Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro

Обсуждается влияние различных факторов на процессы созревания и оплодотворения ооцитов коров in vitro, раннее развитие зародышей до стадии бластоцисты вне организма, цитоморфологические и биохимические особенности зародышей, полученных in vitro и in vivo....

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	1999
Main Authors:	Кузнецова, И.Б., Кузнецов, В.Е., Ковтун, С.И.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1999
Series:	Биополимеры и клетка
Subjects:	Клеточная биология
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155968
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro / И.Б. Кузнецова, В.Е. Кузнецов, С.И. Ковтун // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 1. — С. 49-56. — Бібліогр.: 41 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155968
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1559682025-02-23T18:38:06Z Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro Фактори, що впливають на отримання біологічно повноцінних зародків великої рогатої худоби in vitro Factors affecting the viability of the bovine embryos produced in vitro Кузнецова, И.Б. Кузнецов, В.Е. Ковтун, С.И. Клеточная биология Обсуждается влияние различных факторов на процессы созревания и оплодотворения ооцитов коров in vitro, раннее развитие зародышей до стадии бластоцисты вне организма, цитоморфологические и биохимические особенности зародышей, полученных in vitro и in vivo. Обговорюється вплив різних факторів на процеси дозрівання і зашііднення ооцитів корів in vitro, ранній розвиток зародків до стадії бластоцисти поза організмом, цитоморфологічні і біохімічні особливості зародків, отриманих in vitro та in vivo. It is discussed the effects of different factors on the in vitro maturation and fertilization of cow oocytes, early embryonic development to the blastocyst stage and morphological and biochemical similarities and differences between embryos produced in vitro or in vivo. 1999 Article Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro / И.Б. Кузнецова, В.Е. Кузнецов, С.И. Ковтун // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 1. — С. 49-56. — Бібліогр.: 41 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000505 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155968 576.37:591.3:636.2 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Клеточная биология Клеточная биология
spellingShingle	Клеточная биология Клеточная биология Кузнецова, И.Б. Кузнецов, В.Е. Ковтун, С.И. Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro Биополимеры и клетка
description	Обсуждается влияние различных факторов на процессы созревания и оплодотворения ооцитов коров in vitro, раннее развитие зародышей до стадии бластоцисты вне организма, цитоморфологические и биохимические особенности зародышей, полученных in vitro и in vivo.
format	Article
author	Кузнецова, И.Б. Кузнецов, В.Е. Ковтун, С.И.
author_facet	Кузнецова, И.Б. Кузнецов, В.Е. Ковтун, С.И.
author_sort	Кузнецова, И.Б.
title	Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro
title_short	Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro
title_full	Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro
title_fullStr	Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro
title_full_unstemmed	Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro
title_sort	факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1999
topic_facet	Клеточная биология
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155968
citation_txt	Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro / И.Б. Кузнецова, В.Е. Кузнецов, С.И. Ковтун // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 1. — С. 49-56. — Бібліогр.: 41 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT kuznecovaib faktoryvliâûŝienapolučeniebiologičeskipolnocennyhzarodyšejkrupnogorogatogoskotainvitro AT kuznecovve faktoryvliâûŝienapolučeniebiologičeskipolnocennyhzarodyšejkrupnogorogatogoskotainvitro AT kovtunsi faktoryvliâûŝienapolučeniebiologičeskipolnocennyhzarodyšejkrupnogorogatogoskotainvitro AT kuznecovaib faktoriŝovplivaûtʹnaotrimannâbíologíčnopovnocínnihzarodkívvelikoírogatoíhudobiinvitro AT kuznecovve faktoriŝovplivaûtʹnaotrimannâbíologíčnopovnocínnihzarodkívvelikoírogatoíhudobiinvitro AT kovtunsi faktoriŝovplivaûtʹnaotrimannâbíologíčnopovnocínnihzarodkívvelikoírogatoíhudobiinvitro AT kuznecovaib factorsaffectingtheviabilityofthebovineembryosproducedinvitro AT kuznecovve factorsaffectingtheviabilityofthebovineembryosproducedinvitro AT kovtunsi factorsaffectingtheviabilityofthebovineembryosproducedinvitro
first_indexed	2025-11-24T11:09:30Z
last_indexed	2025-11-24T11:09:30Z
_version_	1849669787741847552
fulltext	/SSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1999. Т. 15. № 1 Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro И. Б. Кузнецова, В. Е. Кузнецов, С. И. Ковтун Институт разведения и генетики животных УААН Ул. Погребняка, 1, с. Чубинское, Бориспольский р-н, Киевская обл., 256319, Украина Обсуждается влияние различных факторов на процессы созревания и оплодотворения ооцитов коров in vitro, раннее развитие зародышей до стадии бластоцисти вне организма, щит омо,уфоло- гические и биохимические особенности зародышей, полученных in vitro и itι vivo. Co времени получения Брекетом [1 ] первого теле- нка после оплодотворения вне организма в этой области исследований достигнут значительный про- гресс. Наряду с этим частота получения бластоцист крупного рогатого скота (KPC) in vitro находится на невысоком уровне — вследствие пониженной метаболической активности жизнеспособность та- ких морул-бластоцист после пересадки реципиен- там, а также их выживаемость после заморажива- ния ниже, чем у зародышей, полученных in vivo. Это ограничивает возможности использования дан- ной методики в воспроизводстве животных и свиде- тельствует о необходимости ее дальнейшего совер- шенствования, включая детальное изучение in vitro и in vivo различных аспектов ядерного и цитоплаз- матического созревания ооцитов, капацитации сперматозоидов, взаимодействия гамет в-процессе оплодотворения, развития зародышей. В условиях in vitro извлеченные из фолликулов ооциты различных видов животных, в том числе коров, способны к созреванию до стадии метафазы II без добавления в среду гормонов, однако такие осциты не способны к формированию полноценного мужского пронуклеуса. Созревание ооцитов в при- сутствии гонадотропинов и стероидов, а также некоторых факторов роста, например, эпидермаль- ного фактора роста (EGF) и инсулиноподобного фактора роста I (IGF-I) способствует последующе- © И Б КУЗНЕЦОВА, В. Е. КУЗНЕЦОВ, С. И. КОВТУН, 1999 му оплодо творению ооцитов in vitro (I V F — in vitro fertilization) и их развитию до стадии бластоцисти [2]. Культивирование ооцитов вне организма, в отличие от их созревания in vivo, может приводить к более быстрому созреванию ядра по сравнению с цитоплазмой, что делает ооциты малопригодными для оплодотворении в результате недоразвития ци- топлазмы: яйцеклетки, созревшей до метафазы II, либо перезревания ядерного материала вследствие продолжительного культивирования ооцита (в по- следнем случае возрастает частота хромосомных нарушений). Большую роль в приобретении ооци- тами компетенции к: оплодотворению in vitro у KPC играют окружающие их фолликулярные клетки, особенно клетки кумулюса [3]. Хотя показано, что добавка большого количества клеток: гранулезы (25-IO6 кл/мл) в среду созревания может ингиби- ровать возобновление мейоза в ооцитах коров in vitro при условии их непосредственного контакта [2], наличие в среде культивирования ооцит-куму- люсных комплексов (OKK) дополнительного коли- чества свежеполученных клеток гранулезы ((3— 5) · IO6 кл/мл) является очень важным для полно- ценного созревания ооцитов коров [4 \|. И именно вследствие сокультивирования незрелых ооцитов коров с клетками гранулезы стало возможным получение вне организма достаточно большого (до 40 % от числа осемененных ооцитов) количества бластоцист KPC [5 ]. Сокультивирование с клетка- ми гранулезы, извлеченными из неатретических 49 КУЗНЕЦОВА И fi И ДР. фолликулов, способствует цитоплазматическому созреванию ооцитов, следствием чего является по- вышение частоты формирования мужского пронук- леуса [6] и увеличение способности к последующе- му развитию in vitro [7 ]. Положительное влияние клеток гранулезы на созревание ооцитов коров, вероятно, связано с тем, что они способны проду- цировать эстрадиол-1Ίβ и прогестерон в присутст- вии инсулина и ФСГ [8 ]. В случае необходимости созревания ооцитов в малых группах (от 1 до 5), например, после прижизненного трансвагинального извлечения у коров-доноров под контролем ультра- звука (C)PU — ovum pick-up) совместное культиви- рование ооцитов с клетками гранулезы значитель- но улучшает их последующее развитие до морулы- бластоцисты ([9], собствен, исследования). Нами показано, что наличие в среде созревания дополни- тельного количества клеток гранулезы компенсиру- ет также обусловленную механическими поврежде- ниями потерю ооцитами части клеток кумулюса, В среды для созревания ооцитов обычно добав- ляют IO—20 % инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка (FCS) или эструсной сыворотки крови коров, полученной в период охоты при выраженном рефлексе неподвижности. Значе- ние сыворотки полностью не выяснено, однако известно, что важную роль в поддержании роста и питания клеток играют находящиеся в ней белки, аминокислоты, предшественники нуклеиновых кислот и витамины [10]. Эструсная сыворотка содержит высокие концентрации эстрадиола-17/? и ЛГ, поэтому в случае ее применения становится необязательным использование добавок гонадотро- 1ИНОВ и/или эстрогенов [11]. В наших исследова- ниях использование эструсной сыворотки крови коров не увеличивало количества ооцитов, созрев- ших in vitro до метафазы II, по сравнению с FCS, но значительно повышало частоту дробления и развития до стадии бластоцисти после IVF. Различия между ооцитами, способными и не- способными к развитию, проявляются на 4—5-й день после оплодотворения (т. е. на стадии меру- лы-бластоцисти). Этот долгий период подтвержда- ет гипотезу Сирарда и Блондина [5] о том, что способные к развитию ооциты должны содержать какой-то важный фактор — белковый или в форме стабильной мРНК. За последние 10 лег при широ- ком спектре условий созреЕіания не было достигну- то значительного улучшения в частоте развития ооцитов, поэтому логично предположить, что имеет место скорее специфическая аккумуляция мРНК, чем посттрансляционные изменения. Таким обра- лом, можно заключить, что компетенция ооцитов к развитию приобретается до начала ядерной конден- сации, которая отмечается через несколько часов после аспирации из фолликула или пика ЛГ. В настоящее время подтверждения этой гипотезы сводятся к следующему: 1) при использовании ооцитов, полученных аспирацией через 42 ч после введения простагландина, т. е. в пределах пика ЛГ, было получено 67 % развития до стадии бластоци- ста после IVF [12]; 2) использование ооцитов из яичников, находившихся в теплом изотоническим растворе в течение 4 ч до извлечения ооцитов, приводило в некоторых опытах до 100 % развития in vitro до стадии морулы-бластоцисты [13]. Значительное повышение эффективности опло- дотворения in vitro было достигнут;; при использо- вании гепарина для капацитации сперматозоидов быка [14]. По-видимому, это связано с тем, что данный метод капацитации сперматозоидов быка является наиболее близким к условиям in vivo — установлено, что активным капацитирующим фак- тором жидкости яйцеводов коров является гепари- ноподобный гликозаминогликан (ГАГ) \|15, 16]. Удаление семенной плазмы, белки которой стабилизируют мембраны сперматозоидов и тем самым ингибируют акросомную реакцию, из эяку- лята быка до замораживания значительно повыша- ет частоту оплодотворения вне организма, а ис- пользование эпидидимальных сперматозоидов бы ка, которые из-за отсутствия контакта с семенной плазмой легче капацитируются in vitro, позволяет получать более стабильные результаты, чем ис- пользование эякулированных сперматозоидов ([17], собствен, исследования). Для поддержания достаточной подвижности сперматозоидов, повышения их способности к пе- нетрации яйцеклеток и частоты формирования пронуклеусов в среды для оплодотворения добавля- ют пеницилламин, гипотаурин и эпинефрин (РНЕ), что существенно уменьшает период от на- чала осеменения до пенетрации ооцитов. Возможно также, что наличие в среде оплодотворения PHE и эпителиальных клеток яйцеводов коров может ока- зывать антиоксидантное действие и нивелировать повреждающее влияние атмосферного кислорода на раннее эмбриональное развитие, связанное с фор- мированием свободных радикалов O2, ускоряющих процессы пероксидации липидов и активации фер- ментов, что в свою очередь приводит к поврежд нию мембран сперматозоидов и потере их подвил ности [18]. Добавление в среду оплодотворения ооцитов коров кластеров эпителиальных клеток- яйцеводов, проявляющих реснитчатую активность после культивирования вне организма в течение не менее 24 ч, значительно повышало частоту разви- тия зигот до четырехклеточной стадии через 24 ч 50 ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ IlA ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛНОЦЕННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ KPC после IVF (собствен, исследования), что свидетель- ствует о повышении жизнеспособности полученных зародышей и их большей потенции к развитию до стадии бластоцисты ([19], собствен, исследования). Многочисленные эксперименты показали, что культивирование зародышей KPC in vitro, как пра- вило, приводит к остановке дробления на 8—16- клеточной стадии развития, на которой у этого вида животных осуществляется переход от мате- ринского к эмбриональному контролю развития (активация генома зародыша) [20]. Для преодоле- ния зародышами блока дробления в культуре необ ходимо наличие в среде культивирования биологи- чески активных (эмбриотрофных) факторов [21 ]. Последние включают в себя специфические и не- специфические факторы, такие как факторы роста, цитокинины (вещества, способствующие делению клеток), антиоксиданты и хелатирующие соедине- ния. Они могут секретироваться соматическими клетками или самими доимплантационными заро- дышами и действовать как яара-аутокринные фак- торы [22 ]. Вырабатывание зародышами аутокрин- ных эмбриотрофных факторов объясняет повыше- ние их жизнеспособности при культивировании в группах, так как в яйцеводе зародыши фактически развиваются в микрообъеме жидкости. К аутотроф- ным факторам зародышей относятся такие факторы роста, как трансформирующий фактор роста, инсу- линоподобный фактор роста II, эпидермальный фактор роста [23]. Дл* получения бластоцист KPC in vitro исполь- зуют две системы культивирования — сокультиви- рование с соматическими клетками (или кондици- онированная с этими клетками среда) и среды с известным или почти полностью известным соста- вом. Сокультивирование и использование кондици- онированных сред обеспечивают поступление в сре- ду факторов роста и /или цитокининов и ослабляет или устраняет действие ингибирующих развитие компонентов, таких как глюкоза или -кислород [24 ]. Наблюдаются значительные различия в час- тоте развития и характеристиках зародышей, полу- ченных в этих системах. Одними из первых систем сокультивирования, с использованием которых впервые получены бла- стоцисты KPC вне организма, были клетки куму- люса или гранулезы и эпителиальные клетки яйце- водов коров [11, 25]. Показано, что вырабатывае- мые этими к л е т к а м и вещества , например , тканевый ингибитор металлопротеиназ способству- ют развитию зародышей вне организма [26]. Хотя можно успешно замораживать клетки эпителия яйцеводов (при этом они сохраняют свои свойства по поддержанию развития зародышей KPC вне организма [27]), их использование огра- ничено, поскольку работа по получению первичной культуры долговременна и трудоемка, а также связана с доступностью боннского материала. Кро- ме того, полученные культуры отличаются по ка- честву и по способности поддерживать развитие зародышей. В связи с этим выгодным является использование уже устоявшихся коммерческих клеточных линий, имеющих постоянные характе- ристики, при котором легко контролируется любая контаминация [26, 20 ]. В настоящее время наиболее часто использу- ются линии таких клеток, как Vero (клетки почек зеленой мартышки) и BRL (клетки печени крысы), способные поддерживать развитие зародышей даже после 10 пассажей и более, что дает возможность стандартизации условий культивирования 128]. Однако в наших исследованиях уже после 5—6-го пассажа клеток Vero и BRl- наблюдалось значи- тельное снижение количества полученных бласто- цист KPC и частоты их вылупления, что могло быть следствием используемого способа заморажи- вания и/или произведенного до него количества пассажей. Показано, что клетки BRL продуцируют боль- шое количество факторов роста, среди них инсули- ноподобный фактор роста II (IGF-II), трансформи- рующий фактор роста β (TGF-/J), фактор ивгиби- рования лейкемии (LIF) и фактор стволовых клеток (SCF), также известный как c-kit литанд [20]; эти же факторы роста обнаружены в половых путях самок, а их добавление в культуральные среды с известным составом значительно повышает способность зародышей к развитию [23, 28 ]. Это, вероятно, объясняется тем, что во время развития в зародышах млекопитающих экспрессируются за- висимые от стадии развития рецепторы для специ- фических факторов роста и их лигандов [29]. Крюме того, показано, что культивирование заро- дышей KPC на монослое клеток BRL приводит к повышению их криорезистентности именно вслед- ствие секреции этими клетками противолєйкі мий- ного фактора. Однако известно, что растущие популяции клеток потребляют питательные вещества энергич- нее, чем зародышм, их рост приводит к более быстрому закисленню сред, особенно в конце пери- ода культивирования, когда плотность их становит- ся очень высокой. Помимо этого, замечено, что клетки BRL и Vero имеют тенденцию к нарастанию на зародыши во время сокультивирования, что ингибирует развитие до стадии бластоцисты. Поэ- тому предпочтительным является использование особых клеточных линий BRL1 клетки которых 51 КУЗНЕЦОВА И fi И ДР. прекращают рост при контакте [7 ], либо клеток Vero с инактивированной пролиферацией, что до- стигается обработкой митомицином С и приводит к получению монослоя, имеющего известную, неиз- менную П Л O l 4 H O C T b клеток в течение всего периода культивирования [26 ]. Соматические клетки, используемые для со- культивирования, могут вырабатывать неизвестные факторы, способствующие Jxxrry зародышей, и/или удалять токсичные вещества (такт: как ионы ам- мония — продукты метаболизма аминокислот) из основной среды, что затрудняет уточнение требова- ний для культивирования и развития зародышей и препятствует ясному пониманию их метаболизма и развития независимо от других типов клеток [30 J. Использование кондиционированных сред имеет такие преимущества, как устранение дополнитель- ного количества клеток и продуктов их метаболиз- ма, возможность их исследования на наличие эмб- риотрофных факторов, замораживания и использо- вания одной партии среды длительное время [31 ]. Для культивирования зародышей KPC наибо- лее часто использу ют среды 199 и Менезо Б2. Это сложные среды с большим количеством компонен- тов — витаминов, аминокислот, солей, нуклеоти- дов и т. п., что отражает потребности скорее соматических клеток, чем зародышей. Показано, что зародыши лучше: развиваются в простых средах, чем в сложных, поэтому при использовании систем сокультивирования важно, чтобы эти среды содержали соответствующие до- бавки, поддерживающие жизнеспособность сомати- ческих клеток [22 j. Получение нормального потомства после пере- садки бластоцист KPC, полученных in vitro в про- стых солевых растворах (например, в среде SOF — синтетической жидкости яйцеводов или CR1 [32 ]) с добавлением энергетических субстратов и источ- ника белка, свидетельствует о том, что требования для развития зародышей in vitro уже практически выяснены. Однако даже гак называемая среда с известным химическим составом может включать неучтенные вещества, например, вследствие «за- грязнения» буфера HEPES значительным количе- ством ацетата или из-за наличия в относительно чистом альбумине, лишенном жирных кислот, не- значительных количеств различных факторов рос- та. Разработка качественных с точки зрения после- дующего фетального и постнатального развития сред с точно известным химическим составом обес- печит должную повторяемость получения бласто- цист KPC вне организма и коммерческое использо- вание этой методики [22 ]. В состав сред для культивирования ранних зародышей KPC должны входить энергетические компоненты (пируват, лактат, глюкоза) и источни- ки белка. Обмен веществ зародышей на различных стадиях развития имеет свои особенности. Так, на ранних стадиях дробления в качестве энергетиче- ского субстрата лучше использовать пируват, а на околокомпактизационных стадиях наблюдается значительное увеличение потребления зародышами глюкозы, ингибирующей развитие зародышей KPC на ранних стадиях даже в отсутствие экзогенного фосфата (в отличие от зародышей хомячка и мы- ши). Считают, что именно высокая концентрация глюкозы (5,56 мМ) в среде культивирования заро- дышей, соответствующая ее концентрации в плаз- ме крови, а не в жидкости яйцеводов коров (0,05— 0,2 мМ), может быть одним из основных факторов, вызывающих блок на 8—16-клеточной стадии зародышей К PC, культивирующихся вне организма [30]. Ким и др. [33 ] показали, что пируват и лактат поддерживают развитие зародышей KPC in vitro до 8-клеточной стадии, а пируват необходим также для развития до стадии морулы; при э ом соотно шение лактат: пируват менее важно, чем обта< концентрация лактата и пирувата, в отличие от зародышей мыши, для которых опти альным явл - ется соотношение данных компонентов 1 : 20 [32 Наличие аминокислот в средах культивирования зародышей KPC способствует повышению частоты развития до стадии формирования бластоцеля ч приводит к значительному увеличению количества клеток в бластоцистах [23, 30]. В качестве источника белка для доимплантэ- ционных зародышей обычно используют сыворотку (чаще всего FCS) и бычий сывороточный альбумин (БСА). Сыворотка содержит гормоны, факторы ро- ста, витамины, хелатирующие соединения (связы- вающие ионы тяжелых металлов), пептиды, белки [29 ]. БСА может содержать пептиды, энергетиче- ские субстраты и факторы роста и положительно влияет на развитие зародышей вследствие высокой способности к связыванию лигандов, что выражает- ся в защитном эффекте против токсичных компо- нентов среды и усилении положительного действия других компонентов [30]. Однако некоторые пар- тии выпускаемого БСА могут ингибировать разви тие зародышей и его иногда заменяют синтетиче- скими макромолекулами — поливиниловым спир- том (PVA) или поливинилпирролидоном (PVP) [29]. Показано, что наличие сыворотки в средах культивирования зародышей KPC угнетает началь- ные деления дробления и стимулирует компактиза- цию морул и формирование бластоцист для ооци- 52 ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ IlA ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛНОЦЕННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ KPC тов коров, созревших и оплодотворенных in vitro [34 J. Однако, хотя сыворотка ускоряет развитие при ее внесении в начале компактизации и способ- ствует повышению частоты формирования бласто- цист, результатом ее добавления являются бласто- цисты худшего качества с увеличенным диаметром и уменьшенным количеством клеток [24, 35, ]; бластоцисты, полученные в бессывороточной среде, имеют лучшую морфологию, более обычные разме- ры и форму, чем бластоцисты, культивируемые в присутствии сыворотки ([31, собствен, исследова- ния). Наличие в среде сыворотки может негативно влиять на морфологию, метаболизм, ультраструк туру и развитие доимплантационных зародышей КРС. У зародышей, культивируемых в присутствии сыворотки, в цитоплазме выявлено повышенное количество липидных гранул по сравнению с бла- стоцистами, полученными в бессывороточной среде и in vivo. Предполагается, что они содержат боль- шое количество триглицеридов, происходящих из сыворотки. Ультраструктурные исследования выя- вили дегенеративные изменения в митохондриях зародышей, культивировавшихся с сывороткой, что может влиять на их метаболические способности; исключение сыворотки из культуральных сред по- зволяет избежать дегенерации митохондриальной ДНК [24 ]. Влияние сыворотки на метаболизм за- родыша заключается в возрастании выработки лак- тата, что негативно сказывается на жизнеспособно- сти. Кроме того, добавление сыворотки не позволя- ет стандартизировать условия культивирования [28 ]. Существует предположение, что именно включение сыворотки в состав сред для созревания ООЦИТОЕ и развития зародышей является причиной аномально большого веса полученных телят [36]. Коммерческое применение метода IVF ограни- чивается тем, что после пересадки полученных вне организма бластоцист наблюдается более высокая частота абортов и трудных отелов, удлиняется продолжительность стельности. Кроме того, пока- зано, что полученные телята менее жизнеспособ- ны, несмотря на их более высокий вес, у них наблюдаются такие аномалии, как сердечные нару- шения, проблемы с конечностями и суставами, внутренние органы большого размера, дисплазия мозжечка, что является показателем несбалансиро- ванного развития, произошедшего девятью месяца- ми ранее [36, 37 ]. В настоящее время культивирование зароды- шей in vitro является недостаточно эффектив- ным — только 20—30 % тщательно отобранных ооцитов достигают стадии бластоцисты. Показана худшая выживаемость после трансплантации бла- стоцист, полученных in vitro (около 40 %) по сравнению с зародышами, полученными in vivo (50—60 %), а также более низкая устойчивость к замораживанию и оттаиванию. Это свидетельству- ет об их худшей жизнеспособности, хотя некото- рый прогресс в эффективности криоконсервирова- ния IVF-s-iродышей наметился в связи с использо- ванием методики нитрификации [381. Показано, что повышенная чувствительность полученных in vitro бластоцист к температуре ниже 14 °С связана с их более низкой плавучей плотностью. Измене- ние белкового и/или липидного состава зародышей, определяющего плотность, может привести к повы- шению их криоустойчивости. Уже показано, что микрохирургическое удаление липидных гранул перед замораживанием повышает выживаемость бластоцист КРС. Использование для развития бла- стоцист промежуточных реципиентов повышает их устойчивость к замораживанию, тогда как наличие в культуральных средах сыворотки снижает ее вследствие увеличения содержания липидсв 124 ]. Полученные в культуре бластоцисты KPC име- ют пониженное количество клеток внутренней кле- точной массы (BKM) (и по количеству клеток ВКМ, и по соотношению BKM : ТЭ (трофэкгодер- ма)). Хотя сами по себе условия в культуре необя- зательно приводят к снижению митотической ак- тивности, большинство культуральных систем от- рицательно сказывается на частоте клеточных делений. На развитие бластоцист в культуре могут влиять и хромосомные нарушения. Наиболее часто встречающимся хромосомным нарушением у заро- дышей, полученных in vitro (15 против 7—10 % для зародышей, полученных in vivo), является триплоидия, которая может объясняться высоким уровнем наличия диплоидных ооцитов (около I l %) после созревания в культуре [24]. При культивировании зародышей часто наблю- даются такие нарушения, как некроз, фрагмента- ция, остановка развития, редукция контактов меж- ду клетками BKM и ТЭ и возрастание вакуолиза- ции цитоплазмы. Степень компактизации морул, полученных in vitro, особенно культивировавшихся в средах с сывороткой, также отличается от морул, полученных in vivo [24 ]. Биохимические исследования показали, что скорость продукции ATP сходна для зародышей, полученных in vivo и in vitro. Поскольку последние имеют меньшее количество клеток (97±7 против 117±10), то у них продуцируется больше ATP в расчете на. один бластомер. Утилизация пирувлта и глюкозы также сравнима для зародышей: обоих видов, однако при тех же различиях на клеточном уровне. Потребление аминокислот примерно на 53 КУЗНЕЦОВА И. Б. И ДР. 30 % больше для бластоцист КРС, полученных in vivo, чем для полученных in vitro, что может объясняться различиями в кинетике их транспорта и/или утилизации. Синтез и содержание белков примерно одинаковы в зародышах обоих видов до компактизации, на посткомпактизационных стади- ях развития наблюдаются различия по этим пока- зателям, определяемые по плавучей плотности и потреблению аминокислот [24 ]. Хотя значительное возрастание синтеза РНК отмечается только во время 4-го клеточного цикла, известно, что транскрипция происходит и раньше. Таким образом, на нее также могут влиять условия культивирования. Показаны различия в экспрессии некоторых генов (например, гена коннексина, Сх43, участвующего в формировании щелевых контактов) для бластоцист, полученных in vivo и in vitro. Описанные выше различия в морфологии, такие как ограниченная компактизация в присут- ствии сыворотки, могут быть обусловлены измене- ниями экспрессии генов во время развития. Этим же могут объясняться повышенный вес и размер телят, наблюдающиеся после культивирования за- родышей вне организма и таких манипуляций, как пересадка ядер и изменение материнского окруже- ния в матке (использование промежуточных реци- пиентов). Показано, что экспрессия генов некото- рых факторов роста изменяется у зародышей, по- лученных после пересадки ядер», гю сравнению с зародышами, полученными in vivo и in vitro. Обна- ружена связь между крупноплодностью и измене- ниями в геномном импринтинге и характере мети- лирования ДНК. Для мышей выявлено, что анома- лии в развитии плодов наблюдаются вследствие субоптимальных условий культивирования зароды- шей [24 ]. Одной из особенностей исследований на KPC является то, что зародыши подвергаются манипу- ляциям до того, как начинается транскрипция эмбрионального генома. Вполне возможно, что ма- нипуляции влияют на транскрипцию одного или большего количества генов, связанных с ранним эмбриональным развитием. Известно, что кратко - временное культивирование зигот мышей до 2-кле- точной стадии может сказываться на экспрессии определенных генов. Более длительный период культивирования, видимо, оказывает значительное влияние на функцию генов, особенно у таких видов, как овцы и КРС, у которых транскрипция не начинается до 8—16-клеточной стадии [37]. Манипуляции с зародышами могут приводить к фенотипическим изменениям также вследствие их влияния на импринтинг генов, необходимых для эмбрионального и фетального развития. Идентифи- цировано ограниченное число генов, подвергаю- щихся импринтингу, некоторые из них участвуют в развитии плода, например, гены инсулиноподоб- ного фактора роста II и его рецептора. У мышей материнская хромосома продуцирует транскрипт для рецептора, а отцовская — транскрипт для ли- ганда. Оба гена экспрессируются в доимплантаци- онном зародыше независимо от их родительского происхождения, однако моноаллельная экспрессия зависит от метилирования ДНК. Нарушение регу- ляции генов такого типа из-за влияния внешних условий может приводить к аномалиям эмбрио- нального и плодного развития [24 ]. Следует отметить, что одним из преимуществ получения бластоцист KPC in vitro может также стать разработка методов селекции зародышей по полу до их трансплантации реципиентам. Так, было показано, что соотношение полов у 7—8- дневных зародышей КРС, полученных in vitro, зависело от их стадии развития — среди быстрее развивающихся зародышей большинство были мужскими (до 100 % для полностью экспандиро- ванных бластоцист), на 8-й день количество муж- ских зародышей составляло 20 % [39]; причиной более быстрого развития мужских зародышей мо- жет быть более высокий метаболизм глюкозы [40 і Однако преимущественное развитие мужских зародышей во время использования материнской мРНК не является атрибутом системы культивиро- вания вне организма, так как их более быстро· развитие наблюдается также in vivo у мышей І KPC [40]. Было показано, что среди вымытых у коров-доноров зародышей более продвинутых ста- дий соотношение полов на 15 % сдвинуто в сторо ну самцов, а для зародышей менее продвинутых стадий — в сторону самок, однако у коров-донорої этот эффект маскируется неодновременной овуля- цией яйцеклеток при суперовуляции [39 ]. При этом мужские зародыши менее способны к имплан- тации и частота их ранней эмбриональной смерт- ности также выше, что свидетельствует о том, что для получения беременности нужно большее коли- чество мужских зародышей, чем женских [40]. Различную скорость роста зародышей в зависи мости от пола может объяснить то что во время раннего эмбрионального развития активными явля- ются обе Х-хромосомы, одна из них становится неактивной на стадии бластоцисты. Следовательно (по крайней мере у мышей), экспрессия генов Х-хромосомы, кодирующих, например, гипоксан- тин-фосфорибозилтрансферазу и глюкозо-6-фсх- фатдегидрогеназу, т. е. энзимы, в присутствии глюкозы способствующие понижению внутрикле- точной концентрации радикалов кислорода, при- .54 ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ IlA ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛНОЦЕННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ KPC мерно в 2 раза выше у самок, чем у самцов, до времени активации эмбрионального генома и инак- тивации Х-хромосомы [41 ]. В практическом отношении можно направлен- но влиять на соотношение полов у зародышей КРС, полученных вне организма. Например, если осеме- нение ооцитов, созревших in vitro, проводить через 8 ч после выделения первого полярного тела, то соотношение полов у полученных бластоцист сдви- гается в сторону самцов (около 70 %), а если сразу после выделения первого полярного тела — в сто- рону самок (60—67 %). Этот феномен может быть объяснен наличием в X- и Y-несущих сперматозо- идах каких-то связанных с половой хромосомой веществ (белков), которые могут влиять на время и успех развития зародышей, и приобретением ооцитами способности к их использованию [40]. Таким образом, системы культивирования in vitro позволяют получать жизнеспособные зароды- ши КРС, пересадка которых реципиентам приводит к получению потомства. Вместе с тем следует отметить, что хотя по многим биохимическим по- казателям бластоцисты, полученные вне организ- ма, сравнимы с полученными от коров-доноров, однако на клеточном и субклеточном уровнях, а также в частоте развития после пересадки сущест- вуют значительные различия между этими двумя источника?.™ зародышей. Для уменьшения этих различий необходимо дальнейшее изучение по- требностей ооцитов и зародышей для их полноцен- ного развития. /. Б. Кузнецова, В. Є. Кузнецов, С. І. Ковтун Фактори, що впливають на отримання біологічно повноцінних зародків великої рогатої худоби in vitro Резюме Обговорюється вплив різних факторів на процеси дозрівання і запліднення ооцитів корів in vitro, ранній розвиток зародків до стадії бластоцисти поза організмом, цитоморфологічні і біо- хімічні особливості зародків, отриманих in vitro та in vivo. І. В. Kuznetsova, V. Ε. Kuznetsov, S. I. Kovtun Factors affecting the viability of the bovine embryos produced in vitro Summary It is discussed the effects of different factors on the in vitro maturation and fertilization of cow oocytes, early embryonic deve- lopment to the blastocyst stage and morphological and biochemical similarities and differences between embryos produced in vitro or in vivo. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ I. Brackett В. G., Bousquet D., Boice Μ. L. Normal development following in vitro fertilization in the cow / / Biol. Reprod.— 1982,—27.—P. 147—158. 2. Hinrichs K. Manipulation of oocyte maturation in vitro Il Arch. Tierz. Dummerstorf. —1996 —39, Special Issue.— P. 43—50. 3. Goto K., Kajihara Y., Kosaka S. et aL Pregnancies after co-culture of cumulus cells with bovine embryos derived from in vitro fertilization of in vitro matured follicular oocytes / / J. Reprod. Fertil.—1988.—83, N 2.—P. 753—758. 4. Galli C., Lazzari G. l a rge scale production of bovine embryos / / Proc. Eur. Conf. Embryo Techn. and Genet Engin. in Catt leand Sheep —Krakow, 1994.—P. 111 — 116. 5. Sirard Af. A., Blondin P. Oocyte maturation and IVF in cattle / / Anim. Reprod. Sci -1996 .—42.—P. 417—426 6. Konishi M., Aoyagi Y., Takedomi T. et al. Presence of granulosa cells during oocyte maturation improved in vitro development of IVN IVF bovine oocytes that were collected by ultrasound-guided transvaginal aspiration / / Theriogenol- ogy.—1996,—45,—P. 573—581. 7. Inzen W. G., Stekelenburg Hamers A. E. P., Weima S- Af. et al. Culture of bovine embryos to the. blastocyst stage using Buffalo rat liver (BRL) cells / / Theriogenology. — 1995.— 43.—P. 723. 8. Saumande J. Culture of bovine granulosa cells in a chemically defined serum-free medium: the effect of insulin and fibronec- tin on the response to FSH / / J. Steroid. Bioehettv Мої. Biol.—1991,—38, N 2.—P. 189—196. 9. О'Doheity E. Af., Wade Af. G., Hill J. L , Boland Af. P. Effects of culturing bovine oocytes either singly or in groups on development to blastocysts / / Theriogenolog^.—1997.—48.— P. 161 — 169. 10. Адаме P. Методы культуры клеток для биохимиков.—M.: Мир, 1983.—2.58 с. 11. Gordon I. In vitro maturation (IVM) and fertilization (IVF) of cattle ova / / Embryo Transfer Newsletter.—1990.—8.—P. 6— 11. 12. Menard D. P., Lamothe P., Smith L C. Aspiration trans- vaginale d'ovocytes chez Ies bovins: mise au point et evaluation d'une technique / / Med. Vet. Quebec. —1995.—25 —P. 92. 13. Blondin P., Guilbaidt L A., Sirard M. A. In vitro production of bovine embryos: developmental competence is acquired before maturation / / Theriogenology.—1995.—43,—P 168. 14. Parrish J. J., Susko-Parrish J. L., First N. L Effect of heparin and chondroitin sulphate on the acrosome reaction and fertility of bovine sperm in vitro Il Ibid.—1985.—24 —P. 537—549. 15. Parrish J. J., Susko-Parrish J. L., Handrow R R. et al. Capaciteition of bovine spermatozoa by oviduct fluid Π Biol. Reprod.—1989.—40 —P. 1020—1025. 16. Gordon I. Large-scale production of cattle embryos by in vitro culture methods / / Agr. Biotech. News and Inform. —1989.— 1, N 3.—P. 345—348. 17. Katska L., Smorag Z. Bull effect on in vitro embryo production in cattle / / J. Physiol. Pharmacol.—1996.—47, N 2,.—P. 71 — 78. 18. Miller G. F., Gtiedt D. W., Rakes J. M., Rorie R. W. Addition of penicillamine, hypotaurine and epinephrine (PHE) or bovine oviductal epithelial cells (BOEC) alone or in combina- tion to bovine in vitro fertilization medium increases the subsequent embryo cleavage rale / / Theriogenology.—1994.— 41,—P. 689—696. 19. Lee E. S., Fujii Y., Fukui Y. A comparative study on developmental capacity to blastocysts derived from 1- and 2(3)-cell bovine embryos after in vitro maturation and fertiliza- tion / / Theriogenology.—1996,—45 —P. 1151—1162. 20. Reed W. A., Suh T., Bunch T. D., White K. L Culture of in vitro fertilized bovine embryos with bovine oviductal epithelial cells, Buffalo rat liver (BRL) cells, or BRL-cell-conditioned medium / / Theriogenology.—1996.—45.—P. 439—449. 55 КУЗНЕЦОВА И В. И ДР. 21. Thibodeaux I. К., Del Vecchio R. P., Hansel W. Role of platelet-derived growth factor in development of in vitro matured and in vitro fertilized bovine embryos / / J. Reprod. Fertil.-1993.—98, N 1,—P. 61—66. 22. Donnay I., Langendonckt A., Aiufuier P. Effects of co-culture and embryo number on the in vitro development of bovine embryos / / Theriogenology.—1997.—47 — P. 1549—1561. 23. Gandolfi F. Autocrine, paracrine and environmental factors influencing embryonic development from zygote to blastocyst / / Theriogenology.--1994.—41 —P. 95—100. 24. Thompson J. G. Comparison between in vivo-derived and in vifro-produced pre-elongation embryos Irom domestic rumi- nants / / Reprod. FertU. Dev.—1997"—9 —P. 341—354. 2 i . Berg U., Brem G. In vitro production of bovine blastocysts by in vitro maturation and fertilisation of oocytes and subsequent in vitro culture / / Zuchthygiene.—1989.—24, N 3.—P. 134— 139. 26. Carnegie J. Д., Durnford R., Algire J., Morgan J. Evaluation of mitomycin-treated Vero cells as a co-culture system for IVM/IVF-derived bovine embryos 11 Theriogenology.— 1997.—48.—P. 377—389. 27 . Katska L·, Rynska B., Smorag Z. The effect of co-culture system on developmental capacity of bovine IVM/IVF oocytes / / Theriogenology.—1995.—43.—P. 859—870. 28. Katska L. Hodowla zarodkow ssakow in vitro Il Med. Wet.— 1996 —11 — P. 6. 29. Keskintepe L, Brackett B. G. In \itro developmental com petence of in Wiro-matured bovine oocytes fertilized and cultured in completely defined media / / Biol. Reprod.— 1996.—55.—P. 333—339. 30. Takahashi >',, First N. I.. Jn vitro development of bovine one-cell embryos: influence of glucose, lactate, pyruvate, amino acids and vitamins / / Theriogenology—1992.—37.—P. 963— 978. 31. Mermillod P., Vansteenirugge A., Wils C. et al. Charac- terization of the enibryotrophic activity of exogenous protein- free oviduct-conditioned medium used in culture of cattle embryos / / Biol. Reprod.—1993.—49.—P. 582—587. 32. Rosenkrans C. F., Zeng C. Q., Menamara G. T. Development of bovine embryos in vitro as affected by energy substrates / / Biol. Reprod.—1993.—49.—P. 459—462. 33. Kim J. H., Funahashi H., Niwa K., Okuda K. Glucose requirement at different developmental stages of in vitro fertilized bovine embryos cultured in semi-defined medium / / Theriogenology.—1993.—39, N 4.—P. 875—886. 34. Lim J. M., Okitsu O., Okuda K., Niwa K. Effects of fetal calf serum in culture medium on development of bovine oocytes matured and fertilized in vitro Il Theriogenology.—1994.— 41.—P. 1091 — 1098. 35. Shamsuddin M., Larsson B., Gustafsson H., Rodriguez-Mar- tinez H. A serum-free, cell-free culture system for development of bovine one-cell embryos up to blastocyst stage with improved viability / / Theriogenology.—P. 1033—1043. 36. Kruip T. A. M., Daas J. H. G. In vitro produced and cloned embryos: effects on pregnancy, parturition and offspring 11 Theriogenology.—1997.—47, N 1.—P. 43—52. 37. Walker S. K., Hartwich K. M., Seamark R. F. The production of unusually large offspring following embryo manipulation: concepts and challenges / / Theriogenology.—1996.—45.— P. 111 — 120. 38. Massip A., Mermillod P., Dinnyes A. Morphology and bie chemistry of in vitro-produced bovine embryos: implications for their cryopreservation / / Hum. Reprod. (Oxf.).—1995.— 10.—P. 3004—3011. 39. Avery B., Madison V., Greve T. Sex and development iti bovine in vitro fertilized embryos / / Theriogenology. —1991 — 35, N 5.—P. 953—963. 40. Dominko T., First N. L. Relationship between the maturationnl state of oocytes at the time of insemination and sex ratio of subsequent early bovine embryos / / Theriogenology. —1997.— 47.—P. 1041 — 1050. 41. Bredbacka K., Bredbaeka P. Glucose controls sex-rtlated growth rate differences of bovine embryos produced in vitro Ί J. Reprod. Fertll.—1996.—106,—P. 169—172 УДК 576.37:591.3:636.2 Поступила в редакцию 02.06.98 .56

Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro

Institution

Similar Items