Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii
Селекционирован мутант rib1-86 P. guilliermondii, у которого рибофлавинзависимость супрессируется регуляторной мутацией rib81, но не таковой rib80. Двойной мутант rib 1-86 rib81 характеризуется низким уровнем активности ГТФ-циклогидролазы, синтез которой слабо регулируется железом. По-видимому, мута...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1991 |
| Hauptverfasser: | , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1991
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155896 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii / Г.М. Шавловский, Н.Н. Стенчук, Б.В. Кшановская // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 6. — С. 96-99. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155896 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Шавловский, Г.М. Стенчук, Н.Н. 2019-06-17T15:08:03Z 2019-06-17T15:08:03Z 1991 Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii / Г.М. Шавловский, Н.Н. Стенчук, Б.В. Кшановская // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 6. — С. 96-99. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000306 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155896 575.24:582.282.23 Селекционирован мутант rib1-86 P. guilliermondii, у которого рибофлавинзависимость супрессируется регуляторной мутацией rib81, но не таковой rib80. Двойной мутант rib 1-86 rib81 характеризуется низким уровнем активности ГТФ-циклогидролазы, синтез которой слабо регулируется железом. По-видимому, мутация rib 1-86 лежит в промоторной области гена RIB1, кодирующего ГТФ-циклогидролазу. У роботі селекціонований мутант rib1-86 P. guilliermondii, у якого рибофлавінзалежність супресується регуляторною мутацією rib81, але не rib80. Подвійний мутант rib1-86 rib81 характеризується низьким рівнем активності ГТФ-циклогідролази, синтез якої слабо регулюється залізом. Очевидно, мутація ribl-86 лежить в промоторній області гену RIB1, що кодує ГТФ-циклогідролазу. The rib1-86 mutant of P. guilliermondii in which riboflavin auxotrophy is suppressed by mutation rib81, but not by rib80 was selected. Double ribl-86 rib81 mutant is characterized by low GTP-cyclohydrolase activity. The enzyme synthesis is faintly regulated by iron. It is supposed that ribl-86 mutation is localized in the promoter region of RIB1 gene which codes for GTP-cyclohydrolase. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Генно-инженерная биотехнология Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii Вплив регуляторної мутації в локусі RIB1 на біосинтез рибофлавіну у Pichia guilliermondii The influence of the regulatory mutation in the rib1 locus on the riboflavin biosynthesis in Pichia guilliermondii Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii |
| spellingShingle |
Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii Шавловский, Г.М. Стенчук, Н.Н. Генно-инженерная биотехнология |
| title_short |
Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii |
| title_full |
Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii |
| title_fullStr |
Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii |
| title_full_unstemmed |
Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii |
| title_sort |
влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у pichia guilliermondii |
| author |
Шавловский, Г.М. Стенчук, Н.Н. |
| author_facet |
Шавловский, Г.М. Стенчук, Н.Н. |
| topic |
Генно-инженерная биотехнология |
| topic_facet |
Генно-инженерная биотехнология |
| publishDate |
1991 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Вплив регуляторної мутації в локусі RIB1 на біосинтез рибофлавіну у Pichia guilliermondii The influence of the regulatory mutation in the rib1 locus on the riboflavin biosynthesis in Pichia guilliermondii |
| description |
Селекционирован мутант rib1-86 P. guilliermondii, у которого рибофлавинзависимость супрессируется регуляторной мутацией rib81, но не таковой rib80. Двойной мутант rib 1-86 rib81 характеризуется низким уровнем активности ГТФ-циклогидролазы, синтез которой слабо регулируется железом. По-видимому, мутация rib 1-86 лежит в промоторной области гена RIB1, кодирующего ГТФ-циклогидролазу.
У роботі селекціонований мутант rib1-86 P. guilliermondii, у якого рибофлавінзалежність супресується регуляторною мутацією rib81, але не rib80. Подвійний мутант rib1-86 rib81 характеризується низьким рівнем активності ГТФ-циклогідролази, синтез якої слабо регулюється залізом. Очевидно, мутація ribl-86 лежить в промоторній області гену RIB1, що кодує ГТФ-циклогідролазу.
The rib1-86 mutant of P. guilliermondii in which riboflavin auxotrophy is suppressed by mutation rib81, but not by rib80 was selected. Double ribl-86 rib81 mutant is characterized by low GTP-cyclohydrolase activity. The enzyme synthesis is faintly regulated by iron. It is supposed that ribl-86 mutation is localized in the promoter region of RIB1 gene which codes for GTP-cyclohydrolase.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155896 |
| citation_txt |
Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii / Г.М. Шавловский, Н.Н. Стенчук, Б.В. Кшановская // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 6. — С. 96-99. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT šavlovskiigm vliânieregulâtornoimutaciivlokuserib1nabiosintezriboflavinaupichiaguilliermondii AT stenčuknn vliânieregulâtornoimutaciivlokuserib1nabiosintezriboflavinaupichiaguilliermondii AT šavlovskiigm vplivregulâtornoímutacíívlokusírib1nabíosintezriboflavínuupichiaguilliermondii AT stenčuknn vplivregulâtornoímutacíívlokusírib1nabíosintezriboflavínuupichiaguilliermondii AT šavlovskiigm theinfluenceoftheregulatorymutationintherib1locusontheriboflavinbiosynthesisinpichiaguilliermondii AT stenčuknn theinfluenceoftheregulatorymutationintherib1locusontheriboflavinbiosynthesisinpichiaguilliermondii |
| first_indexed |
2025-11-24T04:43:26Z |
| last_indexed |
2025-11-24T04:43:26Z |
| _version_ |
1850841724603072512 |
| fulltext |
Генноинженерная
биотехнология
УДК 575.24:582.282.23
Г. Μ. Шавловский, Η. Η. Стенчук, Б. В. Кшановская
ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРНОЙ МУТАЦИИ В ЛОКУСЕ R1B1
НА БИОСИНТЕЗ РИБОФЛАВИНА
У PlCHIA GUILLIERMONDII
Селекционирован мутант rib 1-86 P. guilliermondii, у которого рибофлавинзависимость
супрессируется регуляторной мутацией rib81, но не таковой rib80. Двойной мутант
rib 1-86 rib81 характеризуется низким уровнем активности ГТФ-циклогидролазы, синтез
которой слабо регулируется железом. По-видимому, мутация rib 1-86 лежит в промотор-
ной области гена RIBi, кодирующего ГТФ-циклогидролазу.
Введение. Биосинтез рибофлавина (РФ) у дрожжей P. guilliermondii
регулируется двумя генами негативного типа действия RIB80, RIB81
и двумя — позитивного — RIB83, RIB84 [1—3]. Дефицит железа в сре-
де, а также мутации rib80 и rib81 вызывают дерепрессию биосинтеза
большинства ферментов флавиногенеза и, как следствие, сверхсинтез
РФ дрожжами. Мутанты rib83 и rib84 неспособны к сверхсинтезу это-
го витамина в условиях дефицита железа.
До сих пор не удалось селекционировать мутанты дрожжей с по-
врежденными промоторными зонами структурных генов биосинтеза РФ.
На основе работ по изучению регуляции биосинтеза изо-1-цитохрома с
и других дрожжевых ферментов известно, что в этих зонах находится
несколько локусов (UAS, ТАТА, I), являющихся акцепторами различ-
ных регуляторных сигналов и эффективно влияющих на уровень экс-
прессии структурного гена [4]. Поэтому выделение мутантов с повреж-
денными элементами промотора является важной предпосылкой созда-
ния модели регуляции экспрессии исследуемого гена.
В настоящем сообщении приводятся данные о выделении мутанта
ribl-86 P. guilliermondii с нарушенной регуляцией флавиногенеза, у ко-
торого, по-видимому, повреждена промоторная зона гена RIBly коди-
рующего ГТФ-циклогидролазу.
Материалы и методы. Генотипы использованных в работе штаммов
представлены в таблице. Культуры дрожжей выращивали в синтети-
ческой модифицированной среде Беркгольдера. Состав среды и мето-
ды генетического анализа описаны ранее [5]. Среду от металлов очи-
щали с помощью 8-оксихинолина [6]. Биомассу дрожжей определяли
турбидиметрически на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М (кювета
3 мм, светофильтр № 6). Концентрацию РФ в среде измеряли флюоро-
метрически на приборе ЭФ-ЗМ. Активность ГТФ-циклогидролазы и
РФ-синтазы определяли, используя известные методы [7, 8]. В таб-
лице представлены средние величины, полученные в двух — трех экс-
периментах.
Результаты и обсуждение. Для выделения новых мутантов с дефек-
том позитивного контроля биосинтеза РФ применяли в качестве исход-
ного штамм S131/6, который из-за наличия у него мутации rib81 спо-
собен к сверхсинтезу РФ в условиях оптимального для роста обеспе-
чения железом (см. таблицу). Клоны с резко сниженной интенсивно-
г. М. !ПАВЛОВСКИЙ, Н. Н. СТЕНЧУК, Б. В. КШАНОВСКАЯ, 1991
96 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. \ s о
«Флавиногенез, активность ГТФ-циклогидролазы и РФ-синтазы, регуляторних
мутантов P. guilliermondii
Удельная активность,
Концентра-
РФ среды,
Е/мг б е л к а ' Ю - 5
Штамм Генотип ция железа РФ среды, Штамм Генотип в среде, мг/г клеток
мг/л ГТФ-цикло-
РФ-синтаза гидролаза РФ-синтаза
5131/6 rib81 met Λ 0,2
0,01
1,1
25,6
11,0
13,8
—
LV124 rib 1 -36 г і 681 met Λ 0,2
0,01
0,02
0,01
0,4
0,2
9,9
35,8
LV166 п Ы - 8 6 ade2-19
met Λ
0,2
0,01
— 0,1
0,1
3,0
14,8
LV166-8 WM-86 rib8\
ade2-19 met-l
0,2
0,01
0,02
0,17
0,2
0,1
11,5
16,3
LV172 ribl ^86 rib80 rib81
ade2-19 met-\
0,2
0,01
0,03
0,09
— —
АТСС9058 Дикий тип 0,2
0,01
0,10
14,4
2,7
14,7
2,0
19,й
П р и м е ч а н и е , ade2, met—мутации, обусловливающие аденин- и метионинзависи-
JViocTb соответственно; знак «—» — не определяли.
стью биосинтеза РФ отбирали визуально после подращивания мутаге-
низированной М-метил-Ы'-нитро-Ы'-нитрозогуанидином культуры этого
штамма на іагаризованной среде. Последующее выращивание их в де-
фицитной по железу жидкой среде (0,01 мг Fe/л) позволило отобрать
35 мутантов, неспособных к сверхсинтезу РФ в этих условиях. В кол-
лекции полученных мутантов оказался один (LV124), у которого это
свойство вызвано мутацией, комплементирующей идентифицированные
ранее мутации rib83 и rib84. Очевидно, неспособность к сверхсинтезу
РФ штамма LV124 вызвана нарушением механизма дерепрессии син-
теза ферментов флавиногенеза. Определение активности ГТФ-цикло-
гидролазы и РФ-синтазы показало (см. таблицу), что в условиях де-
фицита железа дерепрессируется только последняя из них.
Для разделения новой регуляторной мутации и мутации rib81
штамм LV124 скрестили со штаммом дикого типа и проанализировали
характер мейотического расщепления у полученного гибрида. Неожи-
данным было то, что среди сегрегантов обнаружены не только таковые
с фенотипами штаммов S131/6 и LV124, но и РФ-зависимые ауксотро-
фы. Результаты гибридизации таких РФ-зависимых сегрегантов с РФ-
зависимыми мутантами генотипов ribl—п'Ь7, дефектных по соответ-
ствующим структурным генам биосинтеза РФ [5], показали, что новая
мутация комплехментирует с мутациями во всех структурных генах, кро-
ме ribl, и, следовательно, локализована в гене RIBl, кодирующем син-
тез ГТФ-циклогидролазы; она обозначена нами ribl-86.
Штамм LV166 (один из сегрегантов), обладающий этой мутацией,
является полным РФ-ауксотрофом. Оптимальной для его роста концент-
рацией РФ является 200 мкг/мл, что характерно для РФ-зависимых
іауксотрофов P. guilliermondii [5]. При длительной (более 5 сут) ин-
кубации клеток этого штамма в среде без РФ в ряде случаев наблю-
дали увеличение оптической плотности культуры только за счет раз-
множения прототрофных ревертантов, но не мутантных клеток ribl-86.
Активность ГТФ-циклогидролазы у штамма LV166 не обнаруживается
даже при росте в условиях дефицита железа, в то время как синтез*
РФ-синтазы репрессирован в условиях оптимального для роста обес-
печения клеток железом и дерепрессирован при его дефиците в среде.
Таким образом, штамм LV166 не является брадитрофным (leaky) му-
тантом по гену R1B1.
РФ-независимость штамма LV124 свидетельствует о том, что мута-
97 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. \s о
ция rib81 супрессирует таковую ribl-86. Дополнительные доказательст-
ва в пользу этого вывода получены с помощью анализа свойств 128
спонтанных РФ-независимых ревертантов штамма LV166. Результаты
комплементационного анализа показали, что 126 из них являются двой-
ными мутантами rib81 ribl-86. Свойства одного из них (LV166-8) пред-
ставлены в таблице. Характерным для него, как и для штамма LV124y
является неспособность к сверхсинтезу РФ в условиях дефицита желе-
за, низкий уровень активности ГТФ-циклогидролазы и дерепрессия син-
теза РФ-синтазы.
Дерепрессию биосинтеза ферментов флавиногенеза у P. guillier-
mondii вызывает также мутация гіЬ80 [1]. Сконструированный нами
двойной мутант rib80 ribl-86 является РФ-зависимым ауксотрофом да-
же в условиях дефицита железа. Следовательно, мутация rib80 не су-
прессирует таковую ribl-86.
РФ-зависимость мутанта rib80 ribl-86 позволила легко ввести в его
геном третью мутацию — rib81 за счет отбора спонтанных РФ-незави-
симых ревертантов. Тройной мутант LV172-2 (прототроф по РФ), как
и штамм rib81 ribl-86, неспособен к сверхсинтезу РФ в условиях дефи-
цита железа, т. е. мутация rib80 в этом случае не усиливает влияния
мутации rib81 на биосинтез РФ (см. таблицу).
Таким образом, выделен регуляторный мутант P. guilliermondii с по-
врежденным геном RIB1, у которого мутация локализована, очевидно,
ь промоторной зоне этого гена. Об этом свидетельствует полная ауксо-
трофность мутанта LV166 по РФ и высокая специфичность супрессии
потребности в РФ под влиянием мутации rib81, но не таковой rib80
или дефицита железа в среде.
Можно предположить, что мутация ribl-86 приводит к нарушению
взаимодействия факторов позитивного типа действия (продуктов генов
RIB83, RIB84 или других, пока не идентифицированных) с их акцеп-
торными сайтами в промоторной зоне гена RIB1. У мутантов ribl-86
продукт гена RIB81, являющийся, очевидно, репреосором, полностью
подавляет экспрессию структурного гена ГТФ-циклогидролазы, так как
мутация rib81 частично восстанавливает синтез этого фермента.
Важно отметить, что у мутантов rib81 ribl-86 дефицит железа не
вызывает дерепрессии активности ГТФ-циклогидролазы и, как следст-
вие, сверхсинтеза РФ. Из этого вытекает, что мутация ribl-86 наруша-
ет механизм регуляции синтеза ГТФ-циклогидролазы, в котором участ-
вует железо.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что механизмы регу-
ляции синтеза ферментов флавиногенеза у дрожжей являются значи-
тельно более сложными по сравнению с таковыми у бактерий. Как из-
вестно, у Bacillus subtilis в регуляции транскрипции РФ-оперона уча-
ствует ген-регулятор ribC и оператор ribO [9].
Очевидно, мутант ribl-86 P. guilliermondii является удобной мо-
делью для изучения взаимодействия различных регуляторных сигналов,
участвующих в контроле биосинтеза ферментов флавиногенеза, путем
конструирования штаммов, несущих несколько регуляторных мутаций.
Клонирование гена RIBl P. guilliermondii [10] открывает возможность
более глубокого изучения структуры регуляторных сайтов промотора
этого гена.
Р е з ю м е
У роботі селекціонований мутант ribl-86 P. guilliermondii, у якого рибофлавінзалеж-
ність супресується регуляторною мутацією гіЬ81, але не гіЬ80. Подвійний мутант ribl-86
rib81 характеризується низьким рівнем активності ГТФ-циклогідролази, синтез якої сла-
бо регулюється залізом. Очевидно, мутація ribl-86 лежить в промоторній області гену
RIB1, що кодує ГТФ-циклогідролазу.
98 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. \s о
S u m m а г у
The ribl-86 mutant of P. guilliermondii in which riboflavin auxotrophy is suppressed by
iiiiitation ribS 1, but not by rib80 was selected. Double ribl-86 rib81 mutant is characteri-
zed by low GTP-cyclohydrolase activity. The enzyme synthesis is faintly regulated by
iron. It is supposed that ribl-86 mutation is localized in the promoter region of RlBl ge-
ne which codes for GTP-cyclohydrolase.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Выделение и характеристика флавиногенных штаммов Pichia guilliermondii, несущих
регуляторную мутацию rib80/ribR / Г. М. Шавловский, Д. В. Федорович, Е. М. JIor-
виненко, Л. В. Колтун / /Микробиология.— 1985.— 54, № 6.— С. 919—926.
2. Генетический контроль биосинтеза рибофлавина у дрожжей Pichia guilliermondii.
Обнаружение нового регуляторного гена rib81 / Г. М. Шавловский, Л. Я. Бабяк,
A. А. Сибирный, Ε. М. Логвиненко/ /Генетика .— 1985.— 21, № 3.—С. 368—371.
3. Регуляция биосинтеза рибофлавина элементами позитивного контроля у дрожжей
Pichia guilliermondii / Г. М. Шавловский, Л. В. Колтун, Б. В. Кшановская и Д р . / /
Там же.— 1987.— 25, № 2.— С. 250—258.
4. Guarente L. Regulatory proteins in y e a s t / / A n n u . Rev. Genet.— 1987.— 21.—
P. 425—452.
5. Генетическая классификация рибофлавинзависимых мутантов дрожжей Pichia guil-
liermondii / Г. М. Шавловский, А. А. Сибирный, Б. В. Кшановская и д р . / / Г е н е т и -
ка.— 1979.— 15, № 9.—С. 1561 — 1568.
П. Waring W. SWerkman С. Н. Grouth of bacteria in iron-free m e d i u m / / A r c h . Bio-
chem.— 1943.— 4, N 2 .—P. 303—310.
7. Влияние железа, актиномицина D и циклогексимида на синтез рибофлавинсинтазы
у флавиногенных дрожжей / Ε. М. Логвиненко, Г. М. Шавловский, А. Е. Закаль-
ский, И. В. Заходило / /Биохимия .— 1982.—47, № 1.—С. 28—33.
8. Исследование роли флавинов в регуляции синтеза рибофлавинсинтазы у дрожжей
Pichia guilliermondii и Candida utilis / Ε. Μ. Логвиненко, Г. Μ. Шавловский,
B. М. Трач, А. А. Сибирный/ /Микробиология— 1973.—42, № 6.—С. 1008—1013.
9. Оперонная организация генов биосинтеза рибофлавина Bacillus subtilis / В. М. Ми-
ронов, М. Л. Чикиндас, А. С. Краев и д р . / / Д о к л . АН СССР.— 1990 — 312, N° 1.—
C. 237—240.
10. Клонирование гена RIB1, кодирующего фермент первого этапа флавиногенеза у
дрожжей Pichia guilliermondii — ГТФ-циклогидролазу, в клетках Escherichia coli /
А. Е. Закальский, М. Л. Злочевский, Ю. 3. Стасив и д р . / / Г е н е т и к а . — 1990.— 26,
№ 4.—С. 614—620.
Львов, отд-ние Ин-та биохимии им. А. В. ГІалладина Получено 15.03.91
АН УССР
99 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. \s о
|