ДНК в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена
Микрофлюориметрическим методом с использованием флюорохрома-интеркалятора бромистого этидия и конфокального лазерного сканирующего флюоресцентного микроскопа изучали топологи ческое состояние ДНК в дисках политенных хромосом Camptochironomus tentans. Показано, что диски содержат топологически замкн...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1997 |
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1997
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155678 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | ДНК в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена / А.Д. Груздев, М. Лецци // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 6. — С. 460-463. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859762494412685312 |
|---|---|
| author | Груздев, А.Д. Лецци, М. |
| author_facet | Груздев, А.Д. Лецци, М. |
| citation_txt | ДНК в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена / А.Д. Груздев, М. Лецци // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 6. — С. 460-463. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Микрофлюориметрическим методом с использованием флюорохрома-интеркалятора бромистого этидия и конфокального лазерного сканирующего флюоресцентного микроскопа изучали топологи ческое состояние ДНК в дисках политенных хромосом Camptochironomus tentans. Показано, что диски содержат топологически замкнутые отрицательно сверхспирализованные домены ДНК, относительная разность скрученности в которых не превышает 0,007.
Мікрофлюориметричним методом з використанням флюорохрома-інтеркалятора бромистого етидію і конфокального лазерного скануючого флюоресцентного мікроскопа вивчали топологічний стан ДНК у дисках політенних хромосом Camptochironomus tentans. Показано, ицо диски містять топологічно замкнені від'ємно суперспіралізовані домени ДНК, відносна різниця скрученості у яких не перевищує 0,007.
Topological state of DNA in bands of poiytene chromosomes of Camptochironomus tentans was investigated under confocal laser scanning fluorescent microscope by microfluorometric method. It was shown that the bands contain topologically closed, negatively supercoiled domains of DNA in which the value of the relative twist difference is very low and does not exceed 0.007.
|
| first_indexed | 2025-12-02T04:28:48Z |
| format | Article |
| fulltext |
I S S N 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1997. Т, 13. № 6
ДНК в дисках политенных хромосом
торсионно не напряжена
А. Д. Груздев, М. Лецци
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН
630090, Новосибирск, пр. Академика Коптюга, 2
Институт Клеточной Биологии Швейцарского Технологического Института
СН 8046, Цюрих, Лерхенберг, 37
Микрофлюориметрическим методом с использованием флюорохрома-интеркалятора бромистого
этидия и конфокального лазерного сканирующего флюоресцентного микроскопа изучали топологи
ческое состояние ДНК в дисках политенных хромосом Camptochironomus tentans. Показано, что
диски содержат топологически замкнутые отрицательно сверхспирализованные домены ДНК,
относительная разность скрученности в которых не превышает 0,007.
Введение. Топологическая замкнутость молекул
ДНК в хромосомах эукариот обусловливает воз
можность изменения их вторичной структуры во
всех процессах, вызывающих в ДНК торсионное
напряжение. В настоящее время известны два типа
источников торсионного напряжения в ДНК.
Согласно модели Лю и Вана [1 ], напряжение в
транскрибируемой ДНК генерируется при движе
нии РНК-полимеразы: положительное напряжения
возникает впереди РНК-полимеразы, отрицатель
ное — позади нее. Знак и величина результирую
щего напряжения в ДНК определяется, по-видимо
му, различиями в релаксирующих активностях мо
лекул топоизомераз I, находящихся впереди и
позади движущейся РНК-полимеразы.
В пользу существования такого механизма у
эукариот свидетельствуют факты наличия напря
жений во всех исследованных на сегодня транс-
крипционно активных генах: генах дигидрофолат-
редуктазы и 45S РНК человека [2]> а также в
генах белка теплового шока hsp70 и 18S РНК
дрозофилы [3, 4 ]. Поскольку движение РНК-поли
меразы индуцирует как положительное, так и от
рицательное напряжение, среднее напряжение в
суммарной ДНК ядра может быть мало и не
обнаруживаться экспериментально [5].
Упомянутый динамический механизм генера-
© А. Д . Г Р У З Д Е В , М. Л Е Ц Ц И , J 9 9 7
ции напряжения отсутствует в нетранскрибируе-
мой ДНК, преобладающей в ядре. Известен, одна
ко, статический механизм появления торсионного
напряжения в ДНК при образовании ею различной
сложности комплексов с белками на всех уровнях
вплоть до компактизации ДНК в метафазные хро
мосомы. Не исключено, что и в данном механизме
топоизомеразы также служат регуляторами напря
жения в ДНК, оставляя его большим в одних
случаях или релаксируя практически до нуля — в
других. Большое напряжение было обнаружено,
например, в неактивированном к транскрипции
гене теплового шока hsp70 [3, 4] . Кроме того,
существует мнение, что в большинстве неактивных
генов ДНК находится в релаксированном состоя
нии. Такая точка зрения опирается преимущест
венно на результаты упомянутой выше работы [5 ],
в которой не было обнаружено напряжения в ДНК
интерфазных ядрах клеток HeLa дрозофилы in
vitro. Однако, по нашим измерениям [6 ], ДНК
интерфазных политенных хромосом хирономуса за
метно напряжена до средней плотности сверхвит
ков, равной -0,019. При этом неясно, насколько
велик вклад в измеренную величину транскрипци-
онно активных генов и генов, не участвующих в
транскрипции. Кроме того, не исключено, что раз
личия в результатах работ \5 ] и [6 ] связаны со
специфической организацией ДНК в неактивных
локусах (дисках) политенных хромосом.
460
Д Н К
Нам кажется, что вопрос о топологическом
состоянии ДНК в ядрах транскрипционно неактив
ных клеток (спермии, лимфоциты, метафазные
хромосомы) и неактивном хроматине диплоидных
и политенных ядер заслуживает экспериментально
го изучения. В настоящей работе измеряли торси
онное напряжение в ДНК транскрипционно неак
тивных дисков политенных хромосом личинок
Camptochironomus tentans. Использовали метод
[6 J, основанный на зависимости степени связыва
ния флюоресцентного красителя интеркалятора
бромистого этидия (БЭ) от степени скрученности
ДНК и на его способности компенсировать недок-
рученность.
Суть метода заключается в том, что при неко
торой концентрации красителя отрицательно на
пряженная (недокрученная) ДНК становится ре-
лаксированной, ненапряженной молекулой потому,
что торсионное напряжение в ней компенсировано
интеркаляцией молекул БЭ. Поскольку введение
однонитчатых разрывов в релаксированную ДНК
не приводит к изменению ее вторичной структуры,
оно не сопровождается изменениями ни в количе
стве связанного с ДНК красителя, ни в интенсив
ности его флюоресценции. Зная численное значе
ние концентрации БЭ, при котором никование
окрашенной ДНК не меняет интенсивности ее
флюоресценции, нетрудно вычислить величину от
носительной разности скрученности ОРС -
= ATw/Tw, являющейся мерой интересующего нас
напряжения в исходной неокрашенной ДНК.
(Обычно используемый термин «плотность сверх
витков» был введен Бауэром [7] для описания
напряженной ДНК в растворе. Однако для описа
ния ДНК в хроматине и хромосомах более коррек
тно использовать термин «относительная разность
скрученности» напряженной молекулы ДНК по
отношению к релаксированной форме. Именно эта
величина измеряется в эксперименте.) Следует от
метить, что использованный нами метод позволяет
сделать заключения лишь о «свободной» ДНК, т. е.
о той части хромосомной ДНК, которая І) доступ
на красителю, 2) доступна ДНКазе I и 3) может
релаксировать после введения в нее разрыва. В
неактивном хроматине дисков перечисленными
свойствами обладает, прежде всего, ДНК межнук-
леосомных линкеров.
Материалы и методы. Измерения проводили
на конфокальном лазерном сканирующем микро
скопе MCR-600 («BioRad», США), имеющем для
целей данной работы целый ряд преимуществ пе
ред обычным флюоресцентным микроскопом. К
ним относятся, прежде всего, локальный способ
возбуждения и регистрации флюоресценции ирепа-
В Д И С К А Х П О Л И Т Е Н Н Ы Х Х Р О М О С О М Т О Р С И О Н Н О Н Е Н А П Р Я Ж Е Н А
рата при его сканировании лазерным лучом, что
резко снижает вклад соседних точек (в том числе и
в вертикальном направлении) в интенсивность
флюоресценции измеряемой точки, а также воз
можность регистрации картин препарата в цифро
вой форме, их хранения и последующей количест
венной обработки.
В работе использовали личинки четвертого во
зраста лабораторной линии 2Lk3 С tentans, нахо
дящиеся в состоянии олигопаузы [8 ], когда репли
кация в тканях личинок практически отсутствут.
Слюнные железы выделяли иглами в растворе
CR6.3 [8], состоящем из 87 мМ NaCl, 3,2 мМ
MgCl2 и 10 мМ трис-малеата, рН 6,3. Железы
инкубировали на холоду в течение 40—45 мин в
том же растворе с добавлением 0,5 % тритона
Х-100 и пипетировали. Дальнейшие процедуры
проводили в растворе CR7.4, отличающемся от
CR6.3 буфером (трис-HCl, рН 7,4).
Изолированные ядра личинок С. tentans поме
щали в проточную камеру, окрашивали БЭ в тече
ние 1—1,5 ч, а для удаления флюоресцентного
фона, создаваемого молекулами внутриядерной
РНК, обрабатывали панкреатической РНКазой.
Камеру с окрашенными ядрами помещали под
объектив микроскопа и включали программу, по
зволяющую компьютеру MCR-600 записать серию
картин препарата, регистрируемых через каждые
5—10 мин. После регистрации 3—5 картин в каме
ру добавляли ДНКазу I до конечной концентрации
около 1 мкг/мл, индуцирующую в хромосомной
ДНК однонитчатые разрывы. Опыт заканчивали
после 15—20 картин.
Для каждой картины измеряли интенсивности
нескольких одиночных дисков среднего размера,
для каждого из дисков строили кривую изменения
интенсивности его флюоресценции во времени и
вычисляли величину относительного изменения
интенсивности All I = ( / П О о , е ~ ^ д о / Л ю с л е > вызванного
нарушением топологической замкнутости ДНК под
действием ДНКазы I,
Опыты проводили с несколькими концентраци
ями БЭ для того, чтобы определить ту его концен
трацию С 0 , при которой напряжение в ДНК ком
пенсировано интеркаляцией молекул красителя, т.
е. когда All I = 0. Затем вычисляли плотность по
садки гь БЭ на ДНК, принимая величину констан
ты связывания К-5-Ю5 М 1 [6], и находили вели
чину относительной разности скрученности ДНК
из О Р С - - 0 , 7 2 г0.
Результаты и обсуждение. Полученные ре
зультаты приведены на рисунке в виде зависимости
величины All I от десятичного логарифма молярной
концентрации красителя. Из рисунка видно, что
461
Г Р У З Д Е В А. Д . , Л Б Ц Ц И М.
А Щ
8 -7 6 -5
Концентрация ВЭ fiog М)
Относительное изменение флюоресценции, Л / / /
большинство измеренных величин Л / / / > 0 , за иск
лючением одной, измеренной при очень низкой
концентрации (10~8 М) БЭ. Отсюда следует, что
торсионное напряжение в ДНК дисков очень мало.
Для определения его величины была построена
кривая (см. рисунок), рассчитанная по изотермам
связывания (1) и (2) красителя с топологически
замкнутой напряженной ДНК и с никованной ДНК
соответственно.
г/С = К{\ - 3r)V(l - 2г)2; (1)
г/С - Кехр[а(г - г0) ](1 - 3r)V(l - 2г)\ (2)
где г — плотность посадки красителя на топологи
чески разомкнутой (1) и сверхспирализованной (2)
ДНК; С — молярная концентрация БЭ в растворе,
а = 1 0 — параметр ДНК, пропорциональный ее
торсионной жесткости.
Наилучшее согласие кривой с эксперименталь
ными точками достигалось при условии, что вели
чина ОРС = -0,007. Для ее наглядной оценки мож
но указать, что различия в скрученности А- или
С-формы ДНК по сравнению с В-формой на поря
док больше (по модулю) измеренной величины
ОРС ДНК в дисках. На порядок больше нее также
такие плотности сверхвитков ДНК, при которых
возможно появление неканонических структур, на
пример, Z-форм ДНК [9].
Хотя измеренная нами абсолютная величина
ОРС ДНК в дисках политенных хромосом очень
мала, есть основания полагать, что ее истинное
значение еще меньше. Дело в том, что при компь
ютерной обработке картин политенных хромосом в
анализируемую часть картины вместе с изображе
нием измеряемого диска неизбежно попадает изо
бражение пары соседних с ним междисков, рыхлый
хроматин которых более доступен действию ДНКа-
зы I, чем плотный хроматин диска. Поэтому не
исключено, что к концу эксперимента, когда каж
дая молекула ДНК получает лишь небольшое чис
ло одноцепочечных разрезов, молекулы ДНК меж
дисков уже оказываются расщепленными до олиго-
нуклеотидов, диффундирующих из междисков или
распадающихся на одиночные цепи, теряющие спо
собность к флюоресценции в комплексе с БЭ. При
этом уменьшение интенсивности флюоресценции
междисков, соседствующих с измеряемым диском,
воспринимается как уменьшение интенсивности
флюоресценции диска, вызванное никованием его
ДНК, а не расщеплением ДНК междисков. Этот
эффект не играет роли при больших изменениях
интенсивности флюоресценции дисков после добав
ления ДНКазы I, т. е. при больших концентрациях
БЭ в растворе. Однако он становится значимым
при малых концентрациях красителя, когда изме
нения флюоресценции дисков, ожидаемые для то
пологически замкнутой, но торсионно ненапряжен
ной ДНК, практически ничтожны.
В пользу высказанного предположения свиде
тельствует тот факт, что величины А/ / / , измерен
ные для длинных участков хромосом, содержащих
пуфы и мелкие рыхлые диски, всегда оказывались
меньше тех же величин, измеренных для плотных
одиночных дисков.
И, наконец, о большей скорости расщепления
ДНК междисков по сравнению с ДНК дисков
свидетельствует очевидное возрастание контраста
дискового рисунка политенных хромосом к концу
эксперимента.
Из изложенного выше следует, что ДНК дис
ков политенных хромосом практически торсионно
не напряжена, хотя топологически замкнута.
Работа выполнена при финансовой поддержке
Швейцарского Национального научного фонда и
Российского фонда фундаментальных исследований
(грант № 94-04-11575а).
О. Д Груздев, М. Лецці
Д Н К у дисках політенних хромосом торсійно не напружена
Резюме
Мікрофлюориметричним методом з використанням флюорох-
рома-інтеркалятора бромистого етидію і конфокального ла
зерного скануючого флюоресцентного мікроскопа вивчали то
пологічний стан ДНК у дисках політенних хромосом
Camptochironomus tentans. Показано, ицо диски містять топо
логічно замкнені від'ємно суперспіралізовані домени ДНК,
відносна різниця скрученості у яких не перевищує 0,007.
462
Д Н К В Д И С К А Х П О Л И Т Е Н Н Ы Х Х Р О М О С О М Т О Р С И О Н Н О Н Е Н А П Р Я Ж Е Н А
A. D. Gruzdev, М. Lezzi
DNA in bands of polytene chromosomes is not under torsional
tension
Summary
Topological state of DNA in bands of polytene chromosomes of
Camptochironomus tentans was investigated under confocal laser
scanning fluorescent microscope by microfluorometric method, it
was shown that the bands contain topological^ closed, negatively
supercoiled domains of DNA in which the value of the relative twist
difference is very low and does not exceed 0.007.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Liu L. F<, Wang J. C . Supercoiiing of the DNA template during
transcription / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1987 .—84 .—
P. 7 0 2 4 - 7 0 2 7 .
2. Ljungman M., Hanawalt P C. Localized torsional tension in
the DNA of human ceils /7 Ibid. — 1 9 9 2 . — 8 9 . — P . 6 0 5 5 —
6059.
3. Jupe E. R.y Sinden R. R.y Cartwright L L. Stably maintained
microdomain of localized unrestrained supercoiiing at Dro-
sophila heat shock gene locus / / EMBO J . — 1 9 9 3 . — 1 2 . —
P. 1067—1075.
4. Jupe E R., Sinden R. R., Cartwright L L~ Specialized
chromatin structure domain boundary elements flanking a
Drosophila heat shock gene locus are under torsional strain in
vivo I! Biochemistry.—1995.—34.—P, 2628—2633 .
5. Sinden R. R., Carlson J. O., Pettijohn D. E. Torsional tension
in the DNA double helix measured with trimethyl psoralen in
living E. coli cells: Analogous measurements in insect and
human cells / / Ce l l .—1980 .—21 .—P. 7 7 3 — 7 8 3 .
6. Шурдов M. А., Свинарчук Ф. Я . , Груздев А. Д. Торсионное
напряжение в Д Н К политенных хромосом / / Молекуляр.
б и о л о г и я . - 1 9 8 9 . — 2 3 , № 1.—С. 2 0 4 — 2 1 4 .
7. Bauer W. R. Structure and reactions of closed duplex DNA / /
Ann. Rev. Biophys. and B ioeng .—1978 .—7.—P. 287—313 .
8. Meyer В., Maehr R.f Eppenberger H. M.t Lezzi M. The
activity of Balbiani rings 1 and 2 in salivary glands of
Chironomus tentans larvae under different modes of develop
ment and after pilocarpine treatment / / Develop. Biol.—
1983 .—98.—P. 265—277 .
9. Thomas M. J., Freeland Т. M.t StroblJ. S Z-DNA formation
in the rat growth hormone gene promoter region / / Мої. and
Cell. B io l .—1990 .—10.—P. 5 3 7 8 — 5 3 8 7 .
УДК 577.21:576 .316 .352
Поступила в редакцию 18.02.97
463
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155678 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-02T04:28:48Z |
| publishDate | 1997 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Груздев, А.Д. Лецци, М. 2019-06-17T10:14:48Z 2019-06-17T10:14:48Z 1997 ДНК в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена / А.Д. Груздев, М. Лецци // Биополимеры и клетка. — 1997. — Т. 13, № 6. — С. 460-463. — Бібліогр.: 9 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0004A7 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155678 577.21:576.316.352 Микрофлюориметрическим методом с использованием флюорохрома-интеркалятора бромистого этидия и конфокального лазерного сканирующего флюоресцентного микроскопа изучали топологи ческое состояние ДНК в дисках политенных хромосом Camptochironomus tentans. Показано, что диски содержат топологически замкнутые отрицательно сверхспирализованные домены ДНК, относительная разность скрученности в которых не превышает 0,007. Мікрофлюориметричним методом з використанням флюорохрома-інтеркалятора бромистого етидію і конфокального лазерного скануючого флюоресцентного мікроскопа вивчали топологічний стан ДНК у дисках політенних хромосом Camptochironomus tentans. Показано, ицо диски містять топологічно замкнені від'ємно суперспіралізовані домени ДНК, відносна різниця скрученості у яких не перевищує 0,007. Topological state of DNA in bands of poiytene chromosomes of Camptochironomus tentans was investigated under confocal laser scanning fluorescent microscope by microfluorometric method. It was shown that the bands contain topologically closed, negatively supercoiled domains of DNA in which the value of the relative twist difference is very low and does not exceed 0.007. Работа выполнена при финансовой поддержке Швейцарского Национального научного фонда и Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 94-04-11575а). ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров ДНК в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена ДНК у дисках політенних хромосом торсійно не напружена DNA in bands of poiytene chromosomes is not under lorsional tension Article published earlier |
| spellingShingle | ДНК в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена Груздев, А.Д. Лецци, М. Структура и функции биополимеров |
| title | ДНК в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена |
| title_alt | ДНК у дисках політенних хромосом торсійно не напружена DNA in bands of poiytene chromosomes is not under lorsional tension |
| title_full | ДНК в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена |
| title_fullStr | ДНК в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена |
| title_full_unstemmed | ДНК в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена |
| title_short | ДНК в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена |
| title_sort | днк в дисках политенных хромосом торсионно не напряжена |
| topic | Структура и функции биополимеров |
| topic_facet | Структура и функции биополимеров |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155678 |
| work_keys_str_mv | AT gruzdevad dnkvdiskahpolitennyhhromosomtorsionnonenaprâžena AT leccim dnkvdiskahpolitennyhhromosomtorsionnonenaprâžena AT gruzdevad dnkudiskahpolítennihhromosomtorsíinonenapružena AT leccim dnkudiskahpolítennihhromosomtorsíinonenapružena AT gruzdevad dnainbandsofpoiytenechromosomesisnotunderlorsionaltension AT leccim dnainbandsofpoiytenechromosomesisnotunderlorsionaltension |