Создание системы для переноса генов посредством ретровируса на основе Pr-RSV-C с расширенной хозяйской специфичностью
Провирус адаптированного к уткам варианта вируса Pr-RSV-C и его трансформационно-дефектного мутанта послужил основой для создания репликативно-компетентного вектора td da Pr-RSV-C е~ и вируса-помощника td da Pr-RSV-C е PSNeo, необходимого для упаковки рпликативно-дефектного ретровирусного вектора. Д...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1997 |
| Main Authors: | , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1997
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155648 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Создание системы для переноса генов посредством ретровируса на основе Pr-RSV-C с расширенной хозяйской специфичностью / И.В. Кайда, Л.А. Цыба, П.Н. Болтовец, В.И. Кашуба // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 5. — С. 408-415. — Бібліогр.: 27 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860126728146386944 |
|---|---|
| author | Кайда, И.В. Цыба, Л.А. Болтовец, П.Н. Кашуба, В.И. |
| author_facet | Кайда, И.В. Цыба, Л.А. Болтовец, П.Н. Кашуба, В.И. |
| citation_txt | Создание системы для переноса генов посредством ретровируса на основе Pr-RSV-C с расширенной хозяйской специфичностью / И.В. Кайда, Л.А. Цыба, П.Н. Болтовец, В.И. Кашуба // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 5. — С. 408-415. — Бібліогр.: 27 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Провирус адаптированного к уткам варианта вируса Pr-RSV-C и его трансформационно-дефектного мутанта послужил основой для создания репликативно-компетентного вектора td da Pr-RSV-C е~ и вируса-помощника td da Pr-RSV-C е PSNeo, необходимого для упаковки рпликативно-дефектного ретровирусного вектора. Для снижения вероятности включения клеточных прото-онкогенов в состав ретровирусного вектора последовательности Е-элемента, предположительно вовлеченные в этот процесс, делетированы. Было показано, что (УГб-клетки, трансформированные последовательностями вируса-помощника td da Pr-RSV-C e'PS'Neo продуцируют вирусные белки, в том числе p27gag7 на уровне, необходимом для. сборки репликативно-дефектного ретровирусного вектора. Помимо этого, из-за модифицирования генома вируса-помощника не происходит включения его собственной РНК в состав вириона и сборки полноценной инфекционной вирусной частицы. Это подтверждается тестированием супернатантов упаковочных клонов методом обратной транскрипции: большинство из них не показывают включения [3Н]ТТР в реакции обратной транскрипции, характерного для репликативно-компетентного вируса.
Провірус адаптованого до качок варіанту вірусу Pr-RSV-C та його трансформаційно-дефектного мутанту став основою для створення реплікативно-компетентного вектора td da Pr-RSV-C е та. вірусу-помічника td da Pr-RSV-C е PS Neo, необхідного для упаковки реплікати&но-дефектного ретровірусного вектора. Для того щоб знизити вірогідність включення клітинних протоопко генів до складу ретровірусного вектора, послідовності Е-елементу, які можуть бути залучені до цього процесу, делетовано. Було показано, що QTb-клітини, трансформовані послідовностями вірусу-помічника td da PrRSV-C е PS Neo, продукують вірусні білки, зокрема p27gag, у кількості, необхідній для складання реплікативно-дефектного ретровірусного вектора. Геном вірусу-помічника модифіковано таким чином, що його власна РНК не включається до складу віріону та не відбувається складання повноцінної інфекційної частинки. Цей факт підтверджено тестуванням супернатантів пакуючих клонів методом зворотної транскрипції: більшість з них не показала включення HTTP у реакції зворотної транскрипції, характерного для регигікативно-компетентного вірусу,
We have constructed retroviral vector td da Pr-RSV-C e and helper virus td da Pr-RSV-C e' PS'Neo based on the duck-adapted variant of Pr-RSV-C with the extended host ranger and its transformation-defective mutant. To decrease the risk of transducing cell proto-oncogencs, E-element, supposedly involved in this process, was deleted. In order to obtain helper cell line the QT6 cells have been transfected by helper phismid p td da Pr-RSV-C e'PS~Neo. Packaging cells produce viral proteins, including p27gag, but intact helper virus is not detectable in reverse trans criptaxe assay.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:43:11Z |
| format | Article |
| fulltext |
ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1997. Т. 13. № 5
ГЕННОИНЖЕНЕРНАЯ Б И О Т Е Х Н О Л О Г И Я
Создание системы для переноса генов
посредством ретровируса на основе Pr-RSV-C
с расширенной хозяйской специфичностью
И. В. Кайда, Л. А. Цыба, П. Н. Болтовец, В. И. Кашуба
Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины
252143, Киев, ул. Академика Заболотного, 150
Провирус адаптированного к уткам варианта вируса Pr-RSV-C и его трансформационно-дефект-
ного мутанта послужил основой для создания репликативно-компетентного вектора td da
Pr-RSV-C е~ и вируса-помощника td da Pr-RSV-C е PSNeo, необходимого для упаковки решикатив-
но-дефектного ретровирусного вектора. Для снижения вероятности включения клеточных прото-
онкогенов в состав ретровирусного вектора последовательности Е-элемента, предположительно
вовлеченные в этот процесс, делетированы. Было показано, что (УГб-клетки, трансформирован
ные последовательностями вируса-помощника td da Pr-RSV-C e'PS'Neo продуцируют вирусные
белки, в том числе p27gag7 на уровне, необходимом для. сборки репликативно-дефектного
ретровирусного вектора. Помимо этого, из-за модифицирования генома вируса-помощника не
происходит включения его собственной РНК в состав вириона и сборки полноценной инфекционной
вирусной частицы. Это подтверждается тестированием супернатантов упаковочных клонов
методом обратной транскрипции: большинство из них не показывают включения [3Н]ТТР в
реакции обратной транскрипции, характерного для репликативно-компетентного вируса.
Введение. Ретровирусы нашли широкое примене
ние как векторы для переноса эндогенных последо
вательностей в эукариотические клетки благодаря
их уникальной способности интегрировать в специ
фические участки генома клетки-хозяина [1 ]. По
следовательности вирусных генов в ретровирусном
векторе частично или полностью заменяют на чу
жеродные кодирующие последовательности, кото
рые в составе вирусной частицы проникают в
клетку. Таким образом можно добиться переноса и
стабильной экспрессии кодирующих последователь
ностей величиной 7—10 тыс. пар нуклеотидов ( п.
н.) в делящихся клетках in vitro и in vivo. Приме
нение ВИЧ в качестве вектора дало возможность
получить экспрессию трансгена и в неделящихся
клетках [2] .
Поскольку рекомбинантный ретровирусный ве
ктор репликативно дефектен из-за отсутствия соб
ственных структурных генов, полностью или час
тично замещенных на чужеродные, то для получе-
© И. В. КАЙДА, Л. А Ц Ы Б А , П. Н. Н О Л Т О В Е Ц ,
В. И. К А Ш У Б А , 1997
ния инфекционных частиц такому репликативно-
дефектному векторному вирусу необходим вирус-
помощник. Поэтому были созданы упаковочные
клеточные линии, экспрессирующие вирусные бел
ки, в которых происходит «сборка» рекомбинантно-
го ретровирусного вектора без продукции реплика
тивно-компетентного вируса дикого типа [3, 4 ] .
Подробно о репликативно-дефектных ретровирус-
ных системах для переноса генов у птиц см. [5 ].
Трансформационно-дефектный мутант адапти
рованного к уткам варианта пражского штамма
вируса саркомы Рауса (td da P r -RSV-C) , выделен
ный из вирусного пула da P r -RSV-C с расширенной
хозяйской специфичностью [6], был использован
при создании упаковочных клеток как вирус-по
мощник. Модифицирование исходного провируса td
da Pr -RSV-C направлено на исключение продук
ции репликативно-компетентного вируса упаковоч
ными клетками: делетирование сигналов упаковки
делает невозможным включение собственной ге
номной Р Н К в состав псевдотипированного вирио
на, несущего Р Н К репликативно-дефектного векто
ра , п р о д у ц и р у е м о г о у п а к о в о ч н ы м и к л е т к а м и .
408
С О З Д А Н И Е С И С Т Е М Ы Д Л Я П Е Р Е Н О С А ГЕНОВ
Включение вместо src-гена последовательностей ге
на неомицинфосфотрансферазы под промотором
вируса SV40 позволяет вести селекцию упаковоч
ных клеток в культуре,
Хозяйская специфичность векторного вируса и
спектр клеток-мишеней зависит от Env-белка обо
лочки вириона [7] . Расширение хозяйской специ
фичности произошло в течение повторяющихся
пассажей Pr-RSV-C на клетках условно-пермиссив-
ного хозяина — утки. Полученный таким образом
вирус был назван адаптированным и отличался от
Pr-RSV-C, в основном, последовательностями, ко
дирующими gp85 домен гена envy ответственный за
узнавание вирусом соответствующего рецептора на
поверхности клетки [8 ]. Благодаря таким измене
ниям адаптированный da Pr -RSV-C может инфи
цировать клетки не только условно-пермиссивного
хозяина — утки, но и клетки млекопитающих [9 ].
Вирусные последовательности интегрируют, однако
вирусная продукция отсутствует. Причиной может
быть нарушение транспорта полноразмерной ге
номной Р Н К в цитоплазму, а также невозможность
эффективного процессирования, сборки и транс
портировки (^^-предшественника в клетках млеко
питающих [10] . Однако это не мешает стабильной
экспрессии вставленного гена в тканях трансген
ных млекопитающих [ I I ] , инфицированных ре-
пликативно-компетентным векторным вирусом на
базе RSV, несущим вместо src последовательность
вставленного гена под контролем тканеспецифиче-
ского промотора. Тот факт , что вирус полностью
репликативно-дефектен в клетках млекопитаю
щих, открывает возможность использовать решти-
кативно-компетентный вектор на его основе для
переноса чужеродных генов в ткани млекопитаю
щих и делает td da Pr -RSV-C особенно привлека
тельным как вектор для генной терапии.
Однако интеграция ретровируса в геном живо
тного может привести к трансдукции клеточных
протоонкогенов и восстановлению трансформаци
онных свойств векторного вируса [12] . Чтобы уме
ньшить вероятность этого процесса, участок генома
td da Pr-RSV-C, названный Е-елементом [13] и
предположительно вовлеченный в этот процесс (Я.
Свобода, частное сообщение), делетировали при
создании конструкции репликативно-компетентно
го векторного вируса td da Pr -RSV-C е и вируса-
помощника td da Pr-RSV е PS Neo.
Материалы и методы. Плазмиды. Из Д Н К
клона DF3 геномной библиотеки утиных эмбрио
нальных фибробластов, содержащего полный про-
вирус da Pr-RSV-C [8 ] , выделен КрпІ-КрпІ-фрат-
мент 6,0 тыс. п. н, и субклонирован в плазмиде
pUC19 (рб.О, рис. 1). Этот фрагмент несет последо
вательности 5 ' -LTR, gag, poL И з клона DFtd7 [8] ,
содержащего дефектный провирус td da Pr -RSV-C,
выделили /Срд/-£)гя/-фрагмент, включающий по
следовательности env, Е-элемеита и З '-LTR td da
Pr -RSV-C, и субклонировали в плазмиде pUC19
(р2.8, см. рис. 1). pSV2~[3G [14] содержит последо
вательности Simian Virus 40 (SV40) промотора.
Бактериальный ген устойчивости к неомицину (G
418) взят из pBR322Neo [14] ,
Ферменты. В работе использованы эндонукле-
азы рестрикции («Boehringer Mannheim», Герма
ния) , Т4~ДНК-лигаза («Promega», С Ш А ) , фраг
мент Кленова Д Н К - п о л и м е р а з ы I Escherichia coli
(«Boehringer Mannheim») .
Клетки и среды. Q T 6 [15] (химически транс
формированные фибробласты перепелки, свобод
ные от эндогенных последовательностей) любезно
предоставлены д-ром Г. Калоти (Ин-т Кюри, Фран
ция) и д-ром Я . Гериком (Ин-т молекулярной
генетики Чешской Академии Наук . Чехия) , QT6-
клетки культивировали на среде D M E M / F 1 0 (1:1)
с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыво
ротки («Биопол», Россия) и 1 % куриной сыворот
ки (Ин-т молекулярной генетики Ч А Н ) . Гибридом-
ные клетки линии H Y . 2 L 6 (Е. Humfries) , продуци
р у ю щ и е а п 1 і - р 2 7 £ Я £ - а н т и т е л а , т а к ж е л ю б е з н о
предоставленные д-ром Я, Гериком, культивирова
ли на среде D M E M / F 1 0 (1:1) с добавлением 10 %
телячьей сыворотки («Sigma», С Ш А ) .
Трансфещия. Плазмидную Д Н К вводили в
клетки QT6 методом электропорации [16] : 750 тыс.
клеток трансформировали 1 мкг плазмидной Д Н К
током импульсом 1,5 к В / с м в течение 100 мкс.
Затем высевали трансформированные клетки по
500 тыс. на чашку диаметром 60 мм и селектиро
вали на среде с добавлением G 418 («СІВСО BRL»,
США) (60 мкг /мл) в течение 14 дней. Индивиду
альные клоны отбирали с помощью цилиндров для
клонирования.
Определение вирусных белков методом ELISA.
Продукцию вирусных белков детектировали мето
дом твердофазного иммуноферментного анализа с
ап1і-р27^а^-антителами [17] . p27gag кодируется ге
ном gag и является капсидным белком вириона.
Anti-p27gag получали из гибридомы HY.21.6
(титр менее 1 мкг антител в 1 мл культуральной
среды). Для повышения титра антител гибридому
пассировали в линейных мышах B A L B / c У трехме
сячных самцов индуцировали асцит внутрибрю-
шинным введением 400 мкл пристана («Serva»,
Германия) . Через две недели в образовавшуюся
опухоль вводили 1,2 млн клеток HY.21.6 и через 14
дней провели забор асцитной жидкости из образо
вавшегося асцита. Иммуноглобулины фракциони-
409
КАЙ ДА И. В. И Д Р .
Рис. 1. Схема получения ировируса репликативно-компетентного трансформационно-дефектного вируса саркомы Рауса (р td da
Pr-RSV-C) и удаления Е-элемента. Прямоугольниками обозначены ретровирусные гены gag, poly env, а также последовательности
Е-элемента, упаковочные последовательности (у) и LTR. Бактериальная часть конструкции показана тонкой изогнутой линией
ровали методом осаждения в 50 % - м сульфате
аммония [18 ].
Продукцию p27gag определяли в еупернатан-
тах и клеточных лизатах упаковочных клеток.
Трипсинизированные клетки осаждали в течение
3 мин при 1500 о б / м и н , суспендировали в 200 мкл
фосфатного буфера и лизировали двукратным раз
мораживанием — оттаиванием. Клеточные облом-
410
ки о с а ж д а л и ц е н т р и ф у г и р о в а н и е м (10 м и н ,
8000 о б / м и н ) , а полученный лизат отбирали и
определяли p27gag в 0,2 мкг суммарного белка
[17] .
Для тестирования супернатанта упаковочных
клеток на наличие p27gag снятый с клеток супер-
натант центрифугировали в течение 15 мин при
3000 об /мин для освобождения от дебриса, а затем
50 мкл супернатанта применяли в одной реакции
ELISA.
Для определения p27gag использовали прямой
ИФА [17] с anti~p27gag в количестве 0,8 мкг в
лунку. Биотинилированные антитела кролика про
тив IgG мыши («ДиаГен», Россия) в разведении
1:500 и авидин-пероксидазу («Sigma») (1:1500)
применяли для тестирования клеточных лизатов на
наличие p27gag, а для тестирования клеточных
супернатантов пользовались конъюгатом кроль —
антимышь, меченным пероксидазой, в разведении
1:800.
Определение вирусной продукции обратной
транскрипцией. Супернатант упаковочных клонов
центрифугировали (15 мин, 3000 об /мин) для оса
ждения дебриса. Д л я одной реакции обратной
транскрипции использовали систему: 15 мкл супер
натанта упаковочного клона; 1 мкМ водный р-р
[ 3 Н ] Т Т Р (5*10 ъ им п /мин) («Amersham», Англия);
5 мкг poIy(rA) -pdT12-18 («Promega»); 10 мМ трис-
НС1, рН 7,4; 10 мМ дитиотреитол; 5 мМ MgCl 2 ;
0,05 % тритон Х-100 («Мегск», Германия) .
Обратную транскриптазу определяли в течение
1 ч при температуре 42 °С. Включение [ 3 Н ] Т Т Р
выявляли, используя DE 81 («Whatman», С Ш А ) .
Несвязавшиеся трифосфаты отмывали 5 % - м рас
твором гидрофосфата натрия и после высушивания
подсчитывали количество и м п / м и н на счетчике
радиоактивности « В е с к т а п » ( С Ш А ) , пользуясь
сцинтилляционной жидкостью «Весктап».
Результаты и обсуждение . Основой для созда
ния провирусов репликативно-компетентного век
тора и вируса-помощника служили последователь
ности адаптированного к уткам варианта вируса
саркомы Рауса и его трансформационно-дефектно-
го мутанта. Адаптированный к уткам вариант Pr-
RSV-C с расширенной хозяйской специфичностью
[8 ] выделен из геномной библиотеки эмбриональ
ных фибробластов уток, трансформированных in
vitro Pr-RSV-C и прошедших 30 пассажей в куль
туре клеток [6 ]. Из Д Н К клона DF3 , содержащего
полный провирус da P r -RSV-C, выделен КрпІ-
/Сря7-фрагмент (см. рис. 1) и субклонирован в
pUC19 (рб.0). Этот фрагмент включает в себя
5 ' -LTR, гены gag, рої. В то же время из клона
DFtd7, содержащего последовательности трансфор-
С О З Д А Н И Е С И С Т Е М Ы Д Л Я П Е Р Е Н О С А ГЕНОВ
мационно-дефектного мутанта td da Pr -RSV-C,
выделен КрпІ-ОгаІ-фрагмепт, состоящий из после
довательностей З ' -LTR, З ' -нетранслируемого райо
на, включая Е-элемент, а т а к ж е гена env, и суб-
клонировали в pUC19 (р2.8). Клонированный про
вирус td da Pr -RSV-C имеет неполный gag-ген и не
содержит 5 ' -LTR. Этот дефект был устранен за
счет аналогичных последовательностей da Pr-RSV-
С. Д л я этого рекомбинантную илазмиду р2.8 рас
щепляли по КрпІ-сакту и лидировали с Kpnl-Kpnl-
фрагментом из плазмиды рб.0. Полученный реком-
бинант содержал 5 ' -LTR и гены gag, рої из
провируса da P r -RSV-C, а т а к ж е ген env и З '-LTR
из провируса td da P r - R S V - C Т а к и м образом
получили провирус репликативно-компетентного
трансформационно-дефектного мутанта da Pr-RSV-
С и базовую конструкцию для создания провируса
репликативно-компетентного вектора р td da Pr-
RSV-C е и вируса-помощника р td daPr -RSV-C
e P S Neo.
Д л я предотвращения восстановления транс
формирующих свойств векторного вируса при пас
сировании его in vivo делетировали Е-элемент [19] ,
обрабатывая р2.8 эндонуклеазами Ball и Ms til.
Размер внесенной делеции составил около 100 н. п.
р2.8е~ обрабатывали эндонуклеазой Крп! и лигиро-
вали с КрпІ-КрпІ-фратмттом плазмиды рб.0. Пла-
змида р Id da Pr -RSV-C е , являющаяся провиру-
сом репликативно-компетентного вектора, стала
основой для создания конструкции вируса-помощ
ника.
Экспрессия структурных генов ретровирусов
gag, рої, env была получена введением в культуру
перепелиных клеток QT6 клонированного в составе
бактериальной плазмиды pUC19 провируса вируса-
помощника р td da P r -RSV-C e 'PS 'Neo. Ген устой
чивости к G 418, необходимый для ведения селек
ции в культуре клеток, поместили под внутренним
промотором вируса SV40 для усиления его транс
крипции [20, 21 ]. Фрагмент с последовательностя
ми SV40 промотора лигировали с HindiII-BamHI
фрагментом, несущим последовательность гена не-
омицинфосфотрансферазы, в составе pBR322 (рис
2) . Nhe-EcoRI-фрЗіГмеит pBR322 $V4QNeo включи
ли в состав р2.8е~ по Sad. Д л я того чтобы предот
вратить упаковку собственной Р Н К вируса-помощ
ника, в его ировирусе необходимо делегировать
сигналы упаковки, расположенные между 5 - L T R и
gag-инициирующим кодоном [22] . Д л я этого в рб.0
удалили BstII-PstI-фрагмент длиной 100 п. н. в
5 ' -нетранслируемой области (см. рис. 2) . Конструк
ция вируса-помощника р td da PR-RSV-C e P S N e o
получена лигированием рб.0 PS и p2.8e'Neo по
КрпІ-сайту.
411
КАЙ ДА И. В. И Д Р .
Рис. 2. Схема создания конструкции вируса-помощника. Часть конструкции, относящаяся к бактериальному вектору, обозначена
тонкой изогнутой линией. Ретровирусные гены gag, рої, env, а также упаковочные последовательности {у ) и LTR обозначены
прямоугольниками. Neo — ген неомицинфосфотрансферазы; SV40 — промотор вируса SV40. Стрелками указаны сайты для
соответствующих рестриктаз
Д Н К вируса-помощника р td da Pr -RSV-C сом 1,5 кВ /см в течение 100 мкс было достаточным
e'PS'Neo трансфекцией вводили в клетки QT6. для эффективного проникновения Д Н К в клетки
Использование для электропорации тока импуль- QT6 (эффективность трансфекции составила 21
412
колонию на 1 мкг плазмидной Д Н К ) и не оказало
значительного повреждающего действия на клеточ
ную мембрану: только около 10 % трансформиро
ванных клеток утратили жизнеспособность в ре
зультате воздействия током. После недельной се
л е к ц и и на среде с G 4 1 8 было отобрано 18
индивидуальных клонов. Их клеточный суперна-
тант проверяли на наличие репликативно-компе-
тентного вируса методом обратной транскрипции
(таблица), что позволило сделать вывод о полноте
внесенной делеции сигналов упаковки в конструк
ции вируса-помощника, Большинство клонов не
показали включения [ 3 Н ] Т Т Р в реакции обратной
транскрипции. Однако при длительном пассирова
нии (7—9 пассажей) прослеживалась тенденция к
увеличению счета, регистрируемого после реакции
обратной транскрипции (F18), a F3 и F33 показали
счета, аналогичные da Pr-RSV-C на QT6 .
Десять из упаковочных клонов тестировали на
продукцию вирусного p27gag в клеточном лизате
(см. таблицу) . В качестве отрицательного контроля
использовали лошадиный сывороточный альбумин.
Достаточно высокий уровень положительного сиг
нала при тестировании клеточного лизата Q T 6 -
клеток можно отнести на счет возможного связыва
ния конъюгата с клеточными белками [17] . При-
С О З Д А Н И Е С И С Т Е М Ы Д Л Я П Е Р Е Н О С А ГЕНОВ
сутствие p27gag обнаружено и в клеточном супер-
натайте упаковочных клонов, однако четкой корре
ляции между уровнем продукции p27gag в клеточ
ном лизате и в супернатанте упаковочных клеток,
описанных в работе [23 ] , в нашем случае не
наблюдалось. Этот факт , скорее всего, связан с
маскировкой истинного связывания моноклональ-
ных апії-р27#а£-антител с антигеном из-за присут
ствия в клеточном супернатанте агента, препятст
вующего эффективному связыванию комплекса ан
т и г е н — а н т и т е л о с к о н ъ ю г а т о м к р о л ь —
антимышь. Возможно, это связано с наличием эм
бриональной телячьей сыворотки и куриной сыво
ротки в клеточном супернатанте . Таким образом,
было доказано, что упаковочные клетки, созданные
на базе последовательностей трансформационно-
дефектного мутанта , адаптированного к уткам ва
рианта Pr -RSV-C, способны продуцировать вирус
ные белки в <ЗТ6-клетках на уровне, сопоставимом
с таковым у клеток, содержащих последовательно
сти полного провируса da P r -RSV-C и необходимом
для упаковки репликативно-дефектного ретрови-
русного вектора.
При создании конструкции вируса-помощника
мы ограничились минимальными изменениями в
последовательности da P r - R S V - C , которые необхо-
Продукция p27gag и обратно транскриптазная активность упаковочных клонов
П р и м е ч а н и е . *Уровень продукции p27gag в клеточных лизатах и супернатантах упаковочных клонов, определенный ELISA;
**лошадиный сывороточный альбумин.
413
КАЙ Д А И. В И Д Р .
димы для предотвращения упаковки РНК вируса
дикого типа и селекции упаковочных клонов в
культуре клеток. Столь популярный в последние
годы подход, заключающийся в глубоком модифи
цировании последовательностей вируса-помощника
для предотвращения рекомбинаций с векторным
вирусом за счет включения последовательностей
различных ретровирусов в состав конструкции ви
руса-помощника: LTR одного вируса, polyA другого
[24]; а также в разнообразном модифицировании
env [25], введении внутренних промоторов и амп
лификации вирусных генов [26 |, повлек за собой
проблему неустойчивости получаемого ретровирус-
ного вектора. При пассировании такого химерного
вектора в культуре клеток наряду с низким титром
отмечают высокую частоту делетирования различ
ных последовательностей, что часто приводит в
конечном итоге к элиминации популяции химерно
го векторного вируса — он не выдерживает давле
ния отбора в культуре клеток.
Главное ограничение всякой репликативно-де-
фектной системы — отсутствие репликативно-ком-
петентного вируса в пуле продуцируемого упако
вочными клетками репликативно-дефектного век
т о р н о г о в и р у с а . О с н о в н ы м и п р и ч и н а м и
восстановления р е п л и к а т и в н о й компетентности
считают гомологическую рекомбинацию между по
следовательностями векторного вируса, вируса-по
мощника, эндогенных вирусов и их «обломков».
Модифицируя вирус-помощник и подбирая соот
ветствующий вектор в опухолевых клетках, не
несущих эндогенных последовательностей [24, 2 7 ] ,
либо в клетках животного иного вида [24 ] решают
на какое-то время проблему широкого распростра
нения репликативно-компетентного или восстанов
ления вируса дикого типа, имеющих селективное
преимущество перед репликативно-дефектным век
тором.
Наличие высокого уровня «шума» в реплика-
тивно-дефектных системах, а т акже их небольшая
продуктивность сместили их с лидирующих пози
ций в системах для переноса генов. Однако, не
смотря на более высокую продуктивность и техно
логичность аденовирусных, полиомавирусных и л и -
п о с о м н ы х с и с т е м , з а м а н ч и в у ю в о з м о ж н о с т ь
встраивать гены непосредственно в геном и насле
довать их по меньшей мере в двух поколениях
трансгенных животных предоставляют только ре-
тровирусы. Исследования, проведенные с реплика-
тивно-дефектными системами, а т акже работы по-
следних лет, касающиеся расширения хозяйской
специфичности птичьих ретровирусов, показывают
значительные преимущества применения птичьих
репликативно-компетентных систем для переноса
генов в клетки млекопитающих: решшкативно-
компетентный вектор генетически более стабилен,
чем репликативно-дефектный; для его наработки
нет необходимости в упаковочных клетках , а пас
сирование его на CEF-0 (свободных от эндогенных
последовательностей) дает достаточно высокую
продукцию векторного вируса [10, 11 J. Поскольку
RSV полностью репликативно-дефектен в клетках
млекопитающих, это открывает возможность при
менения векторов на его основе в генной терапии.
Авторы выражают благодарность С В. Зубаку
и А. И. Михаилику за участие в создании ретрови-
русных конструкций; С. М. Серову — за помощь в
создании упаковочных клеток; К. Д. Маковой — за
участие в получении ant\-p27gag и Л. Л. Сидо-
рик — за помощь в отработке параметров ELISA
системы для определения вирусного p27gag.
I. В. Кайда, Л. А Циба, П. Н. Болтовець, В. I. Кашуба
Створення системи для ретровірусного переносу генів за
допомогою векторного вірусу на базі Pr-RSV-C
з розширеною хазяйською специфічністю
Резюме
Провірус адаптованого до качок варіанту вірусу Pr-RSV-C та
його трансформаційно-дефектного мутанту став основою
для створення реплікативно-компетентного вектора td da
Pr-RSV-C е та. вірусу-помічника td da Pr-RSV-C е PS Neo,
необхідного для упаковки реплікати&но-дефектного ретро
вірусного вектора. Для того щоб знизити вірогідність вклю
чення клітинних протоопко генів до складу ретровірусного
вектора, послідовності Е-елементу, які можуть бути залучені
до цього процесу, делетовано. Було показано, що QTb-клітини,
трансформовані послідовностями вірусу-помічника td da Pr-
RSV-C е PS Neo, продукують вірусні білки, зокрема p27gag, у
кількості, необхідній для складання реплікативно-дефектного
ретровірусного вектора. Геном вірусу-помічника модифіковано
таким чином, що його власна РНК не включається до складу
віріону та не відбувається складання повноцінної інфекційної
частинки. Цей факт підтверджено тестуванням суперна-
тантів пакуючих клонів методом зворотної транскрипції:
більшість з них не показала включення HTTP у реакції
зворотної транскрипції, характерного для регигікативно-ком
петентного вірусу,
І. V Kaida, L. A. Tsyba, P. N. Boltovets, V. J. Kcshuba
A new retroviral vector system based on the duck-adapted variant of
Pr-RSV-C with the extended host ranger
Summary
We have constructed retroviral vector td da Pr-RSV-C e and helper
virus td da Pr RSV-C e PS Neo based on the duck-adapted variant
of Pr-RSV-C with the extended host ranger and its transformation-
defective mutant To decrease the risk of transducing cell pro-
tooncogenes, E-element, supposedly involved in this process, was
deleted. In order to obtain helper cell line the QT6 cells have been
transfected by helper p las mid p td da Pr-RSV-C e'PSNeo*
Packaging cells produce viral proteins, including p27gagf but intact
helper virus is not detectable in reverse transcriptase assay.
414
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Zoubak S.f Rynditch A , Bernardi G. Compositional bimodality
and evolution of retroviral genomes / / G e n e . — 1 9 9 2 . — 1 1 9 . —
P. 207—213
2. Shimada T. Targeted gene transfer into CD4 positive cells by
HIV based vectors / / Int. Symp. on Human Gene Therapy
(Sept. 10—13, 1995).—Inuyama and Nagoya, 1995.—P. 29.
3. Boerkoel C. F.t Federspiel M.t Salter D. W. et al A new
retroviral system based on the Bryan Strain of Rous Sarcoma
Virus / / J. Viro l .—1993.—195.—P. 669—679 .
4. Miller A D. Retrovirus packaging cells / / Human Gene
Therapy.—1990.—1.—P. 5—14.
5. Кайда И. В., Рындич А В. Применение ретровирусных
векторов для целенаправленного переноса генов у птиц / /
Биополимеры и клетка.—1997.—13, № 1.-— С. 5 — 1 3 .
6. Кашуба В. И., Зубах С. В., Рындич А В. и др. Структура
нового трансформационно-дефектного мутанта вируса сар
комы Рауса / / Докл. АН С С С Р . — 1 9 8 9 . — 3 0 4 . — С . 206—
208.
7. Bova-Hi.ll С , Swanstrom R. Genetic analysis of the RSV
subgroup D env gene: mammal-tropism correlates with tem
perature sensitivity of gp85 II J. Virol. — 1 9 9 1 . — 6 5 . —
P. 2073—2080.
8. Кашуба В. И., Кавсан В. М., Рындич А В. и др. Полная
нуклеотидная последовательность адаптированного к клет
кам уток варианта вируса саркомы Рауса / / Молекуляр.
биология.—1993.—27.—С. 436—450 .
9. Bodor J., Svoboda J. The LTR, v-src, LTR provirus generated
in the mammalian genome by src mRNA reverse transcription
and integration / / J. Viro l .—1989.—63.—P. 1015—1018.
10. Barmy E., Hughes S. Gene transfer into mammalian cells by
RSV-based retroviral vector with the host range of the am-
photropic Murine Leukemia Virus / / Ibid.— 1996 .—70.—
P. 3922—3929 .
11. Federspiel M., Bates P., Young /., Hughes S. A system for
tissue-specific gene targeting: transgenic mice susceptible to
subgroup A avian leukosis virus-based retroviral vectors / /
Proc. Nat. Acad. Sci. U S A . — 1 9 9 4 . — 9 1 . — P . 11241—11245 .
12. Dezelee P., Barnier J., Geryk J. et al New case of c-src gene
transduction; the generation of virus PR 2257 / / Folia Biol.
(Praga) ,—1994 .—40.—P. 211 — 2 2 3 .
13. The molecular biology of RNA tumor virus / Eds R. Weiss et
al. / / Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol .—1985,—
P. 580—585.
14. Southern P. J., Berg P. Transformation of mammalian cells to
antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the
SV40 early region promoter / / J. Мої. and Appl. Genet.—
1982.—1.—P. 3 2 7 — 3 4 1 .
С О З Д А Н И Е С И С Т Е М Ы Д Л Я П Е Р Е Н О С А ГЕНОВ
15. Moscovici С.» Moscovici Я . , Jimenez М. et al. Continuous
tissue culture cell lines derivated from chemically induced
tumors of Japanese guail II Ce l l .—1977 .—11 .—P. 95—103 .
16. Погребной П., Серов С, Кленчин В. и др. Экспрессия гена
трансформирующего фактора роста типа L, перенесенного
рекомбинантным ретровирусным вектором в клетки А 431
/ / Молекуляр. биология.—1993 .—27.—С. 833—838 .
17. Clark D., Dougherty R. Detection of avian oncovirus group-
specific antigenes by the enzyme-linked immunosorbent assay
/ / J. Gen. Viro l .—1980 .—47.—P. 2 8 3 — 2 9 1 .
18. Monoclonal antibodies: principles and practice / / Ed. J. W.
Coding.—New York: Acad, press, 1986 .—P. 121—125.
19. Kashuba V., Zubak S.. Rynditch A et al The nucleotide
sequence of the region of src gene deletion in transformation-
defective RSV adapted to semipermissive host cells / / Nucl.
Acids R e s . — 1 9 8 9 . — 1 7 . — P . 3294
20. Emerman M., Temin H. M. Genes with promoters in retrovirus
vectors can be independently suppressed by unepigenetic
mechanism / / Ce l l .—1984 .—39 .—P. 4 5 9 — 4 6 7 .
21. Emerman M.t Temin H. Quantitative analysis of gene suppres
sion in integrated retrovirus vectors / / Мої. and Cell. Biol.—
1986 .—6.—P. 7 9 2 — 8 0 0 .
22. Katz R., Terry R., Skalka A A conserved ш-act ing sequence
in the 5' leader of Avian Sarcoma Virus RNA is required for
packaging / / J. V iro l .—1986 .—59 3 N 1.—P. 163—167.
23. Savatier P., Bagnis C , Thoraval P. et al. Generation of a
helper cell line for packaging avian leukosis virus-based vectors
/ / Ib id .—1989 .—63.—P. 5 1 3 — 5 2 2 .
24. Dougerty J.у Temin H. A promoterless retroviral vector indi
cates that there are sequences in U3 required for 3' RNA
processing / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1987 .—84 .—
P. 1197—1201 .
25. Cosset F.-L., Ronfort C> Molina R. M. et al Packaging cells
for avian leukosis virus-based vectors with various host ranges
/ / J. Viro l .—1992 .—66.—P. 5 6 7 1 — 5 6 7 6 .
26. Boris-Lavrie K. A., Temin H M. Recent advances in retrovirus
vector technology / / Curr. opinion in Genet, and Develop.—
1993 .—3.—P. 102—109 .
27. Cosset F.-L., Legras C, Savatier P. et al. A new avian leukosis
virus-based packaging cell line that uses two separate trans-
complement in helper genomes / / J. Viroi .—1990.—64.—
P. 1070—1078.
УДК 577.21+578.828
Поступила в редакцию 21.05.97
415
http://Bova-Hi.ll
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155648 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:43:11Z |
| publishDate | 1997 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Кайда, И.В. Цыба, Л.А. Болтовец, П.Н. Кашуба, В.И. 2019-06-17T09:44:13Z 2019-06-17T09:44:13Z 1997 Создание системы для переноса генов посредством ретровируса на основе Pr-RSV-C с расширенной хозяйской специфичностью / И.В. Кайда, Л.А. Цыба, П.Н. Болтовец, В.И. Кашуба // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 5. — С. 408-415. — Бібліогр.: 27 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00049F https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155648 577.21+578.828 Провирус адаптированного к уткам варианта вируса Pr-RSV-C и его трансформационно-дефектного мутанта послужил основой для создания репликативно-компетентного вектора td da Pr-RSV-C е~ и вируса-помощника td da Pr-RSV-C е PSNeo, необходимого для упаковки рпликативно-дефектного ретровирусного вектора. Для снижения вероятности включения клеточных прото-онкогенов в состав ретровирусного вектора последовательности Е-элемента, предположительно вовлеченные в этот процесс, делетированы. Было показано, что (УГб-клетки, трансформированные последовательностями вируса-помощника td da Pr-RSV-C e'PS'Neo продуцируют вирусные белки, в том числе p27gag7 на уровне, необходимом для. сборки репликативно-дефектного ретровирусного вектора. Помимо этого, из-за модифицирования генома вируса-помощника не происходит включения его собственной РНК в состав вириона и сборки полноценной инфекционной вирусной частицы. Это подтверждается тестированием супернатантов упаковочных клонов методом обратной транскрипции: большинство из них не показывают включения [3Н]ТТР в реакции обратной транскрипции, характерного для репликативно-компетентного вируса. Провірус адаптованого до качок варіанту вірусу Pr-RSV-C та його трансформаційно-дефектного мутанту став основою для створення реплікативно-компетентного вектора td da Pr-RSV-C е та. вірусу-помічника td da Pr-RSV-C е PS Neo, необхідного для упаковки реплікати&но-дефектного ретровірусного вектора. Для того щоб знизити вірогідність включення клітинних протоопко генів до складу ретровірусного вектора, послідовності Е-елементу, які можуть бути залучені до цього процесу, делетовано. Було показано, що QTb-клітини, трансформовані послідовностями вірусу-помічника td da PrRSV-C е PS Neo, продукують вірусні білки, зокрема p27gag, у кількості, необхідній для складання реплікативно-дефектного ретровірусного вектора. Геном вірусу-помічника модифіковано таким чином, що його власна РНК не включається до складу віріону та не відбувається складання повноцінної інфекційної частинки. Цей факт підтверджено тестуванням супернатантів пакуючих клонів методом зворотної транскрипції: більшість з них не показала включення HTTP у реакції зворотної транскрипції, характерного для регигікативно-компетентного вірусу, We have constructed retroviral vector td da Pr-RSV-C e and helper virus td da Pr-RSV-C e' PS'Neo based on the duck-adapted variant of Pr-RSV-C with the extended host ranger and its transformation-defective mutant. To decrease the risk of transducing cell proto-oncogencs, E-element, supposedly involved in this process, was deleted. In order to obtain helper cell line the QT6 cells have been transfected by helper phismid p td da Pr-RSV-C e'PS~Neo. Packaging cells produce viral proteins, including p27gag, but intact helper virus is not detectable in reverse trans criptaxe assay. Авторы выражают благодарность С В. Зубаку и А. И. Михаилику за участие в создании ретровирусных конструкций; С. М. Серову — за помощь в создании упаковочных клеток; К. Д. Маковой — за участие в получении ant\-p27gag и Л. Л. Сидорик — за помощь в отработке параметров ELISA системы для определения вирусного p27gag. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Генно-инженерная биотехнология Создание системы для переноса генов посредством ретровируса на основе Pr-RSV-C с расширенной хозяйской специфичностью Створення системи для ретровірусного переносу генів за допомогою векторного вірусу на базі Pr-RSV-C з розширеною хазяйською специфічністю A new retroviral vector system based on the duck-adapted variant of Pr-RSV-C with the extended host ranger Article published earlier |
| spellingShingle | Создание системы для переноса генов посредством ретровируса на основе Pr-RSV-C с расширенной хозяйской специфичностью Кайда, И.В. Цыба, Л.А. Болтовец, П.Н. Кашуба, В.И. Генно-инженерная биотехнология |
| title | Создание системы для переноса генов посредством ретровируса на основе Pr-RSV-C с расширенной хозяйской специфичностью |
| title_alt | Створення системи для ретровірусного переносу генів за допомогою векторного вірусу на базі Pr-RSV-C з розширеною хазяйською специфічністю A new retroviral vector system based on the duck-adapted variant of Pr-RSV-C with the extended host ranger |
| title_full | Создание системы для переноса генов посредством ретровируса на основе Pr-RSV-C с расширенной хозяйской специфичностью |
| title_fullStr | Создание системы для переноса генов посредством ретровируса на основе Pr-RSV-C с расширенной хозяйской специфичностью |
| title_full_unstemmed | Создание системы для переноса генов посредством ретровируса на основе Pr-RSV-C с расширенной хозяйской специфичностью |
| title_short | Создание системы для переноса генов посредством ретровируса на основе Pr-RSV-C с расширенной хозяйской специфичностью |
| title_sort | создание системы для переноса генов посредством ретровируса на основе pr-rsv-c с расширенной хозяйской специфичностью |
| topic | Генно-инженерная биотехнология |
| topic_facet | Генно-инженерная биотехнология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155648 |
| work_keys_str_mv | AT kaidaiv sozdaniesistemydlâperenosagenovposredstvomretrovirusanaosnoveprrsvcsrasširennoihozâiskoispecifičnostʹû AT cybala sozdaniesistemydlâperenosagenovposredstvomretrovirusanaosnoveprrsvcsrasširennoihozâiskoispecifičnostʹû AT boltovecpn sozdaniesistemydlâperenosagenovposredstvomretrovirusanaosnoveprrsvcsrasširennoihozâiskoispecifičnostʹû AT kašubavi sozdaniesistemydlâperenosagenovposredstvomretrovirusanaosnoveprrsvcsrasširennoihozâiskoispecifičnostʹû AT kaidaiv stvorennâsistemidlâretrovírusnogoperenosugenívzadopomogoûvektornogovírusunabazíprrsvczrozširenoûhazâisʹkoûspecifíčnístû AT cybala stvorennâsistemidlâretrovírusnogoperenosugenívzadopomogoûvektornogovírusunabazíprrsvczrozširenoûhazâisʹkoûspecifíčnístû AT boltovecpn stvorennâsistemidlâretrovírusnogoperenosugenívzadopomogoûvektornogovírusunabazíprrsvczrozširenoûhazâisʹkoûspecifíčnístû AT kašubavi stvorennâsistemidlâretrovírusnogoperenosugenívzadopomogoûvektornogovírusunabazíprrsvczrozširenoûhazâisʹkoûspecifíčnístû AT kaidaiv anewretroviralvectorsystembasedontheduckadaptedvariantofprrsvcwiththeextendedhostranger AT cybala anewretroviralvectorsystembasedontheduckadaptedvariantofprrsvcwiththeextendedhostranger AT boltovecpn anewretroviralvectorsystembasedontheduckadaptedvariantofprrsvcwiththeextendedhostranger AT kašubavi anewretroviralvectorsystembasedontheduckadaptedvariantofprrsvcwiththeextendedhostranger |