Белковая инженерия

Белковая инженерия

В обзоре кратко проанализированы основные направления развития белковой инженерии – новой области молекулярной биологии и биотехнологии, базирующейся на достижениях генной инжене­рии, структурной биологии и компьютерных технологий. Белковая инженерия ставит задачу направленного изменения структуры б...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Published in:Біополімери і клітина
Date:2001
Main Author: Корнелюк, А.И.
Format: Article
Language:Russian
Published: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2001
Subjects:
Огляди
Online Access:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155884
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Белковая инженерия / А.И. Корнелюк // Біополімери і клітина. — 2001. — Т. 17, № 6. — С. 459-466. — Бібліогр.: 50 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155884
record_format dspace
spelling Корнелюк, А.И.
2019-06-17T14:58:51Z
2019-06-17T14:58:51Z
2001
Белковая инженерия / А.И. Корнелюк // Біополімери і клітина. — 2001. — Т. 17, № 6. — С. 459-466. — Бібліогр.: 50 назв. — рос.
0233-7657
DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0005D5
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155884
577.152.611:576.31
В обзоре кратко проанализированы основные направления развития белковой инженерии – новой области молекулярной биологии и биотехнологии, базирующейся на достижениях генной инжене­рии, структурной биологии и компьютерных технологий. Белковая инженерия ставит задачу направленного изменения структуры белков для придания им новых или изменения существующих свойств либо создания белков de novo. Дизайн белка осуществляется на уровне его трехмерной структуры с использованием компьютерных методов моделирования. Рассмотрен метод сайт-направленного мутагенеза и его применение в белковой инженерии для структурно-функциональ­ного анализа белков. Представлены результаты структурно-функционального анализа тирозил-тРНК синтетаз бактерий и млекопитающих методами белковой инженерии. Описан дизайн искусственных белков de novo. Дана оценка перспективам развития белковой инженерии, ее использованию в биотехнологии и медицине.
The main directions of protein engineering – a novel branch of molecular biology and biotechnology, – are briefly analysed in this review. Protein engineering is based on the achievements of genetic engineering, structural biology and computer technologies. The main goal of protein engineering is a directed alteration of 3D protein structure with the aim of acquisition of novel properties or change of existing properties; or protein design de novo. Protein design is carried out on the level of 3D protein structure using the computer modelling methods. The site-directed mutagenesis method and its applications in protein engineering for structural and functional analysis of proteins is considered. The results of structural and functional investigations of bacterial and mammalian tyrosyl-tRNA synthetases by protein engineering are presented. Protein design of artificial proteins de novo is described. The perspectives of development of protein engineering and its application in biotechnology and medicine are given in the review.
В огляді стисло проаналізовано основні напрямки розвитку білкової інженери – нової галузі молекулярної біології і біотехнології, яка базується на досягненнях генної інженерії, структурної біології та комп'ютерних технологій. Білкова інженерія ставить своїм завданням направлену зміну струк­ури білків для надання їм нових чи зміни існуючих властиво­стей або створення білків de novo. Дизайн білка здійснюється на рівні його тривимірної структури з використанням ком­п'ютерних методів моделювання. Розглянуто метод сайт-спрямованого мутагенезу і його використання в білковій інженерії для структурно-функціонального аналізу білків. Представлено результати структурно-функціонального ана­лізу тирозил-тРНК синтетаз бактерій і ссавців методами білкової інженерії. Описано дизайн штучних білків de novo. Зроблено оцінку перспективам розвитку білкової інженерії, її використанню в біотехнології і медицині.
ru
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Біополімери і клітина
Огляди
Белковая инженерия
Білкова інженерія
Protein engineering
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Белковая инженерия
spellingShingle Белковая инженерия
Корнелюк, А.И.
Огляди
title_short Белковая инженерия
title_full Белковая инженерия
title_fullStr Белковая инженерия
title_full_unstemmed Белковая инженерия
title_sort белковая инженерия
author Корнелюк, А.И.
author_facet Корнелюк, А.И.
topic Огляди
topic_facet Огляди
publishDate 2001
language Russian
container_title Біополімери і клітина
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format Article
title_alt Білкова інженерія
Protein engineering
description В обзоре кратко проанализированы основные направления развития белковой инженерии – новой области молекулярной биологии и биотехнологии, базирующейся на достижениях генной инжене­рии, структурной биологии и компьютерных технологий. Белковая инженерия ставит задачу направленного изменения структуры белков для придания им новых или изменения существующих свойств либо создания белков de novo. Дизайн белка осуществляется на уровне его трехмерной структуры с использованием компьютерных методов моделирования. Рассмотрен метод сайт-направленного мутагенеза и его применение в белковой инженерии для структурно-функциональ­ного анализа белков. Представлены результаты структурно-функционального анализа тирозил-тРНК синтетаз бактерий и млекопитающих методами белковой инженерии. Описан дизайн искусственных белков de novo. Дана оценка перспективам развития белковой инженерии, ее использованию в биотехнологии и медицине. The main directions of protein engineering – a novel branch of molecular biology and biotechnology, – are briefly analysed in this review. Protein engineering is based on the achievements of genetic engineering, structural biology and computer technologies. The main goal of protein engineering is a directed alteration of 3D protein structure with the aim of acquisition of novel properties or change of existing properties; or protein design de novo. Protein design is carried out on the level of 3D protein structure using the computer modelling methods. The site-directed mutagenesis method and its applications in protein engineering for structural and functional analysis of proteins is considered. The results of structural and functional investigations of bacterial and mammalian tyrosyl-tRNA synthetases by protein engineering are presented. Protein design of artificial proteins de novo is described. The perspectives of development of protein engineering and its application in biotechnology and medicine are given in the review. В огляді стисло проаналізовано основні напрямки розвитку білкової інженери – нової галузі молекулярної біології і біотехнології, яка базується на досягненнях генної інженерії, структурної біології та комп'ютерних технологій. Білкова інженерія ставить своїм завданням направлену зміну струк­ури білків для надання їм нових чи зміни існуючих властиво­стей або створення білків de novo. Дизайн білка здійснюється на рівні його тривимірної структури з використанням ком­п'ютерних методів моделювання. Розглянуто метод сайт-спрямованого мутагенезу і його використання в білковій інженерії для структурно-функціонального аналізу білків. Представлено результати структурно-функціонального ана­лізу тирозил-тРНК синтетаз бактерій і ссавців методами білкової інженерії. Описано дизайн штучних білків de novo. Зроблено оцінку перспективам розвитку білкової інженерії, її використанню в біотехнології і медицині.
issn 0233-7657
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155884
citation_txt Белковая инженерия / А.И. Корнелюк // Біополімери і клітина. — 2001. — Т. 17, № 6. — С. 459-466. — Бібліогр.: 50 назв. — рос.
work_keys_str_mv AT kornelûkai belkovaâinženeriâ
AT kornelûkai bílkovaínženeríâ
AT kornelûkai proteinengineering
first_indexed 2025-11-24T06:35:10Z
last_indexed 2025-11-24T06:35:10Z
_version_ 1850843108854464512
fulltext ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2001 . Т. 17. № 6 О Г Л Я Д И Белковая инженерия А. И. Корнелюк Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143 , Украина В обзоре кратко проанализированы основные направления развития белковой инженерии — новой области молекулярной биологии и биотехнологии, базирующейся на достижениях генной инжене­ рии, структурной биологии и компьютерных технологий. Белковая инженерия ставит задачу направленного изменения структуры белков для придания им новых или изменения существующих свойств либо создания белков de novo. Дизайн белка осуществляется на уровне его трехмерной структуры с использованием компьютерных методов моделирования. Рассмотрен метод сайт- направленного мутагенеза и его применение в белковой инженерии для структурно-функциональ­ ного анализа белков. Представлены результаты структурно-функционального анализа тирозил- тРНК синтетаз бактерий и млекопитающих методами белковой инженерии. Описан дизайн искусственных белков de novo. Дана оценка перспективам развития белковой инженерии, ее использованию в биотехнологии и медицине. Введение. Белковая инженерия — новая область молекулярной биологии и биотехнологии — воз­ никла как синтетическая наука и вобрала в себя последние достижения генной инженерии, струк­ турной биологии и компьютерных технологий. Как главную задачу белковая инженерия ставит на­ правленное изменение структуры существующих белков для придания им новых уникальных или изменения существующих свойств [1—3] . В белко­ вой инженерии дизайн белка осуществляется на уровне его пространственной структуры, в чем состоит ее принципиальное отличие от генной ин­ женерии, хотя экспериментальные методы и подхо­ ды генной инженерии являются составной частью и белковой инженерии. Биохимики давно пытались улучшить свойства природних белков, в частности ферментов, для изменения их специфичности, каталитической ак­ тивности, пределов функционирования, увеличе­ ния стабильности, придания им новых функций и т. д. Природные ферменты обычно функционируют только в узких определенных интервалах темпера­ тур и физико-химических условий, что существен­ но ограничивает их использование в биотехноло­ гии. Белковая инженерия позволяет адаптировать структуру белков и их свойства к условиям, необ­ ходимым для биотехнологических процессов. © А. И. КОРНЕЛЮК, 2001 Таким образом, белковая инженерия, с одной стороны, является мощным и информативным ме­ тодом структурно-функционального анализа бел­ ков, а с другой, — становится одним из наиболее передових направлений современной биотехноло­ гии. Направления белковой инженерии. Основны­ ми направлениями белковой инженерии в настоя­ щее время являются: 1) структурно-функциональ­ ный анализ белков методами сайт-направленного мутагенеза отдельных аминокислотных остатков; 2) создание химерных и мультифункциональных белков; 3) случайный мутагенез и селекция белков с определенной функцией (молекулярная эволю­ ция) ; 4) создание искусственных белков de novo. При этом белковая инженерия решает следую­ щие задачи: 1. Изменения специфичности ферментов и их каталитических характеристик (повышение К т а х , уменьшение Кю изменение рН-оптимума, элими­ нация сайта ингибирования). 2. Изменения структурных свойств белков (по­ вышение термостабильности, повышение стабиль­ ности в органических растворителях, изменения физикохимических свойств, модификация специ­ фичности связывания лигандов, изменение внутри­ молекулярной динамики белка) . 3 . Создание новых систем (химерные и муль- тифункциональные белки, введение репортерных 459 КОРНЕЛЮК А. И. Цикл отдельных этапов исследова­ ния в белковой инженерии доменов (GFP) , введение ta^-фрагментов для очи­ стки белков и т. д.) 4. Повышение эффективности белков как тера­ певтических макромолекул для применения в фар­ макологии и медицине. Белковая инженерия возникла как результат логического развития генной инженерии и позволи­ ла сформулировать основные принципы модифика­ ции генов с использованием олигонуклеотидов и создать соответствующие технологии. Метод сайт- направленного мутагенеза, лежащий в основе экс­ периментальной белковой инженерии, разработан Смитом и соавт. в конце 70-х годов [5, 6 ] и дал возможность осуществлять селективные замены оп­ ределенных аминокислотных остатков в белках. З а создание и развитие методов сайт-адресованного мутагенеза генов в 1992 году Смит удостоен Нобе­ левской премии. Последовательность отдельных этапов исследо­ вания белковой инженерии представлена на рисун­ ке. На первом этапе осуществляется дизайн струк­ туры белка и моделирование, на последующих — сайт-специфический мутагенез, экспрессия и очи­ стка мутантного белка, его функциональный и структурный анализ . Успех дизайна белка с по­ мощью компьютерных методов зависит как от по­ нимания принципов фолдинга белков, так и от структурной информации, получаемой из баз дан­ ных. Цикл основных этапов исследования белковой инженерии повторяется до тех пор, пока не будет достигнута поставленная задача. Сайт-направленный мутагенез и структурно- функциональный анализ белков. Возможность на­ правленных селективных замен определенных ами­ нокислотных остатков методом сайт-направленного мутагенеза позволяет изучать их функциональную роль. Особенно эффективным является использова­ ние этого метода в комплексе с рентгеноструктур- ным анализом или структурной ЯМР-спектроско- пией. При проведении данного типа мутагенеза про­ исходит направленное изменение определенного нуклеотида в последовательности гена, приводящее к изменению соответствующей аминокислоты в белке. Используется олигонуклеотидный праймер, в последовательность которого введена планируе­ мая мутация, с последующим его включением в состав молекулы Д Н К в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) или матричного синтеза Д Н К . Применяя методы сайт-направленного мутагенеза, можно вводить в Д Н К такие мутации, как точеч­ ные замены, вставки, делеции, инверсии, слияние генов. Сайт-направленный мутагенез с использовани­ ем олигонуклеотидных гетеродуплексов основан на достройке мутантного олигонуклеотидного прайме- ра, гибридизованного с одноцепочечной матричной Д Н К , при помощи ДНК-полимеразы [5, 6 ] . Выход мутантов при использовании этого метода состав­ ляет около 50 % . Большинство других методов сайт-направленного мутагенеза основано на приме­ нении П Ц Р , преимуществом которого является очень высокий, приближающийся к 100 %, выход мутантов [7, 8 ] . В последнее время процедура проведения сайт- направленного мутагенеза стала одной из рутин­ ных методик молекулярной биологии. Ряд фирм производит стандартные наборы реактивов для сайт-направленного мутагенеза и одновременно 460 БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ разрабатывает новые оригинальные методики. Од­ ним из наиболее эффективных является метод «QuikChange» («Stratagene», США) . Особенностью системы «QuikChange» является то, что праймеры должны быть взаимно комплементарными. Выход мутантов при использовании метода «QuikChange» составляет не менее 80 %. Эта система наиболее оптимальна для введения единичных нуклеотидных замен. Другая предложенная фирмой «Stratagene» система «ExSite» оптимальна для введения таких типов мутаций, как делеции и инсерции, ее эффек­ тивность составляет не менее 60 % . К настоящему времени сайт-направленный му­ тагенез использован для структурно-функциональ­ ного анализа многих сотен белков, результаты этих исследований обобщены во многих обзорах и моно­ графиях [1—5] . В данном обзоре применение бел­ ковой инженерии ограничено только рассмотрени­ ем структурно-функционального анализа амино- ацил-тРНК синтетаз. Одним из первых ферментов, функции которых начали изучать методами белко­ вой инженерии еще в 1982 году, стала тирозил- тРНК синтетаза из термофильных бактерий Bacil­ lus stearothermophilus. Сайт-специфический мутагенез бактериаль­ ной т и р о з и л - т Р Н К синтетазы. Ферментативное аминоацилирование т Р Н К аминоацил-тРНК синте- тазами (АРСазы, К Ф 6.1.1) на дорибосомном этапе биосинтеза белка является одним из ключевых этапов процесса реализации генетической инфор­ мации. Для выяснения молекулярных механизмов специфического аминоацилирования т Р Н К необхо­ димо детальное изучение структурно-функцио­ нальной организации АРСаз . Значительный вклад в изучение структуры активного центра тирозил-тРНК синтетазы из В. stearothermophilus сделан с помощью сочетания ме­ тодов сайт-специфического мутагенеза и рентгено- структурного а н а л и з а [10—21 ]. Исследование структуры комплекса синтетазы с промежуточным продуктом Туг-АМР показало возможность сущест­ вования водородной связи между SH-группой Cys35 и Thr51 в ферменте и З'-гидроксилом рибоз- ного кольца Туг-АМР [10] . Замены Cys35 на Ser и Gly привели к ухудшению связывания А Т Р и уменьшению каталитической константы. Однако удаление водородной связи путем замены Thr51 на Ala и изменение структуры боковой цепи заменой Thr51 на Pro привели к увеличению каталитиче­ ской константы и уменьшению Км для тирозина [11, 12] . Примечательно, что при мутации T h r 5 1 — Pro соотношение кш/Км для АТР увеличилось с 8400 до 208000 с"1 М"1 для реакции формирования тирозиладенилата и с 1860 до 95800 с"1 М"1 для реакции переноса аминокислотного остатка на т Р Н К [12] . На основании полученных данных установлено, что механизм катализа реакции акти­ вации тирозина включает образование пентакоор- динатного промежуточного соединения, фосфатная группа которого может взаимодействовать с боко­ выми цепями Thr40 и His45 [13] . Изучение кинетических свойств мутантных ферментов дало прямые доказательства того, что главным фактором каталитического механизма яв ­ ляется стабилизация переходного состояния [13— 16] . Основными группами, роль которых в катали­ зе состоит в стабилизации переходного комплекса, являются His45 и Thr40 , кроме того, важную ф у н к ц и о н а л ь н у ю роль играют остатки Туг34 , Cys35, His48, Thr51 и Туг169. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что тирозил- тРНКсинтетаза из В. stearothermophilus при ката­ лизе использует механизм стабилизации переход­ ного комплекса (в противоположность предполагав­ шимся нуклеофильному или кислотно-основному катализу) , причем стабилизация происходит как за счет водородных связей, так и электростатических взаимодействий [13] . С помощью сайт-специфичекого мутагенеза получена уникальная информация о функциониро­ вании тирозил-тРНК синтетазы, оказавшейся недо­ ступной для рентгеноструктурного анализа. В рабо­ те [13] реконструирована модель переходного со­ стояния при активации тирозина, благодаря чему обнаружены взаимодействия с подвижными петля­ ми синтетазы, содержащими положительно заря­ женные остатки Lys82, Arg86, Lys230 и Lys233. Эти петли взаимодействуют с комплексом, находя­ щемся в переходном состоянии, по механизму ин­ дуцированного соответствия. Однако, по данным рентгеноструктурного анализа для комплекса тиро- зил-тРНК синтетазы из В. stearothermophilus с тирозиладенилатом, эти остатки удалены на рас­ стояние более 0,8 нм. На основании этого сделан вывод о том, что в растворе бактериальная тиро- зил-тРНК синтетаза при функционировании может претерпевать значительные конформационные дви­ жения петель, которые не обнаруживаются в кри­ сталле при исследовании методом рентгенострук­ турного анализа. Методами сайт-направленного мутагенеза ис­ следованы и межсубъединичные взаимодействия в димере тирозил-тРНК синтетазы [21 ]. Направлен­ ная замена гидрофобного P h e l 6 4 , находящегося в области контакта субъединиц, на заряженные ос­ татки Asp и Lys приводила к обратимой диссоциа­ ции активного димера на неактивные мономеры [21] . 461 КОРНЕЛКЖ А. И. Интересные данные получены по антикоопера­ тивному взаимодействию субъединиц в тирозил- т Р Н К синтетазе из В. stearothermophilus [22 ]. Ди- мер тирозил-тРНК синтетазы, являющийся, по данным рентгеноструктурного анализа, симметрич­ ным, в растворе асимметричен [22 ]. Исследования с помощью сайт-специфического мутагенеза внесли также значительный вклад в изучение структуры тРНК-связывающего центра тирозил-тРНК-синтетазы из В. stearothermophilus. Установлено, что кластер положительно заряжен­ ных аминокислотных остатков Arg207-Lys208 в N - концевом домене одной субъединицы взаимодейст­ вует с акцепторным стеблем т Р Н К [23] . Два от­ дельных кластера положительно заряженных ами­ нокислотных остатков (Arg368-Arg371 и Arg407- Arg408-Lys410-Lys411) в С-концевой области взаимодействуют с антикодоновой ветвью т Р Н К Т у г , при этом происходит фиксирование т Р Н К на моле­ куле фермента в определенной ориентации. В ра­ боте [24 ] предложена детальная модель взаимодей­ ствия т Р Н К Т у г и тирозил-тРНК синтетазы из В. stearothermophilus на основании данных рентгено­ структурного анализа, сайт-специфического мута­ генеза и компьютерного моделирования. Согласно модели, контакт между остатком Тгр-196 и кью- озином в 1-м положении антикодона т Р Н К Т у г явля­ ется неспецифическим, а аденин-76 т Р Н К Т у г взаи- модействовует с Lys-82 и Arg-86. Особый интерес вызывает обнаруженный в [24] дополнительный контакт между т Р Н К Т у г и тирозил-тРНК синтета- зой, который возникает при переходе фермент-суб­ стратного комплекса из стадии инициации в пере­ ходную стадию. Этот контакт осуществляется меж­ ду остатком Lys-151 тирозил-тРНК синтетазы и аденином-73 в т Р Н К Т у г и является критическим для узнавания тирозил-тРНК синтетазой т Р Н К Т у г среди других т Р Н К . С а й т - с п е ц и ф и ч е с к и й м у т а г е н е з т и р о з и л - т Р Н К синтетазы млекопитающих. Цитоплазмати- ческая тирозил-тРНК синтетаза млекопитающих является гомодимером с молекулярной массой 2 * х 59 кДа [23] . Каждый мономер состоит из двух основных структурных модулей: МН 2 -концевого каталитического модуля («минимальная» тирозил- тРНК синтетаза) , который включает нуклеотидсвя- зывающую свертку Россмана с соединительным пептидом, формирующим межсубъединичный ин­ терфейс, и некаталитического цитокинподобного СООН-концевого модуля [24] . Проблема выясне­ ния строения активного центра и механизма узна­ вания эукариотической т Р Н К Т у г тирозил -тРНК синтетазой является весьма важной, поскольку эукариотическая т Р Н К Т у г содержит короткую до­ полнительную петлю, в отличие от длиннопетле- вых т Р Н К Т у г прокариотов, и не аминоацилируется бактериальным ферментом [24 ]. Ранее с помощью методов селективных химических модификаций нами изучена структура активного центра эукари­ отической тирозил-тРНК синтетазы [24, 2 5 ] . Сде­ лан вывод о существенной роли остатков лизина, причем критическим для активности фермента яв­ ляется только один остаток лизина. Методами сайт-направленного мутагенеза на­ ми изучена функциональная роль остатков лизина, локализованных в соединительном пептиде тиро- зил-тРНК синтетазы [26] . Аминокислотные заме­ ны вводили с использованием П Ц Р и мутантного праймера G l n l 4 2 - V a l l 5 3 . Получены два варианта мутаций в тирозил-тРНК синтетазе: Lys l47Tyr и двойная Lysl46Asn, Lys l47Tyr . Замена как двух остатков лизина, так и одного Lysl47 приводила к практически полной потере ферментативной актив­ ности синтетазы в реакции аминоацилирования эукариотической тирозин-специфичной т Р Н К [26 ]. Таким образом, методами белковой инженерии впервые показано, что критическим остатком лизи­ на в реакции аминоацилирования т Р Н К эукарио­ тической тирозил-тРНК синтетазой является оста­ ток Lys l47 , локализованный в соединительном пептиде нуклеотидсвязывающего домена синтета­ зы, соединящем две половины свертки Россмана, — нуклеотидсвязывающего домена. Данный остаток лизина 147 является одним из наиболее интерес­ ных структурных элементов тРНК-связывающего центра бычьей тирозил-тРНК синтетазы, так как, очевидно, он соответствует одному функционально важному остатку лизина, обнаруженному нами ра­ нее [25] в экспериментах по модификации синте­ тазы селективным реагентом пиридоксаль-5'-фос­ фатом. При модификации этого единственного ос­ татка лизина, с одной стороны, почти полностью ингибировалась активность фермента, а с другой,— проявлялась антикооперативность взаимодействия двух субъединиц синтетазы [25] . Данный остаток, вероятно, соответствует остатку лизина в тирозил- т Р Н К синтетазе из В. stearothermophilus, участву­ ющему в формировании дополнительного контакта с т Р Н К Т у г (аденином-73) в переходном состоянии и является критическим для узнавания т Р Н К Т у г сре­ ди других т Р Н К В. stearothermophilus [16, 17] . Тирозил-тРНК синтетазы высших эукариот со­ держат дополнительный СООН-концевой модуль (С-модуль), гомологичный цитокину ЕМАР II и также проявляющий цитокиновую активность в экспериментах in vitro [27] . Как и некоторые гомологичные домены, С-модуль имеет сродство к нуклеиновым кислотам. Д л я дальнейшего струк- 462 БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ турно-функционального анализа С-модуля метода­ ми моделирования по гомологии построена модель его пространственной структуры [28] . Анализ мо­ дели показал наличие в структуре С-модуля потен­ циальных сайтов взаимодействия с т Р Н К Т у г , а так­ же участка, ответственного за цитокиновую актив­ ность. Полученная модель трехмерной структуры С-модуля может служить основой для дальнейшего исследования особенностей структуры и функций тирозил-тРНК синтетазы методами белковой инже­ нерии. Так , например, нами обнаружен эффект олигомеризации С-домена в растворе и образова­ ние фибриллоподобных агрегатов. Для предотвра­ щения олигомеризации белка методом сайт-на­ правленного мутагенеза получен тройной мутант Glu479Lys, Asn509Pro и Met511Glu С-домена тиро- зил-тРНК синтетазы. Экспрессия, выделение и изучение свойств полученного тройного мутанта С-модуля показали, что он не проявляет тенденции к агрегации, характерной для нативного домена. Компьютерное моделирование белков* Компь­ ютерное моделирование белков является одним из ключевых этапов применения методов белковой инженерии. Значительные успехи в секвенирова- нии геномов организмов, включая расшифровку генома человека, стимулировали развитие компью­ терной структурной биологии (биологии in silico) [29, 30] , На основе анализа экспериментально определенных структур белков разработаны эмпи­ рические правила и алгоритмы предсказания их трехмерной структуры, являющиеся основой моле­ кулярного моделирования пространственной струк­ туры белков. В настоящее время банк данных PDB содержит более 15000 пространственных структур различных белков. Атомные координаты гомоло­ гичного белка могут быть использованы как про- странствення матрица для моделирования по гомо­ логии. С помощью «компьютерного мутагенеза» боковые радикалы аминокислотных остатков заме­ няются на остатки моделируемого белка, структура которого затем оптимизируется. Для оценки фазо­ вого пространства структурной модели используют неэмпирические, полуэмпирические и эмпириче­ ские методы. К наиболее часто используемым эм­ пирическим методам относится метод силового по­ ля — физической модели описания макромолекулы аналитическими функциями для энергии взаимо­ действия между всеми парами атомов. Д л я анализа модели пространственной структуры белка и после­ дующего дизайна новой структуры белка использу­ ются методы компьютерной графики. Увеличение стабильности белков* Использова­ ние ферментов в инженерной энзимологии обычно включает проведение биотехнологических процес­ сов при повышенных температурах. Критическим параметром для использования ферментов в био­ технологических процессах является их термоста­ бильность. В настоящее время стандартным подхо­ дом для увеличения термостабильности белков яв ­ ляется конструирование термостабильных мутантов путем введения S-S связей на основе известной ЗБ-структуры. Такой подход реализован, в частно­ сти, для ксиланазы из Bacillus circulans [31 ] за счет введения новых S-S связей методом сайт-на­ правленного мутагенеза . Комбинация мутаций привела к получению мутантного белка ксиланазы, термостабильность которого увеличилась на 15 ° С В результате введения мутаций выяснилось, что сохранность активного центра зависит от стабиль­ ности первого тяжа /?-листа, так как он является мобильным в белковой структуре [31 ]. Другой подход для увеличения термостабиль­ ности был реализован для а -амилазы из Вас. licke- niformis, используемой при промышленном гидро­ лизе крахмала. С помощью случайного мутагенеза и скрининга белков на термостабильность обнару­ жен мутант Val209Ala, имеющий время жизни белка, увеличенное в 3 раза [32] . Этот подход широко используется даже в случае отсутствия детальной пространственной структуры изучаемого белка. Методами белковой инженерии получен му- тантный цитокин IL-6 с заменой Se r l76 на Arg и повышенной биологической активностью по срав­ нению с природным IL-6 (Патент С Ш А WO 94/11402) . Методами сайт-направленного мутаге­ неза получены глюкозоизомеризы с повышенным сродством к D-глюкозе с заменами T r p l 3 9 P h e , Туг; Va l l86Thr (Патент С Ш А 5266475). Сериновые протеазы семейства химотрипсинов были модифицированы таким образом, что приоб­ рели устойчивость к ингибиторам сериновых проте­ аз , что может применяться для терапии заболева­ ний, связанных со свертыванием крови (Патент США WO 94 /03614) . Дизайн белков de novo. При дизайне белков de novo конструируются новые полипептидные после­ довательности, которые могут свертываться в опре­ деленные пространственные структуры с компакт­ ной укладкой и являться носителями заданных функций белка [34 ], Основные правила дизайна de novo сейчас хорошо известны для простых струк­ тур, таких как четырехспиральная связка [1 ]. ДеГрадо и соавт. [35, 3 7 ] провели дизайн и получили белок а 4 , состоящий из четырех одинако­ вых а-спиралей, соединенных тремя петлями, и содержащий гидрофобное ядро из лейциновых ос­ татков [37] . Экспериментальными методами пока- 463 КОРНЕЛЮК А. И. зано, что белок а4 компактен, стабилен при дена­ турации, обладает высоким содержанием «-спи­ ральной структуры, но в то же время находится в состоянии «расплавленной глобулы». Состояние «расплавленной глобулы» является интермедиатом при самоорганизации белка [38, 3 9 ] . Макромоле­ кула белка при этом обладает значительной внут­ римолекулярной динамикой и более лабильна, чем нативная структура белка, поскольку в ней утраче­ на плотная специфическая укладка внутренних групп [38, 39 ] . Тетраспиральный домен «феликс» с неповторя­ ющейся последовательностью [36, 41 ] обладал компактной структурой, однако тоже находился в состоянии «расплавленной глобулы». Дизайном de novo получено несколько металлосвязывающих белков: тетраспиральный белок «гелихром» [42] , связывающий железо, и гемопротеид, связываю­ щий рутений [43] . Одним из распространенных классов структуры белков является /?а-баррель. В работе [18] получен искусственный белок октареллин, состоящий из повторенной восемь раз 31-членной аминокислот­ ной последовательности. Оказалось, что данный белок имел упорядоченную вторичную структуру и способность к кооперативному денатурационному переходу. Низкая кооперативность перехода позво­ лила предположить, что октареллин находится в состоянии «расплавленной глобулы». /^-Структурный белок бетабеллин сконструиро­ ван авторами [19] по типу «сэндвича» из двух идентичных четырехнитчатых антипараллельных /?-листов. Один из вариантов бетабеллина исследо­ вали методом двухмерной ЯМР-спектроскопии [63] , вследствии чего также выявлено состояние «расплавленной глобулы» для структуры белка. Исследователям удалось сконструировать белки и с новой, не обнаруженной до сих пор в природе, структурной организацией. Первая из таких белко­ вых структур, альбебетин, состояла из двух повто­ ряющихся элементов а/Зр и представляла собой 4-тяжевый антипараллельный /?-лист [46] . Далее альбебетин модифицировали для введения в его состав биологически активного участка фрагмента интерферона [45] . Анализ структуры нового белка альбеферона (альбебетин с фрагментом интерферо­ на) показал, что он компактен, стабилен и облада­ ет близкой к альбебетину вторичной структурой, то есть введение биологически активного фрагмента не нарушило существенным образом общей струк­ туры искусственного белка. Обнаружено, что аль- беферон имеет высокое сродство к рецепторам ти- моцитов мыши и активирует реакцию бласт-транс- формации тимоцитов д а ж е э ф ф е к т и в н е е , чем интерферон [45] . В перспективе подобные белко­ вые конструкции могут быть использованы в каче­ стве носителей самых различных биологических активностей. В то же время большинство белков, созданных de novo, находится в состоянии, более близком к состоянию «расплавленной глобулы», нежели к на- тивному состоянию. Дальнейшее развитие этой об­ ласти может быть достигнуто только на основе более детального дизайна с тщательным компью­ терным моделированием и минимизацией получае­ мых пространственных структур белков. Так, на­ пример, в последнее время разработан полностью автоматизированный алгоритм дизайна белков de novo [41 ]. Данный алгоритм основан на расчете потенциальной энергии и стереохимических огра­ ничений и используется для скрининга 1,9*10 2 7 возможных аминокислотных последовательностей для совместимости с белком-мишенью — мотивом /?/?а, представляющим «zinc finger» ДНК-связываю- щий домен [41]. Полученный FSD-1 белок имел очень низкую гомологию аминокислотной последо­ вательности с любым другим известным белком. Пространственная структура FSD-1 белка в раство­ ре, по данным ЯМР-спектроскопии, представляет собой компактную хорошо упорядоченную глобулу [41] . Белковая инженерия и биотехнология. Белко­ вая инженерия позволяет конструировать и созда­ вать новые белки с уникальными или усиленными свойствами (биологическая активность, термоста­ бильность и т. д.) . Быстрый прогресс ее примене­ ния в биотехнологии обеспечил получение многих важных продуктов для рынка и имеет большие перспективы. Мировая фармацевтическая промыш­ ленность в настоящее время интенсивно использует белковую инженерию для получения новых лекар­ ственных средств. Мощный экономический потен­ циал белковой инженерии стимулирует главные фармацевтические и химические кампании расхо­ довать огромные средства на развитие исследова­ тельских программ по белковой инженерии. В Япо­ нии образован консорциум из 14 компаний для развития Института по исследованиям белковой инженерии (PERI) с бюджетом более 100 млн долларов для создания новых и усовершенствова­ ния известных белков. Общие стратегии сосредото­ чены на наиболее важных терапевтических белках и полипептидных гормонах, при этом используются новые технологии скрининга лекарственных препа­ ратов. Перспективы. Современный уровень развития белковой инженерии открывает широкие перспек­ тивы как для фундаментальной молекулярной био- 464 БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ логии, так и для ее практического применения. Белковая инженерия использует комплекс совре- меннных подходов для структурно-функционально­ го анализа белков, что позволяет вводить направ­ ленные мутации в любые сайты белка, изучать структуру и тонкие механизмы функционирования ферментов. На основе использования структурного анализа белков и компьютерного моделирования могут быть созданы новые мутантные белки для медицинских целей, например, цитокины с усиленной биологи­ ческой активностью, модифицированные антитела и т. д. [47, 5 0 ] . На основе экспрессии in vivo мутантных белков с измененными свойствами (уси­ ленное или ослабленное действие, элиминация сай­ тов фосфорилирования, протеолиза и др.) возмож­ но создание нового подхода в генной терапии. Повышение стабильности белков методами на­ правленного изменения их структуры расширяет возможности их применения в различных областях биотехнологии. Новым направлением использова­ ния белковой инженерии может быть ее союз с микроэлектроникой и создание новых биосенсоров [48]. В свою очередь, это открывает возможности появления исключительно малых быстродействую­ щих биочипов [49] для компьютеров нового поко­ ления. A. I. Kornelyuk Protein engineering Summary The main directions of protein engineering — a novel branch of molecular biology and biotechnology, — are briefly analysed in this review. Protein engineering is based on the achievements of genetic engineering, structural biology and computer technologies. The main goal of protein engineering is a directed alteration of 3D protein structure with the aim of acquisition of novel properties or change of existing properties; or protein design de novo. Protein design is carried out on the level of 3D protein structure using the computer modelling methods. The site-directed mutagenesis method and its applications in protein engineering for structural and functional analysis of proteins is considered. The results of structural and functional investigations of bacterial and mammalian tyrosyl-tRNA synthetases by protein engineering are presented. Protein design of artificial proteins de novo is described. The perspectives of develop­ ment of protein engineering and its application in biotechnology and medicine are given in the review. О. І. Корнелюк Білкова інженерія Резюме В огляді стисло проаналізовано основні напрямки розвитку білкової інженери — нової галузі молекулярної біології і біо- технології, яка базується на досягненнях генної інженерії, структурної біології та комп'ютерних технологій. Білкова інженерія ставить своїм завданням направлену зміну струк­ тури білків для надання їм нових чи зміни існуючих властиво­ стей або створення білків de novo. Дизайн білка здійснюється на рівні його тривимірної структури з використанням ком­ п'ютерних методів моделювання. Розглянуто метод сайт- спрямованого мутагенезу і його використання в білковій інженерії для структурно-функціонального аналізу білків. Представлено результати структурно-функціонального ана­ лізу тирозил-тРНК синтетаз бактерій і ссавців методами білкової інженерії. Описано дизайн штучних білків de novo. Зроблено оцінку перспективам розвитку білкової інженерії, її використанню в біотехнології і медицині. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ {.Protein Engineering and Design / Ed. P. R. Сагеую—New York: Acad, press, 1996. 2. Concepts in Protein Engineering and Design / Eds P. Wrede, G. Schneider.—New York: Acad, press, 1994. 3. Leatherbarrow R. /., Fersht A. R. Protein engineering / / Protein Eng .—1986 .—1.—P. 7—16. 4. Shao Z., Arnold F. Engineering new functions and altering existing functions / / Curr. Opin. Struct. Biol .—1996.—6.— P. 513—518 . 5. Gillam S., Smith M. Site-specific mutagenesis using synthetic oligonucleotide primers: I. Optimum conditions and minimum oligodeoxyribonucleotide length. II. In vitro selection of mutant DNA / / Gene .—1979 .—8, N 1.—P. 81—106. 6. Zoller M., Smith M. Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA / / Nucl. Acids Res .—1982 .—10 .—P. 6487—6500 . 7. Boles E., Miosga T. A rapid and highly efficient method for PCR-based site-directed mutagenesis using only one new primer / / Curr. Genet .—1995 .—28.—P. 197—198. 8. Barik S. Mutagenesis and gene fusion by megaprimer PCR / / Methods in Molecular Biology, PCR Cloning Protocols / Ed. B. A. White.—New York: Humana press, 1997.—Vol. 67 .— P. 173—182. 9. Moore J. C, Arnold F. H. Directed evolution of a para- nitrobenzyl esterase for aqueous-organic solvents / / Nature Biotechnol .—1996.—14.—P. 458—467 . 10. Fersht A. R., Laetherbarrow R. J., Wells T. N. Quantitative analysis of structure-activity relationships in proteins by linear free-energy relationships / / Nature.—1986.—322, N 6077.— P. 284—286. 11. Wilkinson A. J., Fersht A. R., Blow D. M., Winter G. Site-directed mutagenesis as a probe of enzyme structure and catalysis: tyrosyl-tRNA synthetase cysteine-35 to glycine-35 mutation / / Biochemistry.—1983.—22, N 15.—P. 3581 — 3586. 12. Fersht A. R., Shi J. P., Wilkinson A. J., Blow D. M., Carter P., Waye M. M. У., Winter G. Analyse von Struktur- Aktivitats-Beziehungen by Enzymen durch Protein Engineering / / Angew. Chem.—1984.—96, N 7 .—P. 455—462 . 13. Fersht A. R., Knill-Jones J., Bedouelle H., Winter G. Recon­ struction by site-directed mutagenesis of the transition state for the activation of tyrosine by the tyrosyl-tRNA synthetase: a mobile loop envelopes the transition state in an induced-fit mechanism / / Biochemistry.—1988.—27.—P. 1581 — 1587. 14. Ferst E. A., Fersht A. R. Mutational and kinetic analysis of a mobile loop in tyrosyl-tRNA synthetase / / Biochemistry.— 1993.—32, N 49 .—P. 13658—13663 . 15. Ferst E. A., Fersht A. R. Mutation of lysine 233 to alanine introduces positive cooperatively into tyrosyl-tRNA synthetase / / Biochemistry.—1993.—32, N 4 9 . — P . 13651 — 13657. 16. Wells T. N. С, Ho C. 1С, Fersht A. R. Free energy of hydrolysis of tyrosy 1-adenylate and its binding to wild type and 465 КОРНЕЛЮК А. И. engineered mutants of tyrosyl-tRNA synthetase / / Bioche­ mistry.—1986.—25, N 21 .—P. 6603—6608. 17. Wilkinson A /., Fersht A &, Blow D. M, Carter P., Winter G. A large increase in enzyme-substrate affinity by protein engineering / / Nature .—1984.—307.—P. 187—188. 18. Laetherbarrow R. Fersht A. R.y Winter G. Transition-state stabilization in the mechanism of tyrosyl-tRNA synthetase revealed by protein engineering / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1985 .—82, N 23 .—P. 7840—7844. 19. Ward W. H. J., Fersht A R. Asymmetry of tyrosyl-tRNA synthetase in solution / / Biochemistry. — 1 9 8 8 . — 2 7 . — P. 1041—1049. 20. Jones D. #., McMillan A. J., Fersht A. R. Reversible dissociation of dimeric tyrosyl-tRNA synthetase by mutagenesis at the subunit interface / / Biochemistry.—1985.—24, N 2 1 . — P. 5852—5857. 21. Bedouelle #., Winter G. A model of synthetase-transfer RNA interaction as deducted by protein engineering / / Nature.— 1986.—320, N 6060 .—P. 371—373 . 22. Labouze E., Bedouelle H. Structural and kinetic bases for the recognition of t R N A T y r by tyrosyl-tRNA synthetase / / J. Мої. Biol .—1989.—205.—P. 729—735. 23. Корнелюк A. Курочкин И. В., Мацука Г. X. Тирозил- тРНК синтетаза из печени быка. Выделение и физико- химические свойства / / Молекуляр. биология.—1988.—22, № 1.—С. 176—186. 24. Корнелюк А. И. Структурно-функциональное исследова­ ние тирозил-тРНК синтетазы / / Биополимеры и клетка.— 1998.—14, № 4 .—С. 349—359 . 25. Найденов В. Г., Вудмаска М. И., Мацука Г. X., Корнелюк А. И. Сайт-направленный мутагенез остатков лизина, ло­ кализованных в соединительном пептиде нуклеотидсвя­ зывающего домена (свертки Россмана) тирозил-тРНК син­ тетазы из печени быка / / Биополимеры и клетка.— 2000.—16, № 4.—С. 275—280 . 26. Гнатенко Д В., Корнелюк А. И., Лаврик О. И. Хими­ ческая модификация остатков лизина тирозил-тРНК син­ тетазы из печени быка с помощью пиридоксаль-5'-фос­ фата / / Биохимия.—1991.—56, № П . — С . 56—60. 27. Kornelyuk А Tas М. P. R., Dybrovsky A , Murray С. Cytokine activity of the non-catalytic EMAP-2-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase / / Биополимеры и кле­ тка.—1999.—15, N 2.—P. 168—172. 28. Голуб А. Г., Одынец К. А., Ныпорко А. Ю., Корнелюк А. Я. Моделирование пространственной структуры СООН- концевого цитокин-подобного модуля цитоплазматической тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих / / Биополимеры и клетка.—2000.—16, № 6.—С. 515—524 . 29. Schwede Т., Diemand A., Guex N.t Peitsch М. С. Protein structure computing in the genomic era / / Res. Microbiol.— 2000 .—151 , N 2 .—P. 107—112. 30. Peitsch M., Schwede Т., Guex N. Automated protein modelling the proteome in 3D / / Pharmacogenomics.—2000.—1, N 3 . — P. 257—266. 31. Wakarchuk W. Thermostabilization of the Вас. circulans xyla- nase by the introduction of disulfide bonds / / Protein Eng.— 1994.—7, N 11.—P. 1379—1386. 32. Declerck N., Joyet P., Trosset J. Y, Cornier J., Gaillardin C. Hyperthermostable mutants of Bacillus licheniformis a-amy- lase: multiple amino acid replacements and molecular modelling / / Protein Eng .—1995 .—8.—P. 1029—1037. 33 . Bruins M. E.t Janssen A. E., Boom R. M. Thermozymes and their applications: a review of recent literature and patents / / Appl. Biochem. and Biotechnol.—2001.—90, N 2.—P. 155— 186. 34. Долгих Д А , Кирпичников M. П., Птицын О. Б., Чемерис B. В. Белковая инженерия искусственных белков / / Моле­ куляр. биология.—1996.—30.—С. 261—272. 35. Regan L, DeGrado W. F. Characterization of a helical protein designed from first principles / / Science.—1988.—241.— P. 976—978. 36. Hecht M. #., Richardson J. S., Richardson D. C , Ogden R. C. De novo design, expression, and characterization of felix: a four-helix bondle protein of native-like sequence / / Science.— 1990.—249.—P. 884—891 . 37. DeGrado W. F., Wasserman Z. R., Lear J. D. Protein design, a minimalist approach / / Science.—1989.—243.—P. 622— 627. 38. Dolgikh D. A , Gilmanchin R. I., Brazhnikov E. V., Bychkova V. E., Semisotnov G. K, Veniaminov S. Yu., Ptitsyn О. B. a-Lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure / / FEBS Lett .—1981.—136.—P. 311—315. 39. Dolgikh D. A., Kolomiets A. P., Bolotina I. A., Ptitsyn О. B. Molten-globule state accumulates in carbonic anhydrase folding / / FEBS Le t t—1984 .—165 .—P. 88—92 . 40. Ptitsyn О. B. Motile globule state / / Protein Folding / Ed. T. E. Creighton.—New York: Freeman, 1 9 9 2 . - 2 4 3 — 3 0 0 . 41. Dahiyat В., Mayo S. De novo protein design: fully automated sequence selection / / Sc ience .—1997.—278.—P. 82—87. 42. Sasaki Т., Kaiser Т. E. Helichrome: Synthesis and enzymatic activity of a designed hemeprotein / / J. Amer. Chem. Soc.— 1 9 8 9 . - 1 1 1 . — P . 180—181. 43. Ghadiri M. R.t Soares C , Choi Ch. Design of an artificial 4-helix bundle metalloprotein via a novel ruthenium (II) assisted self-assembly process / / J. Amer. Chem. S o c — 1992.—114.—P. 4000—4002 . 44. Ackerfeldt К S.t Lear J. P., Waserman Z. R., Chung L. A., DeGrado W. F. Synthetic peptides as models for ion channel proteins / / Acc. Chem. Res .—1993—26.—P. 191 — 197. 45. Долгих Д. А , Габриэлян А Э., Новолоцкая E. В., Чемерис В. В., Кирпичников М. Л. Искусственный белок с заданной пространственной структурой и биологической активно­ стью / / Биофизика.—1993.—28.—С. 67—74. 46. Bornscheuer U. Т., Pohl М. Improved biocatalysts by directed evolution and rational protein design / / Curr. Opin. Chem. Biol .—2001.—5, N 2 .—P. 137—143. 47. McCafferty J., Glover D. R. Engineering therapeutic proteins / / Curr. Opin. Struct. Bio l .—2000.—10, N 4.—P. 417—420. 48. Hunt J. A., Lesburg C. A., Christianson D. W., Thompson R. В., Fierke C. A. Active-site engineering of carbonic anhydrase and its application to biosensors / / E X S — 2 0 0 0 . — 9 0 . — P. 221—40. 49. Weinberger S. R., Morris T. S.t Pawlak M. Recent trends in protein biochip technology / / Pharmacogenomics.—2000.—1, N 4.—P. 395—416. 50. Isaacs J. D. From bench to bedside: discovering rules for antibody design, and improving serotherapy with monoclonal antibodies / / Rheumatology (Oxford) .—2001.—40, N 7.— P. 724—738. УДК 577.152.611:576.31 Надійшла до редакції 23.01.01 466

Similar Items