Ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карциномы эрлиха. Анализ методом нуклеопротеид-целит-хроматографии
Методом НПЦ-хроматографии исследовано распределение нуклеопротеидов различной прочности в изолированных ядрах и ядерном матриксе. В препаратах матрикса, полученных обработкой ядер ДНКазой I, обнаружены устойчивая к соли-мочевине (ДНК II) и неустойчивая (ДНК I) связи ДНК – матрикс. Все связи устойчив...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1991 |
| Hauptverfasser: | , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1991
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155825 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карциномы эрлиха. Анализ методом нуклеопротеид-целит-хроматографии / Н.И. Сьяксте, А.В. Будылин // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 5. — С. 71-80. — Бібліогр.: 31 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155825 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Сьяксте, Н.И. Будылин, А.В. 2019-06-17T13:49:29Z 2019-06-17T13:49:29Z 1991 Ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карциномы эрлиха. Анализ методом нуклеопротеид-целит-хроматографии / Н.И. Сьяксте, А.В. Будылин // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 5. — С. 71-80. — Бібліогр.: 31 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002F6 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155825 577.113 Методом НПЦ-хроматографии исследовано распределение нуклеопротеидов различной прочности в изолированных ядрах и ядерном матриксе. В препаратах матрикса, полученных обработкой ядер ДНКазой I, обнаружены устойчивая к соли-мочевине (ДНК II) и неустойчивая (ДНК I) связи ДНК – матрикс. Все связи устойчивы к действию меркаптоэтанола, ЭДТА и низкой ионной силы. ДНК II чувствительна к действию нуклеазы S1. для ее разрушения необходимо плавление молекулы ДНК. Рестриктазы вызывают деградацию ДНК II с различной эффективностью: AluI, Sau3AI> >EcoRI, PstI, PvuII>HindIII, SalGI, BamHI. По совокупности свойств ДНК I и ДНК ІІ не соответствуют связям ДНК – матрикс, обнаруживаемым другими методами. Методом НПЦ-хроматографії досліджено розподіл нуклеопротеїдів різної міцності в ізольованих ядрах та ядерному матриксі. У препаратах матриксу, одержаних обробкою ядер ДНКзою І, виявлено стійкий до солі сечовини (ДНК II) та нестійкий (ДНК І) зв'язки ДНК – матрикс і фракція залишкового хроматину. Всі зв'язки стійкі до дії меркаптоетанолу, ЕДТА та низької іонної сили. ДНК II чутлива до дії нуклеази S1, для її зруйнування необхідне плавлення молекули ДНК. Рестриктази викликають деградацію ДНК II з різною ефективністю: ті, що пізнають тетрануклеотид, сильніше від атакуючих гексануклеотид, серед останніх EcoRI, PstI, PvuII більш ефективні, ніж HindIII, SalGI, ВатНІ. По сумі властивостей ДНК І та ДНК II не відповідають зв'язкам ДНК – матрикс, що виявлено другими методами. Distribution of the nucleoproteins, of different tightness has been studied in isolated nuclei and in the nuclear matrix by means of the NPC chromatography. A salt-urea resistant (DNAII) and sensitive (DNAI) DNA-matrix bonds and a fraction of residual chromatin have been detected in the matrix preparations obtained from DNAsel treated nuclei. All bonds are resistant to the action of mercaptoethanol, EDTA and low ionic strength. DNAII is sensitive to nuclease SI, the DNA melting is necessary for its destruction. Restrictases cause the DNAII degradation with unequal effectivity: the four base cutters are more effective as compared to the six base cutters. Among the latter EcoRl, PstI and PvuII degrade the bond to a greater degree than Hindlll, SalGl, BamHI. The totality of the DNAI and DNAII features indicate that these bonds do not correspond to differing types of the DNA-matrix boundings revealed by other methods. Авторы благодарят А. В. Лихтенштейна за инициативу в проведении исследования и ценные советы. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Клеточная биология Ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карциномы эрлиха. Анализ методом нуклеопротеид-целит-хроматографии Асоціація доменів хроматину з ядерним скелетом у клітинах асцитної карциноми Ерліха. Аналіз методом нуклеопротеїд-целіт-хроматографії Association of the chromatin domains with the nuclear skeleton in ehrlich ascites carcinoma cells. Analysis by means of nucleoprotein-celite chromatography Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карциномы эрлиха. Анализ методом нуклеопротеид-целит-хроматографии |
| spellingShingle |
Ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карциномы эрлиха. Анализ методом нуклеопротеид-целит-хроматографии Сьяксте, Н.И. Будылин, А.В. Клеточная биология |
| title_short |
Ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карциномы эрлиха. Анализ методом нуклеопротеид-целит-хроматографии |
| title_full |
Ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карциномы эрлиха. Анализ методом нуклеопротеид-целит-хроматографии |
| title_fullStr |
Ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карциномы эрлиха. Анализ методом нуклеопротеид-целит-хроматографии |
| title_full_unstemmed |
Ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карциномы эрлиха. Анализ методом нуклеопротеид-целит-хроматографии |
| title_sort |
ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карциномы эрлиха. анализ методом нуклеопротеид-целит-хроматографии |
| author |
Сьяксте, Н.И. Будылин, А.В. |
| author_facet |
Сьяксте, Н.И. Будылин, А.В. |
| topic |
Клеточная биология |
| topic_facet |
Клеточная биология |
| publishDate |
1991 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Асоціація доменів хроматину з ядерним скелетом у клітинах асцитної карциноми Ерліха. Аналіз методом нуклеопротеїд-целіт-хроматографії Association of the chromatin domains with the nuclear skeleton in ehrlich ascites carcinoma cells. Analysis by means of nucleoprotein-celite chromatography |
| description |
Методом НПЦ-хроматографии исследовано распределение нуклеопротеидов различной прочности в изолированных ядрах и ядерном матриксе. В препаратах матрикса, полученных обработкой ядер ДНКазой I, обнаружены устойчивая к соли-мочевине (ДНК II) и неустойчивая (ДНК I) связи ДНК – матрикс. Все связи устойчивы к действию меркаптоэтанола, ЭДТА и низкой ионной силы. ДНК II чувствительна к действию нуклеазы S1. для ее разрушения необходимо плавление молекулы ДНК. Рестриктазы вызывают деградацию ДНК II с различной эффективностью: AluI, Sau3AI> >EcoRI, PstI, PvuII>HindIII, SalGI, BamHI. По совокупности свойств ДНК I и ДНК ІІ не соответствуют связям ДНК – матрикс, обнаруживаемым другими методами.
Методом НПЦ-хроматографії досліджено розподіл нуклеопротеїдів різної міцності в ізольованих ядрах та ядерному матриксі. У препаратах матриксу, одержаних обробкою ядер ДНКзою І, виявлено стійкий до солі сечовини (ДНК II) та нестійкий (ДНК І) зв'язки ДНК – матрикс і фракція залишкового хроматину. Всі зв'язки стійкі до дії меркаптоетанолу, ЕДТА та низької іонної сили. ДНК II чутлива до дії нуклеази S1, для її зруйнування необхідне плавлення молекули ДНК. Рестриктази викликають деградацію ДНК II з різною ефективністю: ті, що пізнають тетрануклеотид, сильніше від атакуючих гексануклеотид, серед останніх EcoRI, PstI, PvuII більш ефективні, ніж HindIII, SalGI, ВатНІ. По сумі властивостей ДНК І та ДНК II не відповідають зв'язкам ДНК – матрикс, що виявлено другими методами.
Distribution of the nucleoproteins, of different tightness has been studied in isolated nuclei and in the nuclear matrix by means of the NPC chromatography. A salt-urea resistant (DNAII) and sensitive (DNAI) DNA-matrix bonds and a fraction of residual chromatin have been detected in the matrix preparations obtained from DNAsel treated nuclei. All bonds are resistant to the action of mercaptoethanol, EDTA and low ionic strength. DNAII is sensitive to nuclease SI, the DNA melting is necessary for its destruction. Restrictases cause the DNAII degradation with unequal effectivity: the four base cutters are more effective as compared to the six base cutters. Among the latter EcoRl, PstI and PvuII degrade the bond to a greater degree than Hindlll, SalGl, BamHI. The totality of the DNAI and DNAII features indicate that these bonds do not correspond to differing types of the DNA-matrix boundings revealed by other methods.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155825 |
| citation_txt |
Ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карциномы эрлиха. Анализ методом нуклеопротеид-целит-хроматографии / Н.И. Сьяксте, А.В. Будылин // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 5. — С. 71-80. — Бібліогр.: 31 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT sʹâksteni associaciâdomenovhromatinasâdernymskeletomvkletkahascitnoikarcinomyérlihaanalizmetodomnukleoproteidcelithromatografii AT budylinav associaciâdomenovhromatinasâdernymskeletomvkletkahascitnoikarcinomyérlihaanalizmetodomnukleoproteidcelithromatografii AT sʹâksteni asocíacíâdomenívhromatinuzâdernimskeletomuklítinahascitnoíkarcinomierlíhaanalízmetodomnukleoproteídcelíthromatografíí AT budylinav asocíacíâdomenívhromatinuzâdernimskeletomuklítinahascitnoíkarcinomierlíhaanalízmetodomnukleoproteídcelíthromatografíí AT sʹâksteni associationofthechromatindomainswiththenuclearskeletoninehrlichascitescarcinomacellsanalysisbymeansofnucleoproteincelitechromatography AT budylinav associationofthechromatindomainswiththenuclearskeletoninehrlichascitescarcinomacellsanalysisbymeansofnucleoproteincelitechromatography |
| first_indexed |
2025-11-24T16:09:57Z |
| last_indexed |
2025-11-24T16:09:57Z |
| _version_ |
1850850911993200640 |
| fulltext |
16. Bond D. J., McMillan Ζ. The effect of p-iluorophenylalanine on the f requency of
aneuploid meiotic products in Sordaria brevicoilis / / Muta t . Res.—1979.— 60, N 2.—
P. 221—224.
17. A. c. 1544798 СССР, М К И C 12 № 5/00. Стимулятор эмбриогенеза в культуре
растительной ткани / О. В. Захленюк, И. А. Костенюк, В. А. Кунах и др. // Бюлл.
№ 7.— 1990.
18. Malepszy S. Ku l tu ry tkankowe w genet ice rosl in ze szczego lnym uwzclednieniem
haplo idow // Zes. nauk S G G W A R Warsz . Rozrp. nauk.— 1979.— 110 .—S. 113.
19. Gupta N., Bhaskaran S. In vitro i solat ion of biochemical m u t a n t s in haplo id cell
cul tures of Nicotiana tabacum 11 P l a n t cell cuit. crop improv: Proc. Int . symp. (Cal-
cut ta , 1 9 8 1 ) . — N e w York; London, 1983 .—P. 387—396.
20. Role of pe rmanen t dicentric sys tems in car ro t somat ic embryogenes i s / F. Toncelli ,
G. Mar t in i , G. Giovinazzo et a l . / / T h e o r . and Appl. Genet .— 1 9 8 5 . — 7 0 . — P . 345—384.
21. Bvans D. A. Somac lona l var ia t ion-genet ic bas is and b reed ing a p p l i c a t i o n s / / T r e n d s
Genet.— 1989.—5, N 2 . — P . 35—63.
22. Кунах В. А. О связи м е ж д у плоидностью штаммов Crepis capillaris и Haplo-
pappus gracilis и спонтанным органогенезом // Цитология и генетика.— 1974.— 8,
№ 4.— С. 303—308.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики А Н УССР, Киев Получено 11.02.91
Ин-т клеточ. биологии и генет. инженерии А Н УССР, Киев
У Д К 577.113
Н. И. Сьякете, А. В. Будылин
АССОЦИАЦИЯ ДОМЕНОВ ХРОМАТИНА С ЯДЕРНЫМ СКЕЛЕТОМ
В КЛЕТКАХ АСЦИТНОЙ КАРЦИНОМЫ ЭРЛИХА.
АНАЛИЗ МЕТОДОМ НУКЛЕОПРОТЕИД-ЦЕЛИТ-ХРОМАТОГРАФИИ
Методом НПЦ-хроматографии исследовано распределение нуклеопротеидов различной
прочности в изолированных ядрах и ядерном матриксе. В препаратах матрикса, по-
лученных обработкой ядер ДНКазой I, обнаружены устойчивая к соли-мочевине
(ДНК I I ) и неустойчивая (ДНК I ) связи ДНК — матрикс. Все связи устойчивы к дей-
ствию меркаптоэтанола, ЭДТА и низкой ионной силы. ДНК II чувствительна к дейст-
вию нуклеазы St. для ее разрушения необходимо плавление молекулы ДНК. Рестрик-
тазы вызывают деградацию ДНК II с различной эффективностью: AluI, Sau3AI^>
>EcoRIf PstIf PvuII>HindIIIf SalGI, BamHI. По совокупности свойств ДНК I и
ДНК Ii не соответствуют связям ДНК — матрикс, обнаруживаемым другими
методами.
Введение. Со скелетными структурами клеточного ядра (ядерный мат-
рикс, каркас, нуклеоид) ассоциированы многие ферментативные ак-
тивности, включая транскрипцию и репликацию [1—7]. Разнообразие
функций ядерного скелета объясняют множественностью и гетероген-
ностью точек ассоциации Д Н К с этой структурой. Различаются типы
связи Д Н К с ядерным матриксом по признакам устойчивости к хела-
тирующим агентам [1, 8, 9], постоянства и зависимости от транскрип-
ции [4, 6]. Разработана модель функционирования ядерного матрикса,
основанная на разделении функций разных точек связи Д Н К с ядер-
ным скелетом [3]. При помощи метода НІІЦ-хроматографии были об-
наружены различающиеся по прочности два типа связи Д Н К с ядер-
ным матриксом. «Слабая» связь (ДНК I) разрушается в концентри-
рованных растворах соли-мочевины, «прочная» (ДНК I I ) — п р и высо-
кой температуре. Предполагается, что прочная связь участвует в ре-
пликации и имеет топологическую природу. Предварительно охарак-
теризованы полипептиды и последовательности ДНК, образующие
комплексы. Идентифицировать Д Н К I и Д Н К II со связями, обнару-
женными другими методами, не удается [2, 10—14].
Значительная часть результатов получена при помощи двухгради-
ентного варианта НПЦ-хроматографии, в котором Д Н К I и несвязан-
<D н . И. СЬЯКСТЕ, А. в . Б У Д Ы Л И Н , 1991
ISSN 02:>3-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 71
ная с матриксом Д Н К не разделяются, что затрудняет их интерпрета-
цию. В предлагаемой работе ДНК-белковые взаимодействия в препа-
ратах изолированных ядер и ядерного матрикса, подвергнутых различ-
ным воздействиям, изучали усовершенствованным трехградиентным
вариантом НПЦ-хроматографии. Целью работы было сопоставление
некоторых свойств Д Н К I и Д Н К II с различными типами связи, вы-
являемыми на основе других критериев.
Материалы и методы. Работа выполнена на клетках тетраплоид-
ного штамма перевиваемой асцитной карциномы Эрлиха. Д Н К метили
внутрибрюшинным введением 3Н-тимидина (3,7 МБк) за сутки до за-
боя мышей-опухоленосителей (7—9-й день). Ядра и матрикс выделя-
ли, как описано ранее [11, 13]. Обработку ДНКазой I проводили в
25 мМ трис-HCl, рН 7,6, 5 мМ MgCl2, реакцию останавливали добав-
лением ЭДТА до 10 мМ. С Si-нуклеазсй инкубировали в 0,02 M
Na-ацетатном буфере, рН 4,5, 0,2 M NaCl, 1 мМ ZnSO2, реакцию оста-
навливали увеличением концентрации NaCl до 2 М. Инкубацию с ре-
стриктазами осуществляли в среднесолевом рестриктазном буфере
(100 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 0,02 %-ный три-
тон Х-100). Трехградиентный вариант НПЦ-хроматографии подробно
описан ранее [13]. Исследуемые нуклеопротеиды фиксировали на це-
лите белковой частью, Д Н К высвобождали из комплекса с белками
градиентами концентрации NaCl (0—З М), LiCl-мочевины (0—4 М,
8 M соответственно) и температуры (0—IOO0C при постоянном про-
пускании через колонку 4 M LiCl, 8 M мочевины). Все растворы со-
держали 25 мМ трис-HCl, рН 7,6, и 5 мМ MgCl2. В отдельных слу-
чаях вместо 5 мМ MgCl2 растворы содержали 1 мМ ЭДТА или гради-
ент температуры проводили с 0,12 M LiCL 8 M мочевиной. Очистку
ДНК, электрофорез в агарозе и сканирование гелей осуществляли по
общепринятым методикам.
Результаты и обсуждение. На первом этапе работы исследовано
НПЦ-хроматографическое распределение Д Н К из различных субъядер-
ных фракций, полученных после обработки изолированных ядер
ДНКазой I. Д Н К интактных ядер практически количественно элюиру-
ется в градиенте температуры (ДНК II) (рис. 2, а) . Обработка
ДНКазой I резко изменяет характер хроматограммы, пик Д Н К II прак-
тически исчезает, его сменяет пик Д Н К I, присутствует и несвязанная
с матриксом фракция Д Н К 0, элюируемая NaCl (рис. 1: НПЦ-хрома-
тограммы Д Н К субъядерных фракций, полученных обработкой изоли-
рованных ядер асцитной карциномы Эрлиха ДНКазой I (6 ед. Кунит-
ца в 1 мл, 37 °С, концентрация Д Н К 100 мкг/мл): а — изолированные
ядра; б — изолированный матрикс; в — хроматин, экстрагированный
при низкой ионной силе. Здесь и далее по оси абсцисс — номера фрак-
ций, по оси ординат — радиоактивность 3Н-тимидина, (имп/мин) · 10~3).
В данном случае полностью воспроизводятся ранее полученные резуль-
таты [13]. Однако после экстракции хроматина распределение пиков
Д Н К в ядерном матриксе парадоксально изменилось. Представлены
примерно равновеликие фракции Д Н К 0, Д Н К I и Д Н К П. Хроматин,
экстрагированный при низкой ионной силе, элюируется градиентом
концентрации NaCl (см. рис. Ι , β ) . Выраженность пика Д Н К II в пре-
паріатах матрикса, подвергнутых трехградиентной НПЦ-хроматографии,
и почти полное его отсутствие в наших прежних опытах [13] в принци-
пе объяснимы. В двухградиентном варианте фракции Д Н К 0 (остаточ-
ный хроматин, содержание которого может быть значительным) и
Д Н К I налагаются друг на друга и создается впечатление преоблада-
ния Д Н К I. В трехградиентном варианте эти пики разрешаются, Д Н К
II становится более заметным. Кроме того, при работе с клетками ас-
цитной карциномы Эрлиха, меченными in vivo, можно получить боль-
шое количество материала с высокой удельной активностью, что облег-
чает идентификацию фракций. Резкое снижение содержания Д Н К I в
ходе выделения матрикса можно объяснить гидродинамическим отры-
вом массы Д Н К от матрикса при экстракции хроматина. Ранее фрак-
72 I S S N 02:>3-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А . 1991. Т. 7. № 5 72
цию Д Н К Η наблюдали в препаратах матрикса, полученных после об-
работки ядер ДНКазой II и микрококковой нуклеазой [15].
Однако разработанная ранее модель топологической связи в зна-
чительной мере базировалась на данных о гиперчувствительности проч-
ной связи к ДНКазам. Считается, что эта связь образована локально
денатурированным участком ДНК, закрепленным на белковом стерж-
не. Внесение разрывов в этот участок приводит к разрушению связи.
Казалось, что в литературе накапливаются данные, подтверждающие
Рис. 1 Рис. 2
нашу модель. Наличие гиперчувствительных участков в Д Н К II под-
тверждено при помощи ник-трансляции [14], имеется много данных
о существовании гиперчувствительных участков в местах прикрепле-
ния Д Н К к матриксу [7, 16], в том числе и близ начала репликации
[17]. Установлены участие легкоплавких АТ-богатых участков в при-
креплении Д Н К к матриксу [18—20], необходимость суперспирализа-
ции Д Н К для ее связывания с матриксом [21], наличие участков с не-
обычной вторичной структурой в основании петли Д Н К [4, 20, 22, 23]
и факт чувствительности этих участков к нуклеазе Si [5]. Присутствие
остаточной фракции Д Н К II, резистентной к ДНКазе I, не опровергает
полностью нашу модель и к тому же взамен гиперчувствительности не-
обходимо представить столь же веские аргументы.
Подобным аргументом могла бы быть чувствительность прочной
связи к нуклеазам, специфичным к однонитчатой ДНК. Мы располага-
ем такими данными, однако в одном случае они были получены с при-
менением двухградиентной НПЦ-хроматографии [24], что затрудняет
74 I S S N 02:>3-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 73
интерпретацию, в другом — в экспериментах с изолированными ядра-
ми, в которых низка доступность однонитчатых участков для фермен-
та, поэтому результаты малоубедительны [25]. Данные были прове-
рены на препаратах комплексов Д Н К —матрикс, обработанных нукле-
азой Si (рис. 2: НПЦ-хроматограммы комплексов Д Н К —матрикс:
а — интактный комплекс; б —обработка Si-нуклеазой (200 ед/мл,
W 20 ЗО 40 SO
Рис. З
ЗО мин, 37 °С); β — то же (400 ед/мл, 60 мин, 37 °С)). Нуклеаза S1
эффективно переводит Д Н К И в формы Д Н К I и Д Н К 0 в зависимости
от концентрации фермента и времени обработки. Наличие фракции
Д Н К 0 обусловлено, по-видимому, остаточными гистонами на петлях
Д Н К в препарате и лишний раз подтверждает преимущества трехгра-
диентного метода. Эффект перехода значительно сильнее выражен на
комплексах Д Н К — матрикс, чем на изолированных ядрах [25].
Модель предполагает необходимость плавления Д Н К для отрыва
Д Н К И от матрикса. Облегчение условий плавления Д Н К резким сни-
жением ионной силы раствора при проведении градиента температуры
(с 4 до 0,12 M LiCl) с сохріанением высокой концентрации мочевины
(8 М) привело к значительному снижению температуры элюции Д Н К
II от 100 до 15 °С (рис. 3: НПЦ-хроматограмма Д Н К изолированных
ядер. Градиент концентрации NaCl не использовали, при проведении
градиента температуры концентрация LiCl была снижена до 0,12 М.
Стрелки означают этапы градиента температуры). Таким образом, на-
ша модель, по-видимому, в целом верна. Скорее всего, гиперчувстви-
тельный участок не ограничен только локально денатурированным
сайтом, но включает и его окружение. При незначительной фрагмен-
тации разрывы могут располагаться поблизости от расплетенного уча-
стка, сам же он оставаться интактным. В таком случае возможно со-
хранение остаточной фракции Д Н К II.
Неразрешенным до конца вопросом остается и взаимосвязь Д Н К I
и Д Н К II с описанными в литературе типами связи Д Н К — матрикс.
Особенно нас интересовали «тип I» и «тип II», описанные Леммли с
сотр. ([8, 19], обзоры [1, 31]). Тип I чувствителен к действию меркап-
тоэтанола и ЭДТА [9], содержит специфические последовательности,
связывающиеся с матриксом (MAR), консенсус для топоизомеразы II
[8], образует розеточные структуры [9]. Тип II устойчив к действию
74 I S S N 02:>3-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 74
хелатирующих агентов, образован белками ламины. При помощи сла-
бой обработки изолированных ядер ДНКазой I были получены пре-
параты, в которых хорошо выражены все три фракции Д Н К (рис. 4:
НПЦ-хроматограммы изолированных ядер, инкубированных в средах
различного состава. Ядра обработаны ДНКазой I (а — в — 6 ед. Ky-
нитца в 1 мл, 15 мин, 0°С; г, д — 6 ед. Кунитца в 1 мл, 5 мин, 37 °С);
а, г —контроль; 6 — 25 мМ трис-HCl, рН 7,6, 5 мМ MgCl2, 1 мМ β-
меркаптоэтанол, 1 ч, 0°С; в — 1 мМ трис-HCl, рН 7,6, 2 мМ ЭДТА,
1 ч, O0C; <5—15 мМ β-меркаптоэтанол, 10 мМ ЭДТА, 1 ч, 0 °С) . По-
следующая инкубация в среде (см. рис. 4, б) не изменила характера
хроматограмм. Поскольку известно, что для образования связи «тип
II» наиболее важны двухвалентные ионы [9], опыт был повторен в
более жестких условиях. Обработанные ДНКазой I ядра инкубирова-
ли в 15 мМ меркаптоэтаноле, 10 мМ ЭДТА, после чего провели НПЦ-
хроматографию при помощи растворов, в которых 5 мМ MgCl2 был
заменен на 1 мМ ЭДТА. Эта инкубация не элиминировала ни один из
типов связи на НПЦ-хроматограммах (см. рис. 4, д).
Разиным с сотр. [4, 6] обнаружены перманентный и зависящий
от транскрипции типы связи Д Н К — матрикс. Характерной чертой
I S S N 02:>3-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А . 1991. Т. 7. № 5 75
связанных с транскрипцией комплексов является их неустойчивость при
низкой ионной силе [6]. Инкубация обработанных ДНКазой I ядер в
1 мМ трис-НС1, 2 мМ ЭДТА в течение 1 ч при О °С не вызвала, одна-
ко, резких изменений на НПЦ-хроматограммах (рис. 4, в). Таким об-
разом, на основании чувствительности к составу среды Д Н К I и.
Pxic. 5
Д Н К II нельзя отождествить с типами связи Д Н К — матрикс, описан-
ными другими авторами.
Еще одним возможным путем сравнения разных типов связи
Д Н К — матрикс является исследование их чувствительности к перева-
риванию рестриктазами. Нами ранее была описана неодинаковая чув-
ствительность прочной связи к различным рестриктазам в клетках
НТ1080 [42]. Известна также обогащенность различным повторами
ДНК, образующей связи типа I и II по Леммли [9]. Безусловно, Hia
чувствительность к рестриктазам могут влиять различные факторы.
Например, в домене рДНК шпорцевой лягушки имеется лишь один
сайт для HindIII [5], сильно влияет на характер перевара и экраниро-
вание белками, особенно в точках прикрепления к матриксу [26]. Од-
74 I S S N 02:>3-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 6
нако в целом чувствительность к перевору рестриктазами в известной
мере характеризует распределение повторов с различным мотивом
вдоль петли хроматина. Инкубацию с рестриктазами проводили в сред-
несолевом буфере, чтобы исключить влияние различной степени кон-
денсации хроматина в средах с разной ионной силой. На начальном
этапе было исследовано влияние частоты внесения разрывов рестрик-
тазами на характер НПЦ-хроматогріамм. Для этой цели сравнивали
ферменты, атакующие тетрануклеотид, с ферментами, атакующими
гексануклеотид, содержащий ту же
последовательность. Все рестриікта-
зы брали в концентрации 600 ед/мл,
инкубировали 1 ч при 37 °С. На
рис. 5 представлены НПЦ-хромато-
граммы ядер, обработанных рес-
триктазами, узнающими 4 или 6
пар оснований (а: 1 — A l u I (AGCT),
2 —PuulI (GAGCTG); б: 1 —
Sau3AI (GATC), 2 — BamHI
(GGATCC)). Как видим, более
сильная фрагментация Д Н К (ден-
ситограммы электрофорезов ДНК,
выделенных из ядер, представлены
на рис. 6: / — контроль, 2 — BatnHI,
3 — Sau3AI, 4 — PvuII, 5 —AluI:
стрелки обозначают положения
стандартов (11,6; 11,03; 8,04; 4,89;
4,32; 3,11 тыс. пар оснований, спра-
ва налево) сопровождается более
выраженным переходом Д Н К II—
I—0. Если же сравнить эффек-
тивность различных рестриктаз,
атакующих гексаиуклеотиды, то
здесь заметны различия. SalGI1
HindIIIy BamHI вызывают менее
выраженный переход по сравнению
с EcoRI, PstI, PvuII ( с м . р и с . 5 и
рис. 7: НГЩ-хроматограммы изо-
лированных ядер, обработанных
рестриктазами, атакующими гекса-
иуклеотиды: а — SalGI, б —
HindIIU в — EcoRI, г — PstI). Н е -
смотря на различия объектов, дан-
ные очень хорошо совпадают с результатами, полученными на клетках
человека [23]. Аналогии с нуклеоидами I и II типа по Леммли обна-
ружить не удается. ДНК, образующая ЭДТА-чувствительную связь,
содержит повторы PstI и SalGI, нечувствительную — EcoRI и HindIII1
сайты для AluI имеются в Д Н К обоих типов [9].
В заключение следует отметить, что, несмотря на признание все-
ми множественности ассоциации Д Н К с матриксом, конкретные харак-
теристики отдельных фракций сильно различаются у разных авторов.
Ковалентно связанные нуклеопротеиды одинакового полипептидного
состава, по данным одних авторов, участвуют в транскрипции [6], дру-
гих — содержат сателлигную Д Н К и нетранскрибируемые последова-
тельности [27]. Нами в подобных препаратах обнаружены четыре типа
связи Д Н К — белок [28, 29]. Розетки находят во фракции, чувстви-
тельной к ЭДТА [1] и в депротеинизированной Д Н К [30]. Очевидно,
ассоциация Д Н К с ядерным матриксом плохо укладывается в упро-
щенные схемы, по-видимому, картина очень изменчива, возможно об-
разование сложных субпетель внутри одного домена [16]. При береж-
ном выделении ядерного скелета обнаруживается ассоциация с ним
Д Н К на большом протяжении (90 тыс. пар оснований) [26], внутри
74 I S S N 02:>3-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 77
отого участка характер взаимодействий может быть чрезвычайно слож-
ным, а при различных методах выделения матрикса связь с Д Н К мо-
гут сохранять разные его фрагменты.
Прочная связь Д Н К II доступна для исследования только мето-
дом НПЦ-хроматографии и ускользает из поля зрения при примене-
нии других подходов, например, недавно опубликовано сообщение о
Рис. 7
полной экстракции Д Н К из препаратов матрикса солью и мочевиной,
т. е. получена фракция, соответствующая Д Н К I, а Д Н К II осталась
незамеченной [31].
Авторы благодарят А. В. Лихтенштейна за инициативу в проведе-
нии исследования и ценные советы.
Р е з ю м е
ІНетодом НПЦ-хроматографі ї досліджено розподіл нуклеопротеїдів різної міцності в
ізольованих ядрах та ядерному матриксі. У препаратах матриксу, одержаних оброб-
кою ядер Д Н К з о ю І, виявлено стійкий до солі сечовини ( Д Н К II) та нестійкий
( Д Н К І) зв 'язки Д Н К — матрикс і фракція залишкового хроматину. Всі зв 'язки стій-
кі до дії меркаптоетанолу, Е Д Т А та низької іонної сили. Д Н К II чутлива до дії нук-
леази S1, д л я її зруйнування необхідне плавлення молекули Д Н К . Рестриктази ви-
кликають деградацію Д Н К II з різною ефективністю: ті, що пізнають тетрануклео-
тид, сильніше від атакуючих гексануклеотид, серед останніх EcoRI, PstI, PvuII більш
ефективні, н іж HindIII, SalGI, ВатНІ. По сумі властивостей Д Н К І та Д Н К II не
відповідають зв ' я зкам Д Н К — матрикс, щ о виявлено другими методами.
S u m m a r y
Dist r ibut ion of the nucleoproteins , of d i f ferent t i gh tness has been studied in isolated
nuclei and in the nuclear mat r ix by means of the N P C chromatography . A sa l t -u rea
res i s tan t (DNAII ) and sensi t ive (DNAI) DNA-mat r ix bonds and a f rac t ion of res idual
chromat in have been detected in the mat r ix p repara t ions obta ined f rom DNAseI t rea ted
I S S N 0 2 3 3 - 7 6 5 7 . Б И О П О Л И М Е Р Ы И К Л Е Т К А . ! 9 9 1 . Т . 7 . Λο 5
nuclei . All bonds are res i s tan t to the action of mercap toe thanol , EDTA and low ionic
s t r eng th . DNAII is sensi t ive to nuclease S i , the DNA me l t i ng is necessary for its
des t ruct ion. Res t r ic tases cause the DNAII deg rada t ion with unequa l effect ivi ty: the
four base cu t te rs are more effect ive as compared to the six base cut ters . A m o n g the
la t te r EcoRl, PstI and PvuII d eg rade the bond to a g rea te r degree than HindIIIy
SalGIf BamHI. The to ta l i ty of the DNAI and DNAII fea tu res indicate tha t these bonds do
not cor respond to d i f f e r ing types of the D N A m a t r i x b o u n d i n g s revealed by o ther
methods .
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Глазков Μ. В. Нуклеоиды клеток печени крысы: седиментационный и флуорес-
центный анализы; Д Н К , ассоциированная с остаточными ядерными структурами //
Молекуляр . биология.— 1986.—20, № 6 .—С. 1682—1691.
2. И0ентификация прочного комплекса Д Н К — матрикс (тип II) как места нахожде-
ния репликативной вилки / Μ. М. Забойкин, В. Л. Моисеев, В. С. Шапот, А. В. Лих-
т е н ш т е й н / / Т а м же.— 1988.—22, № 4 . — С . I i 19—1126.
3. Bodnar J. W. A domain model for eukaryot ic DNA organ iza t ion : a molecular bas i s
for cell d i f fe ren t ia t ion and chromosome e v o l u t i o n / / J . Theor. Biol.— 1^88.— 132.
N 4,— P. 479—507.
4. Characterization of DNA pa t t e rn in the site of pe rmanen t a t t achment to the nuclear
mat r ix located in the vicinity of repl icat ion or igin / A. G. Ka landadze . S. A. Bu-
shara , E. S. Vasse tzky, Jr. , S. V. Razin // Biochem. and Biophys. Res. Communs .—
1990,— 168, N 1 . — P . 9—15.
5. Marilley M., Gassend-Bonnet G. Supercoiled loop o rgan iza t ion of genomic DNA: a
close re la t ionship between loop domains , expression units, and replicon o r g a n i z a -
t ion in rDNA f rom Xenopus laevisj/ Exp. Cell Res.— 1989,— 180, N 4 . — P . 475—489.
6. The distribution of t igh t ly bound prote ins a long the DNA chain ref lects the type of
cell d i f fe ren t ia t ion / S. V. Razin, V. V. Chernokhvostov , E. S. Vasse tzky , Jr . et a l . / /
Nucl. Acids Res.— 1988,— 16, N 9 . — P . 3617—3633.
7. A nuclear DNA a t tachment element media tes elevated and pos i t ion- independent gene
a c t i v i t y / A . Stief , D. Winter , W. H. S t r a t l i ng , A. S i p p e l / / N a t u r e . — 1989.—341,
N 6240.— P. 343—345.
8. Izaurralde E., Mirkovitch J., Laemmli U. K. In terac t ion of DNA with nuclear scaf-
fo lds in Vitro H J. Мої. Biol.— 1988,—200, N 1 ,—P. 111 — 125.
9. Глазков Μ. В. Структурно-функциональная организация Д Н К в интерфазном яд-
ре. Структурный аспект // Молекуляр. биология.— 1988.— 22, № 1.— С. 16—30.
10. Сьяксте Н. И. Роль разрывов Д Н К в регуляции процессов клеточной пролифера-
ции, дифференцировки и старения / /Онтогенез .— 1987.— 18, № 3.— С. 229—238.
11. Сьяксте Н. И. Взаимодействия различных групп белков ядерного матрикса с
Д Н К / / Б и о х и м и я . — 1988.—53, № 2 ,—С. 256—262.
12. Сьяксте Н. И., Блохин Д. Ю. Белковый состав комплексов Д Н К — матрикс с
«прочным» и «слабым» типом связи, выделенных из клеток асцитной карциномы
Э р л и х а / / Т а м же.— 1989.—54, № 7 .—С. 1217—1223.
13. Анализ клеточных нуклеопротеидов методом нуклеопротеид-целит-хроматографии.
III . Д в а типа взаимодействий Д Н К с ядерным матриксом / Н. И. Сьяксте,
Μ. М. Забойкин, Е. А. Эренпрейса и д р . / / М о л е к у л я р . биология.— 1985.— 13, ЛЬ 5.—
С. 1231 — 1241.
14. Забойкин М. M., Алехина Р. П., Лихтенштейн А. В. Сравнительны;! анализ суб-
доменных фрагментов х р о м а т и н а / / Т а м же.— 1989 — 23, N° 3.—-С. 851—861.
15. Сьяксте Н. И., Буиылин А. В. Прочность ДНК-белковых взаимодействий в раз-
личающихся по чувствительности к иуклеазам фракциях хроматина Ц Молекуляр.
генетика.— 1988 .—№ 10,—С. 30—34.
16. Jartnan А. P., Higgs D. R. Nuclear scaffold a t t achment sites in the h u m a n globin
gene c o m p l e x e s / / E M B O J.— 1988,— 7, N 11.— P. 3337—3344.
17. Pauli Ό., Kuenzler PBraun R. Unusua l nucleoprotein s t ruc tures in the vicinity of
the repl icat ion or ig ins of the ex t rachromosomai rDNA of the sl ime mold Physarutn
p o l y c e p h a l u m / / B i o c h e m . and Cell. Biol.— 1988,— 66, N 9 , — P . 935—941.
18. Hierarchical b ind ing of DNA f r a g m e n t s derived f r o m scaf fo ld -a t t ached regions: cor-
relat ion of proper t ies in vitro and func t ion in vivo I Ch. Mielke, Y. Kohwi, T. Koh-
wi-Shigernatsu , J. Bode // Biochemistry .— 1990.— 29, N 3 2 . — P . 7475—7485.
19. Kas. L., Izaurralde E., Laemmli U. Specific inhibit ion of DNA b ind ing to nuclear
sca f fo lds and his tone H l by dis tamycin. The role of o l i g o ( d A ) - o l i g o ( d T ) t r ac t s / / '
J. Мої. Biol.— 1989.—210, N 3 , — P . 587—599.
20. Greenstein R. Cons t i tu t ive a t t achment of mur ine ery thro leukemia cell h is tone-deple-
ted DNA loops to nuclear s ca f fo ld ing is found in the β -ma jo r but not the a l - g l o -
bin g e n e / / D N A . — 1988,—7, N 9 , — P . 601—607.
21. Tsutsui K., Tsutsui K., Muller M. T. The nuclear sca f fo ld exhibits DNA-bind ing
sites selective for supercoiled D N A / / J . Biol. Chem.— 1988.—263, N 15 ,—P. 7235—
7241.
22. Homberger H. P. Bent DNA is a s t ruc tu ra l fea ture of sca f fo ld -a t t ached regions in
Drosophila melanogaster in te rphase n u c l e i / / C h r o m o s o m a — 1 9 8 9 — 98 N 2 —
P. 99—104.
ISSN 02:>3-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 7 9
23. Yeast A R S f u n c t i o n a n d nuc lea r m a t r i x assoc ia t ion coincide in a shor t sequence
f r o m the h u m a n H P R T l o c u s / R . C. Sykes , D. Lin, S. G. H u a n g et a l . / / M o l . a n d
Gen. Gene t .— 1988.—212, N 2 . — P . 301—309.
24. Сьяксте Η. И., Будылин А. В. Изменение взаимодействий Д Н К с белками ядер-
ного м а т р и к с а при переваривании ядер рестриктазами и нуклеазой ВаІЗІ // Био-
химия.— 1988.—53, JMb 1 .—С. 54—60.
25. Сьяксте Н. И., Будылин А. В. Распределение Д Н К во фракциях , р а з л и ч а ю щ и х с я
по прочности ассоциации с ядерным матриксом при активации Д Н К - э н д о н у к л е а з
клеточных я д е р и действии S i -нуклеазы // М о л е к у л я р . генетика.— 1990.— № 7.—
С. 21—24.
26. Jackson D. Α., Dickinson P., Cook P. R. A t t a c h m e n t of DNA to the nuc leoske le ton
of HeLa cel ls examined u s i n g phys io log ica l c o n d i t i o n s / / N u c l . Acids Res.— 1990.—
18, N 1 5 . — P . 4385—4393.
27. Werner D., Neuer-Nitsche B. S i te-specif ic loca t ion of cova len t DNA-po lypep t ide
complexes in the chicken g e n o m e / / I b i d — 1989 — 17, N 1 5 . — P . 6005—6015.
28. Сьяксте Η. И., Сьяксте Т. Г. Гетерогенность по прочности связи с Д Н К белков,
устойчивых к д е п р о т е и н и з а ц и и / / Б ю л . эксперим. биологии и медицины.— 1990.—
ПО, JMb 8 . — С . 194—196.
29. Sjakste N. L, Budylin Α. V., Sjakste Т. G. D isconnec t ion of D N A d o m a i n s in quies-
cent and d i f f e r e n t i a t i n g c e l l s / / N u c l e a r s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n . — New York, 1990.—
P . 365—369.
30. Identification of a rose t te -enr iched c h r o m a t i n f r a c t i o n f r o m m o u s e f i b rob l a s t n u c l e i /
C. A. Ascoli , M. R. Link, N. V e n t u r o et a l . / / A r c h . Biochem. and B iophys— 1988.—
263, N 2.— P . 334—348.
31. Isolation a n d c h a r a c t e r i z a t i o n of s t ab le nuc l ea r m a t r i x p r e p a r a t i o n s and assoc ia ted
D N A f r o m av ian e r y t h r o b l a s t s / J . R z e s z o w s k a - W o l n y , S. Raz in , E. P u v i o n et a l . / /
Biol . Cel l .— 1 9 8 8 . — 6 4 . — P . 13—222.
Ин-т орг. синтеза Л а т в . АН, Р и г а Получено 04.02.91
У Д К 581.134.4:633.362
А. Ю. Козловский, Ю. В. Пацковский
ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ
СЕМЯН ЯЗВЕННИКА МНОГОЛИСТНОГО
В работе проведено изучение полиморфизма солерастворимых запасных белков семян
нескольких популяций язвенника много лист но го. Методом электрофореза денатуриро-
ванных белков в ПААГ с 0,1 % Ds-Na определена молекулярная масса (м. м.) ос-
новных фракций солерастворимых белков (от 15 G00 до 100 000). Выявлено, что на-
ряду с константными областями белкового спектра (белка с м. м. (·10ζ) 15—50 и
70—90) обнаруживаются вариабельные области, каждая из которых представлена од-
ним или двумя белками с м. м. (-Ю3) 93—96, 63—66, 53—55. Показано, что помимо
появления белков с несколько измененной молекулярной массой в вариабельных
областях изменяется соотношение белка в двух отдельных фракциях, причем взаи-
мозависимо, так что относительное количество белка вариабельной зоны остается
постоянным у всех изученных вариантов. Обсуждается возможный механизм регуля-
ции биосинтеза запасных белков растений.
Введение. В решении вопросов рационального использования ресурсов
растительного мира важное место принадлежит бобовым растениям.
Весьма перспективным видом для Полесья УССР является язвенник
многолистный, обладающий, как и другие бобовые, высокой продуктив-
ностью, способный произрастать на бедных почвах благодаря симбио-
тической азотфиксации, неприхотливый к изменениям природных ус-
ловий, содержащий значительное количество незаменимых аминокис-
лот и имеющий ряд других практически ценных признаков [1, 2].
Несмотря на это, данный вид комплексно не изучался и многие
его особенности оставались вне поля зрения исследователей. Учиты-
вая вышеизложенное, мы решили провести более детальное и систе-
матическое исследование язвенника многолистного в генетическом и
биохимическом аспектах.
Для повышения эффективности селекции необходимо оценить уро-
вень видового полиморфизма. Одним из подходов для этого является
С) А. Ю. К О З Л О В С К И Й , Ю. в . ПАЦКОВСКИЙ, 1991
SO I S S N 02:>3-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 5 10
|