Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами
Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами имеет ряд теоретических и методических особенностей. Для учета некоторых из них предложена математическая модель и описана динамика образования продукта реакции. Приведена формула для вычисления температуры плавления олигонуклеотидных прайме ров...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1995 |
| Main Authors: | , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1995
|
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155753 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами / Р.Н. Календарь, Ю.М. Сиволап // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 3-4. — С. 55-65. — Бібліогр.: 22 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155753 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Календарь, Р.Н. Сиволап, Ю.М. 2019-06-17T11:48:35Z 2019-06-17T11:48:35Z 1995 Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами / Р.Н. Календарь, Ю.М. Сиволап // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 3-4. — С. 55-65. — Бібліогр.: 22 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0003ED https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155753 577.2.01:677.1:577.213.312 Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами имеет ряд теоретических и методических особенностей. Для учета некоторых из них предложена математическая модель и описана динамика образования продукта реакции. Приведена формула для вычисления температуры плавления олигонуклеотидных прайме ров, которая необходима при расчете оптимальной температуры отжига. На базе идеализированной модели геномной ДНК разработаны алгоритм и компьютерная программа поиска произвольных праймеров. Учтена статистическая закономерность определенных сочетаний нуклеотидов в праймере, указывающая на его специфичность при выявлении генетического полиморфизма. Показана возможность целенаправленного моделирования нуклеотидной последовательности праймеров. Полімеразна ланцюгова реакція з довільними праймерами має ряд теоретичних та методичних особливостей. Для враховування деяких з них було запропоновано її математичну модель і показано динаміку утворення продукта реакції та інших молекул, які беруть участь у цьому процесі. Наведено формулу для обчислення температури ялавління олігонуклеотидних праймерів, що необхідно при розрахунку оптимальної температури реасоціації. На базі ідеалізованої моделі геномної ДНК було розроблено алгоритм та комп'ютерну програму пошуку довільних праймерів. Враховано статистичну закономірність певних'поєднань нуклеотидів у праимері, що свідчить про його специфічність при виявленні генетичного поліморфізму. Показано можливість цілеспрямованого моделювання праймерів. Polymerase chain reaction with arbitrary oligonucleotide primers has some theoretical and methodics peculiarities. For resolution of some from them was proposed the mathematical model of PCR reaction and dynamics of formation of the reaction product and other molecules taking part in this process. The formula for calculation temperature of oligonucleotide primers melting was proposed to calculate of the optimal temperature of annealing. The idealize model of the genome DNA and computer program of screening of all arbitrary were created. The statistical regularity of appointed combinations of nucleotides in primers showed;- it is specific for reveal of the polymorphism. Hence in follows possibility of direct designing primers was showed. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами Полімеразна ланцюгова реакція з довільними праимерами Polymerase chain reaction with arbitrary oligonucleotide primers Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами |
| spellingShingle |
Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами Календарь, Р.Н. Сиволап, Ю.М. |
| title_short |
Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами |
| title_full |
Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами |
| title_fullStr |
Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами |
| title_full_unstemmed |
Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами |
| title_sort |
полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами |
| author |
Календарь, Р.Н. Сиволап, Ю.М. |
| author_facet |
Календарь, Р.Н. Сиволап, Ю.М. |
| publishDate |
1995 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Полімеразна ланцюгова реакція з довільними праимерами Polymerase chain reaction with arbitrary oligonucleotide primers |
| description |
Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами имеет ряд теоретических и методических особенностей. Для учета некоторых из них предложена математическая модель и описана динамика образования продукта реакции. Приведена формула для вычисления температуры плавления олигонуклеотидных прайме ров, которая необходима при расчете оптимальной температуры отжига. На базе идеализированной модели геномной ДНК разработаны алгоритм и компьютерная программа поиска произвольных праймеров. Учтена статистическая закономерность определенных сочетаний нуклеотидов в праймере, указывающая на его специфичность при выявлении генетического полиморфизма. Показана возможность целенаправленного моделирования нуклеотидной последовательности праймеров.
Полімеразна ланцюгова реакція з довільними праймерами має ряд теоретичних та методичних особливостей. Для враховування деяких з них було запропоновано її математичну модель і показано динаміку утворення продукта реакції та інших молекул, які беруть участь у цьому процесі. Наведено формулу для обчислення температури ялавління олігонуклеотидних праймерів, що необхідно при розрахунку оптимальної температури реасоціації. На базі ідеалізованої моделі геномної ДНК було розроблено алгоритм та комп'ютерну програму пошуку довільних праймерів. Враховано статистичну закономірність певних'поєднань нуклеотидів у праимері, що свідчить про його специфічність при виявленні генетичного поліморфізму. Показано можливість цілеспрямованого моделювання праймерів.
Polymerase chain reaction with arbitrary oligonucleotide primers has some theoretical and methodics peculiarities. For resolution of some from them was proposed the mathematical model of PCR reaction and dynamics of formation of the reaction product and other molecules taking part in this process. The formula for calculation temperature of oligonucleotide primers melting was proposed to calculate of the optimal temperature of annealing. The idealize model of the genome DNA and computer program of screening of all arbitrary were created. The statistical regularity of appointed combinations of nucleotides in primers showed;- it is specific for reveal of the polymorphism. Hence in follows possibility of direct designing primers was showed.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155753 |
| citation_txt |
Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами / Р.Н. Календарь, Ю.М. Сиволап // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 3-4. — С. 55-65. — Бібліогр.: 22 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT kalendarʹrn polimeraznaâcepnaâreakciâsproizvolʹnymipraimerami AT sivolapûm polimeraznaâcepnaâreakciâsproizvolʹnymipraimerami AT kalendarʹrn polímeraznalancûgovareakcíâzdovílʹnimipraimerami AT sivolapûm polímeraznalancûgovareakcíâzdovílʹnimipraimerami AT kalendarʹrn polymerasechainreactionwitharbitraryoligonucleotideprimers AT sivolapûm polymerasechainreactionwitharbitraryoligonucleotideprimers |
| first_indexed |
2025-11-25T22:29:21Z |
| last_indexed |
2025-11-25T22:29:21Z |
| _version_ |
1850563584363331584 |
| fulltext |
УДК 577.2.01:677.1:577.213.312
Р. Н. Календарь, Ю. М. Сиволап
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
С ПРОИЗВОЛЬНЫМИ ПРАЙМЕРАМИ
Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами имеет ряд теоретических
и методических особенностей. Для учета некоторых из них предложена математическая
модель и описана динамика образования продукта реакции. Приведена формула для
вычисления температуры плавления олигонуклеотидных прайме ров, которая необходима
при расчете оптимальной температуры отжига. На базе идеализированной модели ге
номной ДНК разработаны алгоритм и компьютерная программа поиска произвольных
праймеров. Учтена статистическая закономерность определенных сочетаний нуклеоти-
дов в праймере, указывающая на его специфичность при выявлении генетического
полиморфизма. Показана возможность целенаправленного моделирования нуклеотид-
ной последовательности праймеров.
Введение. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является специфиче
ским высокочувствительным методом, который находит применение для
решения широкого спектра проблем биологии [1—3]. ПЦР с произ
вольными праймерами на основе выявляемого генетического полимор
физма используется в качестве быстрого и чувствительного метода ис
следования эволюционных взаимоотношений, для генного картирова
ния и других целей [4, 5]. Молекулярными маркерами в этой техно
логии служат участки ДНК, обнаруживающие полиморфные сайты с
помощью ПЦР.
Варианты использования амплификации могут быть сгруппирова
ны согласно особенностям самого процесса [6]. Амплификация со спе
цифическими праймерами требует в качестве необходимого условия
знания нуклеотидной последовательности амплифицируемого участка
для подбора соответствующих праймеров к фланкирующим последо-.
вательностям. .Амплификация с перемежающимися повторами (Inter
spersed Repetitive Sequences IRS) Alu-PCR или REP-PCR детермини
руется последовательностью ДНК в многочисленных сайтах обеих це
пей ДНК [7, 8]. Амплификация с вырожденными праймерами может
проходить как недетерминированный проиесс — случайнопраймирован-
ная амплификация (RPA), праймер-расшпренная амплификация (PEP)
и случайная ПЦР (rPCR) [9—11]. Такой тип обусловлен реассоциа-
цией праймера и матрицы в произвольных локусах, что приводит к сто
хастической амплификации фрагментов нуклеиновых кислот или даже
целого генома со случайного сайта. Случайная амплификация обычно
используется при радиоактивном или флюоресцентном мечении ДНК,
для увеличения количества ДНК при конструировании библиотек
кДНК или при ПЦР-типировании одиночных гаплоидных клеток.
Степень генетического родства индивидуальных организмов или
видов можно выявить, сравнивая длину или нуклеотидный состав оп
ределенных фрагментов ДНК. Идентификация подобных молекулярных
маркеров при анализе RFLP требует информации о нуклеотидном сос
таве последовательности ДНК, клонирования и других процедур, свя
занных со значительной экспериментальной работой. Некоторое упро
щение достигается за счет применения техники многочисленных про
филей произвольно амплифицированных ампликонов (МААР, Multiple
© Р. Н. КАЛЕНДАРЬ, Ю. М. СИВОЛАП, 1995
ISSN 023^-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3 - 4 55
Arbitrary Amplicon Profiling) [2], которая подобна методам, выявля
ющим полиморфизм случайно амплифицированной ДНК,— RAPD (Ran
dom Amplified Polymorphic DNA), произвольно праймированной ПЦР
(AP-PCR Arbitrarily Primed PCR) и фингерпринт амплифицированной
ДНК (DAF —DNA Amplification fingerprinting [4, 5, 13]. Эти неза
висимо разработанные подходы основаны на использовании одного или
более произвольных олигонуклеотидных праймеров для амплификации
Синтез полупродукта типа 'а"б I цакле
' ; а~ш
* — • и
Синтез полупродукта типа "ІЇбоП цикле
• ' а
/ — - — • — - »
» •
Образование продукта ПЦР из полупродуктов Ъ и 'сГвШцикле
: Ь
^ _ . d
Рис. 1. Схема образования продукта полимеразной цепной реакции
определенных участков. ДНК, часто полиморфных, с неизвестной ло
кализацией в генома. Выявление 'полиморфизма длин амплифициро-
ванных фрагментов (AFLPs — Amplification Fragment Length Poly
morphisms) может быть удобным и простым способом идентификации.
и картирования генов [15, 16].
Техника МААР различается по количеству продуктов амплифика
ции, длине праймеров, условиям амплификации и способу электрофо-
ретического разделения продуктов. К примеру, в AP-PCR используют
ся праймеры длиной, сравнимой с таковой при обычной ПЦР; в ана
лизе RAPD применяются короткие праймеры около 10 нуклеотидов, в
DAF размер праймеров составляет не менее 5 нуклеотидов (обычно 7—>
8) [4, 5, 13[. Эти и другие различия в конечном результате обусловли
вают соответствующие условия проведения электрофореза для полу
чения высокоразрешающих профилей продуктов амплификации. Раз
деление продуктов в RAPD и AP-PCR достигается электрофорезом в
агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Визуализацию
продуктов DAF и информацию о ДНК-профилях получают с помощью
электрофореза в полиакриламидном геле и окраской серебром для де
текции пикограммового уровня ДНК [17].
Моделирование полимеразной цепной реакции. Для начала необ
ходимо определить понятия, которые будут использованы в описании
механизма ПЦР с произвольными праимерами.
Основной продукт ПЦР (ампликон) —это двухцепочечная моле
кула ДНК, концы которой фланкированы последовательностью прай
меров и комплементарного им участка ДНК.
Полупродукт ПЦР — это одноцепочечная молекула ДНК, содер
жащая на конце последовательность праймера. Молекулы полупродук
тов участвуют в образовании основного продукта и других полупро
дуктов реакции (рис. 1). Накопление последних происходит за счет
образования новых молекул полупродуктов в каждом цикле. Цикл ПЦР начинается с денатурации ДНК, затем отжига праймера на ДНК-матрицу и завершается синтезом полупродукта ДНК-полимеразой. ПЦР с произвольными праимерами обычно происходит в присутствии одного пр_аймера, который выполняет функцию прямоп>
56 ISSN 023Э-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3—4
и обратного. Для амплификации участка ДНК праймер образовывает
дуплексы с обеими комплементарными нитями ДНК. З'-концы прай-
мера ориентированы внутрь амплифицируемого фрагмента (продук
та). Другие способы ориентации прайм-ера относительно комплемен
тарных нитей ДНК не приводят к амплификации основного продукта.
Полупродукты полимеразной цепной реакции. Для упрощения мо
делирования полупродукты амплификации ПЦР были дифференциро
ваны по двум признакам: по уровню их образования и степени ком
плементарное™ концевых участков.
Образование полупродуктов зависит от типа матрицы, с которой
снята копия данного полупродукта (матрицей может служить как ге
номная ДНК, так и синтезированные ранее
полупродукты).
Каждый титт полупродукта включает
комплементарные нити ДНК, синтезирован
ные с комплементарных матриц.
РЙС. 2. Формула 8-членного лраймера для последова
тельности ДНК с CG-составом, равным 49,9 %. Показа
ны пять наиболее часто встречающихся пар нуклеотидов
в данных положениях праймера
В формулах, описывающих динамику формирования каждого ти
па полупродуктов ПЦР, учитывается тип матриц, участвующих при их
образовании в конкретном цикле п и оценивается вклад других полу
продуктов из предшествующих циклов. Тип данного полупродукта не
изменяется в течение всей реакции. Формулы состоят из двух частей:
одна описывает количество образованных молекул полупродукта в дан
ном цикле, вторая — количество полупродукта, полученного из преды
дущих циклов.
Из рис, 1 видно, что в первом цикле образуются молекулы, более
длинные, чем продукт, связанный с ДНК-матрицей. Назовем этот тип
полупродукта «а». Количество молекул «а», синтезируемых в каждом
цикле реакции, одинаково. Сумма молекул комплекса «a»-|-«Af5» —
S(«a»-\-«Ms») (где «Ms» — матричная ДНК в одноцепочечной форме) —
равна количеству матричной ДНК S(«MS»), Длина полупродукта типа
«а» больше, чем длина последовательности основного продукта, так
как терминация синтеза ограничена пределами нити ДНК или ее де
натурацией.
Суммарное количество молекул «а» — 5(а п ) , образованных за п
циклов, описывается следующей формулой:
S(an) = Ms + S(an^); (1)
S{an)^2nMd. (1.1)
Для остальных формул количество матричной ДНК — Md (Md в двух-
цепочечной форме) принято равным единице, в противном случае значе
ние формулы динамики образования полупродуктов необходимо умно
жить на соответствующее количество матричной ДНК.
Во втором цикле из молекул полупродукта типа «а» предыдущего
синтеза S(an-i) образуется новый тип полупродукта — «6». Данный
тип полупродукта короче, чем молекулы «а», и в следующем цикле об
разует продукт реакции.
Суммарное количество молекул типа «b» — S(bn) (арифметиче
ская прогрессия), образованных за п циклов:
S(&n) = S(an_,) + S (&„_,); (2)
S(bn_1) = ni — 3n + 2; (2.1)
S(bn) = Md(n2-n). (2.2)
ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3-4 57
\G-A\
\т-т\
\А-А\
\6-&\
\А-&\
М" •л
\&-G\
\&-т\
\с-т\
гс\
A—A
6—6
А—С
Т--А
г- -С
\А-С\
\G-T\
\т-т\
\А-е\
\т-б\
т--т\
А—Г
Т—6
С—А
\С~ -т
F-sl
\А-Т\
\А-А\
\С-б\
\Т-А\
Т--А
6-А
&—Т
6—0
\А--Т
На 5'-конце праймера возможны некомплементарные матрице
нуклеотиды, характерные только для молекул полупродуктов ти
пов «#» и «6».
В третьем цикле из молекул «6» синтезируются молекулы «d»,
равные по длине молекулам «6». С третьего цикла впервые образуется
продукт, который представлен двухцепочечной молекулой ДНК, содер
жащей цепь молекул «й» и «d».
Суммарное количество синтезированных молекул типа «d»— S(dn)
за п циклов (геометрическая прогрессия):
SW^SM + Siy; (3)
(3.1)
(3.2)
Молекулы типов «й» и «d» одинаковы по нуклеотидному составу,
но происходят от разных матриц (рис. 1, табл. 1).
Особенности молекул этих типов состоят в следующем: во-первых,
полупродукт «Ь» синтезируется на матрице «а» с образованием ком
плекса «a»-f-«6» по структуре, не соответствующей характеристике про
дукта ПЦР (длина молекул типа «а» всегда больше длины продуктов
амплификации); во-вторых, матрицей полупродукта «d» является «&»,
последовательности обеих полностью комплементарны, и комплекс
«6»+«^» представляет собой полноценный продукт; синтез «d» про
исходит в третьем цикле и косвенно связан с полупродуктом «а» че
рез «6». Для удобства описания образования продукта ПЦР из полу
продукта типа «6» недостаточно, и поэтому был введен полупродукт
типа «d»y идентичный ему по нуклеотидной последовательности.
Логические формулы (1—3) объясняют происхождение данного
типа полупродукта, а формулы (1.1), (2.2), (3.2) — пригодны для ко
личественных расчетов.
Продукт полимеразной цепной реакции. В образовании основного
продукта участвуют молекулы типов «6» и «d», синтезированные в
предыдущих циклах, т. е. S(6n-i) и S(dn-i). Образование продукта
ПЦР можно описать как сумму:
где Pd — продукт ПЦР (если количество матрицы Ма=1).
Из всех синтезированных в ПЦР молекул только комплексы ти
пов «a-f-Afs» и «а»-\-«Ь» не являются продуктом реакции и поэтому их
количество снижает значение 2П к значению 2П—2п. Количество ком-
Таблица 1
Динамика образования продукта
и полупродуктов ПЦР
Число
ЦИКЛОВ
1
2
3
4
5
6
7
8
20
Количество
«а»
2
4
6
8
10
12
14
16
40
полупро-
дуктов*
*ь*
2
6
12
20
30
42
56
380
«<2»
2
10
32
84
198
438
2096730
Продукт*
К
2
8
22
52
114
240
348536
Т а б л и ц а 2
Оптимальная температура отжига
Последовательность (5'—3')
CCATGGTACCCGGATCCTCG
ATTAACCCTCACTAAAGGGA
GAGCAAGTTCAGCCTGG
GACAGACAGACAGACA
CGACACGCTG
CGACACGC
CTGCGTGC
ACTTCGTC
Ta*min—max,
°С
55,74—62,81
53,00—60,07
52,33—59,41
48,75—55,82
48,06—55,14
46,82—53,90
46,87—52,52
45,02—52,10
M d = l .
* Та min — max — оптимальная температура
отжига, если продуктом реакции являются мо
лекулы длиной от 300 до 2000 п. н. и (G +
+С) -составом от 45 до 60 %.
58 ISSN 0233<-7бб7. БИОПОЛИМЕРЫ-И КЛЕТКА. 1995. Т, II, Jfc 3-4
плекса S («a»-\-«Ms») равно таковому 2Mdi a S(«a»+«b») = 2(п—1).
Сумма («a»+«Ms») и S(«a»-\-«b») дает 2(Md+n—1), если Ма=\, то
сумма равна 2п. Образование продукта можно описать следующим
образом:
Pd = Md(2n-2n) (5)
или
S(blt_1) + S{dn_i) = 2n-2n. (5.1)
Данная зависимость объективна для идеальных условий, когда все
компоненты реакции (dNTP, Га^-полимеразы, праймеры) в избытке.
При недостатке какого-либо компонента эффективность образования
продукта ПЦР снижается.
Предложенная математическая модель динамики образования про
дукта и других молекул реакции амплификации необходима для опи
сания начальных циклов. Накопление молекул полупродуктов типов
«а» и «6» незначительно сказывается на общем результате:
l/2(S(bn) + S(dn))-Pd = n-\.
Взаимодействие праймера с матрицей. В результате узнавания
ДНК-полимеразой комплекса, сформированного при отжиге праймера
с сайтом-мишенью, реакция носит специфический характер. Это выра
жается в предпочтительной амплификации определенных участков
ДНК-матрицы и создает воспроизводимую картину полиморфизма [6].
Наличие длинных концевых областей с неполной комплементар-
ностью праймера и матрицы препятствует аффинному взаимодействию
фермента с таким комплексом и затрудняет полимеризацию.
Наличие ошибки при связывании праймера с мишенью влияет на
воспроизводимость продуктов амплификации и эффективность работы
полимеразы, которая узнает и удлиняет «ошибочный» комплекс.
Первые восемь нуклеотидов с З'-конца праймера включают район
с высокой степенью комплементарное™ к матрице. Единичная замена
в этом районе значительно сказывается на результатах амплификации.
Поэтому для успешной амплификации на З'-конце праймера необхо
димо не менее пяти — шести нуклеотидов, полностью комплементарных
матрице [6]. Увеличение праймера на два или три нуклеотида не из
меняет количества амплифицированного продукта [6].
Условия проведения полимеразной цепной реакции. На взаимо
действие между отдельными нитями, дуплексами, петлями шпилек и
другими типами молекул, формируемых в течение МААР, влияет ряд
параметров. Использование произвольных праймеров требует опреде
ленных условий реакции, которые обусловливают воспроизводимость
результатов. Для поддержания необходимого равновесия эти условия
должны быть тщательно оптимизированы. Такие параметры, как вре
мя и температура отжига, элонгации, денатурации, число циклов, ско
рость нагрева и охлаждения, концентрация праймеров, матрицы, ионов,
ДНК-полимеразы, от которых зависит результат амплификации, по
нашему мнению, должны быть стандартизированы для простоты этой
технологии. Надо учитывать и качество геномной ДНК.
Особенность рассматриваемой ПЦР, как уже упоминалось, состо
ит в том, что праймер может быть неполностью комплементарным по
следовательности ДНК-матрицы при образовании молекул типа «а»
на матричной ДНК и типа «Ь» на матрице «а». Синтез других типов
полупродуктов происходит с полностью комплементарной матрицы.
Для проведения амплификации необходимо, чтобы в течение первых
трех циклов условия отжига были оптимальными для образования не
полностью комплементарных дуплексов. После третьего цикла ампли
фикации температуру отжига необходимо увеличить до оптимальной,
чтобы в реакцию были вовлечены только молекулы типов «d» и «6»
предшествующих циклов. Это позволит уменьшить фоновую амплифи
кацию: синтез молекулы типа «а» и синтез «Ь» на матрице «а». Боль-
ISSN 023Э-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, Х° 3 - 4 59
шая часть молекул типа «а» не участвует в амплификации основных
продуктов реакции, так как не все варианты амплифицируемых моле
кул «а» являются матрицами для синтеза молекул типа «6» в связи с
отсутствием комплементарных участков для праймера.
Вычисление оптимальной температуры отжига для основных цик-*
лов ПЦР производится по формуле, предложенной авторами работы
[18]:
Таопт = 0,3 77ппраймера + 0,7 7тп р о д у к т а — 14,9. (6)
Температуру плавления продукта определяли по стандартной форму
ле, используемой при гибридизации по Саузерну:
Гтпродукта = 8 1 f 5 + 16,6 lg[K+] + 0,41 [G + С %] — 675/Lp, (7)
где [К+] —концентрация ионов калия в молях; [G+C %] —количе
ство G и С в продукте ПЦР в процентах; Lv — длина продукта в па
рах нуклеотидов.
При вычислении температуры плавления праймера применяли те
орию перекрывающихся соседних пар нуклеотидов [19]. Каждой паре
нуклеотидов соответствуют .свои термодинамические параметры, сум
ма которых влияет на свойства праймера. Для вычислений использо
вали свободную энергию Гиббса (dG) для каждой из 16 п. н. [19]:
Гтпраймера ^ _ k _ d G _ f ( g )
где' k = 2,9136826, если концентрация ионов калия в растворе равна
50 мМ; L — длина прайм-ера (в нуклеотидах). В общем же случае фор
мула выглядит следующим образом:
Гтпраймера = _ 3 9 _dG^ + 1 6 ^ 6 j g [ K + ] ( 8 Л )
Для стандартной амплификации точно вычисленная оптимальная
температура отжига определяет чувствительность амплификации и ее
специфичность. Ошибка в три градуса существенно сказывается на
результате амплификации, что выражается в уменьшении выхода ос
новного и появлении неспецифического продуктов [14, 18, 20]. Опти
мальная температура отжига в AP-PCR различается для коротких про
дуктов ПЦР и для продуктов с максимальной длиной при прочих рав
ных условиях. Максимальная разница может составить 6 °С (табл. 2).
Отжиг можно проводить только в диапазоне температуры, оптималь-
'ном для конкретного праймера. Для праймеров равной длины сущест
вует общий диапазон температуры отжига, в пределах которого про
исходит их отжиг с матрицей.
Условием успешной амплификации с произвольными праймерами
является высокая концентрация ионов магния (при стандартной ам
плификации она составляет 1,5 мМ, для МААР — 4 мМ). Такая кон
центрация способствует инициации синтеза продукта ПЦР с неполно
стью комплементарного комплекса праймера и мишени при темпера
туре отжига, ниже оптимальной. Отжиг первых трех циклов AP-PCR и
RAPD следует проводить при температуре, ниже оптимальной на 10 °С.
Для синтеза продукта амплификации необходима высокая кон
центрация праймера. Для AP-PCR она составляет 0,2—0,3 мкМ, для
DAF — до 3 мкМ [6, 20]. Низкая концентрация праймера приводит к
невоспроизводимости результатов.
На воспроизводимость результатов влияет также качество исполь
зуемых препаратов ДНК. Наличие плохо очищенной' или гидролизо-
ванной ДНК-матрицы вызывает нестабильность воспроизводства про
дуктов реакпии или непредсказуемость результатов [20].
Моделирование праймеров. Применяемые в технике МААР прай-
меры могут быть представлены нуклеотидной последовательностью с
60 ISSN 0233-7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1996. Т. 11, № 3—4
GC-составом от 50 до 70 % и длиной не менее пяти нуклеотидов. Вос
производимость результатов может быть связана с GC-составом прай
мера, но данная зависимость не распространяется на виды с различ
ным GC-составом геномной ДНК [21, 22],
Нуклеотидная последовательность праймеров определяет степень
выявляемого меж- и внутривидового полиморфизма. Одни праймеры
выявляют межвидовой полиморфизм, но неприменимы на внутривидо
вом уровне; другие'же выявляют внутривидовой полиморфизм и ма
лопригодны для межвидового исследования в связи с перекрывающим
ся полиморфизмом. Праймеры можно условно разделить на видоспе-
цифичные, внутривидоспецифичные и, возможно, специфичные для бо
лее высоких таксонов. Вероятно, существует определенная зависимость
специфичности прайімера от его нуклеотидной последовательности. На
ми предложена гипотеза о наличии вышеуказанной специфичности
произвольных праймеров и, следовательно, возможности их целена
правленного подбора на основе свойств пар соседних нуклеотидов.
Суть ее состоит в следующем: нуклеотидная последовательность прай-
мера с 3'-конца разбивается на пары нуклеотидов, смещенные на один
нуклеотид к 5'-концу. Например, праймер З'-ATTGCCAGTT образует
пары:
1-я пара —AT; 2-я — ТТ; 3-я —TG; 4-я —GC; 5-я XX; 6-я —СА;
7-я —AG; 8-я—GT; 9-я — ТТ.
Всего вариантов пар четырех нуклеотидов 16 (24). Если проана
лизировать все праймеры, выявляющие внутривидовую специфичность
(так как они представляют наибольший интерес для исследований), и
частоту встречаемости определенных пар нуклеотидов в данном поло
жении праймера, то полученные данные можно использовать для син
теза произвольных праймеров с экстраполированной последователь
ностью. Такие праймеры с большой вероятностью могут применяться
при исследовании внутривидового полиморфизма. Подобную информа
цию можно получить, анализируя последовательность геномной ДНК,
или из банков данных. Для этой цели разработана компьютерная про
грамма, производящая поиск произвольных праймеров в данной по
следовательности и определяющая их нуклеотидный состав. Поиск про
извольных праймеров происходит с учетом заданного числа ошибок
комплементарности (для 8-нуклеотидного праймера максимальное чис
ло мисметчей равно 3, для 10 нуклеотидов соответственно до 5 и так
далее) при необходимом условии полной комплементарности шести
нуклеотидов на З'-конце праймера.
Смоделирована гипотетическая последовательность геномной ДНК
с максимальным разнообразием ее нуклеотидной последовательности.
Последнее необходимо для увеличения разнообразия последователь
ности и уменьшения повторов. Частые повторы не участвуют в образо
вании продуктов AP-PCR, так как структура амплифицированных
продуктов имеет петлеобразную форму, нехарактерную для высоко-
повторяющихся последовательностей. Поэтому при моделировании этой
последовательности придерживались принципа максимального разно
образия нуклеотидного состава. Нуклеотидная последовательность
«синтезировалась» генератором случайных чисел, где каждому вари
анту из трех нуклеотидных сочетаний соответствовало множество чи
сел, генерирующихся компьютером. Образование нуклеотидной цепи
происходило за счет добавления сочетаний, «вызываемых» генератором
случайных чисел. Например, «вызов» триплета AAA происходил толь
ко в случае, если генерировались числа— 1, 65, 129,, 193, 321, 385, 449
и 513; для триплета ААТ — 2, 66, 130, 194, 258, 322, 386, 450 и 514. Раз
мерность множества генерируемых чисел составляла 576. Длина «син
тезируемой» нуклеотидной последовательности была равна 7500 нук
леотидов. Ее было достаточно, чтобы программа отобрала 450 произ
вольных праймеров длиной 8 нуклеотидов без «ошибок» комплемен-
1SSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1996. Т. 11, № 3 - 4 61
тарности праймера с генерированной последовательностью. GC-состав
«синтезируемых» нуклеотидных последовательностей составлял от 45
до 60%.
Сравнение праймеров длиной 8 нуклеотидов, полученных из раз
ных по GC-составу «синтезированных» последовательностей . (разли
чие в 5 %) показало, что величина сходства наиболее часто встречае
мых пар сочетаний нуклеотидов (первые 9 пар из 16) приближается к
половине, но для различных последовательностей с разным GC-соста-
вом эта величина ближе к 60 %. Данные приведены в табл. 4 (полу
жирным шрифтом выделены сходные пары). Таким образом, для про
извольных праймеров, происходящих из контрастных по GC-составу
исследуемых последовательностей, характерны разные сочетания со
седних нуклеотидов. Наблюдается увеличение частоты встречаемости
пар нуклеотидов, содержащих С или G, для последовательностей с
GC-составом, выше 50 %, и А или Т для последовательностей с GC-
составом, ниже 50%. У произвольных праймеров из последовательнос
тей с близким GC-составом (не более 5 % разницы) частота опреде
ленных пар соседних нуклеотидов приблизительно сходна (табл. 3, 4).
Для подбора праймеров необходимо учитывать GC-состав геном
ной ДНК исследуемого организма. Вероятность, амплификации участ
ков ДНК с контрастным содержанием GC-nap представляется низкой.
Богатые А — Т последовательности не участвуют в амплификации, так
как комплекс праймера с такими участками нестабилен и поэтому
меньше вероятность, что они послужат затравкой для полимеразы.
В среднем же можно ориентироваться на 50%-й GC-состав геномной
ДНК.
Т а б л и ц а 3
Зависимость частоты сочетаний соседних пар нуклеотидов от их положения
в 8-нуклеотидном праймере (GC-состав исследуемой модельной ДНК равен 49,9 %)
Частота встречаемости пары нуклеотидов в праймере* (max-»-min)
пары 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Праймер (3'->
ag
аа
ас
tt
tg
ta
ta
£g
gg
ct
at
ag
ga
eg
aa
ac
gt
tg
tt
gt
aa
tt
ta
Ш
ca
gt
gc
at
ga
tc
at
ct
ac
at
tg
at
ct
aa
ag
gc
ag
ag
ta
tt
ta
ta
ta
tg
gt
gt
tg
с а
ga
ga
cc
. ac
tc
ga
tt
tc
at
ca
gg
AGGTTGAA
GGATGTGT
GGACTGAT
AACTGTAG
TTCTGTAG
GACTTGAG
GACAGTGT
* Число «ошибок» спаривания равно 0.
Т а б л и ц а 4
Зависимость частоты сочетаний соседних пар нуклеотидов от их положения
в 8-нуклеотидном праймере (GC-состав исследуемой модельной ДНК равен 50,89 %)•
Частота встречаемости п ары нуклеотидов в праймере* (max-»-miп)
№
пары 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Праймер (3 ' - )
gt
ta
ca
ас
ее
ас
ее
ag
gc
ас
аа
ta
се
ас
аа
ag
ta
cc
eg
ct
aa
tt
ac
gc
eg
K^
ga
ca
ct
tt
aa
gg
ac
gc
eg
eg
eg
ag
ag
aa
aa
ga
ac
ca
gt
tt
gt
tt
ct
ca
gt
ec
ct
tc
e g
gc
gc
tc
gg
gc
ga
tg
tc
GTACCCTC
GTTCCGAC
GTACGGAC
CTCAGGTC
CAGTTCCA
AGCACCTC
AGTACCCA
* Число «ошибок» спаривания равно 0.
62 ISSN 0233̂ 7667. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. 11, № 3-4
Отмечено, что GC-состав всех произвольных праймеров выше та
кового, характерного для модельной последовательности ДНК, при
мерно на 4 %.
Праймеры длиной 8 нуклеотидов подобны праймерам из 9 и более
нуклеотидов, если они не содержат мистметчей. Этим праймерам ха
рактерны общие пары нуклеотидов, количество 8-нуклеотидных прай
меров больше, чем праймеров длиной 9 нуклеотидов. Ситуация изме
няется, если в 9-нуклеотидном праймере допускается хотя бы один
мистметч на последних трех нуклеотидах 5'-конца. Тогда 9-нуклеотид-
ных праймеров больше, и в них входит множество 8-нуклеотидных
праймеров (табл. 3, 5). Например, последовательность длиной 5823
нуклеотида с GC-составом 49,9 % содержит 285 произвольных прай
меров длиной 8 нуклеотидов, для этой же последовательности число
праймеров длиной 9 нуклеотидов составит 600. При одной и той же
температуре отжига (максимально жесткой для 8-нуклеотидного и
близкой к строгой для 9-нуклеотидного праймеров) в первых циклах
предпочтительно применение праймеров длиннее 8 нуклеотидов при
исследовании полиморфизма внутри вида или на уровне особи. При
проведении отжига в максимально мягких условиях предпочтительнее
короткие праймеры (8—10 нуклеотидов), так как комплекс праймера
с мишенью более стабилен. У длинных праймеров (например, 12 и бо
лее нуклеотидов) в условиях, допускающих комплементарность только
6 нуклеотидам на З'-конце праймера, значение dG увеличивается и,
по-видимому, такой комплекс не будет образовываться.
Т а б л и ц а 5
Зависимость частоты сочетаний соседних пар нуклеотидов от их положения
в 9-нуклеотидном праймере (GC-состав исследуемой модельной ДНК равен 49,9 %)
Частота встречаемо ста пары нуклеотидов в праймере* (max-nnin)
1
аа
аа
ас
at
t£
ta
аа
ее
2
it
gg
at
it
tt
gt
ta
gt
3
ga
ta
£g
ct
ta
ga
eg
ta
4
ta
ac
ta
ca
eg
cc
ag
gg
5
gt
tt
gt
tg
ag
at
at
at
6
tc
tc
ag
gc
gt
eg
gg
ag
7
Rg
ct
cc
ta
gc
ag
tc
ga
8
ag
tg
tt
cc
cc
ac
tg
ac
9
at
at
tc
ga
ac
tg
cc
eg
Праймер (З'-)
AACCTGTAT
AACCAGTAG
TTCCTGTAT
GAAGCGTAC
GACCTGTAG
GAACTGTAG
GACAGCCCC
GTTTGTAGG
* Число «ошибок» спаривания равно 1.
В табл. 3—5 приведены произвольные праймеры, полученные в
результате моделирования наиболее встречаемых пар нуклеотидов в
соответствующих положениях праймера. Эти и подобные им прайме
ры, вероятнее всего, могут выявлять внутривидовой полиморфизм.
Заключение. Техника МААР является относительно простым и мно
госторонним диагностическим приемом, подходящим для решения боль
шого числа биологических задач. Амплификация ДНК с использова
нием произвольных праймеров перспективна при идентификации ге
нов, анализе популяций и потомства и генном картировании. При по
мощи этого подхода возможно изучение геномов про- и эукариот без
предварительной информации относительно их последовательности.
МААР представляет новый молекулярно-генетический подход для ус
пешного и быстрого получения ДНК-маркеров. Произвольные прай
меры приобретают статус предсказуемых с предопределенной спе
цифичностью. Не вызывает сомнений, что техника МААР быстро
заменит менее эффективные методы молекулярно-генетического
маркирования.
ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1996. Т. 11, № 3 - 4 63
№
пары
P. ЛІ Календар, Ю. М. Сиволап
ПОЛІМЕРАЗНА ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ З ДОВІЛЬНИМИ ПРАИМЕРАМИ
Р е з ю м е
Полімеразна ланцюгова реакція з довільними праймерами має ряд теоретичних та ме
тодичних особливостей. Для враховування деяких з них було запропоновано її ма
тематичну модель і показано динаміку утворення продукта реакції та інших молекул,
які беруть участь у цьому процесі. Наведено формулу для обчислення температури
ялавління олігонуклеотидних праймерів, що необхідно при розрахунку оптимальної
температури реасоціації. На базі ідеалізованої моделі геномної ДНК було розроблено
алгоритм та комп'ютерну програму пошуку довільних праймерів. Враховано стати
стичну закономірність певних'поєднань нуклеотидів у праимері, що свідчить про його
специфічність при виявленні генетичного поліморфізму. Показано можливість цілеспря
мованого моделювання праймерів.
JR. N. Calendar, Yu. M. Syvolap
POLYMERASE CHAIN REACTION
WITH ARBITRARY OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS
S u m m a r y
Polymerase chain reaction with arbitrary oligonucleotide primers has some theoretical and
methodics peculiarities. For resolution of some from them was proposed the mathematical
model of PCR reaction and dynamics of formation of the reaction product and other
molecules taking part in this process. The formula for calculation temperature of oli
gonucleotide primers melting was proposed to calculate of the optimal temperature of
annealing. The idealize model of the genome DNA and computer program of screening
of all arbitrary were created. The statistical regularity of appointed combinations of
nucleotides in primers showed;, it is specific for reveal of the polymorphism. Hence in
follows possibility of direct designing primers was showed.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mullis К. В., Faloona F. A., Scharf S. et al. Specific enzymatic amplification of DNA
in vitro : The polymerase chain reaction // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.—
1986.— 51.— P. 263—273.
2. Деґабов В. Г. Локальная амплификация нуклеиновых кислот — новый метод ис
следования / / Молекуляр. биология.— 1990.— 24.— С. 304—309.
3. Вартапетян А. Б. Полимеразная цепная реакция / / Там же.— 1991.— 25.— С. 936—
937.
4. Williams J. G. К., Kubelic A. R., Livak К. J. et al. DNA polymorphisms amplified
by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res.— 1990.—18.—
P. 6531—6535.
5. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers //
Ibid.—P. 7213—7218.
6. Caetano-Anolles G. Amplifying DNA with arbitrary oligonucleotide primers // PCR
Meth. and Applications.—1993.—3.—P. 85—94.
7. Nelson D. L.t Ledbetter S. A., Cordo L. et al. Alu polymerase chain reaction: A met
hod for rapid isolation of human-specific sequences from complex DNA sources //
Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1989.—86.—P. 6686—6690.
8. Versalovic /., Koeuth Т., Lupski J. R. Distribution of repetitive DNA sequences in
eubacteria and applications to fingerprinting of bacterial genomes // Nucl. Acids
Res.— 1991.— 19.— P. 6823—6831.
9. Pat. N 5.043.272. USA. Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides
of random sequence as primers / J. L. Hartley, 1991.
10. Zhang L., Cui X.t Schmitt K. el al. Whole genome amplification from a single cell:
Implications for genetic analysis//Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1992.—89.—
P. 5847—5851.
11. Froussard P. rPCR: A powerful tool for random amplification of whole RNA sequen
ces // PCR Meth. and Applications.—1993.—2.—P. 185—190.
12. Caetano-Anolles G., Bassam B. J., Gresshoff P. M. DNA fingerprinting: MAAPing out
a RAPD redefinition? // Bio/Technology.— 1992.— 10.—P. 937.
13. Caetano-Anolles G., Bassam B. J., Gresshoff P. M. DNA amplification fingerprinting
using very short arbitrary oligonucleotide primers // Ibid.— 1991.— 9.— P. 553—557.
64 ISSN 0233»-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1996. Т. 11, НІ 3 - 4
14. Сиволап Ю. М., Календарь Р. //.Генетический полиморфизм ячменя, детектируемый
ПЦР с произвольными праймерами//Генетика.—1994.—31.— С. 12—18.
15. Caetano-Anolles G., Bassam В. /., Gresshoff P. M. DNA amplification fingerprinting:
A strategy for genome analysis // Plant. Мої. Biol. Rep.—1991.—9.—P. 292—305.
16. Tingey S. V., gel Tufo J. P. Genetic analysis with random amplified polymorphic
DNA markers // Plant Physiol.—1993.—101.—P. 349—352.
17. Bassam B. J., Caetano-Anolles G., Gresshoff P. M. Fast and sensitive silve staining of
DNA in polyacrylamide gels // Anal. Biochem.— 1991.—80.—P. 81—84.
18. Rychlik W., Soencer W. Y., Rhoads R. F. Optimization of the annealing temperature
for DNA amplification in vitro // Nucl. Acids Res.—1990.—18.—P. 6400—6414.
19. Kenneth J. В., Frank R., Blocker H., Marky L. Predicting DNA duplex stability from
the base sequence // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1986.—83.—P. 3746—3750.
20. Сиволап Ю. М., Календарь Р. Н. Исследование генетического полиморфизма злако
вых растений при помощи ПЦР со случайными праймерами / / Цитология и ге
нетика.—1994.—№ 6.—С. 54—61.
21. Ferrenberg А. М., Landau D. P., Wong У. /. Monte Carlo simulations: Hidden erros
from «good» random number generators // Phys. Rev. Lett.— 1992.— 69.— P. 3382—
3384.
22. Hayes B. The wheet of fortune // Amer. Sci.—1993.—81.—P. 114—118.
Селекц.-генет. ин-т Укр. Академии Аграр. наук, Одесса Получено 18.10.94-
XSSN 0ДО-7657* БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА* 1995. Т. il t № 3-4 5—5*835 6&
|