Индукция эндогенного синтеза ДНК при повреждении мембраны ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы
Установлено, что обработка тритоном X-100 ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы, сопровождается удалением наружной ядерной мембраны и приводит к активации эндогенного синтеза ДНК в 20–30 раз. Результаты нескольких независимых методических подходов для анализа продуктов синтеза показывают...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1991 |
| Автори: | , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1991
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155829 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Индукция эндогенного синтеза ДНК при повреждении мембраны ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы / Н.В. Белякова, Т.П. Кравецкая, С.Н. Вальтер, Е.В. Полевая, И.В. Шевелев, В.М. Крутяков // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 5. — С. 98-103. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155829 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Белякова, Н.В. Кравецкая, Т.П. Вальтер, С.Н. Полевая, Е.В. Шевелев, И.В. Крутяков, В.М. 2019-06-17T13:52:13Z 2019-06-17T13:52:13Z 1991 Индукция эндогенного синтеза ДНК при повреждении мембраны ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы / Н.В. Белякова, Т.П. Кравецкая, С.Н. Вальтер, Е.В. Полевая, И.В. Шевелев, В.М. Крутяков // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 5. — С. 98-103. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002F9 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155829 577.213.6 Установлено, что обработка тритоном X-100 ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы, сопровождается удалением наружной ядерной мембраны и приводит к активации эндогенного синтеза ДНК в 20–30 раз. Результаты нескольких независимых методических подходов для анализа продуктов синтеза показывают, что индуцированный синтез не является следствием инициации репликации ДНК. По-видимому, наблюдается ускорение эндогенной элонгации ДНК. катализируемое ДНК-полимеразой а. Обработанные тритоном X-100 ядра могут быть использованы как эффективная природная матричная система для измерения α-полимеразного синтеза у млекопитающих, проницаемая для биополимеров. Встановлено, що обробка тритоном Х-100 ядер, виділених із гепатоцитів криси, які не діляться, супроводжується видаленням зовнішньої мембрани та приводить до активації ендогенного синтезу ДНК в 20–30 разів. Результати декількох незалежних методичних підходів до аналізу продуктів синтезу показують, що індукований синтез не є наслідком ініціації реплікації ДНК. Можливо, спостерігається прискорення ендогенної елонгації ДНК, що каталізується ДНК-полімеразою а. Оброблені тритоном Х-100 ядра можуть бути використані як ефективна природна матрична система, крізь яку проникають біополімери, для вимірювання α-полімеразного синтезу ссавців. Triton X-100 treatment of nuclei isolated from rat hepatocytes is shown to remove outer nuclear membrane and leads to the activation 20–30-fold of endogenous DNA synthesis. Results of a number of independent approaches in the analysis of products of the synthesis prove that induced synthesis is not the consequence of the initiation of DNA replication. Perhaps, we observe the acceleration of endogenous DNA elongation catalyzed by DNA polymerase a. Nuclei treated with triton X-100 can be used as effective natural template system (permeable for biopolymers) for the measurement of mammalian DNA synthesis catalysed by DNA polymerase α. Авторы благодарны 3. Ф. Карабановой, А. Н. Логуновой и Ю. В. Попову за помощь в экспериментах. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Геном и его регуляция Индукция эндогенного синтеза ДНК при повреждении мембраны ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы Індукція ендогенного синтезу ДНК за пошкодження мембрани ядер, виділених з гепатоцитів щура, які не діляться Induction of endogenous DNA synthesis after the injury of membrane of nuclei isolated from quiescent rat hepatocytes Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Индукция эндогенного синтеза ДНК при повреждении мембраны ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы |
| spellingShingle |
Индукция эндогенного синтеза ДНК при повреждении мембраны ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы Белякова, Н.В. Кравецкая, Т.П. Вальтер, С.Н. Полевая, Е.В. Шевелев, И.В. Крутяков, В.М. Геном и его регуляция |
| title_short |
Индукция эндогенного синтеза ДНК при повреждении мембраны ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы |
| title_full |
Индукция эндогенного синтеза ДНК при повреждении мембраны ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы |
| title_fullStr |
Индукция эндогенного синтеза ДНК при повреждении мембраны ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы |
| title_full_unstemmed |
Индукция эндогенного синтеза ДНК при повреждении мембраны ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы |
| title_sort |
индукция эндогенного синтеза днк при повреждении мембраны ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы |
| author |
Белякова, Н.В. Кравецкая, Т.П. Вальтер, С.Н. Полевая, Е.В. Шевелев, И.В. Крутяков, В.М. |
| author_facet |
Белякова, Н.В. Кравецкая, Т.П. Вальтер, С.Н. Полевая, Е.В. Шевелев, И.В. Крутяков, В.М. |
| topic |
Геном и его регуляция |
| topic_facet |
Геном и его регуляция |
| publishDate |
1991 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Індукція ендогенного синтезу ДНК за пошкодження мембрани ядер, виділених з гепатоцитів щура, які не діляться Induction of endogenous DNA synthesis after the injury of membrane of nuclei isolated from quiescent rat hepatocytes |
| description |
Установлено, что обработка тритоном X-100 ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы, сопровождается удалением наружной ядерной мембраны и приводит к активации эндогенного синтеза ДНК в 20–30 раз. Результаты нескольких независимых методических подходов для анализа продуктов синтеза показывают, что индуцированный синтез не является следствием инициации репликации ДНК. По-видимому, наблюдается ускорение эндогенной элонгации ДНК. катализируемое ДНК-полимеразой а. Обработанные тритоном X-100 ядра могут быть использованы как эффективная природная матричная система для измерения α-полимеразного синтеза у млекопитающих, проницаемая для биополимеров.
Встановлено, що обробка тритоном Х-100 ядер, виділених із гепатоцитів криси, які не діляться, супроводжується видаленням зовнішньої мембрани та приводить до активації ендогенного синтезу ДНК в 20–30 разів. Результати декількох незалежних методичних підходів до аналізу продуктів синтезу показують, що індукований синтез не є наслідком ініціації реплікації ДНК. Можливо, спостерігається прискорення ендогенної елонгації ДНК, що каталізується ДНК-полімеразою а. Оброблені тритоном Х-100 ядра можуть бути використані як ефективна природна матрична система, крізь яку проникають біополімери, для вимірювання α-полімеразного синтезу ссавців.
Triton X-100 treatment of nuclei isolated from rat hepatocytes is shown to remove outer nuclear membrane and leads to the activation 20–30-fold of endogenous DNA synthesis. Results of a number of independent approaches in the analysis of products of the synthesis prove that induced synthesis is not the consequence of the initiation of DNA replication. Perhaps, we observe the acceleration of endogenous DNA elongation catalyzed by DNA polymerase a. Nuclei treated with triton X-100 can be used as effective natural template system (permeable for biopolymers) for the measurement of mammalian DNA synthesis catalysed by DNA polymerase α.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155829 |
| citation_txt |
Индукция эндогенного синтеза ДНК при повреждении мембраны ядер, выделенных из неделящихся гепатоцитов крысы / Н.В. Белякова, Т.П. Кравецкая, С.Н. Вальтер, Е.В. Полевая, И.В. Шевелев, В.М. Крутяков // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 5. — С. 98-103. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT belâkovanv indukciâéndogennogosintezadnkpripovreždeniimembranyâdervydelennyhiznedelâŝihsâgepatocitovkrysy AT kraveckaâtp indukciâéndogennogosintezadnkpripovreždeniimembranyâdervydelennyhiznedelâŝihsâgepatocitovkrysy AT valʹtersn indukciâéndogennogosintezadnkpripovreždeniimembranyâdervydelennyhiznedelâŝihsâgepatocitovkrysy AT polevaâev indukciâéndogennogosintezadnkpripovreždeniimembranyâdervydelennyhiznedelâŝihsâgepatocitovkrysy AT ševeleviv indukciâéndogennogosintezadnkpripovreždeniimembranyâdervydelennyhiznedelâŝihsâgepatocitovkrysy AT krutâkovvm indukciâéndogennogosintezadnkpripovreždeniimembranyâdervydelennyhiznedelâŝihsâgepatocitovkrysy AT belâkovanv índukcíâendogennogosintezudnkzapoškodžennâmembraniâdervidílenihzgepatocitívŝuraâkínedílâtʹsâ AT kraveckaâtp índukcíâendogennogosintezudnkzapoškodžennâmembraniâdervidílenihzgepatocitívŝuraâkínedílâtʹsâ AT valʹtersn índukcíâendogennogosintezudnkzapoškodžennâmembraniâdervidílenihzgepatocitívŝuraâkínedílâtʹsâ AT polevaâev índukcíâendogennogosintezudnkzapoškodžennâmembraniâdervidílenihzgepatocitívŝuraâkínedílâtʹsâ AT ševeleviv índukcíâendogennogosintezudnkzapoškodžennâmembraniâdervidílenihzgepatocitívŝuraâkínedílâtʹsâ AT krutâkovvm índukcíâendogennogosintezudnkzapoškodžennâmembraniâdervidílenihzgepatocitívŝuraâkínedílâtʹsâ AT belâkovanv inductionofendogenousdnasynthesisaftertheinjuryofmembraneofnucleiisolatedfromquiescentrathepatocytes AT kraveckaâtp inductionofendogenousdnasynthesisaftertheinjuryofmembraneofnucleiisolatedfromquiescentrathepatocytes AT valʹtersn inductionofendogenousdnasynthesisaftertheinjuryofmembraneofnucleiisolatedfromquiescentrathepatocytes AT polevaâev inductionofendogenousdnasynthesisaftertheinjuryofmembraneofnucleiisolatedfromquiescentrathepatocytes AT ševeleviv inductionofendogenousdnasynthesisaftertheinjuryofmembraneofnucleiisolatedfromquiescentrathepatocytes AT krutâkovvm inductionofendogenousdnasynthesisaftertheinjuryofmembraneofnucleiisolatedfromquiescentrathepatocytes |
| first_indexed |
2025-11-24T18:49:19Z |
| last_indexed |
2025-11-24T18:49:19Z |
| _version_ |
1850493018725941248 |
| fulltext |
УДК 577.213.6
Η. В. Белякова, Т. II. Кравецкая, С. Н. Вальтер,
Е. В. Полевая, И. В. Шевелев, В. М. Крутяков
ИНДУКЦИЯ ЭНДОГЕННОГО СИНТЕЗА ДНК
ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ МЕМБРАНЫ ЯДЕР,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НЕДЕЛЯЩИХСЯ ГЕПАТОЦИТОВ КРЫСЫ
Установлено, что обработка тритоном X-IOO ядер, выделенных из неделящихся ге-
патоцитов крысы, сопровождается удалением наружной ядерной мембраны и приво-
дит к активации эндогенного синтеза ДНК в 20—30 раз. Результаты нескольких не-
зависимых методических подходов для анализа продуктов синтеза показывают, что
индуцированный синтез не является следствием инициации репликации ДНК. По-
видимому, наблюдается ускорение эндогенной элонгации ДИК. катализируемое ДНК-
полимеразой а. Обработанные тритоном X-IOO ядра могут быть использованы как
эффективная природная матричная система для измерения а-полимеразного синтеза
у млекопитающих, проницаемая для биополимеров.
Введение. Для изучения молекулярных механизмов и регуляции био-
синтеза Д Н К у млекопитающих применяются бесклеточные системы,
проницаемые для нуклеотидов и макромолекул. Наиболее нативной
системой являются изолированные неочищенные клеточные ядра. Уро-
вень эндогенного синтеза Д Н К в таких ядрах, выделенных из неделя-
щихся гепатоцитов, очень мал. Использование регенерирующей печени
(5-период) позволяет увеличить скорость синтеза в 2—11 раз [1—3].
Плохая воспроизводимость ускорения элонгации Д Н К в ядрах при пе-
реходе от G0 к S-периоду клеточного цикла, по-видимому, объясняет-
ся различной степенью поврежденности ядерной мембраны в процессе
гомогенизации и обработки неионным детергентом. Действительно, са-
мые различные способы повреждения мембраны ядер, выделенных из
делящихся ооцитов амфибий, ведут к повторной инициации реплика-
ции Д Н К в изолированных ядрах [4].
В настоящей работе впервые показано, что повреждение мембра-
ны ядер, выделенных из покоящихся гепатоцитов, приводит к резкой
активации эндогенного синтеза ДНК. Изучена природа этого синтеза.
Материалы и методы. В опытах использовали самцов белых бес-
породных крыс весом 120—170 г (усыпляли эфиром).
Применяли сефарозу CL-6B («Pharmacia», Швеция), 2-меркапто-
этанол (2-МЭ) и полиэтиленгликоль (ПЭГ) («Loba Chemie», Австрия),
нитроцеллюлозные фильтры («Сынпор», ЧСФР), тритон Х-100 и Хехст
33258 («Serva», ФРГ), N-этилмалеимид («Sigma», США), [ 3 HjdNTP
(«Изотоп», СССР), dNTP, Д Н К лосося, Д Н К фага λ и ДНК-лигазу
T 4 (НИКТИ БАВ, Бердск). Дрожжевая тРНК предоставлена
В. И. Махно, белок SSB из Escherichia coli — О. К. Кабоевым, диаде-
нозинтетрафосфат (Ap4A) — Н. Б. Тарусовой.
Я д р а п о л у ч а л и при 4 cC. 3,5 г печени гомогенизировали в
40 мл среды (0,25 M сахароза, 3 мМ MgCl2, 50 мМ буфер трис-НС1,
рН 7,4, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ 2-МЭ), в стеклянном гомогенизаторе Да-
унса (20 циклов). Гомогенат фильтровали через 8 слоев марли и цен-
трифугировали при 6000 g 10 мин. Ядерный осадок ресуспендировали,
добавив 1 мл раствора А (25 мМ буфер трис-HCl, рН 7,4, 25 мМ KCl,
5 мМ MgCl2, 20 мМ 2-МЭ, 0,5 %-ный ПЭГ (6000), 20 %-ный глице-
рин), и использовали как препарат неочищенных ядер. К осадку не-
очищенных ядер добавляли 5 мл раствора А, содержавшего 1 %-ный
тритон Х-100 (тритоновая среда), гомогенизировали (15 циклов) и ос-
тавляли на 30 мин во льду для экстракции. Затем центрифугировали
при 8000 g 30 мин, супернатант отбрасывали. Для отмывки ядер от
детергента к осадку добавляли 5 мл раствора А, гомогенизировали
(10 циклов) и центрифугировали в том же режиме. Осадок забирали,
© Н. в . БЕЛЯКОВА, Т. П. КРАВЕЦКАЯ, С. Н. ВАЛЬТЕР, Ε. В. ПОЛЕВАЯ, И. В. ШЕВЕЛЕВ,
В. М. КРУТЯКОВ, 1991
98 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- 5
ресуспендировали в 1 мл раствора А и использовали как препарат очи-
щенных ядер.
ДНК-п о л и м е р а з к а я ! а к т и в н о с т ь . Инкубационная смесь
в объеме 100 мкл содержала 5—10 мМ АТР; 150 мкМ СТР, GTP, UTP;
150 мкМ dATP, dCTP, dGTP; 30 мкМ [3H] TTP (185—370 кБк) ; 10 мМ
MgCl2; 10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5; 10 мМ 2-МЭ; 10—
25 мкг ядер (по Д Н К ) . Синтез при 37 °С останавливали добавлением
1 мл лизирующего раствора (0,1 M NaOH, 0,25 M NaCl, 10 мМ ЭДТА,
0,5 %-ный додецилсульфат Na (DS-Na), 1 %-ный пирофосфат Na,
Рис. 2
0,2 мМ тимидин). После лизиса ядер прибавляли 2,5 мл 10 %-ной ТХУГ
наносили на нитроцеллюлозный фильтр и отмывали от невключивше-
гося [3Н]ТТР.
Электронную микроскопию ультратонких срезов ядер проводили
по методу, описанному в работе [5].
Концентрацию Д Н К определяли по Шмидту и Тангаузеру [6] и с
дифениламином [7].
Результаты и обсуждение. Скорость эндогенного синтеза Д Н К в
очищенных ядрах возрастает в 20—30 раз по сравнению с неочищен-
ными (рис. 1: уровень синтеза Д Н К за 30 мин инкубации в ядрах, об-
работанных средой с различным содержанием тритора Х-100; рис. 2:
гель-фильтрация лизированных ядер на колонке с сефарозой CL-6B.
Состав элюирующего раствора: 0,25 %-ный DS-Na, 0,1 M NaOH, 0,25 M
NaCl (или без него), 10 мМ ЭДТА, рН 12,5. Объем колонки 30 мл. На-
носили 1 мл, содержащий —400 мкг ДІ1К: 1 — включение [ 3 HJTMP
в кислотонерастворимую Д Н К очищенных ядер; 2 — то же для неочи-
щенных ядер; 3—распределение ОП2бо Для очищенных ядер; 4 — то
же для неочищенных ядер). Скорость включения [ 3 HJTMP линейно
зависит от концентрации Д Н К ядер в диапазоне 0—400 мкг/мл. Варь-
ирование концентрации TTP (1—30 мкМ) существенно не изменяет ве-
личины ускорения синтеза, т. е. ускорение не объясняется увеличением
проникновения dNTP в очищенные ядра. Синтез Д Н К в очищенных
ядрах в первые 10 мин инкубации в присутствии 150 мкМ СТР, GTP,
UTP в 1,5—1,7 раза выше, чем без них, даже в отсутствие АТР. Син-
тез в неочищенных ядрах в отсутствие ATP прекращается в первые
минуты инкубации, поскольку в ядрах и хроматине содержится высо-
коактивная нуклеозидтрифосфатаза, расщепляющая все dNTP и NTP
[8, 9J. Повторное добавление всех нуклеотидов, указанных в составе
инкубационной среды, через 20 мин инкубации неочищенных ядер по-
зволяет продлить приблизительно линейный период синтеза до 40 мин.
Если то же самое сделать через 1 ч инкубации очищенных ядер, то
синтез продлится до 2 ч; дальнейшие добавки нуклеотидов не сопро-
вождаются увеличением синтеза, а через 4 ч после начала опыта на-
2 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- 5
чинается гидролиз вновь синтезированной Д Н К (рис. 3: кинетика эн-
догенного синтеза Д Н К в очищенных ядрах гепатоцитов: 1 — синтез
при стандартном составе инкубационной среды; 2 — синтез при добав-
лениях ATP и всех dNTP в концентрациях, приведенных в составе ин-
кубационной среды; стрелками указано время добавок).
В обоих препаратах ядер синтез подавляется на 95 % в присут-
ствии 10 мМ N-этилмалеимида, т. е. синтез катализируется ДНК-по-
лимеразой а, а не β. При переходе гепатоцитов от G0 к 5-периоду син-
тез Д Н К в неочищенных ядрах возрастает в 1,5—2 раза, тогда как в
очищенных — в 2—3,5 раза (харак-
терно для экспрессии (х-полимеразы).
Добавление 1 %-ного тритона
X-100 не влияет на активность ДНК-
полимеразы а, экстрагированной рас-
твором А из неочищенных ядер, в при-
сутствии экзогенной ДНК-матрицы.
Обработка тритоновой средой приво-
дит к вымыванию из ядер 50 % свя-
занной с ними ДНК-полимеразы и.
Однако удаление тритонового смыва
или добавление цитозола существенно
не влияют на величину активации эн-
догенной ДНК-полимеразной активно-
сти ядер. Наличие в инкубационной смеси белка SSB Е. coli (30 —
300 мкг/мл) или Ap4A (10—30 мкМ) —возможного индуктора инициа-
ции репликации — не влияло на синтез Д Н К в очищенных ядрах.
Световая микроскопия ядер, окрашенных по Романовскому,— Гим-
за или Хехст 33258, указывает на неизменность количества ядер в по-
ле зрения до и после их обработки тритоновой средой. Данные, пред-
ставленные на рис. 4 (электронная микроскопия срезов неочищенных
(а) и очищенных (б) ядер (Х24 000)), показывают, что эта обработка
сопровождается удалением наружной ядерной мембраны и конденса-
цией хроматина. Лизис очищенных ядер по [10] существенно не влия-
ет на эндогенный синтез ДНК, причем только 25 % его величины при-
ходится на долю водонерастворимого хроматина, в котором преиму-
щественно локализуется ДНК-полимеразы β.
Индуцированный синтез ДІ ІК може г быть следствием инициации
репликации или ускоренного заполнения однонитчатых пробелов в
ДНК. Для решения этого вопроса проведен анализ продуктов синтеза.
Если после синтеза ядра лизировать или Еыделить из них ДНК, а за-
тем провести гель-фильтрацию в щелочных условиях, то наибольшая
удельная радиоактивность Д Н К обнаруживается в зоне приблизитель-
но 4S, где локализуются фрагменты Оказаки и (или) продукты репа-
ративного синтеза (см. рис. 2). Обработка тритоновой средой, как и
процесс инкубации ядер, не приводит к деградации ядерной Д Н К (см.
рис. 2). Матричные свойства ДНК, выделенной из тритонового экс-
тракта ядерной мембраны (примембраиная ДНК) , из очищенных и
неочищенных ядер (общая ДНК) , а также Д Н К фага λ и лососевой
Д Н К существенно не различаются, если вести синтез ДНК-полимера-
зой а из ядерной мембраны. Следовательно, обработка ядер тритоно-
вой средой не сопровождается увеличением количества праймирующих
З'ОН-концов в ДНК.
В случае инициации репликации фрагменты Оказаки появляются
в начале синтеза, а затем объединяются в длинные цепи. Исследуя
продукты синтеза за время инкубации от 0,5 до 120 мин, мы не заме-
тили подобной закономерности. Добавление в момент синтеза экзо-
генной ДНК-лигазы Т4 (300 ед/'мл) не изменяло картины. Более того,
распределение по молекулярной массе меченых продуктов односуб-
стратного синтеза (когда в среде присутствует только один из четырех
dNTP, т. е. синтез длинных цепей невозможен) не отличается от опыта
с полной субстратной средой.
Рис. 3
100 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- 5
При ультрацентрифугировании ДНК в нейтральном градиенте
плотности CsCl не обнаружено утяжеления ядерной ДНК, если синтез
вели, заменив dCTP на Hg+-dCTP.
Инициация репликации сопровождается выплавлением при 55 °С
продуктов инициации из АТ-богатых участков начала репликации [11].
В попытке обнаружить инициацию репликации ядрам обеспечивали
Рис. 4
возможность синтезировать Д Н К в течение 1 или 120 мин в полной суб-
стратной среде в присутствии [3Н]ТТР. Затем из ядер выделяли Д Н К
и выдерживали ее в течение ночи при 55 или 4 °С в растворе 0,3 M
NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ буфер трис-HCl, рН 7,4. После гель-фильт-
рации такой Д Н К на колонке с сефарозой CL-6B в этом же растворе
при 20 °С не обнаруживается продуктов инициации репликации ДНК.
Известно, что воздействие ионизирующим излучением приводит к
подавлению инициации репликации Д Н К [2]. Однако γ-облучение ядер
60Co в дозе 10 крад не изменяло величины активации синтеза ДНК.
101 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- 5
Итак, результаты целого ряда независимых методических подхо-
дов показывают, что эндогенный синтез ДНК, индуцированный трито-
новой обработкой ядер, не является следствием инициации реплика-
ции ДНК. По-видимому, мы наблюдаем ускоренное заполнение одно-
нитчатых пробелов в примембранной ДНК, катализируемое ДНК-по-
лимеразой а. Максимальный уровень синтеза ДНК, регистрируемый
нами в очищенных ядрах, составляет 0,1 % от количества предсущест-
вующей ядерной ДНК.
Некоторые фосфолигшды (в особенности кардиолипин) являются
сильными ингибиторами очищенной ДНК-полимеразы с, причем инги-
бирование снимается в присутствии тритона Х-100 [12]. Возможно, это
одна из причин наблюдаемого нами резкого ускорения эндогенной элон-
гации Д Н К в очищенных ядрах.
Таким образом, в ріаботе показано, что обработанные тритоном
Х-100 ядра представляют собой эффективную систему для измерения
α-полимеразного синтеза на природной матрице у млекопитающих.
С помощью этой системы можно изучать действие различных экзоген-
ных препаратов α-полимеразы и ее комплексов (если подавить собст-
венную ДНК-полимеразу а) и других веществ, которые не могут про-
никать через клеточную и интактную ядерные мембраны.
Авторы благодарны 3. Ф. Карабановой, А. Н. Логуновой и
Ю. В. Попову за помощь в экспериментах.
Р е з ю м е
Встановлено, що обробка тритоном Х-100 ядер, виділених із гепатоцитів криси, які
не діляться, супроводжується видаленням зовнішньої мембрани та приводить до акти-
вації ендогенного синтезу Д Н К в 20—30 разів. Результати декількох незалежних ме-
тодичних підходів до аналізу продуктів синтезу показують, що індукований синтез
не є наслідком ініціації реплікації ДНК. Можливо, спостерігається прискорення ендо-
генної елонгації ДНК, що каталізується ДНК-полімеразою а . Оброблені тритоном
Х-100 ядра можуть бути використані як ефективна природна матрична система, крізь
яку проникають біополімери, для вимірювання α-полімеразного синтезу ссавців.
S u m m a r y
Triton Х-100 treatment of nuclei isolated from rat hepatocytes is shown to remove
outer nuclear membrane and leads to the activation 20—30-fold of endogenous DNA
synthesis. Results of a number of independent approaches in the analysis of products
of the synthesis prove that induced synthesis is not the consequence of the initiation
of DNA replication. Perhaps, we observe the acceleration of endogenous DNA elonga-
tion catalyzed by DNA polymerase a . Nuclei treated with triton X-100 can be used
as effective natural template system (permeable for biopolymers) for the measurement
of mammalian DNA synthesis catalysed by DNA polymerase a .
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Lynch W. E., Surrey S., Liebermati I. Nuclear deoxyribonucleic acid polymerases of
l i ve r / / J . Biol. Chem.—1975,—250, N 20,—P. 8179—8183.
2. Synthesis of deoxyribonucleic acid by isolated liver nuclei / W. E. Lynch,
R. F. Brown, T. Umeda et a l . / / Ib id .— 1970.—245, N 15.—P. 3911—3916.
3. Lynch W. E., Lieberman /. A DNA polymerase in liver nuclei whose activity rises
with DNA synthesis after partial hepatectomy // Biochem. and Biophys. Res. Com-
muns.— 1973.—52, N 3 ,—P. 843—849.
4. Blow J. J., Laskey R. A. A role for the nuclear envelope in controlling DNA repli-
cation within the cell cycle / /Nature .— 1988,— 332, N 6164,—P. 546—548.
5. Бульдяева Т. В., Кузьмина С. H., Збарский И. Б. Белковый состав матрикса и
остаточного белка ядер печени и гепатомы-27 крысы. / /Докл. АН СССР.— 1978.—
241, JVb 6,—С. 1461 — 1464.
6. Schmidt G., Trannhauser /. / . A method for the determination of deoxyribonucleic
acid, ribonucleic acid, and phosphoproteins in animal t i s sues / / J . Biol. Chem.—
1945.— 161, N 1,—P. 83—89.
102 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- 5
7. Химия и биохимия нуклеиновых кислот.— Л. !Медицина, 1968.— 430 с.
8. Белякова Н. В., Нарыжный С. HКрутяков В. М. Механизм активирующего дей-
ствия ATP на репаративный синтез Д Н К в хроматине // Молекуляр. биология.—
1980.— 14, № 3,—С. 586—594.
9. Нарыжный С. H., Крутяков В. Ai Неспецифическая кислая нуклеозидтрифосфата-
за цитозоля и хроматина печени крысы: частичная очистка и основные свойства//
Биохимия.— 1982,—47, № 4.—С. 569—574.
10. Крутяков В. M., Кравецкая Т. П. Эндогенный синтез Д Н К в выделенном хрома-
тине/ /Молекуляр. биология.— 1978.— 12, JMb 3.— С. 654—662.
11 Zannis-Hadjopoclos M., Chepelinsky А. В., Martin R. G. Mapping of the 3 ' -end po-
sitions of SV nascent strands / / J . Мої. iBol.— 1983.— 165, N 4 ,—P. 599—607.
12. Yoshida S., Tamiya-Koizumi K., Kojitna К. interaction of DNA polymerases with
phospholipids//Biochim. et biophys. acta.— 1989.— 1007, N 1,—P. 61—66.
Ленинград, ин-т ядер, физики Получено 11.02.91
им. Б. П. Константинова АН СССР
У Д К 575.155:575.224.46
С. М. Ландау, А. В. Тихонов, И. С. Варзанова, JI. Г. Жарова
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕПЛИКАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЛАЗМИД,
СОДЕРЖАЩИХ ЭУКАРИОТИЧЕСКИЙ РЕГУЛЯТОРНЫЙ
РАЙОН ВИРУСА SV40,
В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Предложен метод выявления функциональной активности эукариотического регуля-
торного района вируса SV40 в составе рекомбинантных плазмид, который может быть
применен при тестировании плазмид, используемых в генной терапии. Показано, что
исследованные рекомбинантные плазмиды реплицируются в культурах клеток CVl и,
следовательно, содержат функционально активный эукариотический регуляторный
район вируса SV40.
Введение. Одной из основных задач генной терапии является констру-
ирование векторов и изучение их биологической активности (репли-
кации и экспрессии) в культурах клеток млекопитающих до их исполь-
зования в модельных опытах на животных. В связи с этим представля-
ет интерес исследование репликативной активности рекомбинантных
плазмид, содержащих эукариотический регуляторный район, в част-
ности, регуляторный район вакуолизирующего вируса SV40. Анализ
репликации таких рекомбинантных плазмид дает возможность сделать
заключение о функциональной активности регуляторного района этого
эукариотического вектора. Кроме того, известно, что реплицирующиеся
Д Н К являются преимущественной матрицей для транскрипции. Таким
образом, оптимизируя условия репликации плазмид, содержащих орид-
жип SV40, можно, по-видимому, оптимизировать и экспрессию генов,
находящихся под промотором SV40.
Известно, что рекомбинантные плазмиды, содержащие в качестве
ориджина репликации регуляторный район SV40, не могут самостоя-
тельно реплицироваться в пермиссивиых для SV40 культурах обезьянь-
их клеток ввиду отсутствия Т-антигена (за исключением COS клеток,
в которых Т-антиген синтезируется). В то же время даже наличие ге-
на Л-белка (Т-антигена SV40) в цис-положении в составе рекомби-
нантных плазмид также не приводит к их репликации из-за наличия
«ядовитых последовательностей» [1].
Ранее нами было показано, что рекомбинантные плазмиды, в сос-
тав которых входили один и два полных генома вируса SV40, репли-
цируются в культурах пермиссивных клеток CVl в присутствии вируса
© С. М. ЛАНДАУ, А. В. ТИХОНОВ, И. С. ВАРЗАНОВА, Л. Г. ЖАРОВА, 1991
103 I S S N 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. Λ1- 5
|