Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii

Селекционирован мутант rib1-86 P. guilliermondii, у которого рибофлавинзависимость супрессируется регуляторной мутацией rib81, но не таковой rib80. Двойной мутант rib 1-86 rib81 характеризуется низким уровнем активности ГТФ-циклогидролазы, синтез которой слабо регулируется железом. По-видимому, мута...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1991
Hauptverfasser:	Шавловский, Г.М., Стенчук, Н.Н.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1991
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Генно-инженерная биотехнология
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155896
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii / Г.М. Шавловский, Н.Н. Стенчук, Б.В. Кшановская // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 6. — С. 96-99. — Бібліогр.: 10 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155896
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1558962025-02-23T17:41:38Z Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii Вплив регуляторної мутації в локусі RIB1 на біосинтез рибофлавіну у Pichia guilliermondii The influence of the regulatory mutation in the rib1 locus on the riboflavin biosynthesis in Pichia guilliermondii Шавловский, Г.М. Стенчук, Н.Н. Генно-инженерная биотехнология Селекционирован мутант rib1-86 P. guilliermondii, у которого рибофлавинзависимость супрессируется регуляторной мутацией rib81, но не таковой rib80. Двойной мутант rib 1-86 rib81 характеризуется низким уровнем активности ГТФ-циклогидролазы, синтез которой слабо регулируется железом. По-видимому, мутация rib 1-86 лежит в промоторной области гена RIB1, кодирующего ГТФ-циклогидролазу. У роботі селекціонований мутант rib1-86 P. guilliermondii, у якого рибофлавінзалежність супресується регуляторною мутацією rib81, але не rib80. Подвійний мутант rib1-86 rib81 характеризується низьким рівнем активності ГТФ-циклогідролази, синтез якої слабо регулюється залізом. Очевидно, мутація ribl-86 лежить в промоторній області гену RIB1, що кодує ГТФ-циклогідролазу. The rib1-86 mutant of P. guilliermondii in which riboflavin auxotrophy is suppressed by mutation rib81, but not by rib80 was selected. Double ribl-86 rib81 mutant is characterized by low GTP-cyclohydrolase activity. The enzyme synthesis is faintly regulated by iron. It is supposed that ribl-86 mutation is localized in the promoter region of RIB1 gene which codes for GTP-cyclohydrolase. 1991 Article Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii / Г.М. Шавловский, Н.Н. Стенчук, Б.В. Кшановская // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 6. — С. 96-99. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000306 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155896 575.24:582.282.23 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Генно-инженерная биотехнология Генно-инженерная биотехнология
spellingShingle	Генно-инженерная биотехнология Генно-инженерная биотехнология Шавловский, Г.М. Стенчук, Н.Н. Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii Биополимеры и клетка
description	Селекционирован мутант rib1-86 P. guilliermondii, у которого рибофлавинзависимость супрессируется регуляторной мутацией rib81, но не таковой rib80. Двойной мутант rib 1-86 rib81 характеризуется низким уровнем активности ГТФ-циклогидролазы, синтез которой слабо регулируется железом. По-видимому, мутация rib 1-86 лежит в промоторной области гена RIB1, кодирующего ГТФ-циклогидролазу.
format	Article
author	Шавловский, Г.М. Стенчук, Н.Н.
author_facet	Шавловский, Г.М. Стенчук, Н.Н.
author_sort	Шавловский, Г.М.
title	Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii
title_short	Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii
title_full	Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii
title_fullStr	Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii
title_full_unstemmed	Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii
title_sort	влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у pichia guilliermondii
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1991
topic_facet	Генно-инженерная биотехнология
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155896
citation_txt	Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii / Г.М. Шавловский, Н.Н. Стенчук, Б.В. Кшановская // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 6. — С. 96-99. — Бібліогр.: 10 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT šavlovskijgm vliânieregulâtornojmutaciivlokuserib1nabiosintezriboflavinaupichiaguilliermondii AT stenčuknn vliânieregulâtornojmutaciivlokuserib1nabiosintezriboflavinaupichiaguilliermondii AT šavlovskijgm vplivregulâtornoímutacíívlokusírib1nabíosintezriboflavínuupichiaguilliermondii AT stenčuknn vplivregulâtornoímutacíívlokusírib1nabíosintezriboflavínuupichiaguilliermondii AT šavlovskijgm theinfluenceoftheregulatorymutationintherib1locusontheriboflavinbiosynthesisinpichiaguilliermondii AT stenčuknn theinfluenceoftheregulatorymutationintherib1locusontheriboflavinbiosynthesisinpichiaguilliermondii
first_indexed	2025-11-24T04:43:26Z
last_indexed	2025-11-24T04:43:26Z
_version_	1849645498848247808
fulltext	Генноинженерная биотехнология УДК 575.24:582.282.23 Г. Μ. Шавловский, Η. Η. Стенчук, Б. В. Кшановская ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРНОЙ МУТАЦИИ В ЛОКУСЕ R1B1 НА БИОСИНТЕЗ РИБОФЛАВИНА У PlCHIA GUILLIERMONDII Селекционирован мутант rib 1-86 P. guilliermondii, у которого рибофлавинзависимость супрессируется регуляторной мутацией rib81, но не таковой rib80. Двойной мутант rib 1-86 rib81 характеризуется низким уровнем активности ГТФ-циклогидролазы, синтез которой слабо регулируется железом. По-видимому, мутация rib 1-86 лежит в промотор- ной области гена RIBi, кодирующего ГТФ-циклогидролазу. Введение. Биосинтез рибофлавина (РФ) у дрожжей P. guilliermondii регулируется двумя генами негативного типа действия RIB80, RIB81 и двумя — позитивного — RIB83, RIB84 [1—3]. Дефицит железа в сре- де, а также мутации rib80 и rib81 вызывают дерепрессию биосинтеза большинства ферментов флавиногенеза и, как следствие, сверхсинтез РФ дрожжами. Мутанты rib83 и rib84 неспособны к сверхсинтезу это- го витамина в условиях дефицита железа. До сих пор не удалось селекционировать мутанты дрожжей с по- врежденными промоторными зонами структурных генов биосинтеза РФ. На основе работ по изучению регуляции биосинтеза изо-1-цитохрома с и других дрожжевых ферментов известно, что в этих зонах находится несколько локусов (UAS, ТАТА, I), являющихся акцепторами различ- ных регуляторных сигналов и эффективно влияющих на уровень экс- прессии структурного гена [4]. Поэтому выделение мутантов с повреж- денными элементами промотора является важной предпосылкой созда- ния модели регуляции экспрессии исследуемого гена. В настоящем сообщении приводятся данные о выделении мутанта ribl-86 P. guilliermondii с нарушенной регуляцией флавиногенеза, у ко- торого, по-видимому, повреждена промоторная зона гена RIBly коди- рующего ГТФ-циклогидролазу. Материалы и методы. Генотипы использованных в работе штаммов представлены в таблице. Культуры дрожжей выращивали в синтети- ческой модифицированной среде Беркгольдера. Состав среды и мето- ды генетического анализа описаны ранее [5]. Среду от металлов очи- щали с помощью 8-оксихинолина [6]. Биомассу дрожжей определяли турбидиметрически на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М (кювета 3 мм, светофильтр № 6). Концентрацию РФ в среде измеряли флюоро- метрически на приборе ЭФ-ЗМ. Активность ГТФ-циклогидролазы и РФ-синтазы определяли, используя известные методы [7, 8]. В таб- лице представлены средние величины, полученные в двух — трех экс- периментах. Результаты и обсуждение. Для выделения новых мутантов с дефек- том позитивного контроля биосинтеза РФ применяли в качестве исход- ного штамм S131/6, который из-за наличия у него мутации rib81 спо- собен к сверхсинтезу РФ в условиях оптимального для роста обеспе- чения железом (см. таблицу). Клоны с резко сниженной интенсивно- г. М. !ПАВЛОВСКИЙ, Н. Н. СТЕНЧУК, Б. В. КШАНОВСКАЯ, 1991 96 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. \ s о «Флавиногенез, активность ГТФ-циклогидролазы и РФ-синтазы, регуляторних мутантов P. guilliermondii Удельная активность, Концентра- РФ среды, Е/мг б е л к а ' Ю - 5 Штамм Генотип ция железа РФ среды, Штамм Генотип в среде, мг/г клеток мг/л ГТФ-цикло- РФ-синтаза гидролаза РФ-синтаза 5131/6 rib81 met Λ 0,2 0,01 1,1 25,6 11,0 13,8 — LV124 rib 1 -36 г і 681 met Λ 0,2 0,01 0,02 0,01 0,4 0,2 9,9 35,8 LV166 п Ы - 8 6 ade2-19 met Λ 0,2 0,01 — 0,1 0,1 3,0 14,8 LV166-8 WM-86 rib8\ ade2-19 met-l 0,2 0,01 0,02 0,17 0,2 0,1 11,5 16,3 LV172 ribl ^86 rib80 rib81 ade2-19 met-\ 0,2 0,01 0,03 0,09 — — АТСС9058 Дикий тип 0,2 0,01 0,10 14,4 2,7 14,7 2,0 19,й П р и м е ч а н и е , ade2, met—мутации, обусловливающие аденин- и метионинзависи- JViocTb соответственно; знак «—» — не определяли. стью биосинтеза РФ отбирали визуально после подращивания мутаге- низированной М-метил-Ы'-нитро-Ы'-нитрозогуанидином культуры этого штамма на іагаризованной среде. Последующее выращивание их в де- фицитной по железу жидкой среде (0,01 мг Fe/л) позволило отобрать 35 мутантов, неспособных к сверхсинтезу РФ в этих условиях. В кол- лекции полученных мутантов оказался один (LV124), у которого это свойство вызвано мутацией, комплементирующей идентифицированные ранее мутации rib83 и rib84. Очевидно, неспособность к сверхсинтезу РФ штамма LV124 вызвана нарушением механизма дерепрессии син- теза ферментов флавиногенеза. Определение активности ГТФ-цикло- гидролазы и РФ-синтазы показало (см. таблицу), что в условиях де- фицита железа дерепрессируется только последняя из них. Для разделения новой регуляторной мутации и мутации rib81 штамм LV124 скрестили со штаммом дикого типа и проанализировали характер мейотического расщепления у полученного гибрида. Неожи- данным было то, что среди сегрегантов обнаружены не только таковые с фенотипами штаммов S131/6 и LV124, но и РФ-зависимые ауксотро- фы. Результаты гибридизации таких РФ-зависимых сегрегантов с РФ- зависимыми мутантами генотипов ribl—п'Ь7, дефектных по соответ- ствующим структурным генам биосинтеза РФ [5], показали, что новая мутация комплехментирует с мутациями во всех структурных генах, кро- ме ribl, и, следовательно, локализована в гене RIBl, кодирующем син- тез ГТФ-циклогидролазы; она обозначена нами ribl-86. Штамм LV166 (один из сегрегантов), обладающий этой мутацией, является полным РФ-ауксотрофом. Оптимальной для его роста концент- рацией РФ является 200 мкг/мл, что характерно для РФ-зависимых іауксотрофов P. guilliermondii [5]. При длительной (более 5 сут) ин- кубации клеток этого штамма в среде без РФ в ряде случаев наблю- дали увеличение оптической плотности культуры только за счет раз- множения прототрофных ревертантов, но не мутантных клеток ribl-86. Активность ГТФ-циклогидролазы у штамма LV166 не обнаруживается даже при росте в условиях дефицита железа, в то время как синтез* РФ-синтазы репрессирован в условиях оптимального для роста обес- печения клеток железом и дерепрессирован при его дефиците в среде. Таким образом, штамм LV166 не является брадитрофным (leaky) му- тантом по гену R1B1. РФ-независимость штамма LV124 свидетельствует о том, что мута- 97 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. \s о ция rib81 супрессирует таковую ribl-86. Дополнительные доказательст- ва в пользу этого вывода получены с помощью анализа свойств 128 спонтанных РФ-независимых ревертантов штамма LV166. Результаты комплементационного анализа показали, что 126 из них являются двой- ными мутантами rib81 ribl-86. Свойства одного из них (LV166-8) пред- ставлены в таблице. Характерным для него, как и для штамма LV124y является неспособность к сверхсинтезу РФ в условиях дефицита желе- за, низкий уровень активности ГТФ-циклогидролазы и дерепрессия син- теза РФ-синтазы. Дерепрессию биосинтеза ферментов флавиногенеза у P. guillier- mondii вызывает также мутация гіЬ80 [1]. Сконструированный нами двойной мутант rib80 ribl-86 является РФ-зависимым ауксотрофом да- же в условиях дефицита железа. Следовательно, мутация rib80 не су- прессирует таковую ribl-86. РФ-зависимость мутанта rib80 ribl-86 позволила легко ввести в его геном третью мутацию — rib81 за счет отбора спонтанных РФ-незави- симых ревертантов. Тройной мутант LV172-2 (прототроф по РФ), как и штамм rib81 ribl-86, неспособен к сверхсинтезу РФ в условиях дефи- цита железа, т. е. мутация rib80 в этом случае не усиливает влияния мутации rib81 на биосинтез РФ (см. таблицу). Таким образом, выделен регуляторный мутант P. guilliermondii с по- врежденным геном RIB1, у которого мутация локализована, очевидно, ь промоторной зоне этого гена. Об этом свидетельствует полная ауксо- трофность мутанта LV166 по РФ и высокая специфичность супрессии потребности в РФ под влиянием мутации rib81, но не таковой rib80 или дефицита железа в среде. Можно предположить, что мутация ribl-86 приводит к нарушению взаимодействия факторов позитивного типа действия (продуктов генов RIB83, RIB84 или других, пока не идентифицированных) с их акцеп- торными сайтами в промоторной зоне гена RIB1. У мутантов ribl-86 продукт гена RIB81, являющийся, очевидно, репреосором, полностью подавляет экспрессию структурного гена ГТФ-циклогидролазы, так как мутация rib81 частично восстанавливает синтез этого фермента. Важно отметить, что у мутантов rib81 ribl-86 дефицит железа не вызывает дерепрессии активности ГТФ-циклогидролазы и, как следст- вие, сверхсинтеза РФ. Из этого вытекает, что мутация ribl-86 наруша- ет механизм регуляции синтеза ГТФ-циклогидролазы, в котором участ- вует железо. Приведенные данные свидетельствуют о том, что механизмы регу- ляции синтеза ферментов флавиногенеза у дрожжей являются значи- тельно более сложными по сравнению с таковыми у бактерий. Как из- вестно, у Bacillus subtilis в регуляции транскрипции РФ-оперона уча- ствует ген-регулятор ribC и оператор ribO [9]. Очевидно, мутант ribl-86 P. guilliermondii является удобной мо- делью для изучения взаимодействия различных регуляторных сигналов, участвующих в контроле биосинтеза ферментов флавиногенеза, путем конструирования штаммов, несущих несколько регуляторных мутаций. Клонирование гена RIBl P. guilliermondii [10] открывает возможность более глубокого изучения структуры регуляторных сайтов промотора этого гена. Р е з ю м е У роботі селекціонований мутант ribl-86 P. guilliermondii, у якого рибофлавінзалеж- ність супресується регуляторною мутацією гіЬ81, але не гіЬ80. Подвійний мутант ribl-86 rib81 характеризується низьким рівнем активності ГТФ-циклогідролази, синтез якої сла- бо регулюється залізом. Очевидно, мутація ribl-86 лежить в промоторній області гену RIB1, що кодує ГТФ-циклогідролазу. 98 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. \s о S u m m а г у The ribl-86 mutant of P. guilliermondii in which riboflavin auxotrophy is suppressed by iiiiitation ribS 1, but not by rib80 was selected. Double ribl-86 rib81 mutant is characteri- zed by low GTP-cyclohydrolase activity. The enzyme synthesis is faintly regulated by iron. It is supposed that ribl-86 mutation is localized in the promoter region of RlBl ge- ne which codes for GTP-cyclohydrolase. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Выделение и характеристика флавиногенных штаммов Pichia guilliermondii, несущих регуляторную мутацию rib80/ribR / Г. М. Шавловский, Д. В. Федорович, Е. М. JIor- виненко, Л. В. Колтун / /Микробиология.— 1985.— 54, № 6.— С. 919—926. 2. Генетический контроль биосинтеза рибофлавина у дрожжей Pichia guilliermondii. Обнаружение нового регуляторного гена rib81 / Г. М. Шавловский, Л. Я. Бабяк, A. А. Сибирный, Ε. М. Логвиненко/ /Генетика .— 1985.— 21, № 3.—С. 368—371. 3. Регуляция биосинтеза рибофлавина элементами позитивного контроля у дрожжей Pichia guilliermondii / Г. М. Шавловский, Л. В. Колтун, Б. В. Кшановская и Д р . / / Там же.— 1987.— 25, № 2.— С. 250—258. 4. Guarente L. Regulatory proteins in y e a s t / / A n n u . Rev. Genet.— 1987.— 21.— P. 425—452. 5. Генетическая классификация рибофлавинзависимых мутантов дрожжей Pichia guil- liermondii / Г. М. Шавловский, А. А. Сибирный, Б. В. Кшановская и д р . / / Г е н е т и - ка.— 1979.— 15, № 9.—С. 1561 — 1568. П. Waring W. SWerkman С. Н. Grouth of bacteria in iron-free m e d i u m / / A r c h . Bio- chem.— 1943.— 4, N 2 .—P. 303—310. 7. Влияние железа, актиномицина D и циклогексимида на синтез рибофлавинсинтазы у флавиногенных дрожжей / Ε. М. Логвиненко, Г. М. Шавловский, А. Е. Закаль- ский, И. В. Заходило / /Биохимия .— 1982.—47, № 1.—С. 28—33. 8. Исследование роли флавинов в регуляции синтеза рибофлавинсинтазы у дрожжей Pichia guilliermondii и Candida utilis / Ε. Μ. Логвиненко, Г. Μ. Шавловский, B. М. Трач, А. А. Сибирный/ /Микробиология— 1973.—42, № 6.—С. 1008—1013. 9. Оперонная организация генов биосинтеза рибофлавина Bacillus subtilis / В. М. Ми- ронов, М. Л. Чикиндас, А. С. Краев и д р . / / Д о к л . АН СССР.— 1990 — 312, N° 1.— C. 237—240. 10. Клонирование гена RIB1, кодирующего фермент первого этапа флавиногенеза у дрожжей Pichia guilliermondii — ГТФ-циклогидролазу, в клетках Escherichia coli / А. Е. Закальский, М. Л. Злочевский, Ю. 3. Стасив и д р . / / Г е н е т и к а . — 1990.— 26, № 4.—С. 614—620. Львов, отд-ние Ин-та биохимии им. А. В. ГІалладина Получено 15.03.91 АН УССР 99 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. \s о

Влияние регуляторной мутации в локусе rib1 на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii

Institution

Ähnliche Einträge