недоступными факторам сплайсинга. ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 15 Связывание белков ядерного экстракта лимфоцитов на колонке с пришитым Rev (/?ву-аффинность) показало специфическое взаимодейст вие только с фактором В23, который способствует транспорту рибосом- ных белков в ядро. В присутствии RRE стабильный комплекс В23 — Rev диссоциирует с образованием комплекса RRE — Rev [70]. Для других белков ядра высокоаффинного сродства к Rev пока не обнаружено. Была также проведена работа по поиску белков из экспрессиру- ющей библиотеки кДНК человека, специфически связывающихся с RRE. Выявили продукт массой 27 000. Этот белок эффективно связы вался с RRE и интерферировал с Rev, ингибируя репликацию ВИЧ-1 в клетках [71]. Оказалось также, что ген этого белка индуцируется интерфецонами альфа и гамма, ингибирующими экспрессию ВИЧ-1. Это открытие обнаружило один из возможных механизмов антивирус ной активности указанных интерферонов. Ген rev, являясь для ВИЧ жизненно важным и наиболее сущест венным наряду с Tat (регулятором репродукции вируса), служил объ ектом пристального внимания молекулярно-генетических лабораторий, изучавших в последнее десятилетие ВИЧ-1. К настоящему времени оче видным представляется механизм взаимодействия Rev с его q/s-сайтом RRE, как и его роль в судьбе транскриптов лентивирусов. Но роль кле точных факторов в этом взаимодействии остается гипотетичной (воз можно, по причине недостаточности сведений о системах сплайсинга и транспорта РНК в клетках). Поскольку Rev препятствует сплайсингу мРНК, он косвенно ре прессирует экспрессию самого себя, а также Tat и Nef. Матрица Rev сложная и состоит из трех экзонов, а рамка транс ляции перекрывает два экзона (рис. 1). Оба кодирующих экзона аб солютно необходимы для функционального Rev. Матрицы для регуля- торных белков Tat и Rev различаются. Сайт Козак рамки трансляции Tat имеет больший инициаторно-трансляционный потенциал, чем тако вой у рамки Rev [72, 73], и при наличии стартового кодона Tat выше рамки Rev в мРНК преимущественно транслируется Tat. Это соответ ствует теории сканирования рибосомой полицистронной мРНК, и с Tat- специфической мРНК белки Rev и Nef транслируются весьма слабо (хотя указанная мРНК полицистронна). Среди множественно сплай- сированных вирусных мРНК матрицы Rev представляют не более 20 %. Удельное количество матриц Rev в индуцированных лимфоцитах, ак тивно продуцирующих вирус, не превышает 6 % всех вирусных транс криптов в клетке [4]. Ген tat критически (как и rev) необходим в геноме ВИЧ и других лентивирусов для их репликации. Рамка трансляции белка Tat лежит в пределах тех же двух экзонов, что и рамка Rev, и перекрывается с ней со сдвигом (рис. 1). Tat является ранним белком всех лентивиру сов. В зависимости от изолята ВИЧ-1 длина белка варьирует от 86 до 101 аминокислоты, а масса соответственно — от 14 000 до 18 000 [74, 75]. Ген tat получил название от Viral Transcription Activator и является активатором промотора LTR ВИЧ. Tat — металлофосфопротеин, но его фосфорилирование не обяза тельно и не влияет критически на трансактивацию [76]. Фосфорилиро вание гомологичных белков у других лентивирусов иммунодефицитов человека и животных имеет относительное значение для их функции. Консервативный участок белка, включающий с 37-го по 48-й аминокис лотный остаток, считается металл-связывающим [77] и специфически взаимодействует с цинком. Этот участок вместе с предыдущим Cys-бо- гатым мотивом (с 22-го по 37-й аминокислотный остаток) отвечает за связывание Tat с клеточными факторами и определен, как Tat Activa tion Domain. Другой консервативный участок белка от 49-го до 57-го аминокислотного остатка отвечает за его транспорт в ядро и ядрышко- вую локализацию (Tat в основном локализован в ядрышке) [77, 78]. Кроме того, этот пептид способен слабо активировать транскрипцию. 16 ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № б В экспериментах по мутагенезу обнаружено, что первые 58 аминокислот могут в определенной мере трансактивировать LTR-направленную транскрипцию [74]. Пептид, соответствующий аминокислотным остат кам 58—72 (5'-конец первого кодирующего Га^экзона), высококонсер вативен среди всех изолятов ВИЧ и значительно усиливает транскрип цию с LTR-промотора ВИЧ [79, 80]. Мутации в районе остатков 22—37 формируют негативно-доминант ный фенотип белка Tat, конкурирующий как репрессор с диким функ циональным трансактиватором ВИЧ и подавляющий активацию транс крипции in trans. Мутации в других доменах tat приводят к появлению неактивного белка с рецессивным фе нотипом. Клоны ВИЧ, утратившие tat, ха рактеризуются низким уровнем транс крипции, цитопатичности и экспрессии антигенов. При слабодетектируемых иммунологически уровнях синтеза Gag и Env продукция вирионов практиче ски не обнаруживается, за исключени ем некоторых высокопермиссибельных культур клеток. Провирус такого де фектного клона не дает инфекционных вирионов [25, 81]. Мишень, через которую трансак тиватор ВИЧ-1 влияет на транскрип цию, представляет собой структуриро ванный участок РНК непосредственно на б'-конце всех его транскриптов (от сайта кэпирования мРНК до нуклео- Рис. 4. Структура элемента TAR ВИЧ-транс- криптов. Начало нумерации нуклеотидов со ответствует сайту кэпирования мРНК (старт транскрипции). Стрелками указаны возмож ные вариации консервативной последователь ности TAR (более или менее модулирующие уровень трансактивации) среди превалирую щих изолятов ВИЧ-1. Функционально важны трехнуклеотидное «выпячивание» и петля шпильки, а также расстояние между ними тида +58), названный Trans Activator Response element (TAR). Ми- нимальый TAR расположен между нуклеотидами +18 . . .+44 по отно шению к старту транскрипции (рис. 4) и соответствует верхней части шпильки + 1 . . .+60. TAR выступает в роли энхансера и это единствен ный известный случай РНК-энхансера транскрипции. Трансактивирую- щее действие Tat, таким образом, необычно [74, 82—86]. Tat и производные от него пептиды высокоаффинны к TAR [87], но до сих пор точно не установлено, что является пререквизитным для его функции — связывание с TAR или же предварительное узнавание Tat клеточными факторами перед связыванием с 5'-концом вновь син тезирующейся РНК ВИЧ в момент формирования шпильки TAR. Само же участие ядерных факторов в трансактивации LTR-направляемой транскрипции через TAR показано достаточно [86, 87]. В структуре TAR РНК (рис. 4) чрезвычайно важны трехнуклеотидное «выпячива ние» в шпильке и шестинуклеотидная петля. Белок Tat связывается с двухспиральнои частью шпильки и «выпячиванием», узнавая последнее своим аргининовым остатком по типу «аргининовой вилки» [82, 88—91J. Взаимодействие с клеточными факторами, усиливающими трансакти вацию, осуществляется непосредственно через петлю шпильки. Оба эти события абсолютно необходимы для трансактивации транскрипции, как JSSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № б 2—4-881 17 и взаимодействие Tat с его клеточными аффекторами — ядерньши бел ками. Белок-нуклеиновое узнавание Tat — TAR достаточно изучено на различных структурных уровнях, включая попытки электронной мик роскопии комплекса. Роль каждого нуклеотида в TAR-элементе рас смотрена на уровне активности всего LTR провируса и представлена в цифрах относительной трансактивации. Опуская подробное и емкое изложение структурных особенностей такого узнавания, отметим глав ный результат работы Tat — TAR-системы — критическое усиление транскрипции с ВИЧ-промотора в сотни и тысячи раз в сравнении с неактивированным LTR в отсутствие Tat [38, 83, 84, 92, 93]. При экзо генном введении Tat в клетки, несущие маркерный ген под контролем LTR ВИЧ, экспрессия возрастала более чем в 30 000 раз (при насы щении) [94]. До сих пор нет четких доказательств посттранскрипционного влия ния Tat на мРНК ВИЧ. Практически все эксперименты, подтвержда ющие такое влияние Tat на трансляцию, проведены на ооцитах Хепо- pus laevis, где условия отличны от таковых в ядре пермиссибельных для ВИЧ клеток [95—97]. Ряд последних работ, проведенных с клет ками HeLa, COS и др., опровергают посттранскрипционное влияние Tat [98]. Достоверно установлено только то, что присутствие TAR-элемен- та в мРНК между САР-сайтом и инициаторным кодоном снижает транс ляцию нижележащей открытой рамки считывания в 2—3 раза в клет ках человека за счет мощной вторичной структуры (или других фак торов, более или менее специфически узнающих эту структуру). Таким образом, несмотря на обнаруженные факты существенного влияния Tat на трансляцию TAR+ РНК в ооцитах Xenopus, в клетках человека такого посттранскрипционного влияния не выявлено. Очевид но, ооциты представляют собой уникальную систему трансляции, не воспроизводимую в других эукариотических клетках. Но все же пред полагаемые решения этого вопроса остаются противоречивыми. Промотор ВИЧ имеет сравнительно низкий базальный уровень транскрипции полноразмерных мРНК в отсутствие белка-энхансера, г его можно в целом охарактеризовать как слабый ТАТА-инициатор транскрипции. Кроме того, выше промотора в LTR расположена про тяженная и сложная по структуре генетических сигналов область NRE — Negative Regulation Elements (рис. 2). Эта область содержит мотивы в виде последовательностей ДНК, узнаваемых многими ядер ными факторами-репрессорами, а также двумя активаторами транс крипции. Главный энхансер вируса способен усиливать экспрессию его генов до трех раз на фоне действия трансактиватора и на порядок — в его отсутствие. Чрезвычайно сложная структура LTR ставит экспрес сию вирусных генов в значительную зависимость от условий (регуля- торных факторов) клетки-хозяина. Последнее означает конкуренцию факторов за близкорасположенные сайты узнавания в LTR ВИЧ и ин терференцию между собой. Такое строение генома вируса делает его уязвимым при отсутствии мощного трансактиватора, с одной стороны, но обусловливает высокочувствительное триггерное состояние его ла- тентности в клетке при наличии гена Tat — с другой. На основании большого количества работ по изучению влияния Tat на LTR-транскрипцию его действие представляется двояким и сво дится к усилению инициации транскрипции, а также ее процессивности. Некоторые исследователи указывают на то, что Tat влияет только на элонгацию транскрипции [92]. Действительно, уровень инициации транс крипции с LTR-промотора ВИЧ достаточно высок и в отсутствие Tat, но элонгация транскрипции в этом случае не дает продуктов длиннее (обнаружено в экспериментах) 60 нуклеотидов. Такие короткие транс крипты присутствуют в инфицированной клетке в значительном коли честве в отсутствие Tat. При экспрессии Tat короткие транскрипты поч ти исчезают, и в клетке критически возрастает синтез полноразмерных полиаденилированных мРНК ВИЧ [99]. С другой стороны, функция Tat вряд ли сводится к антитерминации транскрипции, поскольку не 18 \ ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 file:///ISSN обнаружено терминаторов в пределах R-области LTR, а клонирование этой области в другие гетерологичные транскрипционные единицы не влияло существенно на экспрессию генов независимо от Tat [83, 100J. Кроме того, Tat на фоне активации процессивной транскрипции увели чивает копийность лидерной (TAR) последовательности в клетке (ина че, уровень копий 5'-концевой 20-нуклеотидной последовательности в составе всех вирусных транскриптов в трансактивированной клетке вы ше такового в отсутствие Tat). Считают, что в действительности LTR ВИЧ при отсутствии Tat не может активно формировать транскрипци онные комплексы по типу РНК-полимераз II, способных эффективно элонгировать транскрипцию [101]. А детектируемые короткие транс крипты могут представлять собой остатки более длинных, случайно тер минированных транскриптов, стабилизированные вторичной структурой (шпилькой TAR) этого участка транскрипта и/или ядерными белко выми факторами, взаимодействующими с ней (например, протеинкина- зой, зависящей от двунитчатых РНК и активируемой некоторыми ин- терферонами [102]). Что касается элемента TAR, то он не похож ни на аттенюатор (как отмечено выше, его присутствие в других транскрипционных единицах не блокировало ощутимо экспрессию генов [101]), ни на энхансер, так как его действие строго определено ориентацией и критически зависит от расположения относительно промотора (при изменении оптималь- ного расстояния от TAR до TATA трансактивация резко снижается) [84]. Долгое время существовала дилемма, является TAR-структурой РНК или ДНК? Большинство работ убедительно подтверждает функ циональность TAR-PHK [103]. Связывание транскрипционных факто ров клетки с LTR провируса (ДНК) и трансактивация Tat — незави симые события. Сама структура TAR функционирует как вновь обра зованная (nascent) РНК, а на зрелые TAR-содержащие транскрипты (через отдельные TAR-PHK) Tat не оказывает влияния [74, 94J. В ра боте [104] была собрана уникальная конструкция — гибридный белок Tat/Rev, содержащий последовательность первого (трансактивирующе- го) экзона Tat и RRE-связывающий домен Rev. В транскрипционную единицу с маркерным геном под контролем LTR ВИЧ-1 на место уда ленного TAR клонировали RRE. Такая транскрипционная единица от вечала активацией транскрипции в ответ на экспрессию гибридного Tat/Rev. Аналогичная конструкция с другим белком, узнающим свою специфическую РНК, также трансактивировала гибридный промотор при наличии ds-элемента на месте TAR [105]. Это также подтвержда ет то, что TAR для Tat выступает фактором локации, местом связыва ния трансактиватора для его функционирования in situ. Позже были собраны аналогичные функциональные конструкции [106] с другими лоцирующими элементами, представляющими собой, как и в предыду щем случае, домены в составе Га^-гибридного белка, узнающие cis- сайты выше промотора. При наличии таких элементов в гибридном промоторе (выше TATA) и отсутствии TAR гибридные белки трансак- тивировали транскрипцию в пределах того же порядка, что и нативнал Tat — TAR-система. То есть TAR может замещаться как РНК-элемен тами ниже промотора, так и ДНК-сигналами выше промотора. А если специфический лоцирующий элемент TAR заместим, то клеточные фак торы, взаимодействующие с ним, могут влиять только на его связыва ние с трансактиватором, модулируя аффинность комплекса. Следова тельно, TAR-узнающие белковые факторы клетки выступают для про мотора вируса в роли медиаторов регуляторных изменений в клетке, а участие их в работе комплекса элонгации маловероятно. Стадия уз навания TAR трансактиватором в этом случае может быть условноли- митирующей [107]. Исходя из этого принято считать клеточный белок TRBR (Tat Response Binding Protein), или TRP-185, усиливающий трансактивацию, ранним клеточным регулятором экспрессии ВИЧ-1. Для него установлена первичная структура, картирован его ген в пре делах 12-й хромосомы человека, а также показано влияние клеточных ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 2* 19 кофакторов и Tat на его взаимодействие с TAR [108]. В свою очередь, влияние фосфокиназ лимитирует роль кофакторов TRBR [107J. Так сложно выглядит один из «векторов» клеточных воздействий на функ цию Tat и провирус в целом. Показано также, что TAR способен функционировать с различны ми промоторами РНК-полимеразы II, в том числе не содержащими ТАТА-инициатора [109]. В комплексе с промоторами других полиме- раз TAR не функционирует. Что касается элементов промотора, через которые Tat влияет на транскрипцию, то ряд авторов определяет в своих работах минималь ный Га/-индуцибельный промотор как ТАТА-инициатор в комплексе с TAR в пределах —40 . . .+60 LTR ВИЧ-1 [ПО]. Но величины транс активации у такой транскрипционной единицы при индукции Tat были «ниже на порядки, а в роли ТАТА-бокса выступал участок гетерологич- ного промотора. Так что результат можно трактовать как экстраполя цию. Другие авторитетные работы отрицают Га^-индуцибельность та кого минимального промотора, несмотря на наличие полноценного TAR [111]. Эти исследования роли ТАТА-инициатора и энхансера ВИЧ в индукции транскрипции Tat показали, что для эффективной работы TAR—Та/-системы необходимо еще присутствие в транскрипционной единице хотя бы одного из элементов базальных факторов инициации транскрипции (таких как Spl, API, Oct) или мотива энхансера (в том числе гетерологичного). При наличии энхансера ВИЧ-1 NF-kappa-p уровни, трансактивации выше, чем в присутствии его элементов Spl. Не менее важной зависимостью, установленной в подобных иссле дованиях [112], является то, что небольшие модификации в ТАТА-мо- тиве, не влияющие на связывание TATA-binding protein (фактор транс крипции TFIID) и не изменяющие существенно уровней базальной транскрипции, значительно воздействовали на масштабы Га^-трансак- тивации. Поскольку ТАТА-мотив и его фланги (элементы факторов) определяют состав комплекса инициации — элонгации транскрипции, то установленная зависимость утверждает связь между составом этого комплекса и функцией Tat. Обращает на себя внимание и «заинтере- соданность» Tat в энхансере NF-kappa-p, который также влияет на сос тав комплекса инициации транскрипции. Промотор ВИЧ содержит две копии этого энхансерного элемента, узнающегося факторами Rel-типа (содержащими ДНК-связывающую Rel-субъединицу в составе энхан- серного комплекса). В свою очередь, ВИЧ способен индуцировать экс прессию фактора NF-kappa-p в некоторых клетках [113]. От наличия (уровня) этого фактора, а также уровня его активированное™ (фос- форилирование) в. клетке зависит субъединичный состав энхансерного комплекса (и его активность). Похоже, что вирус при определенных условиях посредством факторов клетки индуцирует непрерывность ак тивации собственного промотора-энхансера. Но для культуры лимфоид- ных, клетрк установлено, что трансактивация LTR-направляемой транс крипции рекомбинантных последовательностей, наблюдаемая в первые часы после трансформации клеток геном tat в виде высокого пика, за тем существенно , снижается до порядков латентного состояния провй- руса з неактивированных клетках [114]. В случае трансформации кле ток провирусной ДНК (трансфекция) также отмечено уменьшение трансактивации рекомбинантной конструкции с LTR ВИЧ в те же ча сы после инфекции. Причем это не было связано со снижением уровня Га/-кодирующей мРНК. Таким образом, в клетке есть механизм об ратной связи, регулирующий активность кофакторов Tat и, следова тельно, LTR ВИЧ-1 через регуляторную цепь (каскад факторов), вклю чающую вирусный трансактиватор. Поскольку в работе [114] исполь зовали LTR-промотор ВИЧ с делецией всех ДНК-сигналов выше эн хансера (NF-kappa-p-элемент), мы полагаем, что именно клеточный ген субъединицы фактора NF-kappa-p занимает ключевое место в упомя нутой регуляторной цепи и в значительной мере определяет латентный 20 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1994. Т. 10. Дэ 5 период внутриклеточного цикла ВИЧ. Общеизвестным фактом для ВИЧ-инфекции лимфоцитов является то, что их активация антигенами (неспецифические или специфические инфекции ВИЧ-инфицированно го организма) вызывает резкое усиление репродукции ВИЧ и наруше ние латентности персистентной инфекции. Эта активация — следствие иммунного ответа клеток, который опосредуется NF-kappa-p-фактором. Но поскольку энхансер заместим для функции Tat, молекулярный ме ханизм его влияния на трансактивацию неясен. Установлена необычная способность элемента LTR ВИЧ направ лять синтез коротких транскриптов [109]. Этот элемент назван Induc tor of Short Transcripts (1ST). Неизвестно, каким образом функциони рует 1ST, как РНК или ДНК, но установлено, что он является не толь ко промотирующим, но и усиливающим элементом для нестабильных низк^опроцессивных транскрипционных комплексов. Иначе говоря, его активность как бы накладывается на активность промотора (ВИЧ или гетерологичного). 1ST расположен между нуклеотидами —5 . . .+82 от носительно старта транскрипции и перекрывается с TAR. Но мутации, нарушающие функциональность TAR, не. влияли на активность 1ST, следовательно, это разные структуры. Делетирование всего TAR сни жало базальный уровень транскрипции LTR и прекращало синтез ко ротких транскриптов. Вероятнее всего, действие 1ST накладывается на конститутивную активность LTR-промотора до тех пор, пока в его ра боту не включится Tat. Поскольку при этом резко снижается синтез корыких РНК, можно предположить, что транскрипционный комплекс, сформированный при участии 1ST, стабилизируется или модифициру ется действием Tat. Тогда короткие транскрипты как бы опосредуют (лоцируют) трансактивацию и затем утилизируются как старт для стабильной элонгации транскрипции модифицированным комплексом. Однако, скорее всего, сам Tat не влияет на слабые низкопроцессивные транскрипционные комплексы, а обусловливает формирование в облас ти TATA стабильных полимеразных комплексов по типу РНК-полиме- раз II. В этом случае короткие транскрипты могут играть роль акти ваторов промотора в присутствии Tat в виде «nascent» РНК и/или ре гуляторов промотора при низком уровне Tat в клетке (несколькими ав торами показано, что избыток TAR-транскриптов отвлекает на себя Tat и блокируют трансактйвацию в клетке [114, 115]). Такой механизм функционирования Tat — TAR-системы наиболее вероятен, хотя не ис ключена гипотеза о том, что ее влияние осуществляется на уже пре- формированном транскрипционном комплексе при прохождении им об ласти +59, и в этом случае Tat работает как ген-специфический фак тор элонгации [93]. Так или иначе, положительная роль коротких транскриптов (в ча стности, 1ST) показана. Интересно, что TAR в клетке существует, в ос новном, в виде нуклеопротеиновых частиц — комплексов с Tat. Число таких комплексов составляет около 104 на клетку [116]. То есть мРНК ВИЧ остается Га^-ассоциированной при транспорте в цитоплазму и фор мировании полисом. Период жизни мРНК в комплексах длиннее, чем у свободных транскриптов. Это может обусловливать наблюдаемые на уровне клетки эффекты посттранскрипционного потенцирования экс прессии генов вируса и повышенной утилизации его транскриптов при наличии Tat. Ключевым направлением активного изучения молекулярных меха низмов влияния Tat является поиск молекул, подвергающихся его воз действию в клетке. Уже обнаружено и изучено влияние трех таких бел ков, специфически аффинных к Tat. Первый белок, выделенный на Tat- аффинной колонке, потенцировал трансактивацию ВИЧ-LTR в клетках мышей [117]. Второй (TRP-1) изолировали из экспрессирующей биб лиотеки ДНК человека. Установлено, что он подавляет трансактивацию [118]. Третий, полученный как кДНК человека и названный MSSI, имет ет 42 % аминокислотной гомологии с TRP-1 и потенцирует действие Tat на репортерную конструкцию с ВИЧ-промотором [119]. ISSN 0233-7&57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 21 Поскольку не все среди открытых аффекторов Tat (и TAR-узнаю- щих кофакторов) достаточно изучены на генетическом уровне, трудно составить общую для них картину, основываясь на их функциональ ных свойствах. Чрезвычайно важным моментом в понимании выработанного эво люцией ВИЧ механизма трансактивации своих генов является опреде ление стадии транскрипции, на которой Tat воздействует на транскрип ционный комплекс. Суммируя известные результаты, мы пришли к вы воду, что, вероятнее всего, это — стадия сборки комплекса инициации — элонгации и/или инициация транскрипции. Это подтверждается боль шинством работ по изучению функции Tat и результатов его влияния на транскрипцию LTR ВИЧ, а также косвенно — рядом исследований свойств гибридных и гетерологичных систем, «нацеливающих» Tat на всевозможные транскрипционные единицы и репортерные конструкции с TAR и без него [110, 120—122] в ВИЧ-пермиссивных и непермиссив- ных клетках. Очевидно, что механизм влияния Tat на транскрипционный ком плекс реализуется через универсальную функцию (компонент) послед него и не устанавливает специфического альтернативного пути индук ции промотора-энхансера. По эффекту активирующего влияния на транскрипцию Tat похож на базальные факторы инициации транскрип ции (Transcription Factors Inducing Initiating) TFIIF и TFIIE (извест ные транскрипционные факторы классифицированы в ряд А, В, С, D, Е, F, H, J, S, ...). Фактор TFIIF необходим в транскрипционном ком плексе для эффективного функционирования Tat и (в случае избытка TFIIF в клетке) он активирует элонгацию транскрипции с ВИЧ-промо тора в отсутствие трансактиватора [123]. Так как этот фактор моби лизует мРНК-полимеразу в преинициирующий комплекс и является ли митирующим для Tat, похоже, что последний может действовать на факторы элонгации, связывающиеся с комплексом после TFIIF и поли- меразы (такие как Е, Н, J, S), или замещать их. Среди таких факто ров есть протеинкиназы и от Tat может зависеть химическая модифи кация элементов комплекса элонгации. Для Tat и некоторых других трансактиваторов родственных ретро- вирусов HTLV-группы установлены протоонкогенные свойства и транс формирующее действие на клетки [124]. В целом ВИЧ не следует рас сматривать как онкогенныи, хотя его трансактиватор на продуктивной стадии вирусного цикла может существенно влиять на синтез некото рых цитокинов (иммунокинов) в определенных типах лимфоцитов. Так, для Tat обнаружена способность усиливать синтез Tumor Necrosis Fac tor Betta (TNF-p), возможно, интерлейкинов 1 и 6 [125]. Таким обра зом, Tat может модулировать активность иммунных клеток. Активируя синтез TNF-p в В-лимфоцитах и их предщественниках, ВИЧ ингибиру- ет их антиген-индуцированную пролиферацию в периферической кро ви. Вместе с тем, этот цитокин (лимфотоксин) является фактором рос та для некоторых недифференцированных клеток (клетки саркомы Ка- поши), и ВИЧ-инфекция может усиливать возникшие неоплазии [12G], Установлено также, что Tat увеличивает синтез Transforming Growth Factor р>-1 (TGF-pi) первичными макрофагами костного мозга, что так же подавляет гемопоэз [127]. Tat способен репрессировать в клетках ген главного комплекса ги- стосовместимости (МНС) на уровне транскрипции [128]. При снижении количества молекул МНС 1 на поверхности лимфоцита он становится менее уязвимым для цитолиза цитотоксическими Т-клетками и, таким образом, вирус «скрывает» себя от клеточного иммунитета. В крови ВИЧ-носителей на определенной стадии обнаруживаются антитела к Tat. Внеклеточному трансактиватору приписывают свойства экзогенного трансформирующего агента (показан транспорт Tat в клет ки и их ядра [124, 129]). В экспериментах с культурами клеток Tat из культуральной среды, куда он экскретировался клетками Гя^-транс- формантами, утилизировался другими клетками, не имеющими гена 22 ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. Ш 5 tat. Последние несли в себе Га^-индуцибельную репортерную конструк цию, которая активировалась таким экзогенным Tat [130]. Это под тверждает возможность патофизиологических влияний ВИЧ-инфициро ванных лимфоцитов на соседние в субпопуляции (например, в плотно- локализованной популяции в строме лимфоидных органов). Рядом работ подчеркивается влияние TAR per se на функциониро вание интерферон-опосредованной системы защиты клетки от вирусных РНК (Double-Strand-RNA-Activated Inhibitor of Translation). Часть ав торов указывает на структуру TAR-РНК как мишень для этой защит ной системы клетки. Другие исследования утверждают ингибирующий эффект TAR на синтез интерферонов [102]. TAR является непротяжен ной и несовершенной двухспиральной структурой РНК, малопредстав- ленной в клетке в свободном виде. В работах по длительной суперэкс прессии TAR и анти-TAR РНК в культуре лимфоцитов метаболизм клеток не изменялся [114, 115]. Тем не менее, в ВИЧ-инфицированных лимфоцитах отмечается падение синтеза интерферонов, снижение уров ня Double-Strand-RNA-Activated Inhibitor, а также незначительно по вышается экспрессия 2'—5'-олигоаденилат-синтетазы в ответ на вве дение извне интерферона. (Хотя репликация ВИЧ ингибируется интер- феронами, особенно у-интерфероном.) Механизм разрушения интерфе рон-зависимой защиты вирусом здесь выглядит более сложным и, воз можно, включает TAR. Экспрессия и накопление Tat в остроинфицированной клетке, так же как и при хронической латентной инфекции, имеют ключевое зна чение для эффективной экспрессии всего вирусного генома и наступле ния активной продуктивной фазы его клеточного цикла. Очевидно, что накопление и влияние Tat должны предшествовать действию Rev, вслед за которым происходит переключение на синтез поздних структурных белков. Без достаточной степени трансактивации транскрипции Rev не функционирует эффективно, так как его накопление в ядре не дости гает порогового уровня. Принимая во внимание сведения о свойствах Tat, можно сделать вывод о том, что именно этот вирусный продукт ин дуцирует такие изменения в инфицированной клетке, которые утверж дают «права» его генома на инициацию цикла развития по пути латент ной персистенции или репродукции [131]. Интересно, что почти все группы ретровирусов человека, в том чис ле близкородственные (HTLV), имеют трансактиваторы с высокой ами нокислотной гомологией с Tat, но не имеют структуры, аналогичной TAR. Трансактивация у них осуществляется через ядерные белки, а сами они непосредственно с LTR не взаимодействуют. Криптический as-элемент для этих регуляторов также расположен в пределах U3- области LTR вблизи старта транскрипции [132]. Эти гетерологичные трансактиваторы связываются с TAR, но не способны трансактивиро- вать LTR ВИЧ-1. Возможно, из-за отсутствия элементов РНК-локации у этих гомологичных трансактиваторов они не обладают кросс-активно стью по отношению к LTR ВИЧ. Некоторые вирусы человека, не отно сящиеся к лентивирусам, также имеют собственные активаторы транс крипции, но Tat, действующий через РНК-мишень, уникален. Есть со общения об ингибировании активации транскрипции с LTR ВИЧ про дуктами гена Elk аденовируса и белками предранних генов вируса гер песа, что, по-видимому, указывает на общие клеточные факторы, мо- билизируемые промоторами перечисленных вирусов при участии ука занных вирусных белков [132]. Для трансактиватора ретровируса HTLV-1 уже установлен в об щих чертах молекулярный механизм воздействия на транскрипционный комплекс [135]. Трансактиватор Тах-1 усиливает димеризацию транс крипционных факторов и стабильность их' комплексов за счет взаимо действия с их субдоменами, содержащими основные аминокислоты (в частности, лейциновые домены). Эти же основные районы активирую щих транскрипцию факторов (ATF) определяют их связывание с ДНК в области cis-сайтов выше TATA. Активирующие транскрипцию факто- ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 23 ры, имеющие гомологичный ДНК-связывающий домен в виде последо вательности основных аминокислот, известный под названием Basic Zipper Region (b-ZIP), объединены в семейство ATF. Tax сильно сме щает равновесие между неассоциированными ATF и их комплексами в сторону димеров. Димеризация ATF является пререквизитной для их взаимодействия с ДНК и Тах-1, усиливая степень ассоциации димеров, существенно (на несколько порядков) снижает пороговые концент рации различных ATF в клетке, необходимые для активации транс крипции. На стабильность связывания транскрипционных факторов с ДНК Тах-1 не влиял. Соотносить результаты, полученные для Тах-1, с таковыми для трансактиватора Tat ВИЧ-1 можно только с большими ограничениями, так как as-элемент в промоторе HTLV мобилизует другой набор ATF при формировании энхансера транскрипции [135J, и другие структуры лоцируют трансактиватор. Но похоже, что здесь две соседние ветви эволюционного древа ретровирусов развивались в одном направлении, и итогом эволюционного отбора стали гомологичные системы регуля- торных вирусных белков. Tat транслируется с собственной мРНК (их три, рис. 1). Доля Tat- специфических мРНК среди всех малых множественно сплайсирован- ных мРНК ВИЧ для всех типов пермиссивных клеток во вес фазы ин фекции постоянна и не превышает 2—3 % (менее 1 % всех вирусных мРНК) [4]. Функциональные сайты в области старта трансляции Tat определяют высокую частоту трансляции его рамки в полицистронных мРНК. Спорной выглядит возможность синтеза укороченных форм Tat и гибридных форм Tat — Env, Tat — Rev (рис. 1), обладающих транс- активирующими свойствами (трансляция первого экзона дает отчасти активный белок) [4, 10, 133]. Кроме того, вирус синтезирует в очень малых количествах белок Tev, обладающий свойствами Tat [4, 76J. Белок Tev. В ряде работ по иммунологии СПИДа при фракциони ровании ВИЧ-специфических белков моноклональными антителами или сыворотками носителей ВИЧ-1 авторами обнаружен вирусный белок, реагировавший как с антителами к Tat, так и с антителами к Rev. Мас са белка составляла около 28 000. Позже была клонирована кДНК ука занного гибридного белка [4, 76], включающего экзоны Tat — Rev, a также экзон 6D (рис. 1), характерный только для этой специфической мРНК. Белок состоит из первых 57 N-концевых аминокислот Tat, не большого участка Env и 91 аминокислоты на С-конце, кодируемых вто рым экзоном Rev. Название белок получил как производное от Tatr Env и Rev (встречается также Tnv). Экспрессия такой кДНК in trans по отношению к taZ-индуцибель- ной транскрипционной единице (LTR-CAT) [4] показала, что Tev об ладает всеми свойствами Tat. Говорить о наличии у Tev функциональ ных свойств Rev трудно, так как оба экзона последнего абсолютно не обходимы, но RRE он способен узнавать. Наличие первого экзона Tat вряд ли компенсирует отсутствие первого экзона Rev. Белка Tev в клетке очень мало. На более поздних стадиях инфек ции его синтез подавляется на уровне сплайсинга белком Rev. Таким образом, можно предположить только слабое регуляторное действие его на ранней стадии репликации ВИЧ. Некоторые несущественные функции могут выполнять неполноразмерные и конъюгированные бел ки-химеры, производные альтернативного сплайсинга рамок считыва ния Tat и Rev (рис. 1). Перечисленные в последнем разделе обзора химерные белки ВИЧ следует рассматривать как пример побочных продуктов эволюции рет ро-геномов. Об остальных кратко охарактеризованных здесь вирусных продуктах можно судить как о генах эволюционного отбора. Принятое зарубежными авторами для этих шести определение Auxiliary genes (побочные или вспомогательные гены), пожалуй, нехарактерно для tat и rev — уникальных главнейших регуляторов экспрессии обширной группы лентивирусных геномов. Особенно это касается трансактива- 24 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. №• 5 тора Tat, которому в данном обзоре уделено основное внимание. Даль нейшее изучение этой «загадки» изобретательной и изменчивой приро ды ретровирусов может приблизить нас к пониманию важных меха низмов регуляции транскрипции в клетке. О. П. Кухаренко, А. Д. Швед РЕГУЛЯТОРН1 ГЕНИ В1Л ТА IX РОЛЬ У РЕАЛ13АЦН ГЕНОМУ Р е з ю м е В огляд1 наведено вщомосп щодо наукових публжащй з вивчення рол! та функцш дополпжних регуляторних гешв nef, vpu, vpr, vif, tat та rev В1Л-1 в його репродукцп. Увагу переважно прщилено генам tat, rev i ix продуктам як найвпливовшшм регуляторам активности В1Л-1 та шших представниюв групи лентив1рус1в, а також гену nef. Розглянуто можлив1 мехашзми впливу цих гешв на ексиресш npoBipycy за участю фактор1в юптин-хазяша та на ({нзюлопчьп процеси, що вщбуваються у BIJI-iii- фжованих клкинах. A. P. Kukharenko, A. D. Shved HIV-1 REGULATORY GENES AND THEIR ROLE IN THE VIRAL GENOME REALIZATION S u m m a r y Review summarises recent data related to the role and function of the auxiliary re gulatory genes nef, vpu, vpr, vif, tat and rev of HIV-1 in viral replication. We devoted attention rather to the tat, rev, nef and their products as to the main regulators of the realization of HIV-1 lentiviral genome. Possible mechanisms of influence of these viral products on proviral activity in couple with host-cellular factors are considered. Cy- topathophysiological effections of some viral regulatory proteins upon HIV-1 persisten- tion of permissible cells are also shortly reviewed. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Delassus S., Cheynier R., Wain-Hob son S. Evolution of HIV-1 nef and LTR sequ ences over 4 years in vivo and in vitro // J. Virol.— 1991.— 65, N 1.— P. 225—231. 2. Kaminchik J., Bashan N., Itach A. et at. Genetic characterization of HIV-1 nef gene products translated in vitro and expressed in mammalian cells // Ibid.— N 2.— P. 583—588. 3. Guy В., Riviere У'., Dott K. et at. Mutational analysis of the HIV nef protein / / Virology.—1990.—176.—P. 413—425. 4. Michael N. L., Morrow P., Mosca J. et al. Induction of human immunodeficiency virus type-1 expression in chronically infected cells is associated primarily with a shift in RNA splicing patterns // J. Virol.—1991.—65, N 3.—P. 1291 — 1303. 5. Laurent A. G., Hovanessian A. G., Riviere Y. et al. Production of the defective nef in HIV-1 infected СЕМ cells // J. Gen. Virol.—1990.—71, N 10.—P. 2273—2281. 6. Cullen B. R., Green W. C. Functions of the auxiliary gene products of the HIV-1 // Virology.—1990.—178, N 1.—P. 1—5. 7. Nebreda A. R., Bryan Т., Segade F. et al. Biochemical and biological comparison of HIV-1 NEF and ras gene products // Ibid.—1991.—183.—P. 151—159. 8. Kim S., Ikeuchi Kv Byrn R. et al. Lack of a negative influence on viral growth by the nef gene of HIV-1 / /Proc . Nat. Acad. Sci. USA.— 1989.—86.—P. 9544-9548. 9. Harnmes S. R., Dixon E. P., Matim M. H. et al. Nef protein of HIV-1: Evidence against its role as a transcriptional inhibitor // Ibid.— P. 9549—9553. 10. Bachelerie F., Alcami J., Hazan U. et al. Constitutive expression of HIV nef pro tein in human astrocytes does not influence basal or induced HIV LTR activity // J. Virol.— 1990.— 64, N 6.—P. 3059—3062. 11. Ronde A., Klaver В., Keulen W. et al. Natural HIV-1 NEF accelerates virus repli cation in primary human lymphocytes // Virology.— 1992.— 188.— P. 391—395. 12. Skowronski Т., Parks D., Mariani R. Altered T cell activation and development in transgenic mice expressing the HIV-1 nef gene/ /EMBO J.—1993.—12.— P. 703—713. 13. Ahmed N., Venkatesan S. Nef protein of HIV-1 is a transcriptional repressor of HIV-1 LTR // Science.—1988.—241, N 4872.—P. 1481—1485. 14. Cheng-Mayer C., Iannallo P., Shaw К et al. Differential effects of nef on HIV re plication: Implications for viral pathogenesis in the host // Ibid.— 1989.— 246, N 4937,—P. 1629—1633. ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 25 15. Laria S., Chambers I., Berg P. Expression of the HIV-1 Nef protein in T-cells pre vents antigen receptor-mediated induction of interleukin-2 messenger RNA // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1991.—88, N 12.—P. 5326—5330. 16. Poulin L.t Levy J. A., The HIV-1 nef gene product is associated with phosphoryla tion of a 46 kD cellular protein//AIDS.—1992.—6.—P. 787—791. 17. Werner Т., Ferroni S., Saermark T. et al. HIV-1 Nef protein exhibits structural and functional similarity to scorpion peptides interacting with K+ channels // Ibid.— 1991.—5.—P. 1301—1308. 18. Burch H. В., Nag у E. V., Lukes Y. G. et al. Nucleotide and amino acid homology between the human thyrotropin receptor and the HIV-1 Nef protein: identification and functional analysis // Biochem. and Biophys. Res. Communs.—1991.—181.— P. 501—505. 19. Strebel K., Klimkait Т., Maldarelli F., Martin M. A. Molecular and biochemical ana lysis of HIV-1 vpu g e n e / / J . Virol.—1989.—63, N 9.—P. 3784—3791. 20. Strebel K, KUmkait Т., Martin M. A. A novel gene of HIV-1, vpu, and its 16 kD product //Science.—1988.—241, N 4870.—P. 1221—1223. 21. Terwilliger E. F., Cohen E. A., La Y. et al. Functional role of HIV-1 vpu / /P roc . Nat. Acad. Sci. USA.—1989.—86.—P. 5163—5167. 22. Arrigo S. J., Chen I. Rev is necessary for translation but not cytoplasmic accu mulation of HIV-1 vif, vpr, and evn/vpu-2 RNAs // Genes and Dev.— 1991.—5, N 5.—P. 808—819. 23. Schwartz S., Felber B. /(., Fenyo E.-M., Pavlakis G. N. Env and Vpu proteins of HIV-1 are produced from multiple bicistronic mRNAs // J. Virol.—1990b.—64, N 11.—P. 5448—5456. 24. Cohen E. A., Dehni G., Sodroski / . G., Haseltine W. A. Vpr of HIV-1 is virion- associated regulator protein // Ibid.—1990.—64, N 6.—P. 3097—3099. 25. Shibata R., Tomoyuki M.t Masanori H. et al. Mutational analysis of the HIV-2 - genome in relation to HIV-1 and SIV (AGM) // Ibid.— N 2.—P. 742—747. 26. Ogawa K., Shibata R., Kiyomasu T. et al. Mutational analysis of the HIV vpr open reading frame // Ibid.—1989.—63, N 9.—P. 4110—4114. 27. Levy D. N.t Fernandes L. S., Williams V. W., Weiner D. B. Induction of cell dif ferentiation by HIV-1 vpr H Cell.—1993.—72.—P. 541—550. 28. Shibata R., Tomoyuki M.t Masanori H. et at. Complementation of the rev gene mu tation among human and simian lentiviruses // J. Virol.— 1990.— 64, N 5.— P. 2202—2207. 29. Golub E. I., Li G., Volsky D. J. Differences in the basal activity of the LTR deter- - mine different replicative capacities of two closely related HIV-1 isolates // Ibid.— N 8.— P. 3654—3660. 30. Sakai /(., Ma X. Y'., Gordienko I., Volsky D. S. Recombinational analysis of na tural noncytopathic HIV-1 isolate — role of the vif gene in HIV-1 infection kine tics and cytopathicity // Ibid.—1991.—65, N 11.—P. 5765—5773. 31. Felber В. К., Drisdale С. М., Pavlakis G. N. Feedback regulation of HIV-1 expres sion by the Rev protein // Ibid.— 1990.—64, N 8.—P. 3734—3741. 32. Terwilliger E., Burghoft R., Sia R. et al. The art gene product of HIV is required for replication // Ibid.—1988.—62, N 2.—P. 655—658. 33. Hammarskjold M.-L., Heimer /., Hammarskjold B. et al. Regulation of HIV-1 env expression by the rev gene product // Ibid.—1989.—63, N 5.—P. 1959—1966. 34. Sodroski /., Goh W., Rosen C. et al. A second posttranscriptional transactivator gene required for HTLV-III replication // Nature.—1986.—321.—P. 412—413. 35. Cochrane A. V., Golub E„ Volsky D. et al. Functional significance of phosphoryla tion to the HIV Rev protein // J. Virol.—1989.—63, N 10.—P. 4438—4440. 36. Hope T. J., McDonald D., Huang X. et al. Mutational analysis of the HIV-1 Rev transactivator: Essential residues near the amino terminus // Ibid.— 1990.— 64, N 11.—P. 5360—5366. 37. Zapp M. L., Green M. R. Sequence specific RNA binding by the HIV-1 Rev pro tein // Nature.—1989.—342, N 6250.—P. 714—716. 38. Sadaie M. R.f Benter Т., Woong-Staal R Site directed mutagenesis of two trans- regulatory genes (tat HI, trs) of HIV-1 // Science.— 1989.—239, N 4842.— P. 910—913. 39. Cochrane A. W., Perkins A., Rosen С A. Identification of sequences important in the nucleolar localization of HIV Rev: relevance of nucleolar localization to fun ction // J. Virol.—1990.—64, N 2.—P. 881—885. 40. Kubota S., Nosaka Т., Cullen B. et al. Effects of chimeric mutants of human im munodeficiency virus type-1 Rev and HTLV type-1 Rex on nucleolar targeting sig nals // Ibid.—1991.—65, N 5.—P. 2452—2456. 41. Hadzopoulou-Cladaras M., Felber B. K., Cladaras C. et al. The (trs I art) protein of HIV-1 affects viral mRNA and protein expression via a as-acting sequence in the env region // Ibid.—1989.—63, N 3.—P. 1265—1274. 42. Malim M. H., Bohnlein S., Hauber J., Cullen B„ R. Functional desection of the HIV-1 Rev trans-activator-derivation of a trans-dominant repressor of Rev fun ction // Cell.—1989.—58, N 1.—P. 205—214. 43. Rimski L., Dodon M. D., Dixon E. P., Greene W. С Trans-dominant inactivationj HTLV-1 and HIV-1 gene expression by mutation of the HTLV-1 Rex transactiva tor // Nature.—1989.—341, N 6241.—P. 453—456. 44 Dillon P J., Nelbock P., Perkins A., Rosen C. A. Structural and functional analysis of the HIV type-2 Rev protein // J. Virol.— 1991.— 65, N 1.—P. 445—449. 26 ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 45. Bohnhlein S., Pirker F. P., Hofer L. et at. Transdominant repressors for HTLV-1 Rex and HIV-1 Rev function // Ibid.—P. 81—88. 46. Daly T. /., Rennert P., Lynch P», Barry J. K. Perturbation of the carboxy termi nus of HIV-1 Rev affects multimerization on the rev responsive element // Bio chemistry.— 1993.—32.—P. 8945—8954. 47. Malim M. H., Cullen B. R. HIV-1 structural gene expression requires the binding of multiple rev monomers to the viral RRE-implications for HIV-1 latency // Cell.—1991.—65, N 2.—P. 241—248. 48. Felber B. K, Hadzopoulou-Cladaras M., Cladaras C. et al. Rev protein of HIV-1 affects the stability and transport of the viral mRNA // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1989.— 86, N 5.—P. 1495—1502. 49. Knight D. M., Flomerfelt F. A., Ghrayeb G. Expression of the Art/Trs protein of HIV and study of its role in viral envelop synthesis // Science.— 1987.— 236.— p. 837—840. 50. Enter man M., Vaseux R., Reden K. The Rev gene product of the HIV affects enve lop specific RNA localization // Cell.—1989.—57, N 6.—P. 1155—1162. 51. Kim J. H., Kaufman P. A., Hanly S. M. et al. Rex transregulation of human T-cell leukemia virus type-II gene expression//J. Virol.— 1991.— 65, N 1.— P. 405—414. 52. Rosen C. A., Terwilliger E., Dayton A. et al. Intragenic as-acting art gene res ponsive sequences of the HIV // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1988.—85, N 7.— P. 2071—2075. 53. Malim M. H., Hauber J., Shu-Yun he et al. The HIV Rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA // Nature.—1989.—338, N 6212.—P. 254—257. 54. Dayton E. Т., Powell D. M., Dayton A. I. Functional analysis of CAR, the target sequence for the Rev protein of HIV-1 // Science.—1989.—246, N 4937.—P. 1625— 1628. 55. Lewis N., Williams J., Rekosh D., Hammarskjold M. Identification of a c/s-acting element in human immunodeficiency virus type-2 (HIV-2) that is responsive to the HIV-1 Rev and human T-cell leukemia virus type-I and type-II Rex proteins// j . Virol.—1990.—64, N 4.—P. 1690—1697. 56. Yip M., Dynan W., Green P. et al. HTLV Type-II Rex protein binds specifically to RNA sequences of the HTLV LTR but poorly to the HIV type-1 #ea-responsive element // Ibid.—1991.—65, N 5.—P. 2261—2272. "57. Daly T. J., Cook S., Grey G. S., et al. Specific binding of HIV-1 recombinant Rev protein to the Яеи-responsive element in vitro // Nature.—1989.— 342, N 6251.— P. 816—819. 58. Huang X. J., Hope T. J., Bond B. L. et al. Minimal Rev-response element for type-1 HIV // J. Virol.—1991.—65, N 4.—P. 2131—2134. 59. Cook K. S., Fisk G. J., Hauber J. et al. Characterization of HIV-1 Rev protein- binding stoichiometry and minimal RNA substrate // Nucl. Acids Res.—1991.— 19, N 7.—P. 1577—1583. 60. Karn J., Dingwall C, Finch T. RNA binding by the tat and rev proteins of HIV-1 // Biochimie.— 1991.— 73.— P. 9—16. 61. Heaphy S., Finch J. Т., Gait M. J. et at. Human immunodeficiency virus type 1 regulator of virion expression, rev, forms nucleoprotein filaments after binding to a purine-rich «bubble» located within the rea-responsive region of viral mRNAs // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1991.— 88 — P. 7366—7370. 62. Holland S. M., Chavez M., Gerstberger S., Venkatesan S. A specific sequence with a bulged guanosine residue S' in a stem-bulge-stem structure of Rev-responsive element RNA is required for trans activation by human immunodeficiency virus type 1 Rev // J. Virol.—1992.—6.—P. 3699—3706. 63. Iwai S., Pritchard C, Mann D. A., et al. Recognition of the high affinity binding site in Rev-response element by the HIV-1 Rev protein // Nucl. Acids Res.— 1992.— 20, N 24.— P. 6465—6472. 64. Lu Y., Touzjian N., Stenzel M. et al. Identification of c/s-acting repressive sequen ces within the negative regulatory element of HIV-1 // J. Virol.— 1990.— 64, N 10.—P. 5226—5229. 65. Chang D. D., Sharp P. A. Regulation by HIV rev depends upon recognition of splice sites // Cell.—1989.—59.—P. 789—795. 66. Chang D. D., Sharp P. A. Messenger RNA transport and HIV rev regulation // Science.— 1990.— 249.— P. 614—615. 67. Kjems J., Brown M., Chang D. D., Sharp P. A. Structural analysis of the intera ction between the HIV Rev protein and the Rev response element // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1991.—88, N 3.—P. 683—687. 68. Olsen H. S., Cochrane A. W., Dillon P. J. et al. Interaction of the human immuno deficiency virus type 1 Rev protein with a structured region in env mRNA is dependent on multimer formation mediated through a basic stretch of amino acids // Genes and Dev.—1990.—4.—P. 1357—1364. 69. Lu X., Heimer J., Rekosh D., Hammarsjold M.-L. Ul small nuclear RNA plays a direct role in the formation of a rey-regulated HIV evn mRNA that remains unspli- sed // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1990.—87.—P. 7598—7602. 70. Fankhauser C, Izaurralde E.t Adachi Y. et al. Specific complex of human immuno deficiency virus type-1 Rev and nucleolar B23 proteins-dissociation by the Rev response element // Mol. and Cell. Biol.— J991.—11, N 5.—P. 2567—2575. ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 27 71. Constantoulakis P., Campbell M., Felber В. K. et al Inhibition of #eu-mediated expression by an RNA binding protein encoded by the interferon-inducible 9—27 gene // Science.—1993.—259, N 5099.—P. 1320—1323. 72. Robert-Guroff M., Popovic M., Gartner S. et al. Structure and expression of tat-, rev- and /w?/-specific transcripts of HIV-1 in infected lymphocytes and macropha ges // J. Virol.— 1990.—64, N 7.—P. 3391—3398. 73. Schwartz S., Felber B. K., Benko D. M. et al. Cloning anc functional analysis of multiply splised mRNA species of HIV-1 // Ibid.—N 6.—P. 2519—2529. 74. Berkhout В., Silverman R. H., Jeang K.-T. Tat transactivate HIV-1 through a nascent RNA target // Cell.—1989.—59, N 2.—P. 273—282. 75. Wright C. M., Felber B. K., Paskalis H., Pavlakis G. N. Expression and characte rization of the trans-activator of HTLV-III/LAV virus // Science.—1986.—234.— P. 988—992. 76. Benko D. M., Schwartz S., Pavlakis G. N., Felber В. К A novel HIV-1 protein, tev, shares sequences with tat, env, and rev proteins // J. Virol.— 1990.—64, N 6.—P. 2505—2518. 77. Sadaie M. R., Mukhopadhyaya R., Benaissa Z. N. et al. Conservative mutations in the putative metal-binding region of HIV tat disrupt virus replication // AIDS Res. and Human Retrovir.—1990.—0, N 11.—P. 1257,—1263. 78. Gitlin S., Lindholm P., Marriott S., Brady J. Transdominant HTLV type-I TAXI mutant that fails to localize to the nucleus // J. Virol.—1991.— 65^ N 5.— P. 2612—2621. 79. Green M.t Ishio M., Loewenstein P. AT. Mutational analysis of HIV-1 Tat mini mal domain peptides: identification of trans-dominant mutants that suppress HIV- LTR-driven gene expression // Cell.—1989.—58, N 1.—P. 215—223. 80. Carroll R., Martarano L., Derse D. Identification of lentivirus Tat functional do mains through generation of equine infectious anemia virus/HIV-1 tat gene chi meras // J. Virol.—1991.—65.—N 7.—P. 3460—3467. 81. Feinberg M. В., Jarrett R. F., Aldovini A. et at. HTLV-III expression and produ ction involve complex regulation at the levels of splising and translation of viral RNA // Cell.—1986.—46, N 6.—P. 807—817. 82. Feng S., Holland E. C. HIV-1 tat transactivation requires the loop sequence wit hin TAR // Nature.—1988.—334, N 6178.—P. 165—1в7. 83. Hauber J., Perkin A., Heimer E. P., Cullen B. R. Transactivation of HIV gene expression is mediated by nuclear events / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1987.— 84.— P. 6364—6368. 84. Jakobovits A., Smith D. H., Jakobovits A., Capon D. L. A discrete element 3 ' of AIV-1 and HIV-2 mRNA initiation sites mediates transcriptional elonga tion by an HIV trans activator // Mol. and Cell. Biol.—1988.—8, N 6.— P. 2555—2561. 85. Selby M. J., Bain E. S., Luciw P. A., Peterlin В. М. Structure, sequence and po sition of the stem-loop in TAR determine transcriptional elongation by Tat through the HIV-1 LTR // Genes and Dev.—1989.—3.—P. 547—558. 86. Selby M. J., Peterlin В. М. Transactivation by HIV-1 Tat via heterologous RNA binding protein // Cell.—1990.—62, N 4.—P. 769—776. 87. Gatignol A., Buckler-White A., Berkhout В., Jeang K.-T. Characterization of a human TAR RNA binding protein that activates HIV-1 LTR // Science.—1991.— 251, N 5001.—P. 1597—1602. 88. Weeks K. M., Amp* C, Schults S. С et al. Fragments of the HIV-1 Tat protein specifically bind TAR RNA // Ibid.—1990.—249, N 4974.—P. 1281—1285. 89. Cordingley M. G., LaFemina R. L., Callahan P. L. et al. Sequence-specific intera ction of Tat protein and Tat peptides with the transactivation-responsive sequence element of HIV-1 in vitro // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1990.—87, N 22.— P. 8985—8989. 90. Roy S., Parkin N. Т., Rosen C. et al. Structural requirements for trans activation of HIV-1 LTR-directed gene expression by tat: importance of base pairing, loop sequence, and bulges in the /a^-responsive sequence // J. Virol.— 1990.— 64, N 3.— p. 1402—1406. 91. Weeks K. M„ Crothers D. M. RNA recognition by Tat-derived peptides: Interaction in the major groove // Cell.— 1991.— 66, N 3.—P. 577—588. 92. Kao S., Calmon A., Luciw P., Peterlin Я. Antitermination of transcription within the LTR of HIV-1 by tat gene product // Nature.—1987.—330.— P. 489—493. 93. Rice A. P., Mathews M. B. Transcriptional but not translational regulation of HIV-1 by the tat gene product // Ibid.— 1988.—332.—P. 551—553. 94. Feinberg M. В., Baltimore D., Frankel A. D. The role of Tat in HIV life cycle indicates a primary effect on transcriptional elongation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1991.—88, N 9.—P. 4045—4049. 95 Braddock M., Shambers A., Wilson W. et al. HIV-1 Tat «activates» presynthesized RNA in the nucleus // Cell.—1989.—58.—P. 269—279. 96. Braddock M., Therburn A. M., Chambers A. et al. A nuclear translational block imposed by the HIV-1 U3 region is relieved by the 7a/-TAR interaction // Ibid.— 1990.— 62, N 6.—P. 1123—1133. 97. Braddock M., Therburn A. M., Kingsman A. J., Kingsman S. M. Blocking of I n dependent HIV-1 RNA modification by an inhibitor of RNA polymerase-H proces- sivity // Nature.— 1991.—350, N 6317.—P. 439—441. 28 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1954. Т. 10. № 5 98. Chin D. /., Selby M. /., Peterlin В. M. HIV-1 Tat does not transactivate mature trans-acting responsive region RNA species in the nucleus or cytoplasm of prima te cells // J. Virol.—65, N 4.—P. 1758—1764. 99. Laspia M. F., Rice A. P., Mathews M. B. HIV-1 Tat protein increases transcrip tional initiation and stabilizes elongation // Cell.—1989.—59, N 2.—P. 283—292. 100. Cullen B. R. .Trans-activation of HIV occurs via a bimodal mechanism // Ibid.— 1986.—46, N 7.—P. 973—982. 101. Greenblatt J., Nodwell J. R., Mason S. W. Transcriptional antitermination // Na ture.— 1993.—364, N 6436.—P. 401—406. 102. Gunnery S., Rice A. P., Robertson H. D., Mathews M. В. Т at-responsive region RNA of HIV-1 can prevent activation of the double-stranded-RNA-activated protein kinase // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1990.—87.—P. 8687—8691. 103. Berkhout В., Gatignol A., Rabson А. В. TAR-independent activation of the HIV-1 LTR: Evidence that Tat requires specific regions of the promoter//Cell.— 1990.— 62, N 4.— P. 757—767. 104. Southgaie C, Zapp M. P., Green M. R. Activation of transcription by HIV-1 Tat protein tethered to nascent RNA through another protein // Nature.— 1990.— 345.— p. 640—644. 105. Selby M. J., Peterlin В. М. Transactivation by HIV-1 Tat via a heterologous RNA binding protein // Cell.—1990.—62.—P. 769—776. 106. Kamine J., Chinnadural G. Synergistic activation of the human immunodeficiency virus type ) promoter by the viral Tat protein and cellular transcription factor Spl // J. Virol.—1992.—66.—P. 3932—3936. 107. Han X. M., Laras A., Rounseville M. P. et al, Human immunodeficiency virus type 1 ^/-mediated transactivation correlates with the phosphorylation state of a cellular TAR RNA stem-binding factor // Ibid.—P. 4065—4072. 108. Wu F., Garcia /., Sigman D., Gaynor R. tat regulates binding of the human immu nodeficiency virus trans-activating region RNA loop-binding protein TRP-185 // Genes and Dev.— 1991.— 5.— P. 2128—2140. 109. Ratnasab apathy R., Sheldon M., Johal L., Hernandez N. The HIV-1 LTR contains an unusual element that induces the synthesis of short RNAs from various messen ger RNA and snRNA promoters // Ibid.—4, N 12A.—P. 2061—2074. 110. Han P., Brown R., Barsoum /. Transactivation of heterologous promoters by HIV-1 tat H Nucl. Acids Res.—1991.—19.—P. 7225—7229. 111. Berkhout В., Jeang К. Т., Functional roles for the TATA promoter and enhancers in basal and TaMnduced expression of the human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat / / J . Virol.—1992.—66.—P. 139—149. 112. Olsen H. S., Rosen C. A. Contribution of the TATA motif to Га^-mediated trans criptional activation of human immunodeficiency virus gene expression // Ibid.— P. 5594—5597. 113. Bachelerie F., Alcami J., Arenzana-Seisdedos F. et al. HIV enhancer activity per petuated by NF-kappa-P induction on infection of monocytes // Nature.— 1991.— 350.—P. 709—712. 114. Sullenger B. A., Gallardo F. H.} Ungers G. E., Gilboa E. Overexpression of TAR sequences renders cells resistant to HIV replication // Cell.— 1990.— 63, N 2.— P. 601—608. 115. Grahem G. J., Maio J. J. RNA transcripts of the HIV TAR element can inhibit action of the viral transactivator // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1990.—87.— P. 5817—5821. 116. Pfeifer K., Bachmann M., Schroder H. C. et al. Formation of a small ribonucleo- protein particle between Tat protein and trans-acting response element in human immunodeficiency virus-infected cells // J. Biol. Chem.— 1992.— 226.— P. 14620— 14626. 117. Desai K., Loewenstein P. M, Green M. Isolation of a cellular protein that binds to the HIV-1 Tat protein and can potentiate transactivation of the viral promo ter // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1991.—88.—P. 8875—8879. 118. Nelbock P., Dillon P. S., Perkins A., Rosen C. A. cDNA for a protein that inte racts with the HIV-1 Tat transactivator // Science.—1990.—248.—P. 1650—1653. 119. Shibuya H., Irie K., Ninomiya-Tsuji J., Goebl M. et al. New human gene encoding a positive modulator of HIV Tatf-mediated transactivation // Nature.— 1992.— 357.—P. 700—702. 120. Kim I. S. TAR-independent transactivation of the murine cytomegalovirus major immediate-early promoter by the Tat protein / / J . Virol.— 1993.— 67, N 1.— P. 239—248. 121. Taylor J. P., Pomerantz R.f Bagasra O., Chowdhury M. et al. TAR-independent transactivation by Tat in cells derived from the CNS: a novel mechanism of HIV-1 gene regulation // EMBO J.— 1992.—11.—P. 3395—3403. 122. Remenick J., Radonovich M. F., Brady J. N. Human immunodeficiency virus Tat transactivation: induction of a tissue-specific enhancer in a nonpermissive cell line // J. Virol.—1991.—65.—P. 5641—5646. 123. Kato H., Sumimoto И., Pognonec Ph. et al. HIV-1 Tat acts as a processivity fac tor in vitro in conjunction with cellular elongation factors // Genes and Dev.— 1992.—6, N 4.—P.'655—666. 124. Ensoli В., Barillari G., Salahuddin S. Z. et al. Tat protein of HIV-1 stimulates growth of cells derived from Kaposi's sarcoma lesions of AIDS patients // Na ture.—1990.—345.—P. 84—87. ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5 29 125. Zauli G., Furllni G., Milani D. et al. HIV-1 Tat protein stimulates the production of interleukin-6 by peripheral blood monocytes // Microbiologica.—1993.—16, N 2 . - P . 115—120. 126. Sastry K. J., Reddy R. H. R., Pandita R. et al. HIV-l tat gene induces tumor necrosis factor-p (lymphotoxin) in a human ZMymphoblastoid cell line // J. Biol. Chem.—1990.—265, N 33.-P. 20091-20093. 127. Zauli G. Tat protein stimulates production of TGF-beta by marrow makrophages: a potential mechanism for HIV-1 induced hematopoietic supression // Blood.— 1992.—80, N 12.—P. 3036—3043. 128. Howcroft T. K., Strebel R., Martin M. A., Singer D. S. Repression of MHC class I gene promoter activity by two-exon Tat of HIV //• Science.— 1993.— 260, N 5112.—P. 1320—1323. 129. Mann D. A., Frankel A. D. Endocytosis and targeting of exogenous HIV-1 Tat protein // EMBO J.—1991.—10, N 7.—P. 1733—1739. 130. Helland D. E.} Welles J. L.t Caputo A., Haseltine W. A. Transcellular transacti- vation by the human immunodeficiency virus type 1 Tat protein // J. Virol.— 1991.—65.—P. 4547—4549. 131. Culten B. R. Does HIV-1 Tat induce a change in viral initiation rights? // Cell.— 1993.__73._ p . 4i7_420. 132. Nicholas J., Nevins J. R. Distinct DNA targets for transactivation by HTLV-1 tax and adenovirus E1A // Virology.—1991.—182, N 1.—P. 156—167. 133. Siegel L. /., Ratner S. F.t Derse J. D. et al. Transactivation induced by HTLV-III maps to a viral sequence encoding 58 amino acids and lacks tissue specificity // Ibid.—1986.—148, N 1.—P. 226—231. 134. Drysdale C. M.f Pavlakis G. N. Rapid activation and subsequent down-regulation of HIV-1 promoter in the presence of Tat: Possible mechanisms contributing to latency // J. Virol.— 1991.—65, N 6.—P. 3044—3051. 135. Wagner S., Green M. R. HTLV-1 Tax protein stimulation of DNA binding of bZIP proteins by enhancing dimerization // Science.—1993.—262, N 5132.—P. 395— 399. Ин-т молекуляр. биологии и генетики Получено 31.01.94 НАН Украины, Киев 30 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1994. Т. 10. № 5

Регуляторные гены ВИЧ и их роль в реализации генома

Репозитарії

Схожі ресурси