SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments: a signal to the engagement of apoptosis?
In this paper we employed an extraction of the cells with high concentration of sodium chloride (a procedure commonly used for preparation of histone-depleted nuclei) to investigate the genesis of nuclear DNA degradation during apoptosis. We demonstrated that apoptosis in primary culture of murine t...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1997 |
| Автор: | |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | English |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1997
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155586 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments: a signal to the engagement of apoptosis? / V.T. Solov'yan // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 4. — С. 314-322. — Бібліогр.: 58 назв. — англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155586 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Solov'yan, V.T. 2019-06-17T07:57:12Z 2019-06-17T07:57:12Z 1997 SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments: a signal to the engagement of apoptosis? / V.T. Solov'yan // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 4. — С. 314-322. — Бібліогр.: 58 назв. — англ. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000491 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155586 In this paper we employed an extraction of the cells with high concentration of sodium chloride (a procedure commonly used for preparation of histone-depleted nuclei) to investigate the genesis of nuclear DNA degradation during apoptosis. We demonstrated that apoptosis in primary culture of murine thymocytes and in continuously growing Swiss 3T3 fibroblasts is associated with progressive disintegration of nuclear DNA into high molecular weight (HMW) DNA fragments of about 50–150 kb followed by the development of oligonucleosomai DNA ladder. In apoptotic cells both HMW DNA cleavage and internucleosomal DNA fragmentation can be detected cither by cell treatment with ionic detergents (SDS) or by extraction with high concentration of sodium chloride. However, at the early stage of apoptosis only SOS-detected HMW-DNA cleavage can be observed which precedes the sodium-chloride-detected nuclear DNA degradation. SDS-detected but not sodium-chloride-detected formation of HMW-DNA fragments occurs in apoptotic cells as early as before detachment. It may be observed also in nonapoptotic cells after they reach t/ic confluent state and is reversible. On the basis of obtained results it is possible to suggest thai SDS-detected HMW-DNA cleavage represents a physiological reaction of alive cells that accompanies an early commitment step of apoptosis. У роботі застосовано метод високосолевої екстракції інтактних клітин для вивчення динаміки розщеплення ядерної ДНК при апоптозі. Показано, що апоптоз в первинній культурі тимоцитів і культивованих прикріплених клітинах фібробластів мииіі супроводжується прогресивною деградацією ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти розміром 50–150 тис. п. н. з подальшим формуванням олігонуклеосомних фрагментів. В апоптозних клітинах розщеплення ядерної ДНК на високо молекулярні та олігонуклеосомні фрагменти відбувається як при обробці клітин DS-Na, так і при високо-солевій, екстракції. Однак на ранніх етапах апоптозу має місце лише DS-Na-залежна високомолекулярна фрагментація ядерної ДНК, яка передує формуванню високо молекулярних фрагментів, що виявляються при високосолевій екстракції клітин. На відміну від розривів, які виявляються високосолевою екстракцією, DS-Na-залежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти спостерігається в апоптозних клітинах перед вспливанням, а також має місце в неапоптозних клітинах, що досягли моношару. Показано, що DS-Na-залежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти на початкових стадіях апоптозу є зворотним в умовах, що сприяють залежному від топоізомерази II лігуванню розривів ДНК. Отримані результати свідчать, що DS-Na-залежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти є фізіологічною реакцією живих клітин, яка передує апоптозній деградації ядерної ДНК. В работе применен метод высокосолевой экстракции интактных клеток для изучения динамики расщепления ядерной ДНК при апоптозе. Показано, что апоптоз в первичной культуре тимоцитов и культивированных прикрепляющихся клетках фибробластов мыши сопровождается прогрессивной деградацией ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты размером 50–150 тыс. п. н. с последующим формированием олигонуклеосомных фрагментов. В апоптозных клетках расщепление ядерной ДНК на высокомолекулярные и олигонуклеосомные фрагменты происходит как при обработке клеток DS-Na, так и при высокосолевой экстракции. Однако на ранних этапах апоптоза имеет место лишь DS-Na-зависимая высокомолекулярная фрагментация ядерной ДНК, предшествующая формированию высокомолекулярных фрагментов, выявляемых высокосолевой экстракцией клеток. В отличие от разрывов, обнаруживаемых высокосолевой экстракцией, DSNa-зависимое расиитление ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты наблюдается в апоптозных клетках перед всплытием, а также имеет место в неапоптозных клетках, достигших монослоя. Показано, что DS-Na-зависимое расщепление ядерной ДНК на. высокомолекулярные фрагменты на начальных стадиях апоптоза является обратимым в условиях, способствующих опосредованному топоизомеразой II лигированию разрывов ДНК. Полученные результаты свидетельствуют, что DS-Na-зависимое расщепление ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты представляет собой физиологическую реакцию живых клеток, которая, предшествует апоптозной деградации ядерной ДНК. I thank Dr. P. Pogrebnoy, for kindly provided cell cultures, Dr. S. Mikholap for help in fluorescent analysis, and Igor Andreev for excellent assistance in conducting of experiments and preparation of manuscript. This work was supported by the Committee for Fundamental Research at the National Academy of Sciences, Ukraine. en Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Геном и его регуляция SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments: a signal to the engagement of apoptosis? DS-Na-залежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти: сигнал до початку апоптозу? DS-Na-зависимое расщепление ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты: сигнал к началу апоптоза? Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments: a signal to the engagement of apoptosis? |
| spellingShingle |
SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments: a signal to the engagement of apoptosis? Solov'yan, V.T. Геном и его регуляция |
| title_short |
SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments: a signal to the engagement of apoptosis? |
| title_full |
SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments: a signal to the engagement of apoptosis? |
| title_fullStr |
SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments: a signal to the engagement of apoptosis? |
| title_full_unstemmed |
SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments: a signal to the engagement of apoptosis? |
| title_sort |
sds-dependent cleavage of nuclear dna into high molecular weight dna fragments: a signal to the engagement of apoptosis? |
| author |
Solov'yan, V.T. |
| author_facet |
Solov'yan, V.T. |
| topic |
Геном и его регуляция |
| topic_facet |
Геном и его регуляция |
| publishDate |
1997 |
| language |
English |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
DS-Na-залежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти: сигнал до початку апоптозу? DS-Na-зависимое расщепление ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты: сигнал к началу апоптоза? |
| description |
In this paper we employed an extraction of the cells with high concentration of sodium chloride (a procedure commonly used for preparation of histone-depleted nuclei) to investigate the genesis of nuclear DNA degradation during apoptosis. We demonstrated that apoptosis in primary culture of murine thymocytes and in continuously growing Swiss 3T3 fibroblasts is associated with progressive disintegration of nuclear DNA into high molecular weight (HMW) DNA fragments of about 50–150 kb followed by the development of oligonucleosomai DNA ladder. In apoptotic cells both HMW DNA cleavage and internucleosomal DNA fragmentation can be detected cither by cell treatment with ionic detergents (SDS) or by extraction with high concentration of sodium chloride. However, at the early stage of apoptosis only SOS-detected HMW-DNA cleavage can be observed which precedes the sodium-chloride-detected nuclear DNA degradation. SDS-detected but not sodium-chloride-detected formation of HMW-DNA fragments occurs in apoptotic cells as early as before detachment. It may be observed also in nonapoptotic cells after they reach t/ic confluent state and is reversible. On the basis of obtained results it is possible to suggest thai SDS-detected HMW-DNA cleavage represents a physiological reaction of alive cells that accompanies an early commitment step of apoptosis.
У роботі застосовано метод високосолевої екстракції інтактних клітин для вивчення динаміки розщеплення ядерної ДНК при апоптозі. Показано, що апоптоз в первинній культурі тимоцитів і культивованих прикріплених клітинах фібробластів мииіі супроводжується прогресивною деградацією ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти розміром 50–150 тис. п. н. з подальшим формуванням олігонуклеосомних фрагментів. В апоптозних клітинах розщеплення ядерної ДНК на високо молекулярні та олігонуклеосомні фрагменти відбувається як при обробці клітин DS-Na, так і при високо-солевій, екстракції. Однак на ранніх етапах апоптозу має місце лише DS-Na-залежна високомолекулярна фрагментація ядерної ДНК, яка передує формуванню високо молекулярних фрагментів, що виявляються при високосолевій екстракції клітин. На відміну від розривів, які виявляються високосолевою екстракцією, DS-Na-залежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти спостерігається в апоптозних клітинах перед вспливанням, а також має місце в неапоптозних клітинах, що досягли моношару. Показано, що DS-Na-залежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти на початкових стадіях апоптозу є зворотним в умовах, що сприяють залежному від топоізомерази II лігуванню розривів ДНК. Отримані результати свідчать, що DS-Na-залежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти є фізіологічною реакцією живих клітин, яка передує апоптозній деградації ядерної ДНК.
В работе применен метод высокосолевой экстракции интактных клеток для изучения динамики расщепления ядерной ДНК при апоптозе. Показано, что апоптоз в первичной культуре тимоцитов и культивированных прикрепляющихся клетках фибробластов мыши сопровождается прогрессивной деградацией ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты размером 50–150 тыс. п. н. с последующим формированием олигонуклеосомных фрагментов. В апоптозных клетках расщепление ядерной ДНК на высокомолекулярные и олигонуклеосомные фрагменты происходит как при обработке клеток DS-Na, так и при высокосолевой экстракции. Однако на ранних этапах апоптоза имеет место лишь DS-Na-зависимая высокомолекулярная фрагментация ядерной ДНК, предшествующая формированию высокомолекулярных фрагментов, выявляемых высокосолевой экстракцией клеток. В отличие от разрывов, обнаруживаемых высокосолевой экстракцией, DSNa-зависимое расиитление ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты наблюдается в апоптозных клетках перед всплытием, а также имеет место в неапоптозных клетках, достигших монослоя. Показано, что DS-Na-зависимое расщепление ядерной ДНК на. высокомолекулярные фрагменты на начальных стадиях апоптоза является обратимым в условиях, способствующих опосредованному топоизомеразой II лигированию разрывов ДНК. Полученные результаты свидетельствуют, что DS-Na-зависимое расщепление ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты представляет собой физиологическую реакцию живых клеток, которая, предшествует апоптозной деградации ядерной ДНК.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155586 |
| citation_txt |
SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments: a signal to the engagement of apoptosis? / V.T. Solov'yan // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 4. — С. 314-322. — Бібліогр.: 58 назв. — англ. |
| work_keys_str_mv |
AT solovyanvt sdsdependentcleavageofnucleardnaintohighmolecularweightdnafragmentsasignaltotheengagementofapoptosis AT solovyanvt dsnazaležnerozŝeplennââdernoídnknavisokomolekulârnífragmentisignaldopočatkuapoptozu AT solovyanvt dsnazavisimoerasŝeplenieâdernoidnknavysokomolekulârnyefragmentysignalknačaluapoptoza |
| first_indexed |
2025-11-26T00:08:39Z |
| last_indexed |
2025-11-26T00:08:39Z |
| _version_ |
1850593165101236224 |
| fulltext |
ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка, 1997. Т. 13. № 4
SDS-dependent cleavage of nuclear DNA
into high molecular weight DNA fragments:
a signal to the engagement of apoptosis?
V. T. Solov'yan
Institute of Molecular Biology and Genetics Ukrainian Academy of Sciences
150 Zabolotnogo str., 252143 , Kyiv, Ukraine
In this paper we employed an extraction of the cells with high concentration of sodium chloride (a
procedure commonly used for preparation of hist one-depleted nuclei) to investigate the genesis of nuclear
DNA degradation during apoptosis. We demonstrated that apoptosis in primary culture of murine
thymocytes and in continuously growing Swiss 3T3 fibroblasts is associated with progressive disintegration
of nuclear DNA into high molecular weight (HMW) DNA fragments of about 50—J50 kb followed by the
development of oligonucleosomal DNA ladder. In apoptotic cells both HMW-DNA cleavage and
internucleosomal DNA fragmentation can be detected cither by cell treatment with ionic detergents (SDS)
or by extraction with high concentration of sodium chloride. However, at the early stage of apoptosis only
SDS-detected HMW-DNA cleavage can be observed which precedes the sodium-chloride-detected nuclear
DNA degradation. SDS-detected but not sodium-chloride-detected formation of HMW-DNA fragments
occurs in apoptotic celts as early as before detachment. It may be observed also in nonapoptotic cells after
they reach the confluent state and is reversible. On the basis of obtained results it is possible to suggest
that SDS-detected HMW-DNA cleavage represents a physiological reaction of alive cells that accompanies
an early commitment step of apoptosis.
I n t r o d u c t i o n . A p o p t o s i s is a g e n e t i c a l l y r e g u l a t e d fo rm
of cell d e a t h , in w h i c h s u p e r f l u o u s o r a b n o r m a l cel ls
a r e e l i m i n a t e d f r o m a n o r g a n i s m [1 J. A p o p t o s i s ( a l so
r e f e r r e d to a s a p r o g r a m m e d cell d e a t h ) p l a y s a
f u n d a m e n t a l r o l e in cell h o m e o s t a s i s a n d in a v a r i e t y
of phys io log i ca l a n d p a t h o l o g i c a l p r o c e s s e s [2 , 3 ] .
A l t h o u g h a p o p t o s i s o c c u r s in d i v e r s e cell t y p e s a n d is
t r i g g e r e d b y a n u m b e r of e x t r a c e l l u l a r a n d i n t r a
ce l l u l a r s i g n a l s it i nvo lves t h e u n i f o r m m o r p h o l o g i c a l
c h a n g e s of t h e ce l l s s u c h a s c h r o m a t i n c o n d e n s a t i o n ,
c y t o p l a s m i c v a c u o l i z a t i o n a n d p l a s m a m e m b r a n e b l e b -
b i n g [ 2 ) . T h e m o r p h o l o g i c a l a l t e r a t i o n s of a p o p t o s i s
a r e a c c o m p a n i e d b y a v a r i e t y of b i o c h e m i c a l c h a n g e s .
E l e v a t i o n s in c y t o s o l i c f r ee c a l c i u m ( rew [4 ]) a n d
cy toso l i c h y d r o g e n i o n s | 5 ] a r e fo l lowed by i n t e r
n u c l e o s o m a l D N A d e g r a d a t i o n [6 , 7 ] a n d s h a r p
d e c r e a s e s in c e l l u l a r N A D levels | 8 — 1 0 ] . D e s p i t e
c o n s i d e r a b l e effort h a s b e e n d i r e c t e d t o w a r d d e f i n i n g
t h e b i o c h e m i c a l b a s i s for m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s a s s o
c i a t ed w i th a p o p t o s i s , n o c o n s e n s u s h a s b e e n a c h i e
ved . Ac t iva t ion of e n d o n u c l e a s e w h i c h p r e f e r e n t i a l l y
© V У S O L O V ' Y A N . \997
c l e a v e s D N A a t i n t e r n u c l e o s o m a l r e g i o n s h a s b e e n
c o n s i d e r e d a s a c r i t i ca l e v e n t in a p o p t o s i s for m a n y
y e a r s [2 , 3 ] . M o r e r e c e n t l y , t h e a t t e n t i o n of m a n y
l a b o r a t o r i e s h a s b e e n f o c u s e d o n a n o t h e r e s s e n t i a l
s t e p of a p o p t o s i s , n a m e l y , a c t i v a t i o n of p r o t e a s e s
[ r e w s 1 1 , 1 2 ] .
In t h e e a r l y p h a s e s of a p o p t o s i s p e c u l i a r m o d i f i
c a t i o n s of n u c l e a r m o r p h o l o g y b e c o m e e v i d e n t . M o r
p h o l o g i c a l n u c l e a r c h a n g e s t y p i c a l for a p o p t o s i s u s u
a l ly c o i n c i d e w i th d o u b l e - s t r a n d c l e a v a g e of D N A a t
i n t e r n u c l e o s o m a l s i t e s [2 , 3 ] . R e c e n t e v i d e n c e s u g
g e s t s , h o w e v e r , t h a t t h e c h a n g e s in n u c l e a r m o r
p h o l o g y o b s e r v e d d u r i n g a p o p t o s i s s e e m to b e m o r e
c lose ly c o r r e l a t e d w i t h t h e p r o t e o l y s i s of a s u b s e t of
n u c l e a r p r o t e i n s [ 1 3 — 1 8 ] a n d t h e o n s e t of h i g h
m o l e c u l a r w e i g h t ( H M W ) D N A f r a g m e n t a t i o n , a n
e v e n t t h a t h a s b e e n s h o w n to p r e c e d e [ 1 9 — 2 2 ] , o r ,
in s o m e cell t y p e s , t o o c c u r in t h e a b s e n c e of
i n t e r n u c l e o s o m a l D N A c l e a v a g e [ 2 3 — 2 5 ] . T h e
f o r m a t i o n of H M W - D N A f r a g m e n t s , pos s ib ly r e s u l t e d
f rom t h e c l e a v a g e of l o o p e d D N A d o m a i n s a t t h e
a t t a c h m e n t p o i n t s o n t h e n u c l e a r scaf fo ld , a n d t h e
ac t i va t i on of p r o t e a s e s , w h i c h s e e m to ac t in pa r a l l e l
3 1 4
S D S - D E P E N D K N T C L E A V A G E OP N4 J CLEAR DNA
w i t h n u c l e a s e s [ 1 6 — 1 8 ] , h a v e b e e n p o s t u l a t e d t o b e
a n e a r l y c r i t ica l e v e n t in a p o p t o s i s .
A l t h o u g h c o n s i d e r a b l e p r o g r e s s h a s b e e n a c h i
eved in u n d e r s t a n d i n g t h e b i o c h e m i c a l e v e n t s , u n d e r
l y i n g m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s in a p o p t o t i c ce l l s , r e m a r
k a b l y few is k n o w n a b o u t i n i t i a t i n g e v e n t s t h a t t r i g g e r
a p o p t o t i c cell d e a t h . T h e o b s e r v a t i o n t h a t a p o p t o s i s -
r e l a t e d c y t o p l a s m i c c h a n g e s c a n b e a c h i e v e d in e n u c
l e a t e d cel ls [ 26 , 2 7 ] s u g g e s t s t h a t n u c l e a r e v e n t s a r e
no t e s s e n t i a l for i n i t i a t i o n of a p o p t o s i s . G e n o t o x i c
d a m a g e , h o w e v e r , is a power fu l a p o p t o t i c s t i m u l u s ,
a n d it s e e m s l ike ly t h a t t h e n u c l e u s c o n t a i n s i m p o r
t a n t m e d i a t o r s w h i c h c a n i n i t i a t e a p o p t o t i c c a s c a d e , a t
l eas t for p a r t i c u l a r a p o p t o t i c i n d u c e r s .
In th i s p a p e r w e e m p l o y e d a p r o c e d u r e of cel l
e x t r a c t i o n w i th h i g h c o n c e n t r a t i o n of s o d i u m c h l o r i d e
to m o n i t o r t h e i n t e g r i t y of n u c l e a r D N A d u r i n g
a p o p t o s i s a n d d e m o n s t r a t e d t h a t b e f o r e t h e f o r m a t i o n
of H M W - D N A f r a g m e n t s , r e v e a l e d i n s o d i u m - c h l o
r i d e - e x t r a c t e d ce l l s , t h e « h i d d e n » H M W - D N A c l e a
vage t a k e s p l a c e i n a p o p t o t i c ce l l s , t h a t c a n b e
d e t e c t e d b y cell t r e a t m e n t w i t h S D S . S D S - d e p e n d e n t
H M W - D N A c l e a v a g e i n a p o p t o t i c ce l l s o c c u r s a t t h e
e a r l y s t a g e of a p o p t o s i s , is o b s e r v a b l e in t h e d e n s i t y -
a r r e s t e d n o n a p o p t o t i c ce l l s , a n d is r e v e r s i b l e .
E x p e r i m e n t a l P r o c e d u r e s . Cell lines and culture
conditions. M u r i n e t h y m o c y t e s o b t a i n e d f r o m t h e
t h y m u s of a 4 — 5 w e e k o ld m o u s e ( l ine B A L B / C ) a n d
Swiss 3 T 3 f i b r o b l a s t s w e r e u s e d for t h i s i n v e s t i g a t i o n .
3 T 3 f i b r o b l a s t s w e r e r o u t i n e l y i n c u b a t e d i n D M E M
m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 10 % fe ta l calf s e r u m
(PCS) in a n a t m o s p h e r e of 9 5 % a i r , 5 % C 0 2 t o give
a f inal s u s p e n s i o n of 5 10° c e l l s / m l . A p o p t o s i s in
e x p o n e n t i a l l y g r o w i n g 3 T 3 f i b r o b l a s t s w a s i n d u c e d b y
s e r u m w i t h d r a w a l . T h y m o c y t e s p r i m a r y c u l t u r e s w e r e
p r e p a r e d from i n t a c t t h y m o c y t e s t o g ive a f ina l
s u s p e n s i o n of 5 - 1 0 ° c e l l s / m l in R P M I 1 6 4 0 / 1 0 %
F C S a n d i n c u b a t e d u n d e r c o n d i t i o n s i n d i c a t e d a b o v e
for a t l ea s t 6 h e i t h e r w i t h o r w i t h o u t 1 m M
d e x a m e t h a s o n e .
Morphological examination of cells. C e l l s w e r e
h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d r e s u s p e n d e d in 100 jul
of p h o s p h a t e bu f f e r ed n o r m a l s a l i n e ( P B S ) a t ~ 1 0 7
c e l l s / m l fo l lowed b y s t a i n i n g w i th 1 , u g / m l of H o e c h s t
3 3 3 4 2 for 3 0 m i n a t 37 °С. Af t e r w a s h i n g ce l l s w e r e
r e s u s p e n d e d in 3 0 JU\ of P B S a n d f ixed w i th ЗО /Л of
4 % p a r a f o r m a l d e h y d e . F o r i n s p e c t i o n of c h r o m a t i n
10 jul a l i q u o t s w e r e l a id on g l a s s s l i d e s c o a t e d w i t h
3 - a m i n o p r o p y l - t r i e t h o x y s i l a n e . M i c r o s c o p y w a s p e r
f o r m e d u n d e r c o n d i t i o n s of n o r m a l i l l u m i n a t i o n a n d
f l uo re scen t l ight u s i n g p h a s e c o n t r a s t o p t i c s .
DNA analysis in cellular preparations. 2 0 0 /u\ of
t h y m o c y t e s u s p e n s i o n c o n t a i n i n g a p p . 1 • 1 0 6 ce l l s w e r e
p l aced i n t o t h e wel l of cel l c u l t u r e p l a t e a n d e q u a l
v o l u m e of 1 % l o w - m e l t i n g p o i n t a g a r o s e in P B S - b u f f -
e r p r e h e a t e d to 37 °С w a s a d d e d . F o r p r e p a r a t i o n of
D N A s a m p l e s f rom 3 T 3 f i b r o b l a s t s c u l t u r a l m e d i u m
w a s co l l ec t ed a n d d e t a c h e d ce l l s w e r e h a r v e s t e d f rom
t h e c u l t u r a l m e d i u m b y c e n t r i f u g a t i o n . A t t a c h e d cel ls
w e r e s c r a p e d i n t h e f r e s h m e d i u m a n d co l l ec t ed by
c e n t r i f u g a t i o n . B o t h a t t a c h e d a n d d e t a c h e d ce l ls w e r e
r e s u s p e n d e d i n 2 0 0 jul of t h e f r e s h m e d i u m a n d
e m b e d d e d i n t o a g a r o s e b y a d d i t i o n of p r e h e a t e d to
37 °С e q u a l v o l u m e of 1.5 % l o w - m e l t i n g po in t
a g a r o s e p r e p a r e d o n P B S - b u f f e r . A g a r o s e - e m b e d d e d
cel ls ( b o t h t h y m o c y t e s a n d f i b r o b l a s t s ) w e r e e i t h e r
t r e a t e d w i t h t h e l y s i n g bu f f e r ( P B S - b u f f e r c o n t a i n i n g
10 m M E D T A , 1 % S D S ) for 1 h a t 2 5 °С o r wi th
t h e e x t r a c t i o n bu f fe r ( 2 0 m M t r i s - H C l , p H 7 . 5 , 1 m M
E D T A , 0 .2 m M P M S F , 2 M N a C l ) t h r e e t i m e s for 2 0
m i n a t 4 °С . B o t h S D S - t r e a t e d a n d s o d i u m - c h l o r i d e -
e x t r a c t e d e m b e d d e d i n a g a r o s e ce l l s w e r e w a s h e d
t h r e e t i m e s for 2 0 m i n a t 2 5 °С w i t h w a s h i n g buf fe r
( e x t r a c t i o n bu f f e r w i t h o u t N a C l ) a n d s u b j e c t e d to
e l e c t r o p h o r e s i s .
Agarose gel electrophoresis A g a r o s e p l u g s w i t h
S D S - t r e a t e d - a n d s o d i u m - c h l o r i d e - e x t r a c t e d ce l l s w e
r e s u b j e c t e d to c o n v e n t i o n a l o r f ie ld i n v e r s i o n gel
( F I G E ) e l e c t r o p h o r e s i s . C o n v e n t i o n a l gel e l e c t r o p h o
r e s i s w a s c a r r i e d o u t i n 1.2 % a g a r o s e a t 7 0 V for
3 — 4 h u s i n g 0 . 5 x T B E b u f f e r ( 0 . 0 8 9 M T r i s ,
0 . 0 8 9 M b o r i c a c i d , 0 . 0 0 2 M E D T A , p H 8 . 5 ) . A s a
m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r w a s u s e d 1 k b l a d d e r ,
o b t a i n e d f rom Life T e c h n o l o g i e s . F I G E w a s p e r
f o r m e d in 1 % a g a r o s e a t 8 5 V for 18 h in 0 . 5 *
x T B E buf fe r u n d e r c o n s t a n t p u l s e s of e l ec t r i c field
(24 s « f o r w a r d » a n d 8 s « b a c k w a r d » ) a l l o w i n g r e s o
l u t i o n of D N A m o l e c u l e s s i z e d u p to 5 0 0 k b [47 J. In
s o m e c a s e s F I G E w a s c a r r i e d o u t for 5 — 6 h a l l o w i n g
r e s o l u t i o n of b o t h l o w - a n d h i g h m o l e c u l a r w e i g h t
D N A . Af t e r e l e c t r o p h o r e s i s , t h e ge l w a s s t a i n e d w i t h
1 jug/ml e t h i d i u m b r o m i d e for 10 m i n , v i e w e d u s i n g
a U V t r a n s i l l u m i n a t o r a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g M i c r a t
3 0 0 f i lm.
R e s u l t s . D a t a p r e s e n t e d in F i g . 1 s h o w t h a t
d e x a m e t h a s o n e - i n d u c e d a p o p t o s i s in p r i m a r y c u l t u r e
of t h y m o c y t e s is a s s o c i a t e d w i t h a n e x t e n s i v e c l e a v a g e
of n u c l e a r D N A i n t o h i g h m o l e c u l a r w e i g h t ( H M W )
D N A f r a g m e n t s of a b o u t 3 0 0 k b a n d 5 0 — 1 5 0 k b (300
k b - D N A f r a g m e n t s r e p r e s e n t a n c o m p r e s s i o n a r t i f ac t
u n d e r F I G E e m p l o y e d , r e s u l t s n o t s h o w n ) . P a r a l l e l
f r a c t i o n a t i o n of S D S - t r e a t e d a p o p t o t i c ce l l s b o t h by
f i e l d - i n v e r s i o n - a n d c o n v e n t i o n a l gel e l e c t r o p h o r e s i s
i n d i c a t e s t h a t t h e f o r m a t i o n of H M W - D N A f r a g m e n t s
t a k e s p l a c e a t t h e e a r l y s t a g e of a p o p t o s i s (F ig . 1),
a n d p r e c e d e s t h e i n t e r n u c l e o s o m a l D N A f r a g m e n
t a t i o n , w h i c h r e p r e s e n t s a h a l l m a r k of a p o p t o s i s in
t h e s e ce l l s .
As is e v i d e n c e d f rom t h e r e s u l t s p r e s e n t e d in F ig .
2 t h e typical p a t t e r n of n u c l e a r D N A d i s i n t e g r a t i o n in
a p o p t o t i c t h y m o c y t e s c a n b e d e t e c t e d e i t h e r b y t r e a t
m e n t of a g a r o s e - e m b e d d e d ce l l s w i t h ion ic d e t e r g e n t
3 1 5
s o i . o v v \ \ V. T
Fig. I. The pattern of nuclear l ) \ : A cleavage in murine thymocytes
induced to undergo apoptosis with dexamethasone. Intact murine
thymocytes were resuspended in RPMT medium supplemented with
10 % FBS and allowed to incubate for 1—6 h in the presence of 1
juM dexamethasone. At different time points the samples of the cells
were embedded in low-melting agarose as described in Experimental
Procedure. Agarose-embedded cells were treated with 1 % SDS for
1 h at 37 °С and fractionated either by FIGE (Panel A) or by
conventional gel electrophoresis (panel В). C, control cells, non-
treated with dexamethasone
S D S o r by celJ e x t r a c t i o n wi th h i g h c o n c e n t r a t i o n of
s o d i u m c h l o r i d e (a p r o c e d u r e c o m m o n l y u s e d for
p r e p a r a t i o n of h i s t o n e - d e p i e t e d n u c l e i ) . H o w e v e r , t h e
f o r m a t i o n of S D S - d e t e c t e d H M W - D N A f r a g m e n t s in
a p o p t o t i c t h y m o c y t e s p r e c e d e s t h e n u c l e a r D N A f r a g
m e n t a t i o n d e t e c t e d b y h i g h - s a l t - e x t r a c t i o n (F ig . 2 ,
A). I n c u b a t i o n of p r i m a r y t h y m o c y t e c u l t u r e w i t h o u t
a p o p t o t i c i n d u c e r s a l s o r e s u l t s in s i m i l a r p a t t e r n of
n u c l e a r D N A d i s i n t e g r a t i o n , w h i c h involves t h e for
m a t i o n of H M W - D N A f r a g m e n t s a n d c o n c o m i t a n t
d e v e l o p m e n t of o l i g o n u c l e o s o m a l D N A l a d d e r (F ig . 2 ,
B). T h i s i n d i c a t e s t h a t i s o l a t e d t h y m o c y t e s a r e c o m
m i t t e d t o d e a t h , a n d d i e via a p o p t o s i s even in t h e
a b s e n c e of a p o p t o t i c i n d u c e r s . At t h e s a m e t i m e t h e
f o r m a t i o n of H M W - D N A f r a g m e n t s to o c c u r r a p i d l y
i n t h e ce l l s c o m m i t t e d to a p o p t o s i s c a n be d e t e c t e d
o n l y in S D S - t r e a t e d - b u t no t in h i g h - s a l t - e x t r a c t e d
ce l l s , w h i l e t h e o l i g o n u c l e o s o m a l D N A l a d d e r can b e
d e t e c t e d b y b o t h cell t r e a t m e n t wi th S D S a n d e x
t r a c t i o n wi th h i g h c o n c e n t r a t i o n of s o d i u m c h l o r i d e
(F ig . 2 , B). T h e e x a m i n a t i o n of n u c l e a r m o r p h o l o g y
b y H o e c h s t 3 3 3 4 2 - s t a i n i n g r e v e a l s t h a t i n t e r n u c l e o
s o m a l D N A f r a g m e n t a t i o n a c c o m p a n i e s t h e a p o p t o t i c
c h a n g e s in n u c l e a r m o r p h o l o g y , w h i l e t h e S D S -
d e t e c t e d H M W - D N A c l e a v a g e is no t a s s o c i a t e d w i th
t h e a p o p t o s i s - r e l a t e d c h r o m a t i n c h a n g e s (F ig . 2 ) .
D a t a p r e s e n t e d in F ig . 3 s h o w t h a t S D S - d e t e c t e d
H M W - D N A c l e a v a g e in a p o p t o t i c t h y m o c y t e s is r e
v e r s i b l e a f t e r br ief h e a t t r e a t m e n t of t h e ce l l s . T h e
r e v e r s i b i l i t y of H M W - D N A c l e a v a g e is o b s e r v e d at t h e
e a r l y s t a g e of a p o p t o s i s w i t h i ts s u b s e q u e n t loss a t t h e
a d v a n c e d s t a g e c o i n c i d i n g w i t h t h e d e v e l o p m e n t of
o l i g o n u c l e o s o m a l D N A l a d d e r (F ig . 3 ) .
T h e a b s e n c e of H M W - D N A c l e a v a g e in S D S - n o n -
t r e a t e d t h y m o c y t e s a s wel l a s r e v e r s i b i l i t y of H M W -
D N A c l e a v a g e a t t h e e a r l y s t a g e of a p o p t o s i s a l low us
to s u g g e s t t h a t S D S - d e t e c t e d H M W - D N A c l e a v a g e is
n o t a s s o c i a t e d wi th t h e a p o p t o t i c D N A d e g r a d a t i o n
b u t r e p r e s e n t s a n e a r l y g e n o m i c e v e n t in ce l l s p r e
d i s p o s e d to u n d e r g o a p o p t o s i s . T o f u r t h e r i n v e s t i g a t e
t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e H M W - D N A c l e a v a g e a n d
a p o p t o t i c D N A d e g r a d a t i o n we e x a m i n e d t h e i n t e g r i t y
of n u c l e a r D N A in c o n t i n u o u s l y g r o w i n g Swiss 3 T 3
cel ls i n d u c e d to u n d e r g o a p o p t o s i s by s e r u m d e
p r i v a t i o n . T o fac i l i t a te t h e D N A a n a l y s i s a c o n
v e n t i o n a l g e l - e l e c t r o p h o r e s i s h a s b e e n u s e d i n s t e a d of
F I G E s i n c e it a l l ows to d e t e c t ea s i ly b o t h i n t e r
n u c l e o s o m a l a n d H M W - D N A f r a g m e n t a t i o n ( l a t t e r is
d e t e c t e d a s a s i n g l e c o n d e n s e d b a n d s ized a b o u t
5 0 k b , Fig. 1) .
D a t a p r e s e n t e d in F ig . 4 d e m o n s t r a t e t h a t t h e
p r o g r e s s i v e a c c u m u l a t i o n of H M W - D N A f r a g m e n t s
a n d c o n c o m i t a n t d e v e l o p m e n t of o l i g o n u c l e o s o m a l la
d d e r , d e l e c t e d e i t h e r b y cell t r e a t m e n t wi th S D S o r
e x t r a c t i o n wi th s o d i u m c h l o r i d e , is r e s t r i c t e d to t h e
d e t a c h e d s e r u m - d e p r i v e d 3 T 3 ce l l s . In a t t a c h e d ce l l s ,
h o w e v e r , t h e r e is n o o b v i o u s s o d i u m - c h l o r i d e - d e t e c t e d
D N A f r a g m e n t a t i o n b u t S D S - d e t e c t e d H M W - D N A
c l e a v a g e m a y be o b s e r v e d . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t
t h e f o r m a t i o n of S D S - d e t e c t e d H M W - D N A f r a g m e n t s
in a p o p t o t i c 3 T 3 cel ls p r e c e d e s s o d i u m - c h l o r i d e - d e
t e c t e d H M W - D N A c l e a v a g e a n d o c c u r s in a l ive ( a t
t a c h e d ) cel ls c o m m i t t e d to u n d e r g o a p o p t o s i s .
F r o m t h e d a t a p r e s e n t e d a t F ig . 5 it is s e e n t h a t
t h e S D S - d e t e c t e d f o r m a t i o n of H M W - D N A f r a g m e n t s
t a k e s p lace in a t t a c h e d 3 T 3 cel ls in t h e a b s e n c e of
a p o p t o t i c i n d u c e r s , w i th t h e m a x i m a l eff iciency of
f r a g m e n t a t i o n b e i n g in c o n f l u e n t ce l l s . At t he s a m e
316
SDS' D E P E N D E N T С EE Л V АСІ E Oh NUCLEAR DNA
DEX
(h) 0 / 2 3 4 5 20 0 1 2 3 4 5 20
NaO SDS
DEX
(h) 0 1 2 3 4 5 20 0 1 2 3 4 5 20
II 4
В
AaCl SDS
Fig. 2, The pattern of nuclear DNA cleavage in apoptotic thymocytes and thymocytes committed to undergo apoptosis. Intact murine
thymocytes were incubated at 37 °С for 0 20 h either with (panel A) or without (panel В) 1 uM dexamethasone. After incubation the cells
were embedded in low-melting agarose as described in Experimental Procedure and then were extracted either with 2 M NaCl or treated with
1 •% SDS (as pointed on the figure). Both sodium-chloride-extracted and SDS-treated cells were washed three times with washing buffer
(see Experimental Procedure) and fractionated by E1GE. Left panels demonstrate the HMW-DN'A fragments separated by EiGE (ethidiurn
bromide staining). Right panels show the morphological features of chromatin in l loechsl 33342-stained thymocytes after 5 h of cell incubation
3 1 7
S'OLOV'YAN V. Т.
f A ^ h i g h c o n c e n t r a t i o n of s o d i u m c h l o r i d e [ 2 8 — 3 4 ] o n e
c a n e x p e c t t h a t d s D N A b r e a k s s h o u l d be r e v e a l e d in
h i g h - s a l t - e x t r a c t e d ce l l s . A s a n i l l u s t r a t i o n b o t h
H M W - D N A f r a g m e n t s a n d o l i g o n u c l e o s o m a l D N A
l a d d e r c a n b e d e t e c t e d in h i g h - s a l t - e x t r a c t e d cel ls a t
t h e a d v a n c e d s t a g e of a p o p t o s i s (F ig . 2 , 4) a n d is
Fig. 3. The reversibility of HMW-DNA cleavage in thymocytes at the
early stages of apoptosis. Thymocytes were treated with 1 tuM
dexamethasone and allowed to incubate for 0—3 h. At different time
points cells were embedded into agarose as described in Ex
perimental Procedures (panel A) or were additionally incubated at
55 °С for 10 min followed by agarose embedding (panel B). After
gelation cells were treated with SDS and fractionated by FIGE as
described in Experimental Procedures
t i m e in d e t a c h e d ce l l s , w h i c h a p p e a r a f t e r m o n o l a y e r
h a s b e e n e s t a b l i s h e d in a t t a c h e d ce l l s , t h e H M W -
D N A c l e a v a g e c a n b e r e v e a l e d by b o t h cell t r e a t m e n t
wi th S D S a n d e x t r a c t i o n w i t h s o d i u m c h l o r i d e (F ig . 5 ,
B).
D a t a p r e s e n t e d s u g g e s t t h a t S D S - d e t e c t e d for
m a t i o n of H M W - D N A f r a g m e n t s r e p r e s e n t s a p h y
s io logical r e a c t i o n of a l ive ce l l s t h a t a c c o m p a n i e s
c h a n g e s in f u n c t i o n a l ac t iv i ty of t h e ce l l s d u r i n g t h e
cell p a s s a g e .
D i s c u s s i o n . O u r r e s u l t s s h o w t h a t a p o p t o s i s in
p r i m a r y c u l t u r e of m u r i n e t h y m o c y t e s a n d in c o n
t i n u o u s l y g r o w i n g 3 T 3 f i b r o b l a s t s is a c c o m p a n i e d b y
a n o r d e r e d f r a g m e n t a t i o n of n u c l e a r D N A . T w o
s t a g e s of n u c l e a r D N A d i s i n t e g r a t i o n c a n b e d i s
t i n g u i s h e d in a p o p t o t i c ce l l s : t h e f o r m a t i o n of H M W -
D N A f r a g m e n t s fo l lowed b y t h e d e v e l o p m e n t of
o l i g o n u c l e o s o m a l D N A l a d d e r (F ig . 1, 4 ) . At t h e s a m e
t i m e o u r d a t a i n d i c a t e t h a t t h e r e a r e two t y p e s of
H M W - D N A c l e a v a g e in ce l l s i n d u c e d to u n d e r g o
a p o p t o s i s , n a m e l y , t h e H M W - D N A c l e a v a g e d e t e c t e d
e i t h e r w i th N a C l o r S D S a n d t h a t d e t e c t e d o n l y by
cell t r e a t m e n t w i t h S D S .
B e c a u s e mos t of t h e h i s to r i e s a n d n o n - h i s t o n e
p r o t e i n s a r e e x t r a c t e d u p o n t r e a t m e n t of ce l l s wi th
0 6 12 18 29 54 M
NaCl
50 kb
SDS
NaCl SDS
Fig. 4. The pattern of MMW-DNA fragmentation in attached (panel
A) and detached (panel В) 3T3 fibroblasts induced to undergo
apoptosis by serum deprivation. Exponentially growing cells (50 %
of monolayer) were Incubated in serum-deficient medium For 0—54
h. Following incubation the cultural medium was collected and
detached cells were harvested from the cultural medium by cen-
trifligation. Attached cells were scraped in the fresh serum-deficient
medium and collected by centrifugation. Both attached and detached
cells were embedded into agarose as described in F,xperimental
Procedures followed by extraction either with 2 M NaCl or 1 %
SDS. Both sodium-chloride- and SDS-ex traded cells were washed
three times with washing buffer (see Experimental Procedure)
followed by fractionation by conventional gel electrophoresis. M,
molecular weight standard, 1 kb-DNA ladder
318
S O S - D E P E N D E N T C E E A V A G E Ol N'ECLEAK DNA
NaCl SDS
NaCl SDS
Fig. 5. The pattern of HMW-DNA fragmentation in 3T3 fibroblasts
in the absence of apoptotic inducers. The conditions of experiment
and the designations are the same as described in the legend to Fig.
4 with the only difference that cells were incubated in serum-
containing medium. Asterisk indicates the time point when monolayer
has been established
f u r t h e r c o n f i r m e d by t h e r e s u l t s of L i c h t e n s t e i n et a l .
[571 t h a t t r e a t m e n t of i s o l a t e d nuc l e i w i t h D N A s e I
r e l ea se s t h e n u c l e a r D N A u p o n e x t r a c t i o n of nuc le i
wi th 2 M N a C l . T h e a b s e n c e of t h e H M W - D N A
c leavage in h i g h - s a l t - e x t r a c t e d t h y m o c y t e s , c u l t u r e d
in vitro w i t h o u t a p o p t o t i c i n d u c e r s , a s wel l a s in
t h y m o c y t e s at t h e e a r l y s t a g e of d e x a m e t h a s o n e -
i n d u c e d a p o p t o s i s (F ig . 2) c l e a r l y i n d i c a t e t h a t t h e r e
a r e n o p r e e x i s t i n g d s D N A b r e a k s in t h e ce l l s
c o m m i t t e d to u n d e r g o a p o p t o s i s o r a t t h e e a r l y s t a g e
of a p o p t o s i s . At t h e s a m e t i m e t h e d e t e c t i o n of
H M W - D N A c l e a v a g e in t h e s a m e cel ls b y cel l t r e a t
m e n t wi th S D S s u g g e s t s t h a t t h e H M W - D N A c l e a v a g e
is e i t h e r i n d u c e d o r r e v e a l e d b y a d d i t i o n of d e t e r g e n t .
S D S - d e p e n d e n t f o r m a t i o n of H M W - D N A f r a g m e n t s
m a k e s t h e p h e n o m e n o n o b s e r v e d s t r i k i n g l y a n a l o g o u s
t o t h e t o p o i s o m e r a s e I I - d e p e n d e n t D N A c l e a v a g e .
T h i s is f u r t h e r c o n f i r m e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t
S D S - d e t e c t e d H M W - D N A c l e a v a g e a t t h e e a r l y s t a g e
of d e x a m e t h a s o n e - i n d u c e d a p o p t o s i s in m u r i n e t h y
m o c y t e s is r e v e r s i b l e u n d e r c o n d i t i o n s t h a t favor
t o p o i s o m e r a s e I I - d e p e n d e n t r e j o i n i n g r e a c t i o n [58 ]
(F ig . 3 ) . It is of i n t e r e s t t h a t t h e r eve r s ib i l i t y of
S D S - d e t e c t e d H M W - D N A c l e a v a g e in d e x a m e t h a -
s o n e - t r e a t e d t h y m o c y t e s is los t a t t h e a d v a n c e d s t a g e
of a p o p t o s i s , w h e n o l i g o n u c l e o s o m a l D N A l a d d e r is
d e v e l o p e d (F ig . 3 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t d i f f e r en t n u c
l e a s e s m a y b e invo lved i n t h e H M W - D N A c l e a v a g e a t
t h e d i f f e r e n t s t a g e s of a p o p t o s i s . A l t e r n a t i v e e x p
l a n a t i o n is t h a t a p o p t o s i s - r e l a t e d p r o t e o l y s i s of t o p o
i s o m e r a s e II 124, 4 8 ] c o u l d u n d e r l i e t h e loss of
r e v e r s i b i l i t y of H M W - D N A c l e a v a g e a t t h e a d v a n c e d
s t a g e of a p o p t o s i s .
T h e e x a m i n a t i o n of n u c l e a r D N A d i s i n t e g r a t i o n
in 3 T 3 f i b r o b l a s t s , i n d u c e d to u n d e r g o a p o p t o s i s by
s e r u m d e p r i v a t i o n , a l l o w s u s t o d i v i d e s e v e r a l s t a g e s
of a p o p t o t i c D N A f r a g m e n t a t i o n a s fo l lows. S D S -
d e t e c t e d f o r m a t i o n of H M W - D N A f r a g m e n t s p r o c e e d s
in a t t a c h e d ce l l s a t t h e e a r l y s t a g e of a p o p t o s i s , t h e n
t h e d e t a c h m e n t of t h e ce l l s t a k e s p l a c e , w h i c h is
a s s o c i a t e d w i t h t h e s o d i u m - c h l o r i d e - d e t e c t e d H M W -
D N A c l e a v a g e , fo l lowed b y t h e d e v e l o p m e n t of o l igo
n u c l e o s o m a l D N A l a d d e r . I n t h e c o n s e c u t i v e e v e n t s of
a p o p t o t i c D N A d e g r a d a t i o n t o o c c u r in 3 T 3 cel ls t h e
a p p e a r a n c e of s o d i u m - c h l o r i d e - d e t e c t e d H M W - D N A
f r a g m e n t s s e e m s to b e a t t r i b u t e d to t h e d e t a c h e d
( d e a d ) ce l l s (F ig . 4 ) . At t h e s a m e t i m e t h e S D S -
d e t e c t e d H M W - D N A c l e a v a g e , w h i c h p r e c e d e s t h e
s o d i u m - c h l o r i d e - d e t e c t e d f o r m a t i o n of H M W - D N A
f r a g m e n t s in a p o p t o t i c t h y m o c y t e s (F ig . 2 ) , o c c u r s in
a t t a c h e d s e r u m - d e p r i v e d 3 T 3 cel ls (F ig . 4) a s well a s
i n t h e c o n f l u e n t s e r u m - n o n - d e p r i v e d ce l l s (F ig . 5 ) .
F u r t h e r m o r e , t h e S D S - d e t e c t e d H M W - D N A c l e a v a g e
is r e v e r s i b l e a t t h e e a r l y s t a g e s of a p o p t o s i s u p o n br ief
h e a t t r e a t m e n t of t h e ce l l s (F ig . 3) a n d a f t e r a d d i t i o n
of t h e s e r u m to t h e s e r u m - d e p r i v e d ce l l s 149 |. All
t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t S D S - d e t e c t e d f o r m a t i o n of
H M W - D N A f r a g m e n t s s h a r e s n o c o m m o n f e a t u r e
w i t h a n a p o p t o t i c D N A d e g r a d a t i o n b u t r e p r e s e n t s a n
e a r l y g e n o m i c e v e n t in ce l l s c o m m i t t e d t o u n d e r g o
a p o p t o s i s . I n d e e d , t h e r e is n o d i f f e r e n c e in t h e ab i l i ty
to S D S - d e t e c t e d f o r m a t i o n of H M W - D N A f r a g m e n t s
b o t h in a t t a c h e d s e r u m - d e p r i v e d ce l l s ( p r e a p o p t o t i c
cel ls) a n d s e r u m - n o n - d e p r i v e d ( h e a l t h y ) cel ls ( c o m
p a r e F ig . 4 a n d 5 ) . R e m a r k a b l y , a n i n c r e a s e d for
m a t i o n of S D S - d e t e c t e d H M W - D N A f r a g m e n t s t a k e s
p l ace i n ce l l s s t i m u l a t e d t o u n d e r g o a p o p t o s i s by
n o n - g e n o t o x i c i n d u c e r s , n a m e l y by d e x a m e t h a s o n e ,
a n d b y s e r u m d e p r i v a t i o n . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e
n u c l e u s c o n t a i n s i m p o r t a n t m e d i a t o r s of t h e e a r l y
e v e n t s of a p o p t o s i s e v e n in t h e a b s e n c e of D N A
d a m a g i n g a g e n t s .
I t is b e c o m i n g i n c r e a s i n g l y e v i d e n t t h a t a p o p t o s i s
319
SOLO W A N V. Т.
o c c u r s in r e s p o n s e t o m a n y d i f f e r e n t s t i m u l i , of w h i c h
a pa r t i a l l ist i n c l u d e s w i t h d r a w a l of g r o w t h f a c t o r s ,
i n a p p r o p r i a t e e x p r e s s i o n of g e n e s t h a t s t i m u l a t e cell
cyc le p r o g r e s s i o n , a n d v i ra l i n f e c t i o n . S e v e r a l of t h e s e
fac to r s h a v e in c o m m o n t h e p r o p e r t y t h a t t h e y a l t e r
t h e cell cyc l e , a n d it h a s b e e n p r o p o s e d t h a t a p o p t o s i s
p r i m a r i l y re f l ec t s a cel l c y c l e p e r t u r b a t i o n [50 , 5 1 ].
B e c a u s e t h e m o s t p r o b a b l e e v e n t a c c o m p a n y i n g a cel l
e n g a g e m e n t to a p o p t o s i s m i g h t b e a n a r r e s t of cell
p ro l i f e r a t i on o n e c o u l d a s s u m e t h a t S D S - d e t e c t e d
f o r m a t i o n of H M W - D N A f r a g m e n t s r e f l ec t s c h a n g e s
in p ro l i f e ra t ive s t a t u s of t h e ce l l s . T h i s is f u r t h e r
c o n f i r m e d by t h e d a t a t h a t m o n o l a y e r e s t a b l i s h m e n t
in c o n t i n u o u s l y g r o w i n g 3 T 3 cel ls is a c c o m p a n i e d b y
a n i n c r e a s e d f o r m a t i o n of S D S - d e t e c t e d H M W - D N A
f r a g m e n t s (F ig . 6 ) . O n t h e o t h e r h a n d , t h e s t i
m u l a t i o n of c o n f l u e n t ce l l s t o p r o l i f e r a t i o n b y d i l u t i o n
of m o n o l a y e r is a c c o m p a n i e d b y d e c r e a s e d H M W -
D N A c l e a v a g e [ 4 9 ] . T h e s e d a t a a l low u s t o s u g g e s t
t h a t a n a r r e s t of cel l p r o l i f e r a t i o n m a y u n d e r l i e t h e
f o r m a t i o n of S D S - d e t e c t e d H M W - D N A f r a g m e n t s , a n
even t t h a t s e e m s to r e p r e s e n t a n e a r l y c o m m i t m e n t
s t e p to t h e s u b s e q u e n t a p o p t o s i s .
T h e c l e a v a g e of n u c l e a r D N A i n t o H M W - D N A
f r a g m e n t s t o o c c u r a t t h e e a r l y s t a g e of a p o p t o s i s (o r
a t t h e c o m m i t m e n t s t a g e of a p o p t o s i s ) c l e a r l y i n d i c a t e
t h a t t h e r e is a p e r i o d i c l o c a t i o n of c l e a v a g e s i t e s a l o n g
g e n o m i c D N A . It is b e c o m i n g a p p a r a n t l y e v i d e n t t h a t
in t h e i n t e r p h a s e n u c l e u s e a c h c h r o m o s o m e o c c u p i e s
its own t h r e e - d i m e n s i o n a l s p a c e d u e to t h e e s t a b
l i s h e d c o n t a c t s w i t h t h e p r o t e i n scaffold to g e n e r a t e a
c o m p l e x s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n . A n e x t r a c t i o n of
nuc le i wi th h i g h c o n c e n t r a t i o n of s o d i u m c h l o r i d e
revea l s t h a t n u c l e a r D N A is o r g a n i z e d i n t o t o p o -
logical ly c o n s t r a i n e d l o o p d o m a i n s a n c h o r e d to a
p r o t e i n b a c k b o n e s t r u c t u r e r e f e r r e d to a s t h e n u c l e a r
m a t r i x o r c h r o m o s o m e scaffold [ 2 8 — 3 4 ] .
T o p o i s o m e r a s e I I h a s b e e n s h o w n t o b e a m a j o r
c o m p o n e n t of t h e n u c l e a r m a t r i x a n d p l a y s a n i m
p o r t a n t r o l e in c h r o m o s o m e s t r u c t u r e a n d d y n a m i c s
[ 3 5 — 3 7 ] . S e v e r a l l i n e s of e v i d e n c e s u g g e s t t h a t
t o p o i s o m e r a s e II i s c o n c e n t r a t e d i n a n u m b e r of
d i s c r e t e a n c h o r i n g c o m p l e x e s w h i c h p r o b a b l y f o r m t h e
b a s e s of t h e c h r o m a t i n l o o p d o m a i n s [ 3 5 , 3 8 — 4 0 , r e w
4 1 , 4 2 ] .
P r e v i o u s l y w e d e m o n s t r a t e d t h a t t h e H M W - D N A
f r a g m e n t s , r e s u l t e d f rom t h e t r e a t m e n t of n u c l e a r
D N A p r e p a r a t i o n s w i t h t h e p r o t e i n - d e n a t u r i n g
a g e n t s , c o r r e s p o n d to D N A loop d o m a i n s [ 5 2 ] . T h e
r e l a t i o n of H M W - D N A f r a g m e n t s to t h e D N A loop
d o m a i n s w e r e a l s o c o n c l u d e d by o t h e r a u t h o r s [ 5 3 ,
5 4 ] . W e p r e s e n t e d e v i d e n c e i n d i c a t i n g t h a t D N A loop
d o m a i n s in n o n a p o p t o s i z i n g t i s s u e s a r e invo lved in
func t iona l t o p o i s o m e r a s e I I / D N A c o m p l e x e s w i t h t h e
ab i l i ty to m e d i a t e t h e c l e a v a g e / r e j o i n i n g r e a c t i o n s
[ 5 5 , 5 6 ] . B a s e d o n s t u d i e s w i t h p u r i f i e d t o p o II
e n z y m e s a n d D N A , a t w o - s t a g e m o d e l for t o p o
i s o m e r a s e I I - m e d i a t e d c l e a v a g e / r e l i g a t i o n r e a c t i o n s
h a s b e e n p r o p o s e d [ 4 5 , 4 6 ]. A c c o r d i n g to th i s m o d e l ,
a n e n z y m e / D N A c l e a v a b l e c o m p l e x is t h e k e y cova-
l e n t i n t e r m e d i a t e in t h e t o p o i s o m e r a s e I I - m e d i a t e d
D N A t u r n o v e r w h i c h is in r a p i d e q u i l i b r i u m wi th t h e
n o n c l e a v a b l e c o m p l e x [ 4 5 , 4 6 ]. D N A in t h e c l e a v a b l e
c o m p l e x is b r o k e n , b u t d s D N A b r e a k s a r e h i d d e n
s i n c e t h e y a r e c l a m p e d b y t o p o II e n z y m e . T h e
e x p o s u r e of t h e c l e a v a b l e c o m p l e x to p r o t e i n d e n a -
t u r a n t s s u c h a s S D S o r a l k a l i r e s u l t s in a c l eaved
D N A p r o d u c t i nvo lv ing t h e c o v a l e n t l i n k i n g of t o p o
i s o m e r a s e II s u b u n i t s t o t h e 5 ' - e n d s of b r o k e n D N A
[ 4 5 , 4 6 ] .
P r o c e e d i n g f rom t h e r e s u l t s t h a t s t r u c t u r a l d o
m a i n s of n u c l e a r D N A c o n t r i b u t e to t h e func t iona l
t o p o i s o m e r a s e I I / D N A c o m p l e x [ 5 5 , 5 6 ) it s e e m s
a p p r o p r i a t e to i n t e r p r e t t h e S D S - d e t e c t e d H M W - D N A
c l e a v a g e t o o c c u r a t t h e e a r l y s t a g e of a p o p t o s i s a s a
t r a n s i t i o n of D N A s t r u c t u r a l d o m a i n s f rom « n o n -
c l e a v a b l e » t o «c l eavab l e» s t a t e , m e d i a t e d b y t o p o
i s o m e r a s e I I . O u r r e s u l t s a l l ow u s to s u g g e s t t h a t
c h a n g e s in t h e f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s of t h e c o m p l e x e s
t o p o i s o m e r a s e I I / D N A s t r u c t u r a l d o m a i n s , r e s u l t i n g
in a l t e r e d p a t t e r n of H M W - D N A c l e a v a g e , m a y b e a
p h y s i o l o g i c a l l y v a l u a b l e g e n o m e r e a c t i o n , t h a t u n
d e r l i e s a n e a r l y c o m m i t m e n t s t e p of a p o p t o t i c cell
d e a t h .
T o s u m m a r i z e it c a n b e c o n c l u d e d t h a t c h a n g e s
i n t h e i n t e g r i t y of n u c l e a r D N A , r e c o g n i z a b l e a s a n
a l t e r e d p a t t e r n of S D S - d e p e n d e n t H M W - D N A c l e
a v a g e , r e p r e s e n t a p h y s i o l o g i c a l r e a c t i o n of t h e cel ls
e n g a g e d in a p o p t o s i s . T h i s r e a c t i o n m a y be a s s o c i a t e d
w i t h c h a n g e s in p r o l i f e r a t i v e s t a t u s of t h e cel ls a n d
m a y b e i n t e r p r e t e d a s a t r a n s i t i o n of t o p o i s o m e r a s e
I I / D N A c o m p l e x b e t w e e n « c l e a v a b l e » a n d « п о п с і е -
a v a b l e » s t a t e s .
I t h a n k D r . P . P o g r e b n o y , for k i n d l y p r o v i d e d cell
c u l t u r e s , D r . S. M i k h o l a p for h e l p in f l uo re scen t
a n a l y s i s , a n d I g o r A n d r e e v for e x c e l l e n t a s s i s t a n c e in
c o n d u c t i n g of e x p e r i m e n t s a n d p r e p a r a t i o n of m a
n u s c r i p t . T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e C o m m i t t e e
for F u n d a m e n t a l R e s e a r c h a t t h e N a t i o n a l A c a d e m y
of S c i e n c e s , U k r a i n e .
в. T. Солов'ям
D S - N a - з а л е ж н е розщеплення ядерної Д Н К па
високомолекулярні фрагменти : сигнал до початку апоптозу?
Резюме
У роботі застосовано метод високосолевої екстракції ін
тактних клітин для вивчення динаміки розщеплення ядерної
ДНК при апоптозі. Показано, що апоптоз в первинній куль
турі тимоцитів і культивованих прикріплених клітинах фіб
робластів мииіі супроводжується прогресивною деградацією
ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти розміром 50—
150 тис. п. н. з подальшим формуванням олігонуклеосомних
фрагментів. В апоптозних клітинах розщеплення ядерної
3 2 0
ДНК на ви со ко молекулярні та олігонуклеосомні фрагменти
відбувається як при обробці клітин DS-Na, так і при високо-
солевій, екстракції. Однак на ранніх етапах апоптозу має
місце лише DS-Na-залежна високомолекулярна фрагментація
ядерної ДНК, яка передує формуванню високо молекулярних
фрагментів, що виявляються при високосолевій екстракції
іслітин. На відміну від розривів, які виявляються високосоле-
вою екстракцією, DS-Na-залежне розщеплення ядерної ДНК на
високомолекулярні фрагменти спостерігається в апоптозних
клітинах перед вспливанням, а також має місце в неапоптоз-
них клітинах, що досягли моношару. Показано, що DS-Na-за
лежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фраг
менти на початкових стадіях апоптозу є зворотним в умо
вах, що сприяють залежному від топоізомерази II лігуванню
розривів ДНК. Отримані результати свідчать, що DS-Na-за
лежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фраг
менти є фізіологічною реакцією живих клітин, яка передує
апоптозній деградації ядерної ДНК.
В. Т. Соловьям
DS-Na-заиисимое расщепление ядерной Д Н К на
высокомолекулярные фрагменты: сигнал к началу апоптоза?
Резюме
В работе применен метод высокосолевой экстракции интакт-
ных клеток для изучения динамики расщепления ядерной ДНК
при апоптозе. Показано, что апоптоз в первичной культуре
тимоцитов и культивированных прикрепляющихся клетках
фибробластов мыши сопровождается прогрессивной деграда
цией ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты разме
ром 50—150 тыс. п. н. с последующим формированием олиго-
нуклеосомных фрагментов. В апоптозных клетках расщепле
ние ядерной ДНК на высокомолекулярные и олигонуклеосомные
фрагменты происходит как при обработке клеток DS-Na,
так и при высокосолевой экстракции. Однако на ранних
этапах апоптоза имеет место лишь DS-Na-зависимая высо
комолекулярная фрагментация ядерной ДНК, предшествую
щая формированию высокомолекулярных фрагментов, выяв
ляемых высокосолевой экстракцией клеток. В отличие от
разрывов, обнаруживаемых высокосолевой экстракцией, DS-
Na-зависимое расиитление ядерной ДНК на высокомолекуляр
ные фрагменты наблюдается в апоптозных клетках перед
всплытием, а также имеет место в неапоптозных клетках,
достигших монослоя. Показано, что DS-Na-зависимое расщеп
ление ядерной ДНК на. высокомолекулярные фрагменты на
начальных стадиях апоптоза является обратимым в услови
ях, способствующих опосредованному топоизомеразой II лиги-
рованию разрывов ДНК. Полученные результаты свидетельст
вуют, что DS-Na-зависимое расщепление ядерной ДНК на
высокомолекулярные фрагменты представляет собой физио
логическую реакцию живых клеток, которая, предшествует
апоптозной деградации ядерной ДНК.
R E F E R E N C E S
1. Ellis R. Е., Yuan Y.-Y., Horvitz H. R. Mechanisms and
function of ceil death / / Annu. Rev. Cell Biol. — 1 9 9 1 . — 7 . —
P. 663—668 .
2. Kerr J. F. R., Wyllie A. H., Currie A. R. Apoptosis: a basic
biological phenomenon with wide ranging implications in tissue
kinetics / / Br. J. Cancer . — 1 9 7 2 . — 2 6 . — P . 2 3 9 — 2 5 7 .
3. Wyllie А. П., Kerr /. F. R., Currie A. R. Cell death: the
significance of apoptosis / / Int. Rev. Cy to l .—1980 .—68 .—
P. 2 5 1 - 3 0 5 .
4. McConkey D. J., Orrenius S.t Jondal M. Cellular signaling in
programmed cell death (apoptosis) / / Immunol. T o d a y . —
1 9 9 0 . - 11 .—P. 1 2 0 — 1 2 1 .
S D S - D E P E N D E N T C L E A V A G E ОЕ NUCLEAR DNA
5. Barry M. A., Eastman A. Endonuclease activation during
apoptosis: the role of cytosolic C a 2 + and pH / / Biochem. and
Biophys. Res. Communs .—1992. — 1 8 6 . — P . 782—789 .
6. Caron-Leslie L.-A. M., Schwartzman R. A., Gaido M. L. ei al
Identification and characterizat ion of glucocorticoid-regulated
nuclease(s) in lymphoid cells undergoing apoptosis / / J.
Steroid Biochem. and Мої. Biol. — 1 9 9 1 . — 4 8 . — P . 6 6 1 — 6 7 1 .
7. Arends M. J., Wyllie A. H. Apoptosis: mechanisms and roles
in pathology / / Int. Rev. E x p . Pa tho l .— 1 9 9 1 . — 3 2 . — P . 2 2 3 —
254.
8. Das S. K, Berger N. A. Alterations in deoxynucleoside
tr iphosphate metabolism in DNA damaged cells: implication
and consequences of poly (ADP-r ibose) polymerase dependent
and independent processes / / Biochem. and Biophys. Res.
Communs .—1986 — 1 3 7 . — P . 1 1 5 3 — 1 1 5 8 .
9. Berger N. A., Berger S. J., Sudar D. S., Distelhort C. W. Role
of nicotinamide aden ine dinucleotide and adenoside triphos
phate in glucocorticoid-induced cytotoxicity in susceptible lym
phoid cells / / J. Clin. I n v e s t . — 1 9 8 7 . — 7 9 . — P . 1558—1563 .
10. Denisenko M. F., Soldatenkov V. A., Belovskaya L. ЛЛ,
Filippovich I. V. Is the NAD-poly(ADP-r ibose) polymerase
system the trigger in rad ia t ion- induced death of mouse
thymocytes? / / Int. J. Radia t . B i o l — 1 9 8 9 . — 5 6 — P. 277—
285 .
11 . Patel Т., Gores G. J., Kaufmann S. H. T h e role of proteases
during apoptosis / / FASEB J. — 1 9 9 6 . — 1 0 . — P . 587—597 .
12. Takahashi A., Earnshaw W. C. ICE-re la ted proteases in
apoptosis / / Curr . Opinion Genet , and Develop. — 1 9 9 6 . — 6 . —
P . 5 0 — 5 5 .
13. Kaufmann S. H., Desnoyers S., Ottavia.no Y. et al. Specific
proteolytic cleavage of poly (ADP-r ibose) polymerase: an early
marker of chemotherapy- induced apoptosis / / Cancer Res .—
1 9 9 3 . — 5 3 . — P . 3 9 7 6 — 3 9 8 5 .
14. iMsebnik Yu. A., Cole S., Cooke C. A. et al Nuclear events of
apoptosis in vitro in cell-free mitotic extracts: a model system
for analysis of the active phase of apoptosis / / J. Cell
Bio l .—1993. — 1 2 3 . — P . 7—22 .
15. Zweyer M., Bareggi R., Grill V. et al Behavior of nuclear
matrix proteins during camptothecin- induced apoptosis in HL-
60 human leukemia cells / / E x p . Cell Res. — і 995 .—221 . —
P . 27—40 .
16. Weaver V. M., Carson Ch. E., Walker P. R. ei al. Degradation
of nuclear matrix and DNA cleavage in apoptotic thymocytes
/ / J. Cell Sci. — 1 9 9 6 . — 1 8 9 . — P . 4 5 - - 5 6 .
17. Lasebnik Yu. A., Takahashi A., Moir R. D. et al Studies of
the lamin proteinase reveal multiple parallel biochemical pa th
ways during apoptotic execution / / Proc . Nat. Acad. Sci.
USA. —1995 .—92 — P . 9 0 4 2 — 9 0 4 6 .
18. Hara S., Halicka II. D., Bruno S. et al. Effect of protease
inhibitors on early events of apoptosis / / Exp . Cell Res .—
1 9 9 6 . — 2 2 3 . — P . 3 7 2 — 3 8 4 .
19. Oberhammer F., Fritch G., Schmied M. et al Condensation of
the chromatin at the membrane of an apoptotic nucleus is not
associated with activation of endonuclease / / J. Cell Sci.—
1 9 9 3 . — 1 8 4 . — P . 3 1 7 — 3 2 6 .
20. Brown D. G., Sun X.-M., Cohen G. M. Dexamethasone- in-
duced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments
prior to internucleosomal fragmentation / / J. Biol. Chem.—
1 9 9 3 . — 2 6 8 . — P . 3 0 3 7 - - 3 0 3 9 .
2 1 . Walker P. R., Kokileva L., LeBlanc J., Sikorska M. Detection
of the initial stages of DNA fragmentation in apoptosis / /
BioTechniques. — 1 9 9 3 . — 1 5 . — P . 1032—1040 .
22. Cohen G. M.t Sun X.-M., Fearnhead H. et al. Formation of
large molecular weight fragments of DNA is a key commitment
step of apoptosis in thymocytes / / J . Immuno l . - -1994 . — 153 —
P . 5 0 7 — 5 1 6 .
3 2 1
http://Ottavia.no
SOLOV'YAN V. Т.
23. Oberhammer R, Wilson J. W., Dive C. et al Apoptotic death
in epithelial cells: cleavage of DNA to 300 a n d / o r 50 kb
fragments prior to or in the absence of internucleosomal
fragmentation / / EMBO J. — 1 9 9 3 . — 1 2 . — P . 3679—3684 .
24. Beere H. M., Chresta С. M., Alejokerberg A. et al. Investiga
tion of the mechanism of higher order chromatin fragmentation
observed in drug- induced apoptosis / / Мої. Pharmacol .—
1995 .—47 .—P . 986—996 .
25. Cohen G M., Sun X. M.p Snowden R. T. et al. Key
morphological features of apoptosis may occur in the absence
of internucleosomal DNA fragmentation / / Biochem. J.—
1992 .—286 .—P. 3 3 1 — 3 3 4 .
26. Schulze-Osthoff K., Walczak #., Droge W., Krammer P. H.
Cell nucleus and DNA fragmentation a re not required for
apoptosis / / J. Cell B io l .—1994 .—127 .—P . 15—20.
27. Jacobson M. D., Вите J. F., Raff M. C. Programmed cell
death and Bcl-2 protection in the absence of a nucleus / /
EMBO J. — 1 9 9 4 . — 1 3 . — P . 1899—1910 .
28. Berezney R., Coffey D. S. Identification of a nuclear protein
matrix / / Biochem. and Biophys. Res . Communs .—1974 .—
6 0 . — P . 1410—1417 .
29. Benyajati C, Worcel A. Isolation, character izat ion, and struc
ture of the folded interphase genom of Drosophila tnela-
nogaster II C e l l . — 1 9 7 6 . — 9 . — P . 3 9 3 — 4 0 7 .
30. Cook P. R.t Brazell I. A. Conformational constraints in nuclear
DNA / / J. Cell. Sci. — 1 9 7 6 . — 2 2 . — P . 2 8 7 — 3 0 2 .
3 1 . Adolph K. W.t Cheng S. M., Laemmli if. K. Role of non-histon
proteins in metaphase chromosome structure / / Cel l .—1977.—
12 .—P. 805—816 .
32. Laemmli if. K., Cheng S. M., Adolph K. W. et al. Metaphase
chromosome structure: T h e role of nonhistone proteins / / Cold
Spring Harbor Symp. Quant . Biol. — 1 9 7 8 . — 4 2 . — P . 351 —
360.
33 . Pardoll D. M.t Vogelstein В., Coffey D. S. A fixed site of DNA
replication in eukaryotic cells / / Cell. — 1 9 8 0 . — 1 9 . — P . 5 2 7 —
537.
34. Mirkovitch J., Mirault M.-E., Ілеттіі if. K. Organization of
the higher order chromatine loop: specific DNA at tachment
sites on nuclear scaffold / / Ibid. — 1 9 8 4 . — 3 9 . — P . 223—232 .
35. Earns haw W. C, Heck M. M. S. Localization of topoisomerase
II in mitotic chromosomes / / J . Cell. B io l .—1985 .—100 .—
P. 1716—1725.
36. Berrios M., Osheroff N., Fisher P. A. In situ localization of
DNA topoisomerase II , a major polypeptide component of
Drozophila nuclear matrix fraction / / P roc . Nat. Acad. Sci.
USA. — І 9 8 5 . — 8 2 . — P . 4 1 4 2 — 4 1 4 6 .
37. Cockeri.il P. N., Garrard W. T. Chromosomal loop anchorage
of the kappa immunoglobulin gene occurs next to the enhancer
in a region containing topoisomerase II sites / / Ce l l .—1986.—
4 4 . — P . 2 7 3 — 2 8 3 .
38. Gasser S. M., Laroche Т., Falquet J. et. a I. Metaphase
chromosome structure. Involvement of topoisomerase II / / J.
Мої. Biol.—1 986. — 1 8 8 . — P . 6 1 3 — 6 2 9 .
39. Adachi Y., Kas E., Laemmli U. K. Preferential , cooperative
binding of DNA topoisomerase II to scaffold-associate regions
/ / EMBO J. — 1 9 8 9 . — 8 . — P . 3 9 9 7 — 4 0 0 6 .
40. Sperry A. O.y Blasquez V. C, Garrard W. T. Dysfunction of
chromosomal loop a t tachment sites: Illegitimate recombination
linked to matrix association region and topoisomerase II / /
Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1 9 8 9 . — 8 6 . — P . 5 4 9 7 — 5 5 0 1 .
4 1 . Gasser S. M., Laemmli if. K. A glimpse at chromosomal order
/ / Trends Genet . — 1 9 8 7 . — 3 . — P . 16—22.
42. Poljak L., Kas E. Resolving the role of topoisomerase II in
chromatin structure and function / / Trends Cell Biol.—
1 9 9 5 . — 5 . — P . 348—354 .
43 . Vosberg H.-P. DNA topoisomerases: enzymes that control DNA
conformation / / Curr . Top . Microbiol. Immunol .—1985.—
114 .—P. 91 — 102.
44. Wang J. C. DNA topoisomerases / / Annu. Rev. Biochem.—
1 9 8 5 . — 5 4 . - - P . 665—697 .
45. Osheroff N. Biochemical basis for the interaction of type I and
II topoisomerases with DNA / / Pharmacol . T h e r . — 1 9 8 9 . —
4 1 . — P . 2 2 3 — 2 4 1 .
46. Liu L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs / /
Annu. Rev. B iochem.—1989 .—58 .—P. 3 5 1 — 3 7 5 .
47. Heller C , Pohl F. M. A systematic study of field inversion gel
electrophoresis / / Nucl. Acids R e s . — 1 9 8 9 . — 1 7 . — P . 5989—
6003 .
48 . Kaufmatin S. H. Induction of endonucleolytic DNA cleavage in
human acute myelogenous leukemia cells by etoposide, campto-
thecin, and other cytotoxic ant icancer drugs: a cautionary note
/ / Cancer R e s . — 1 9 8 9 . — 4 9 . — P . 5 8 7 0 — 5 8 7 8 .
49. Solovyan V. Т., Andreev I. O., Kolotova T. Yu. et al. An
ordered disintegration of nuclear DNA as a specific genome
reaction accompanying apoptosis, stress response and differen
tiation / / Biopolymers and Cell. — I 996. — 1 2 , N 3 .—P. 6 7 —
76.
50. ticker D. S. Death by suicide: one way to go in mammalian
cellular development II New Biologis t .—1991.—3.—P. 103—
109.
5 1 . Sen S., D'lncalci M. Apoptosis. Biochemical events and
relevance to cancer chemotherapy / / FEBS Let t .—1992.—
3 8 7 . — P . 122—127.
52. SoloVyan V. Т., Andreev I. O., Kunakh V. A. The fractiona
tion of eukaryotic DNA by pulsed field gel electrophoresis. II.
The discrete DNA fragments and the levels of chromatin
structural organization / / Molec. Biol. (Russia). — 1991 .—
2 5 . — P . 1159—1163 .
5 3 . Filipski /., Leblanc Youdale T. et al Periodicity of DNA
folding in higher o rder chromatin structure / / EMBO J.—
1 9 9 0 . — 9 . — P . 1319—1327 .
54 . Razin S. V., Hancock R., larovaia O. el al. Structural and
functional organization of DNA domains / / Cold Spring
H a r b o r Symp. Quant . B i o l . — 1 9 9 3 . — 5 8 . — P . 2 5 — 3 5 .
5 5 . SoloVyan V. Т., Andreev J. Q.t Kunakh V. A. Functional
organization of plant nuclear DNA. I. Evidence for a DNA-
Topoisomerase II complex / / Мої. Biol. (Russia). — 1 9 9 3 . —
2 7 . — P . 770—774 .
56 . SoloVyan V. Т., Andreev I. O. Structural domains of plant
nuclear DNA as a constitutive component of topoisomerase
I I /DNA complex / / Acta biochim. poi .— 1995.—42, N 2 .—P.
201—204 .
57. Lichtenstein A. V., Zaboikin M. M.f Sjakste N. I., Alechina
R. P. Differential dissociation of chromatin digests: a novel
approach revealing a hierarchy of DNA-protein interactions
within chromatin domains / / J. Cell Sci.—1991 . — 9 9 . —
P . 5 0 3 — 5 1 3 .
58 . Hsiang Y.-H., Liu L. F. Evidence for the reversibility of
cellular DNA lesion induced by mammalian topoisomerase И
poisons II J. Biol. Chem.— 1 9 8 9 . — 2 6 4 . — P . 9 7 1 3 - 9715.
Received 24.12.96
3 2 2
http://Cockeri.il
|