Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях

В обзоре собраны данные, демонстрирующие возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии (МИ-МС) в молекулярно-биологических исследования по двум направлениям: термодинамическом и структурно-аналитическом. Дано описание методики температурно-зависимой полевой масс-спектрометрии, с помощью которой...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1991
1. Verfasser:	Суходуб, Л.Ф.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1991
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Структура и функции биополимеров
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155900
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях / Л.Ф. Суходуб // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 6. — С. 15-32. — Бібліогр.: 55 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155900
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1559002025-02-09T14:18:34Z Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях Можливості м’якоіонізаційної мас-спектрометрії у молекулярно-біологічних дослідженнях The possibilities of the soft-ionization mass-spectrometry in the molecular-biological studies Суходуб, Л.Ф. Структура и функции биополимеров В обзоре собраны данные, демонстрирующие возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии (МИ-МС) в молекулярно-биологических исследования по двум направлениям: термодинамическом и структурно-аналитическом. Дано описание методики температурно-зависимой полевой масс-спектрометрии, с помощью которой впервые были поставлены эксперименты по измерению термодинамических характеристик ряда биологических ассоциатов: уотсон-криковские, «неправильные» и др. пары оснований, стопочные димеры оснований, комплексы «аминокислота–основание», гидраты оснований и их пар. Сделан анализ этих данных в сочетании с теорией. Показаны перспективы МИ-МС в изучении продуктов гидролиза (распада) лекарственных препаратов в физиологическом растворе и аддуктов их взаимодействия с ДНК. В огляді зібрано дані, що демонструють можливості м'якоіонізаційної мас-спектрометрії (MI-MC) в молекулярно-біологічних дослідженнях у двох напрямках: термодинамічному та структурно-аналітичному. Описано методику температурно-залежної мас-спектрометрії поля, за допомогою якої вперше поставлено експерименти по вимірянню термодинамічних характеристик ряду біологічних асоціатів: уотсон-криківських, «неправильних» та інших пар основ, купкові дімери основ, комплекси «амінокислота–основа», гідрати основ та їх пар. Зроблено аналіз цих даних в поєднанні з теорією. Показано перспективи MI-MC у вивченні продуктів гідролізу (розпаду) лікувальних препаратів у фізіологічному розчині та аддуктів їх взаємодії з ДНК. The results which demonstrate the possibilities of the soft-ionization mass-spectrometry (SI-MS) for molecular-biological studies in two direction–thermodynamic and analytical-structural are given. The method of the temperature-dependent field ionization mass-spectrometry which was the first time used for measuring of the thermodynamic characteristics of the number biological associates: Watson-Crick, mispairing and other base pairs, «aminoacid-base» complexes, hydrates of the bases and their pairs are described. The possibilities of the SI-MS for study of the hydrolysis the antitumour drugs in the physiological solutions and adducts of their interactions with DNA are shown. Автор выражае т искреннюю признательность М. Ю. Беляевой и В. Д. Чиванову за участие при подготовке рукописи. 1991 Article Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях / Л.Ф. Суходуб // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 6. — С. 15-32. — Бібліогр.: 55 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0002FC https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155900 577.3+543.51+612 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Суходуб, Л.Ф. Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях Биополимеры и клетка
description	В обзоре собраны данные, демонстрирующие возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии (МИ-МС) в молекулярно-биологических исследования по двум направлениям: термодинамическом и структурно-аналитическом. Дано описание методики температурно-зависимой полевой масс-спектрометрии, с помощью которой впервые были поставлены эксперименты по измерению термодинамических характеристик ряда биологических ассоциатов: уотсон-криковские, «неправильные» и др. пары оснований, стопочные димеры оснований, комплексы «аминокислота–основание», гидраты оснований и их пар. Сделан анализ этих данных в сочетании с теорией. Показаны перспективы МИ-МС в изучении продуктов гидролиза (распада) лекарственных препаратов в физиологическом растворе и аддуктов их взаимодействия с ДНК.
format	Article
author	Суходуб, Л.Ф.
author_facet	Суходуб, Л.Ф.
author_sort	Суходуб, Л.Ф.
title	Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях
title_short	Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях
title_full	Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях
title_fullStr	Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях
title_full_unstemmed	Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях
title_sort	возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1991
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155900
citation_txt	Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях / Л.Ф. Суходуб // Биополимеры и клетка. — 1991. — Т. 7, № 6. — С. 15-32. — Бібліогр.: 55 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT suhodublf vozmožnostimâgkoionizacionnojmassspektrometriivmolekulârnobiologičeskihissledovaniâh AT suhodublf možlivostímâkoíonízacíjnoímasspektrometrííumolekulârnobíologíčnihdoslídžennâh AT suhodublf thepossibilitiesofthesoftionizationmassspectrometryinthemolecularbiologicalstudies
first_indexed	2025-11-26T17:54:01Z
last_indexed	2025-11-26T17:54:01Z
_version_	1849876437321908224
fulltext	У Д К 577.3+543.51+612 Л. Φ. Суходуб ВОЗМОЖНОСТИ МЯГКОИОНИЗАЦИОННОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ В МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ В обзоре собраны данные, демонстрирующие возможности мягкоионизационной масс- спектрометрии (МИ-MC) в молекулярно-биологических исследования по двум направ- лениям: термодинамическом и структурно-аналитическом. Дано описание методики температурно-зависимой полевой масс-спектрометрии, с помощью которой впервые были поставлены эксперименты по измерению термодина- мических характеристик ряда биологических ассоциатов: уотсон-криковские, «непра- вильные» и др. пары оснований, стопочные димеры оснований, комплексы «аминокис- лота—основание», гидраты оснований и их пар. Сделан анализ этих данных в сочетании с теорией. Показаны перспективы МИ-МС в изучении продуктов гидролиза (распада) лекарственных препаратов в физиологическом растворе и аддуктов их взаимодействия с ДНК. Введение. Масс-спектрометрический метод исследования вещества, от- крытый в начале века Астоном, в настоящее время относится к разряду наиболее широко используемых аналитических методик. Его практи- ческое применение началось с физики и химии с момента появления в 50-е годы первых промышленных образцов. Дальнейшее развитие метода позволило перейти к изучению медико-биологических и эколо- гических объектов. В итоге в наши дни масс-спектрометрия (MC) ста- новится неотъемлемым инструментальным методом как научно-произ- водственных, так и академических лабораторий различного профиля. Подтверждением этому служат, например, данные о том, что в США на 1987 г. около 5000 ученых используют MC в качестве основного исследовательского инструмента и примерно 1500 из них принимают участие в ежегодных конференциях по MC и родственным направле- ниям, организуемых американским обществом по MC [1]. Методы мягкой ионизации в масс-спектрометрии. Разработка и внедрение мягкоионизационных (МИ) методик в MC вызвали настоя- щий взрыв аналитико-молекулярных исследований в биологических науках. Это обусловлено, прежде всего, возможностью проведения ана- лиза ранее недоступных, труднолетучих, высокополярных и/или термо- Ф Л. Ф. СУХОДУБ, 1991 ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 6 2 — 1-610 15 лабильных молекул органического и биоорганического происхождения в диапазоне молекулярных масс до 20 O1OO и выше. Другой немаловаж- ной причиной наблюдаемого процесса является внедрение методов компьютерной обработки МС-ИНформацИИ И представление ее в удоб- ной для пользователя аналитической форме. Особенно эффективно использование МИ-МС применительно к медико-биологическим и фар- макологическим смесям в сочетании с различными видами хроматогра- фии. Ниже приведена краткая характеристика некоторых МИ-методов, Рис. 1. Диаграмма потенциальной энергии электрона в атоме: а — в свободном простран- стве (Z7=O); б — Р Ф 0 ; в — вблизи металлической поверхности развиваемых и используемых в лаборатории, руководимой автором, а т а к ж е даны примеры их применения в молекулярно-биологических и биофизических исследованиях. П о л е в а я и о н и з а ц и я ( П И ) и п о л е в а я д е с о р б ц и я ( П Д ) . Начало МС-ПИ было положено Мюллером и продолжено Беки и его учениками [2]. Параллельно в это же время с акцентом на тео- рию метода проводились работы киевской группой из Института физической химии АН УССР [3]. В основе метода П И лежит явление ионизации молекул в сильном (F~ IO8 В/см) электрическом поле по механизму туннельного эффекта. В отсутствие поля (F=O) валентный электрон молекулярной орбитали находится в потенциальной яме глу- биной, равной энергии ионизации молекулы (Eli). При наложении электрического поля потенциальная яма деформируется, что приводит к возникновению барьера конечной ширины (рис. 1). Вблизи металли- ческой поверхности эмиттера происходит дополнительная деформация барьера за счет действия сил изображения, благодаря чему вероятность туннелирования электрона из молекулы в металл становится еще выше. Характерной особенностью П И является наличие критического расстояния ионизации (хкр) (см. рис. 1), оценка которого может быть произведена по приближенной формуле (2): Д л я биологических молекул £ „ ~ 1 0 эВ, поэтому при —̂' 108 В/см, Ф = 5 эВ, параметр хКр = 0,5 нм. Время ионизации молекулы ти обычно оценивается по формуле [2]: Разновидностью П И является методика ПД, для которой характерна конденсированная форма исследуемого вещества, нанесенного непосред- ственно на эмиттер (рис. 2) . а д б 16 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 6 2 — 1-610 16 Б о м б а р д и р о в к а б ы с т р ы м и и о н а м и (Б Б И) и а т о - м а м и (Б Б А). В данных методах ионизация молекул осуществляет- ся в результате бомбардировки поверхности образца пучком ускорен- ных (несколько кэВ) ионов или атомов (аргон, ксенон) (см. рис. 2) . Предполагается [4], что в этих процессах первичная частица вызывает каскад соударений в небольшом объеме исследуемого вещества. Часть энергии первичных частиц расходуется на распыление поверхностных частиц в нейтральном и ион- ном состояниях. При бом- бардировке образца ней- тральными атомами веще- ство находится в жидкой матрице (глицерине), бла- годаря чему в поверхност- ном слое поддерживается определенный уровень кон- центрации исследуемых мо- лекул за счет их диффузии ІІЗ объема. Это дает воз- можность наблюдать ста- бильный масс-спектр в тече- ние длительного времени. П л а з м е н н а я д е - с о р б ц и я о с к о л к а м и д е л е н и я 2 5 2C i. В основе данной методики лежит вза- имодействие высокоэнерге- тичных осколков деления '2 5 2Cf с исследуемым веще- ством. В результате за очень Рис. 2. Мягкоионизационные мето- ды MC короткое ( ~ 1 0 - 1 2 с) время происходит сильный разогрев микрообъема образца до 20 ООО К, что позволяет регистрировать в масс-спектрах ионы, соответствующие высокомолекулярным полимерным структурам, например инсулину, без значительной фрагментации. Результаты и обсуждение. М е ж м о л е к у л я ρ н ы е в з а и м о- д е й с т в и я . Взаимодействие молекул осуществляется с образованием как ковалентных связей, так и межмолекулярных комплексов (ассоциа- TOB). В последнем случае имеют дело с невалентным (физическим, вандерваальсовым) взаимодействием, природа которого заключается в электромагнитных свойствах молекул. Это слабые взаимодействия, которые чрезвычайно важны для биологических систем. Достаточно отметить, что биологическое функционирование важнейших макромо- лекул клетки (ДНК, РНК, белки) зависит как от внутримолекулярных взаимодействий, так и от взаимодействий макромолекул с ион-гидрат- ным окружением. Суммарная энергия межмолекулярного взаимодей- ствия определяется балансом четырех составляющих сил (электроста- тической, поляризационной, дисперсионной и силой обменного отталки- вания) , благодаря которым между взаимодействующими молекулами устанавливается равновесное расстояние. Анализ состояния теории межмолекулярных взаимодействий пока- зывает, что квантовая химия способна так же успешно описывать ван- дерваальсовы комплексы, включая биологические, как и кова- лентные [5]. Экспериментальное изучение межмолекулярных взаимодействий представляет огромную трудность. Д л я малых молекул, подобных мо- ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 6 2 — 1-610 17 лекуле H 2 O, обычно используют методику упругого рассеяния молеку- л я р н ы х пучков, радио- и микроволновую спектроскопию [5]. М е ж - молекулярные биологические комплексы типа уотсон-криковских пар Д Н К наблюдали в неполярных растворителях с помощью таких тради- ционных методов, как ИК-ЯМР-, ПМР-спектроскопии [6—10]. Однако из-за влияния растворителя, которое в ряде случаев значительно, дан- ные о полученных энтальпиях (AHac) и константах ассоциации (Kac) образующихся комплексов следует рассматривать как полуколичествен- ныа оценки [8]. Экспериментальное взаимодействие молекул в вакууме стало воз- можным в результате разработки и апробации на ряде систем методики Испаритель 1 с беїдестбом А Рис. 3. Методика ТЗ-ПМС для изучения межмолекулярных взаимодействий в вакууме температурно-зависимой полевой MC ( Т З - П М С ) [9, 10]. Д а н н а я ме- тодика основана на M C с полевой ионизацией (рис. 3 ) . Необходимая напряженность электрического поля создается с помощью игольчатого вольфрамового или платинового эмиттера с радиусом вершины г, ~ ~ IO2—IO3 нм, на который подается потенциал до 5 кВ. Исследуемые молекулы, например основания Д Н К , поступают в зону ионизации (вершина эмиттера) из двух стеклянных испарителей. Б л а г о д а р я эффекту полевой конденсации [11, 12] плотность исследуемых молекул вблизи вершины эмиттера на несколько порядков выше таковой в ис- парителе. В результате становятся заметными столкновения молекул друг с другом, приводящие к образованию межмолекулярных комплек- сов. Часть исходных молекул и ассоциатов ионизируется и мгновенно выталкивается из зоны столкновений. Меняя температуру в зоне столк- новений молекул, МОЖНО измерить термодинамические величины (Кас, АН ас), характеризующие энергетику наблюдаемых в вакууме ассоциа- тов в условиях термодинамического равновесия [11, 12]. Внутримолекулярные взаимодействия в ДНК Р а с с м а т р и в а я внут- римолекулярные взаимодействия в Д Н К — м а т е р и а л ь н о м носителе генетической информации в живых организмах,— выделяют компла- нарные (горизонтальные) и стопочные (вертикальные) взаимодействия 18 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. №6 2* 18 между нуклеотидными основаниями. Вопрос об относительном вкладе этих двух типов взаимодействий в суммарный баланс сил Д Н К явля- ется принципиальным. А. Горизонтальные взаимодействия. Исследования проводили на специальных механических смесях — 9 -метиладенин+ 1-метилтимин (Hi9A-Pm1T), 9 -метилгуанин+1-метилцитозин (m 9 G- \| -m 1 C), включающих метилпроизводные оснований, при взаимодействии которых образуются ассоциаты (димеры), в том числе в точности соответствующие уотсон- криковским парам Д Н К (см. рис. 3) . Поскольку интенсивность пика в масс-спектре пропорциональна концентрации соответствующей ком- поненты в зоне реакции, то из соотношения интенсивностей димерных пиков к мономерным легко получить величину Kac, температурный ход которой характеризует энтальпию реакции [11, 12]. В табл. 1 собраны величины измеренных AHaс. Т а б л и ц а 1 Энергетика диме ров оснований нуклеиновых кислот (кДж/моль) —Е(теория) —Е(теория) Димеры —АН (опыт) [5] [15] Димеры —АН (опыт) [5] [15] Компланарные In 9 A - IT i 1 U 6 0 , 7 — 4 9 , 8 Hi9A-ITi1T 54,4 77 9 I T i 9 G - m i C 8 7 , 9 1 2 6 , 5 Ir i iU-ITi 1 U 3 9 7 — Irr1T-ITi1T 378 6 7 , 1 ITi1C-ITi1C 7 3 , 3 9 9 , 7 ITi9G-ITi1U 5 9 , 4 — r n 9 A · ITi1C 5 6 , 5 — Ir i^2 t 9G-In1C 68,6 — π ι 2 ' 2 ^ t 6 G - I T i 1 C 5 7 , 3 — 106,7 40,6 73,2 56,0 57,8 57,8 Стопочные и / и 23,0 — 32,2 r n 1 , 3 U / 1 , 3 U 36,4 Т /Т 30,1 — 29,7 т і , з т / т і , з т 43,5 С/С 32,2 — 51,1 т М , 4 С / т Ы , 4 с 52,2 51,1 А/А 18,0 — 32,2 Т 6 , 6 , 9 Д / Т 6 , 6 , 9 Д 38,1 — — Coff/Coff 49,8 — — Б. Вертикальные взаимодействия. В табл. 1 приведены т а к ж е величины «вакуумных» энтальпий стопочных димеров оснований и их метилпроизводных, найденные с помощью Т З - П М С [11, 12]. Анализ полученных данных показывает, что уотсон-криковские пары образуются с заметно большим энергетическим выигрышем по сравнению с димерами соответствующих гомоассоциатов. Вакуумные энтальпии находятся в хорошем количественном согласии с современ- ными теоретическими расчетами [5, 15]. Из сравнения горизонтальных и вертикальных взаимодействий в модельных системах можно предпо- ложить, что последние вносят меньший вклад в суммарный баланс сил Д Н К . В табл. 1 приведены т а к ж е измеренные энтальпии д л я так назы- ваемых «неправильных» пар (m 9 G-m 1 U, Hi9A-Hi1C, Hi^2 j 9I6G-Iii1C), ко- торые сравнительно редко встречаются в структуре нуклеиновых кислот, однако, тем не менее, имеют важное функциональное значение [16]. Так, подобное спаривание оснований может встречаться при встраивании в двойную спираль Д Н К модифицированных оснований, например, 6-тиогуанина, который используется в химиотерапии. По- строенные на основе атомного моделирования структуры «неправиль- ных» пар показывают, что в случае пар In9G^m1U, IrL9A-ITi1C спаривание осуществляется с помощью двух водородных связей между основа- ниями в обычной таутомерной форме, а в случае пар, содержащих производные m 9 G и Hi1C,— с помощью двух водородных связей, соеди- няющих молекулу Iii1C с енольным таутомером m 9 G [16]. Предположе- ние о том, что основание G в реакционной зоне находится в двух таутомерных формах, основано на результатах ИК-спектроскопических исследований матрично изолированных метилпроизводных оснований: In1U, ITi1C, m 9A, m 9 G [17]. Из этих данных следует, что д л я всех оснований, кроме m 9 G в матричном окружении, содержатся только т а к ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 6 2 19 называемые «биологические» таутомерные формы. Д л я m9G в инерт- ной (Ar или N2) газовой матрице обычный «оксо» таутомер находится приблизительно в соотношении 1 : 1 с редким «гидрокси» таутомером [17]. Следует отметить удовлетворительное согласие вакуумных энталь- пий с предсказаниями теории [18]. В заключение отметим, что wobble- пара G - U h пара A-C сравнимы по стабильности с уотсон-криковской парой A-U. Замена кислорода на атом серы в молекуле nVJG заметно ( ~ 1 7 %) понижает стабильность пары G-C, что может вызвать локаль- ное уменьшение внутримолекулярных взаимодействий в ДНК, посколь- ку при подобном замещении стопочные взаимодействия, вероятнее всего, останутся неизменными. В табл. 2 содержатся предварительные результаты, полученные методом T3-IIMC, касающиеся энергетики образования комплексов в системе «аминокислота—основание» [19]. В экспериментах исследовали механические смеси, состоящие из ме- тил производных оснований (ITi1U и Hiu3T) и акриламида, моделирующего узнающие группы атомов аминокислот глутамина и аспарагина. Найденные величины Δ # количественно хорошо согласуются с результатами теории (см. табл. 2). Они могут быть исполь- зованы для оценки вероятности узна- вания боковыми группами аминокислот глутамина и аспарагина атомных групп тимина и урадила в случае одно- и двутяжевого состояния HK [19]. Гидратация нуклеотидных оснований и уотсои-криковских пар. Из- вестно, что гидратация биополимеров играет существенную роль в балансе сил, определяющих их функциональные конформации [14]. Достаточно отметить, что изменение содержания воды в полинуклео- тидных нитях является причиной конформационного перехода в двойной спирали [27]. Однако до недавнего времени наши знания о гидрата- ционных свойствах структурных составляющих биополимеров, в частно- сти азотистых оснований, ограничивались квантовохимическими и атом- атомными расчетами. Методика ТЗ-ПМС оказалась весьма информа- тивной при изучении энергетики гидратации как изолированных молекул, так и их ассоциатов [14, 25]. В экспериментах по гидратации молекулы воды и метилпроизводные оснований поступали к игольча- тому эмиттеру из двух испарителей, имеющих разные температуры, β специальных опытах было установлено, что механизм образования гидратных ассоциатов имеет ступенчатый характер Т а б л и ц а 2 Энтальпии образования (ΔΗ) и энергии (E) комплексов с акриламидом (A) в вакууме (кДж I моль) Комплекс —АН —Е т 1 U-A m1 ' 3 T - A 40 ,6+4 ,2 28 ,5±2 ,5 42,2 27,6 ' 20 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА; 1991. Т. 7. № 6 (В-молекулы основания). Из температурных зависимостей гидратных масс-спектров в координатах In K^c Hz°—1/Т вычисляли величины энтальпий образования гидратных комплексов [14]. Анализ полученных данных и результатов теории [20—22] привел к построению структурно-энергетических схем гидратации (табл. 3), характеризующих взаимодействие ближайших молекул воды с полярными атомными группами оснований. Из приве- денных схем следует, что урацил, тимин имеют два сильных центра связывания (присоединение третьей молекулы воды к дигидрату B - ( H 2 O ) - ( H 2 O ) происходит с заметно меньшим энергетическим выигрышем (см. табл. 3) ) , цитозин и аденин — по три центра, а гуанин характеризуется максимальной энтальпией моногидратации (см. табл .3 ) . Вопрос о количестве центров сильного связывания гуанина эксперимен- тально до конца не выяснен. Тем не менее, уже из имеющихся данных следует вывод о том, что взаимодействие молекул воды с гидрофиль- ными атомами оснований G h C заметно выше по сравнению с анало- Т а б л и ц а З гичными взаимодействиями в случае А и T ( U ) , что согласуется с тео- рией [20—22, 27] . Наблюдение гидратных комплексов оснований с большим коли- чеством молекул воды ( п н 2 о > 3 ) стало возможным благодаря разра- ботке низкотемпературного полевого источника ионов [23]. В резуль- тате были зарегистрированы гидратные ионы, соответствующие класте- рам, включающим до десяти молекул воды вокруг оснований [24]. Из анализа зависимостей «интенсивность гидратного иона — число молекул воды» следует, что среди пиримидиновых оснований гидратная оболоч- ка цитозина из 10 молекул воды характеризуется повышенной стабиль- ностью [14, 24]. Разработка масс-спектрометрической низкотемпера- турной методики позволила подойти к исследованию гидратации более сложных биологических объектов в вакууме, например, комплементар- ной пары A - U [25]. С понижением температуры эмиттера до 170 К в полевом масс-спектре механической смеси ( m 9 A + m 1 U 4 - H 2 0 ) устой- чиво регистрируется ряд пиков, соответствующих кластерам ш 9 А Х X m 1 U ( H 2 O ) n , где Yi= 1—7 [25]. Отличительной особенностью низко- температурных гидратных полевых масс-спектров является характерное 21 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 6 2 — 1-610 16 распределение интенсивностей ионов-ассоциатов с различными η [24]. В случае полигидратов Tn 1 U(H 2 O) n , ITi9A(H2O)n и O i 9 A^m 1 U(N 2 O) n (наблюдаемых в одном и том же эксперименте) в распределениях ин- тенсивностей наблюдаются максимумы при п=2,4(In1U), 2 , 5 ( т 9 А ) и 4 ( m 9 A - m 1 U ) (рис. 4) . По-видимому, наблюдаемая особенность в случае In1U для п~-= 4 связана с возникновением кольцевой гидратной структу- ры, стабилизированной цепочкой водородных связей с участием двух СО-групп Iii1U. Подобная структура водного мостика может образо- ваться вокруг молекулы ш 9 А с участием 4 молекул воды и атомов азота N ( 3 ) , N ( 6 ) . Максимум при п = 5 свидетельствует о том, что Рис. 4. Распределение интенсивностей пиков гидратного масс-спектра, соответствующих кластерам оснований U ( H 2 O ) n (a), A(H 2 O) n (б), A - U ( H 2 O ) n (в) в зависимости от числа молекул воды в кластере. Температура эмиттера 7Э==70К водный мостик образован 2, 3, 4 и 5-й молекулами воды, тогда как пер- вая молекула воды, вероятнее всего, локализована между аминогруп- пой NH 2 и атомом N(7) [20, 22] . Д л я пары I T T 9 A - I T I 1 U подобная гидрат- ная структура наблюдается при п = 4, причем в ее образовании, по-ви- димому, принимают участие атомы обоих оснований, что отражается на усилении ее стабильности [26]. В связи с полученными данными представляют большой интерес результаты недавней работы [27], в которой методом Монте-Карло моделировали гидратацию гидрофильных центров оснований и комплементарных пар в кластере из 25 молекул воды. Авторы [27] показали, что для гидратных оболочек пар A - U и G - C характерно образование мостиковых связей как между отдель- ными молекулами воды и гидрофильными атомами оснований, так и между молекулами воды, образующими двух- и трехчленные водные мостики, связывающие полярные атомы двух молекул оснований. Отме- чается, что подобные мостиковые структуры усиливают стабильность пар оснований в двухспиральных полинуклеотидах [27]. В заключение отметим, что ценность приведенных данных, полу- ченных с помощью нового экспериментального подхода, значительно возрастает при их дополнении современными теоретическими расчета- ми, подобными проводимым в [27, 28], с учетом особенностей МС-эксперимента. С т а б и л ь н о с т ь и в з а и м о д е й с т в и е л е к а р с т в е н н ы х п р е п а р а т о в с Д Н К и е е к о м п о н е н т а м и . Фопурин. При полевой ионизации молекулярный ион M + приобретает небольшую из- быточную энергию. Это означает, что последующая фрагментация M + , вероятнее всего, будет связана с разрывом наиболее лабильных 22 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. №6 2* 22 межатомных связей. В этом случае по виду полевого масс-спектра можно предсказывать пути превращения материнских молекул в ходе участия их в биохимических реакциях. Это предположение было апро- бировано при изучении противоопухолевого алкилирующего препара- т а — фопурина [29]. Масс-спектры получали с помощью магнитного прибора модели МИ-1201, снабженного лабораторным источником ионов с игольчатым вольфрамовым эмиттером. Анализ спектров показал, что пик с m/z 192 структурно полностью соответствует пуриновой части фопурина. Пики с m/z 206, 218 возникли при разрыве N—Р-связи с последующим присоединением атомом N(6) Рис. 5. Предполагаемая схема фрагментации фопурина в электрическом поле (F) с об- разованием ионов 192+, 206+, 218+ групп CH3 , C 2 H 3 соответственно. Этим реакциям, очевидно, предше- ствует раскрытие одного из этилениминных циклов N<1 вследствие дополнительной поляризации С = 0-группы в электрическом поле (рис. 5). Сопоставляя результаты опытов по фрагментации фопурина с тако- выми, проведенными на клеточных структурах и выявившими один из метаболитов со структурой 2-диметиламино-6-амино-7-метилпурина [30], можно заметить, что обнаруженный в клетке метаболит в точ- ности соответствует наиболее интенсивному пику полевого масс-спектра с m/z 192 [29]. Приведенные данные наталкивают на мысль о направ- ленном поиске метаболитов лекарственных препаратов in vivo, пред- сказываемых полевой фрагментацией их молекулярных ионов. Спра- ведливость этого предположения, мы надеемся, подтвердится в допол- нительных исследованиях ряда родственных препаратов с этиленимин- ными группами, которые проводятся в настоящее время в нашей лаборатории. Арил- и ацилдиэтилентриамиды фосфорной кислоты. Возможности М С - П Д и электронного удара (ЭУ) в идентификации и структурных исследованиях противоопухолевых алкилирующих препаратов были продемонстрированы на примере арил- и ацилдиэтилентриамидов фос- форной кислоты [31, 32]. А. Замещенные производные М-фенил-Гчт/, N' , Ν", N' '-дизтилен- триамида фосфорной кислоты. Масс-спектры ряда лекарственных со- единений (схема 1) получали с помощью двух режимов ионизации: П Д и ЭУ (прибор «VARIAN МАТ-711»). Анализ этих данных показал: масс-спектры ЭУ 23 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 6 2 — 1-610 16 характеризуются значительным распадом молекулярных ионо-в M+; масс-спектры, полученные в режиме ПД, содержат, как правило, толь- ко пики M+; для всех соединений, имеющих заместители в пара-поло- жении, схема фрагментации качественно одна и та же: максимальную интенсивность имеют ионы M+, за исключением соединения с R = IU-Brt для которого максимальным пиком в масс-спектре является ион ( Μ — N < ) + Перечисленные особенности указывают на относительно высокую устойчивость данных соединений к ЭУ, что согласуется с их незначи- тельным гидролизом в водных растворах при рН 8 [33]. Следует отметить, что МС-результаты по фрагментации коррели- руют с рентгеноструктурными исследованиями фенидета, согласно ко- торым длина связи N — P меньше таковой между атомом фосфора и этилениминными атомами азота N / и N" [34]. Согласно квантовохимическим расчетам подобных молекул [35], на атоме азота, связанном с фосфором, сосредоточена повышенная элект- ронная плотность. Один из возможных механизмов ионизации может быть связан с уходом электрона с атома азота с последующим разры- вом P—N-связи. При этом положительный заряд должен локализо- ваться преимущественно на атоме N. В результате интенсивность фрагментных ионов (см. схему 1) (2) по сравнению с комплементар- ными ионами (с3) должна быть выше, что и наблюдается в экс- перименте [31]. Б. К-бензол-№, N' , N", К"-диэтилентриамиды фосфорной кислоты. Масс-спектры П Д и ЭУ ряда препаратов (схема 2), полученные с помощью прибора «VARIAN МАТ-711», имеют следующие характеристики: низкие интенсивности молекулярных ионов M+; каче- ственное совпадение для большинства соединений основных путей фрагментации; различие в интенсивностях фрагментных ионов в зави- симости от типа заместителей в бензольном кольце; зависимость ну-, тей фрагментации от положения заместителя в кольце. Основными направлениями фрагментации исследуемых соединений являются: а) отщепление этилениминных циклов с образованием ионов (М-42)+, (М-84-Н)+, (N<])+; б) разрыв С—N-связи с образованием фрагмента с m/z 174 и ионов [RC 6 H 4 CO]+; в) разрыв RC 6 H i —С-связи с образова- нием ионов с m/z 174 и [RC 6 H 4 ] + ; г) появление малоинтенсивного иона [O = P = (N<] )2] + с m/z 131; д) элиминирование заместителя в орто-положении (орто-эффект). Сравнение обсуждаемых данных с результатами для арилдиэтилен- триамидов показывает, что последние характеризуются повышенной устойчивостью к ЭУ по сравнению с ацилдиэтилентриамидами. Отметим, что во всех П Д масс-спектрах присутствуют интенсивные молекулярные ионы ( 1 0 0 % ) , причем для пара- и тибта-изомеров фраг- ментация практически отсутствует, а для орто-изомера с йодом ( / ) , так же как и в случае ЭУ, характерен отрыв заместителя с образова- нием иона ( M - I ) + ( 1 6 % ) [32]. В случае дийодзамещенных соединений обнаружено, что пути фрагментации молекулы с R = 2, 5-І (применяющийся в клинике пре- парат) существенно отличаются от молекулы с R = 3, 5-І ' максимальную интенсивность в масс-спектре ЭУ молекулы с R= 2, 5-І имеет ион с m/z 376 (Μ—I)+, тогда как в сравниваемом изомере с R = 3, 5-І моле- кулярный ион является недетектируемым, а максимальную интенсив- ность имеет ион с m/z 355, образовавшийся при разрыве С—N-связи. Д л я данной группы соединений, легко фрагментируемых при вза- 24 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 6 2 — 1-610 16 имодействии с ионизирующими электронами, метод П Д весьма полезен для их идентификации: в случае 3, 5- и 2, 5-дийодбензотэфа в масс- спектрах надежно регистрируются молекулярные и квазимолекулярные ионы M+ и M H + соответственно. Триэтилентиофосфамид (тиоТЭФ). Противоопухолевый препарат тиоТЭФ в клинической онкологии используется около 30 лет. Однако его стабильность и механизмы превращения в водно-солевых растворах до недавнего времени оставались практически неизученными. Литера- турные данные, касающиеся данного вопроса, немногочисленны и про- тиворечивы. В связи с этим нами выполнена серия работ [36—39] no-изучению стабильности тиоТЭФ ^ — ^ <? / f n^. ί в физиологических растворах, ко- торую можно рассматривать как первый шаг в последовательном рассмотрении проблемы механиз- мов взаимодействия данного пре- парата с Д Н К и ее компонентами (см. ниже). Основным инструмен- тальным методом в отмеченной серии работ является MC с поле- вой ионизацией. Гидролиз тиоТЭФ в водно-со- левых растворах осуществляли при 37 °С и различных значениях рН. Разделение продуктов гидро- лиза проводили с помощью тон- кослойной хроматографии (TCX) [37—39]. Сорбенты, снятые с пластин, экстрагировали метано- лом и после вакуумной сушки получали образцы, пригодные для МС-анализа в режиме ПИ. Со- д е р ж а н и е э т и л е н и м и н н ы х г р у п п Рис. 6. Схема гидролиза тиоТЭФ в физиоло- ( Э И Г ) в р а с т в о р е о п р е д е л я л и гическом растворе методом потенциометрического титрования, основанного на реакции взаимодействия ЭИГ с тиосуль- фатом натрия [36]. Проведенные исследования показали, что а) стабильность тиоТЭФ в водных растворах с концентрацией, обычно используемой на практике ( ~ 1 мг/мл), сравнительно высока: в течение 72 ч инкубирования титр ЭИГ уменьшился всего лишь на 4 % (этот результат противоречит выводу авторов [40] о быстром разложении препарата при нейтраль- ном значении рН; возможно, это связано с тем, что в [40] стабильность тиоТЭФ изучали в 0,1 M фосфатном буфере (рН 7,4), который взаимо- действует с тиоТЭФ); б) существенное снижение стабильности тиоТЭФ при р Н < 7 . Так, при рН 4,5 титр ЭИГ за время 4 ч инкубации умень- шился приблизительно на 5 0 % [37]. Аналогичный результат получен и группой Гутерриза [41], изучавшей гидролиз тиоТЭФ в моче и нат- рий-ацетатном буфере при 37 0C и рН 4,0. Гидролиз тиоТЭФ при р Н < 7 происходит с образованием ряда соединений, идентификация которых проведена с помощью TCX и МС-ПИ [37, 38]. Хроматограмма, полученная в результате кислотного гидролиза тиоТЭФ, содержит четыре пятна со следующими значениями Ri: 0,16 (Л), 0,36 (B)y 0,5 (С), 0,6 (D) [37, 38]. Аналогичный распад препарата происходит в моче при рН 4, о чем свидетельствуют соответствующие величины Rf: 0,15 (A)y 0,35 (B)y 0,52 (C)y 0,6 (D) [41]. Из масс-спектров найде- но, что пятно А содержит молекулы тиоТЭФ, пятно В — включает группу пиков с m/z 225, 227, соотношение ингенсивностей которых рав- но 3 : 1 . Это указывает на включение в данный продукт атома хлора. Д л я пятна С характерна группа пиков, среди которых основными являются пики с m/z 261, 263, из соотношения интенсивностей которых ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. .№ 6 25- следует, что в данном продукте содержатся два атома хлора [37, 38] . Кроме описанных продуктов, идентифицирован целый ряд других соединений, проявляющихся на начальных стадиях распада пре- парата (рис. 6). Продукты алкилирования. А. Взаимодействие тиоТЭФ с азотистыми основаниями. Исследуемая реакционная смесь тиоТЭФ+основание со- д е р ж а л а 0,01—0,5 M основание и 0,05—0,15 M лекарственный препарат. Время инкубации 3—5 сут при температуре 37 °С. Д л я МС-измерений водные растворы реакционных смесей и продукты, выделенные хрома- тографически, высушивали на роторном испарителе при 35 °С. Причем для съемок в режимах П И ББА-образец готовили с максимально воз- можным удалением влаги, тогда как для режима П Д использовали концентрированные растворы [42]. Вначале были проведены контроль- ные эксперименты, показавшие, что взаимодействия между реагентами в условиях МС-анализа не наблюдается [42]. При анализе смесей (без разделения) в масс-спектрах ПИ, ПД, Б Б А помимо пиков, соответствующих исходным компонентам, наблю- дался ряд новых пиков, которые можно было отнести к продуктам реакций алкилирования. Заметим, что для каждого метода ионизации подбирались оптимальные условия регистрации в масс-спектре того или иного продукта. Основные пики с массой m>M (M — масса основания) в масс- спектрах ПИ, П Д следующие [43] : в случае цитозина — (М + 26)+, (Λί+43)+ , (Λί+66)+, ( Μ + T ) + (Αί+2Τ)+, ( 2 Μ + Τ ) + (Τ — тиоТЭФ); в случае аденина— (Λί+43)+, (Λί+Τ)+; в случае гуанина— ( М + 4 3 ) + , (ΛΪ+Τ)+, ( М + 2 Т ) + . Д л я масс-спектров ББА характерны аналогичные ионы только в протонированной форме. Образование наблюдаемых продуктов происходит по следующему механизму [44, 45] (схема 3) 2 6 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № б Из приведенной схемы следует, что в водном растворе происходит раскрытие одного из этилениминных циклов тиоТЭФ с последующим его взаимодействием с нуклеофильным атомом основания. Это приводит к образованию комплекса I. При разрыве связи P—N образуется комплекс II. Таким образом, ионы ( М + Т ) + в ПД-спектре и (Λί + + T H ) + — в ББА-спектре в соответствии с предложенной схемой отве- чают комплексам I, для которых соотношение биомолекула: лекар- ственный препарат равно 1 : 1. Ионы ( М + 2 Т ) + , ( М + 2 Т Н ) + соответствуют комплексам, включаю- щим две молекулы тиоТЭФ на одну молекулу основания. Обнаружение соединений, которым соответствуют ионы ( 2 М + Т ) + свидетельствует о принципиальной возможности взаимодействия двух нуклеотидных оснований с тиоТЭФ. Отсюда следует предположение о возможности возникновения двунитчатых «сшивок» в Д Н К . Отметим, что в первых опытах с использованием ПИ были зарегистрированы только ионы со структурой комплекса II [46, 47]. Отсутствие в масс-спектрах П И ионов, отвечающих структуре I, обусловлено высокой лабильностью последних. Д л я доказательства того, что в масс-спектрах наблюдаются ноны, соответствующие продуктам, образовавшимся в реакционной смеси, а не в условиях МС-эксперимента, были поставлены опыты по выделению индивидуальных продуктов алкилирования с использованием TCX [42, 43]. Так, например, в случае реакционной смеси ( С + т и о Т Э Ф ) после хроматографирования выявляются четыре пятна, проявляющихся в парах йода [42]. Анализ MC- и УФ-спектроскопических данных по- казал, что пятна It 4 соответствуют исходным компонентам: С и тиоТЭФ. Масс-спектры пятна 2 не содержали каких-либо характери- стических пиков, тогда как в случае пятна 3 наблюдались интенсивные пики с m/z 300 (ПД) и 301, 258 (ББА) , отвечающие комплексу I. От- сутствие в масс-спектрах пятна 3 каких-либо фрагментных ионов, в частности ( Λ ί + 4 3 ) + , свидетельствует о том, что последний соответствует индивидуальному соединению, образующемуся в реакционной смеси. Кроме идентификации продуктов реакций алкилирования в системе «тиоТЭФ+основание», в [46] была предпринята попытка применить МС-ПИ для определения центров алкилирования на молекулах осно- ваний ДНК- Д л я этой цели использовали набор специально синтезиро- ванных метилпроизводных оснований (табл. 4) . О взаимодействии судили по интенсивности в масс-спектрах П И комплекса II. Из табл. 4 следует, что в случае С взаимодействие с тиоТЭФ, вероятнее всего, происходит по атому N ( 1 ) . Д л я тимина таким атомом является N(3 ) , аденина — N(9) . Заметим, что при этом не исключаются другие центры алкилирования, а именно: N ( I ) ( T ) , N(1) , N(6) (А), N(1 ) , 0 ( 6 ) , N ( 7 ) , (G) . Полученные данные о продуктах взаимодействия тиоТЭФ с осно- ваниями имеют самостоятельный интерес, так как свидетельствуют о возможности образования в клетках модифицированных оснований — предшественников синтеза Д Н К . Наличие подобных структур может быть одной из причин задержанного мутагенного эффекта [48, 49]. Б. Взаимодействие тиоТЭФ с нуклеотидами. Используя времяпро- летный масс-спектрометр с ионизацией осколками деления 2 5 2Cf, в последнее время нами проведены исследования по наблюдению высо- комолекулярных комплексов тиоТЭФ с нуклеотидами (дезоксигуано- зин-5-монофосфат (dGMP) и дезоксицитидин-5-монофосфат (dCMP), Из масс-спектра (рис. 7) следует, что в модельной системе образуется целый набор комплексов с включением до шести (!) молекул тиоТЭФ в случае dGMP: d G M P - T ( m / z 536); d G M P - ( T ) 2 (m/z 735); d G M P X X ( T ) 3 ( m / z 915); d G M P · (T) 4 ( m / z 1104); d G M P - ( T ) 5 ( m / z 1293); d G M P · (T) 6 ( m / z 1482). В случае нуклеотида dCMP получен лишь один комплекс d C M P - T (m/z 495). Присутствие в среде обоих нуклеотидов d G M P и dCMP показывает предпочтительность связывания тиоТЭФ с dGMP. В настоящее время проводятся исследования по изучению динамики накопления и устойчивости наблюдаемых комплексов, а так- же механизмов их образования. Т а б л и ц а 4 Интенсивности пиков ( M ' и (М-\-43)~^ в масс-спектрах ПИ метилпроизводных оснований после их инкубации с тиоТЭФ и некоторые центры алкилирования, найденные из этих данных M етил произ- M + (М+43) + ι Центры алкилирования M етил произ- водные m/z m/z Настоящая Литературные данные оснований m/z m/z I* I работа \|_42, 44] т 5 С 125 168 30 N d ) N(3) , N(4) т 1 ''1C 139 182 0 ITi1C 125 168 0 — — ITi4-1C 139 182 40 — — T 126 169 3 N43) N(1) , N(3) , 0 ( 4 ) г п 1 ! 140 183 1,5 — In1-3T 154 197 0 — — τη7Λ 149 192 10 N(9) N(9 ) , N(3) , N(7) , N(6) т 9 А 149 192 0 — — т 6 , 6 А 163 206 65 — — in ' " ' y G 193 236 30 N(7) N ( 7 ) , 0 ( 6 ) , N ( I ) * 1 — относительная концентрация продуктов, полученная как отношение интенсивно- стей соответствующих пиков к интенсивности пика Ai+. ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 6 2 — 1-610 27 В. Взаимодействие тиоТЭФ с Д Н К . В данном разделе продемон- стрированы возможности МИ-МС в идентификации продуктов взаимо- действия тиоТЭФ с Д Н К , выделение которых основано на явлении выщепления из Д Н К модифицированных пуринов при нагреве (депу- Массауа.е.м. Рис. 7. Масс-спектр инкубационной смеси dGMP с тиоТЭФ (T), полученный с помощью десорбционной ионизации осколками деления 252Cf (UycK,=—20 кВ, время накопления Гн = 3/105 стартов) ринизация) [50]. Продукты разделяли с помощью ТСХ, масс-спектры снимали в режиме Б Б А . Кроме того, проводили и УФ-спектрометриче- ские исследования разделенных продуктов. Реакцию тиоТЭФ с Д Н К осуществляли при молярном отношении 20 : 1 в течение 140 мин при 37 °С. Далее раствор упаривали и избыток тиоТЭФ экстрагировали смесью бензол—хлороформ. В результате разделения раствора выделены три фракции, основные характеристики которых приведены в табл. 5 [42]. С помощью масс-спектров Б Б А этих фракций показано, что фракции II соответствует комплекс (GH- + T H ) (m/z 341), а фракции III — ( А + Т Н ) ( m / z 325). Используя данные УФ-спектроскопии, результаты на модельных системах [51, 52J и литературные данные по алкилпроизводным G h A [53], установлено, что реакция алкилирования Д Н К тиоТЭФ происходит по N (7)G и N ( 3 ) А (схема 4). S T 2 0 ( C H 2 ) 2 N H P ^ 2 ® т ^ у Ν ^ j A * ' H2N^ N ^ Ν' ® (CH2)2NHP^ 28 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 6 2 — 1-610 16 Т а б л и ц а 5 Видглвпп'лз фракции взаимодействия ДНК с тиоТЭФ и их хроматографические, масс-спектрометрические и спектральные характеристики [42] Номер фракции Характеристика фракции I ! І і II I I I Объем, МЛ 82 34 55 mi ζ (MH)- — 342 325 Rj основного пятна на TCX в системах: а * — 0,52 0,20 б ** — 0,59 0,92 AirjllX (им) при ρ 11: 1,0 256 276 7,0 13 — 285 277 7,0 13 — 280 27G Ал·,η (им) при рН: 1,0 — 234 240 7,0 — 202 249 13 — 259 250 Выход продуктов, % — 8,3 3,4 Продукты Олпгодезоксирпбо- 7-МопотиоТЭФ- 3-МонотиоТЭФ-про- нуклеотиды производное изводное аденпна гуанина * н-бутанол — ацетон — вода ( 2 : 1 : 1 ) ; ** — изопронан — 25 %-ный водный раствор аммиака ( 3 : 2 ) . Таким образом, из вышеизложенного следует, что методика МИ-МС, в частности ББА, является вполне пригодной для детектирования продуктов взаимодействия Д Н К с тиоТЭФ, минуя стадию гидролиза и препаративного выделения индивидуальных продуктов. Выводы и перспективы. Цель настоящего обзора — попытке) про- демонстрировать эффективность использования МИ-МС в молекулярно- биологпчеекпх исследованиях по двум направлениям: термодинамическом и структурно-аналитическом. Подобное сочетание в литературе встре- чается впервые. Внедрение в практику молекулярно-биофизических исследований методики ТЗ-ПМС позволило впервые поставить эксперименты по изучению термодинамических характеристик биологических ассоциатов (уотсон-криковские, «неправильные» и др. пары, комплексы «амино- кислота—основание», гидраты оснований и их ассоциаты) в условиях вакуума. Помимо фундаментального значения этих данных для моле- кулярной биофизики, следует отметить их эффективность для теории, поскольку с их появлением стало возможным проведение корректного сравнения теоретических данных с опытными, измеренными в адекват- ных условиях. Однако, несмотря на уникальность МС-данных о стабильности биологических ассоциатов, их перенос на реальные биообъекты следует производить с осторожностью, учитывая, прежде всего, влияние ион- гидратного окружения исследуемого ассоциата на его стабильность. Модификация предложенной методики, а именно: создание низко- температурного полевого источника ионов открыла дополнительные возможности в исследовании межмолекулярной ассоциации в условиях, приближенных к биологическим. Нет сомнения в том, что дальнейшее развитие ТЗ-ПМС может быть исключительно полезным в выявлении роли межмолекулярных взаимодействий (на модельном уровне) в таких биосистемах, как гормон—рецептор, нейромедиатор—рецептор, лекар- ственное вещество—рецептор, антиген—антитело и др. Подводя краткий итог структурно-аналитическому направлению, затронутому в обзоре, отметим следующее. Весьма перспективными выглядят возможности МИ-ПС в идентификации продуктов распада. 29 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. № 6 2 — 1-610 16 включая следовые уровни, лекарственных препаратов и аддуктов их реакций с Д Н К . Сочетание этих данных с результатами, полученными традиционными методами [54, 55], приведет к более глубокому пони- манию физико-химических механизмов процесса алкилирования. Заслуживают также внимания результаты по фрагментации лекар- ственных препаратов в условиях действия сильного электрического поля и связь этих наблюдений с опытами по выявлению метаболитов на клеточных структурах. Вполне возможно, что на этом пути удастся прояснить вопрос о влиянии (по крайней мере для определенной группы препаратов) мембранного потенциала на гидролиз проникающего в клетку лекарственного препарата. Автор выражает искреннюю признательность М. Ю. Беляевой и В. Д . Чиванову за участие при подготовке рукописи. Р е з ю м е В огляді зібрано дані, що демонструють можливості м'якоіонізаційної мас-спектромет- рії (MI-MC) в молекулярно-біологічних дослідженнях у двох напрямках: термодина- мічному та структурно-аналітичному. Описано методику температурно-залежної мас-спектрометрії поля, за допомогою якої вперше поставлено експерименти по вимірянню термодинамічних характеристик ряду біологічних асоціатів: уотсон-криківських, «неправильних» та інших пар основ, купкові дімери основ, комплекси «амінокислота—основа», гідрати основ та їх пар. Зроблено аналіз цих даних в поєднанні з теорією. Показано перспективи MI-MC у вивченні продуктів гідролізу (розпаду) ліку- вальних препаратів у фізіологічному розчині та аддуктів їх взаємодії з ДНК. S u m m а г у The results which demonstrate the possibilities of the soft-ionization mass-spectrometry (SI-MS) for molecular-biological studies in two direction—thermodynamic and analyti- cal-structural are given. The method of the temperature-dependent field ionization mass-spectrometry which was the first time used for measuring of the thermodynamic characteristics of the number biological associates: Watson-Crick, mispairing and other base pairs, «aminoacid-base» complexes, hydrates of the bases and their pairs are described. The possibilities of the SI-MS for study of the hydrolysis the antitumour drugs in the physiological solutions and adducts of their interactions with DNA are shown. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Cooks R. G., Hand 0. W. Tandem mass spectrometry at low kinetic e n e r g y / / N u c l . Instruments Meth. in Phys. Res.— 1987.— B29.— P. 427—436. 2. Beckey H. D. Principles of field desorption mass spectrometry.— New York: Perga- mon press, 1978.— 348 p. 3. Физические основы полевой масс-спектрометрии / Э. Η. Король, В. В. Лобанов, В. А. Назаренко, В. А. Покровский.— Киев : Наук, думка, 1987.— 196 с. 4 .Benninghove t i A. Gaede-Langmuir lecture: static SIMS applications — form silicon single crystal oxidation to DNA s e q u e n c i n g / / J . Vac. Sci. Technol.— 1985.— A3, N 3 .—P. 451—460. 5. Хобза П., Заградник P. Межмолекулярные комплексы : Роль вандерваальсовых систем в физической химии и биодисциплинах.— М . : Мир, 1989.— 375 с. 6. Kyogoky J., Lord R. С., Rich A. An infrared study of the hydrogen-bonding specifi- city of hypoxantine and other nucleic acid derivatives / / Biochim. et biophys. acta.— 1 9 6 9 . - 179, N 1.—P. 10—17. 7. Chen M. C., Lord R. C. Re-investigation of specific hydrogen-bonding of certain ade- nine and uracil derivatives by infrared spec t roscopy/ / Ib id .— 1974.— 340, N 1.— P. 90—94. 8. Petersen S. B., Led J. J. Watson-Crick base pairing between guanosine and cytidine studied by 13C-nuclear magnetic resonance spec t ro scopy / / J . Amer. Chem. Soc.— 1981,— 103, N 18,—P. 5308—5313. 9. Detection of guanine-adenine base pair in a decadeoxyribonucleotide by proton mag- 30 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. №6 2* 30 Iietic resonance spectroscopy / L. S. Kan, S. Chandrasegaran, S. M. Pulford, P. S. Mil- ler / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1983.— 80, iN 14.— P. 4263—4265. 10. Iwahashi HSugeta H., Kyogoky Y. Detection of separated amino proton resonance signal of adenine derivatives at low temperature and its application to estimation po- pulation adenine-uracil dimers in so lu t ion/ /Biochemis t ry .— 1982.— 21, N 4.— P. 631 — 638. 11. Sukhodub L. F., Yanson I. K. Mass spectrometric studies of binding energies for nitrogen bases of nucleic acids in v a c u o / / N a t u r e . — 1976.— 264, N 18.— P. 245—247. 12. Yanson /. K., Teplitsky A. B., Sukhodub L. F. Experimental studies of molecular in- teractions between nitrogen bases of nucleic ac ids / /Biopolymers .— 1979.— 18, N 5 . — P. 1149—1170. 13. Суходуб Л. Φ. Взаимодействия в компланарных и стопочных димерах оснований нуклеиновых кислот в вакууме. Масс-спектрометрические исследования / / Биофизи* ка.— 1987.— JVb 6.—С. 994—1005. 14. Sukhodub L. F. Interactions and hydration of nucleic acid bases in vacuum. Experi- mental study / / C h e m . Rev.—1987.—87, N 3 .—P. 589—606. 15. Полтев В. И. Невалентные взаимодействия и конформации Д Н К : Дис.. . . д-ра физ.- мат. наук.— Пущино, 1985.— 273 с. 16. Теплицкий А. Б., Суходуб JI. Ф. Энергетика неправильного нуклеотидного спари- вания. Масс-спектрометрические исследования в вакууме / /Биофизика .— 1990.— 35, № 5.— С. 876—877. 17. Tautomerism of nucleic acid bases and the effect of molecular interactions on tauto- meric equ i l i b r i a /W. P. Person, K. Szczepaniak, M. Szczesniak et a l . / / J . Мої. Struct.— 1989.— 194.— P. 239—258. 18. Poltev V. /., Shulyupina Ν. V. Simulation of interactions between nucleic acid bases by refined a t o m / a t o m potential f u n c t i o n s / / J Biomol. and Struct. Dyn.— 1986.— 3,, N 2.— P. 739—765. 19. Теплицкий А. Б.г Галетич И. JI., Суходуб JI. Φ. Энергетика образования комплек- сов аминокислота—основание в вакууме (глутамин, аспарагин—урацил, тимин) / / Биофизика.— 1990.—35, № 5.—С. 709—710. 20. Шарафутдинов М. Р., Данилов В. И., Полтев В. И. Теоретическое изучение гидра- тации метилпроизводных аденина в вакууме / / Докл. АН УССР. Сер. Б.— 1983.— No 12.—С. 69—72. 21. Del Bene J. Ε. Molecular orbital theory of the hydrogen band. 24. Ground state w a - ter-uracil c o m p l e x e s / / J . Comput. Chem.—1981.—5, N 2 .—P. 188—199. 22. Del Bene J. E. Molecular orbital theory of the hydrogen bonding. 21. Water with the purine bases adenine and g u a n i n e / / J . Мої. Struct.— 1984.— 108.— P. 179—197. 23. Гайворонский Д. Α., Суходуб JI. Φ. Низкотемпературная приставка к полевому ис- точнику ионов масс-спектрометра МИ 1 2 0 1 / / П р и б о р ы и техника эксперимента.— 1983.— № 5.—С. 173—176. 24. Веркин Б. И., Суходуб JI. Ф., Гайворонский Д. А. Наблюдение полигидратов нук- леотидных оснований в вакууме методом низкотемпературной полевой масс-спект- р о м е т р и и / / Д о к л . АН СССР.— 1984.—277, № 5.—С. 1252—1255. 25. Суходуб JI. Ф., Теплицкий А. Б., Лодяной Ю. М. Гидратация комплементарной па- ры 9-метиладенин-* 1-метилурацил при низких температурах по данным полевой масс-спектрометрии / / Биофизика.— 1989.— 34, № 2.— С. 181—186. 26. Teplitsky А. В., Sukhodub L. F. Polyhydration of associates of nucleotide bases at low t e m p e r a t u r e s / / S t u d , biophys.— 1987.— 122, N 1—3.—P. 107—112. 27. Monte Carlo simulation of hydration of the nucleic acid f r a g m e n t s / Α . V. Teplukhin, V. I. Poltev, Ν. V. Shulyupina, G. G. M a l e n k o v / / J . Biomol. and Struct. D y n . - 1 9 8 9 . - 7 , N 1.—P. 75—99. 28. Danilou V. I., Tolokh I. S. Hydration of uracil and thymine methylderivatives: a Mon- te Carlo simulation / / I b i d . — 1990.—7, N 5 .—P. 1167—1183. 29. Веркин Б. И., Суходуб JI. Φ., Моисеенко А. А. Исследование фрагментации фопури- на и его метаболита методом полевой ионизации / / Докл. АН СССР.— 1982.— 265, No 1.—С. 115—120. 30. Лекявичюс Р. КСлапиште Г. В. / / Генетика и селекция народному хозяйству.— Вильнюс; Каунас, 1 9 7 7 . - 9 8 с. 31. Масс-спектрометрическое исследование арилдиэтилентриамидов фосфорной кисло- т ы / Л . Ф. Суходуб, М. В. Косевич, И. Е. Болдескул, JI. Д . Проценко / / Укр. хим. журн.— 1989.—55, № 6.—С. 642—645. 32. Масс-спектрометрическое исследование ацилдиэтилентриамидов фосфорной кисло- т ы / Л . Ф. Суходуб, М. В. Косевич, И. Е. Болдескул, Л. Д. П р о ц е н к о / / Т а м же.— No 7.— С. 752—757. 33. Проценко Л. Д. Исследование в области этиленаминопроизводных кислот фосфора и пиримидина : Автореф. дис.... д-ра хим. наук.— Киев, 1970 — 43 с. 34. Реброва О. П., Биюшин В. П., Малиновский Т. И. Кристаллическая и молекуляр- ная структура N ^ e m m - N ' , N ' , ^ ' ^ " - д и э т и л е н т р и а м и д а фосфорной к и с л о т ы / / Д о к л . АН СССР.— 1983.—272, № 4.—С. 870—873. 35. Пеньковский В. В., Болдескул И. E. Квантовохимическое изучение амидов 0,0-ди- метилфосфорной к и с л о т ы / / T e o р . и эксперим. химия.— 1984.— 20, № 2.— С. 198—202. 36. Изучение стабильности тиофосфамида в водных и водносолевых растворах / Т. Л. Пятигорская, О. Ю. Жилкова, Η. М. Архангелова и д р . / / Х и м . - ф а р м . журн.— 1984.— 18, No. 3.— С. 343—349. 37. Изучение продуктов превращения тиофосфамида в водных растворах методами ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. .№ 6 31- тонкослойной хроматографии и масс-спектрометрии / Т. JI. Пятигорская, О. Ю. Жил- кова, В. С. Шелковский и д р . / / Т а м же.— 1985.—29, N 10.—С. 1235—1241. 38. Hydrolysis of 1,1,1 -phosphinothioylidinetriazidine (Thiotepa) in aqueous s o l u t i o n / T L Pyatigorskaya, 0 . Yu. Zhilkova, V. S. Shelkovsky et a l . / / B i o m e d . Environ. M a s s S p e c t r . - 1987 - 14, N 4 , - P . 143-148 . 39. Суходуб JI. Φ. Применение мягкоионизационной масс-спектрометрИИ ΰ ОИОХИМШІ / / Укр. биохим. жури,— 1989.—61, № 4.—С. 16—30. 40 Mellet L. В., Wood L. A. The comparative physiological disposition of the thioTEPA and TEPA in the d o g / / C a n c e r Res.— I960.—20, N 4 ,—P. 524—532. 41. Effects of pH and temperature on the stability and decomposition of Ν,Ν,Ν-triethy- lenthiophosphoramide in urine and buffer / В. E. Cohen, M. J. Egorin, M. S. B. Nayar, P. L. Guttierrez / / Ibid.— 1984.— 44, N 5 .—P. 4312—4316. 42. Косевич Μ. В. Молекулярный анализ лекарственных препаратов и продуктов их взаимодействия с Д Н К и ее компонентами по данным мягкоионизационной масс- спектрометрии : Дис... . канд. физ.-мат. наук.— Харьков, 1989.— 180 с. 43. Прямое наблюдение аддуктов азотистых оснований с тио-ТЭФ с помощью мягкоио- низационной масс-спектрометрии / Л. Ф. Суходуб, М. В. Косевич, В. С. Шелковский и др. / / Биофизика.— 1990„— 35, № 4.— С. 549—551. 44. Химиотерапия злокачественных опухолей / Под ред. Η. Н. Блохина.— М . : Медици- на, 1977.—320 с. 45. Росс У. Биологические алкилирующие вещества.— М. : Медицина, 1964.— 240 с. 46. Масс-спектрометрическое исследование взаимодействия тиофосфамида с основания- ми нуклеиновых кислот / Л. Ф. Суходуб, В. С. Шелковский, М. В. Косевич и др. / / Докл. АН СССР.— 1985.—283, JVb 3.—С. 714—716. 47. Nucleic acid base complexes with thioTEPA as revealed by field ionization mass spect- rometry / L. F. Sukhodub, V. S. Shelkovsky, Μ. V. Kosevich et a l . / / B i o m e d . Environ. Mass Spectr.— 1986,— 13, N 4 .—P. 167—170. 48. Дубинин Η. П., Сапрыкина E. Г. Цепная реакция при химическом мутагенезе / / Докл. АН СССР.— 1964.— 158, № 4.—С. 956—959. 49. Сидоров Б. H., Соколов Н. H., Андреев В. С. Высокоактивные вторичные алкили- рующие мутагены / / Генетика.— 1966 — 2 , № 4.—С. 269—278. 50. Harrap К. R-, Gascoigne Е. W. The interaction of bifunctional alkylating agents with the DNA of tumor c e l l s / / E u r . J. Cancer.— 1976.—28.—P. 269—278. 51. Направления алкилирования дезоксигуанина и дезоксигуаниловой кислоты тио- Т Э Ф о м / А . М. Серебряный, Г. В. Андриевский, А. П. Беккер и др. / / Биоорг. хи- мия.— 1986.— 12, № 4.— С. 499—506. 52. Строение продуктов модификации нуклеотидов и Д Н К этиленимином и тио-ТЭФом / А. М. Серебряный, Г. В. Андриевский, А. Р. Беккер и д р . / / Т а м же.— 1987.— 13, No 6,— С. 787—792. 53. Singer В. The chemical effects of nucleic acid alkylation and their relation to muta- genesis and ca r c inogenes i s / /P rog r . Nucl. Acids Res. and MoL Biol.— 1975.— 15.— P. 219—284. 54. Волощук T. П., Пацковский Ю. В., Потопальский А. И. Алкилирование компонентов нуклеиновых кислот производными этиленимина. 1. Алкилирование оснований / / Биоорг. химия.— 1990.— 16, № 7.— С. 987—989. 55. Пацковский Ю. В., Волощук Т. П., Потопальский А. И. Некоторые особенности реакции полинуклеотидов с тиофосфамидом/ /Биополимеры и клетка.— 1989.— 5, № 5.— С. 64—70. Отд-ние прикл. физики ин-та металлофизики АН УССР, Получено 30.04.91 Сумы УДК 577.3:535.338.41 Г. С. Литвпноз ИНФРАКРАСНЫЕ К О Л Е Б А Т Е Л Ь Н Ы Е СПЕКТРЫ ФИТОВИРУСОВ И ИХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПОНЕНТОВ Исследованы спектры ИК-поглощения белков, РНК и вирионов спирального (вирус табачной мозаики) и сферического (вирус крапчатости гвоздики) типов симметрии. Об- наружено, что характеристики спектров, такие как общее число полос, их группиров- ка в частотные интервалы, наличие характерных по интенсивности, полуширине и часто- те полос (амид А, амид В, амид 1, амид 2, фосфат 1 фосфат 2 и др.), весьма близки как для целостных вирусных нуклеопротеидов, так и для их биохимических компонен- тов. Наряду с этим наблюдаются и достоверные различия, по которым возможно диф- ференцировать между собой и вирионы, и входящие в них биополимеры. © Г. С. ЛИТВИНОВ, 1991 32 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1991. Т. 7. .№ 6 32-

Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях

Institution

Ähnliche Einträge