Противовирусные свойства новых искусственных белков, созданных на основе альбеферона и фрагмента LKDRHDF (30–36) из интерферона-α2 человека
Настоящая работа посвящена получению и исследованию биологических свойств двух искусственных белков с заданной функцией, созданных путем включения фрагмента LKDRHDE (30–36) из интерферона-α2 человека в N- и С-концевые последовательности альбеферона–искусственного белка с заданной структурой и функц...
Saved in:
| Published in: | Біополімери і клітина |
|---|---|
| Date: | 2002 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2002
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155991 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Противовирусные свойства новых 
 искусственных белков, созданных на 
 основе альбеферона и фрагмента LKDRHDF 
 (30–36) из интерферона-α2
 человека / Р.В. Черткова, Н.А. Степаненко, Д.А. Долгих, // Вiopolymers and Cell. — 2002. — Т. 18, № 2. — С. 
 161-163. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860087952289300480 |
|---|---|
| author | Черткова, Р.В. Степаненко, Н.А. Долгих, Д.А. |
| author_facet | Черткова, Р.В. Степаненко, Н.А. Долгих, Д.А. |
| citation_txt | Противовирусные свойства новых 
 искусственных белков, созданных на 
 основе альбеферона и фрагмента LKDRHDF 
 (30–36) из интерферона-α2
 человека / Р.В. Черткова, Н.А. Степаненко, Д.А. Долгих, // Вiopolymers and Cell. — 2002. — Т. 18, № 2. — С. 
 161-163. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Біополімери і клітина |
| description | Настоящая работа посвящена получению и исследованию биологических свойств двух искусственных белков с заданной функцией, созданных путем включения фрагмента LKDRHDE (30–36) из интерферона-α2 человека в N- и С-концевые последовательности альбеферона–искусственного белка с заданной структурой и функцией. На клеточных культурах L-41 и VERO показано, что оба белка обладают противовирусной активностью и практически не обнаруживают цитотоксических свойств.
Роботу присвячено отриманню і дослідженню біологічних властивостей двох штучних білків із заданою функцією, ствоних шляхом включення фрагмента LKDRHDF (30–36) з інтерферону α2-людини в N- і С-кінцеві послідовності альбеферону – штучного білка з заданою структурою і функцією. На клітинних культурах L-41 та VERO показано, що обом білкам притаманна противірусна активність і вони майже зовсім не проявляють цитотоксичних властивостей.
Two biologically active de novo proteins, ABB1-11 and ABBI-1, were engineered by including the fragment LKDRHDF (30–36) from human interferon-α2 (HuJFN-α2) into the N- and C-termini of albeferon – de novo protein with predesigned structure and function. It was shown that both proteins prevented the destruction of the L-41 and VERO cell monolayers generated by cytopathical action of a virus with the efficiency of native HuIFN-α2 and did not possess cytotoxicological properties.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:21:08Z |
| format | Article |
| fulltext |
ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2002. Т. 18. № 2
Противовирусные свойства новых
искусственных белков, созданных на
основе альбеферона и фрагмента LKDRHDF
(30—36) из интерферона-а2 человека
Р. В. Черткова, Н. А. Степаненко, Д. А. Долгих
Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН
Ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Москва, 117997, Россия
Настоящая работа посвящена получению и исследованию биологических свойств двух искусствен
ных белков с заданной функцией, созданных путем включения фрагмента LKDRHDE (30—36) из
интерферона-аг человека в N- и С-концевые последовательности альбеферона—искусственного
белка с заданной структурой и функцией. На клеточных культурах L-41 и VERO показано, что
оба белка обладают противовирусной активностью и практически не обнаруживают цитотокси-
ческих свойств.
Введение. Альбеферон [1 ] получен путем введения
в N-концевую последовательность альбебетина —
искусственного белка с заданной структурой [2 ] —
пептидного фрагмента LKEKKYSP (130—137, пет
ля ДЕ) [3J, расположенного в консервативной
части молекулы ИФН-а 2 и участвующего в форми
ровании специфического центра связывания с ре
цептором интерферона [4 ]. Показано, что альбефе
рон обладает более высокой по сравнению с натив-
ным ИФН-а 2 бласт-трансформирующей активно
стью [1 ], а также более компактной и стабильной
структурой альбебетина [5]. В настоящей работе
получены два варианта (АВВІ-ІІ и АВВІ-І) альбе
ферона, содержащего последовательность из ИФН-
а2 LKDRHDF (30—36, петля АВХ — второго фраг
мента, участвующего в образовании центра взаи
модействия с рецептором [4 ], — в N- и С-конце-
вых последовательностях соответственно.
Материалы и методы. В работе использовали
реактивы производства фирм «ICN», «Sigma», «Ser-
va», «Віо-Rad» (США); «Реахим» (Россия). Олиго-
нуклеотиды синтезированы твердофазным фосфо-
амидитным методом в УНЦ ИБХ им. М. М. Шемя
кина и Ю. А. Овчинникова РАН.
Конструирование векторов. Генно-инженер
ные работы выполняли по стандартным методикам
© Р. В. ЧЕРТКОВА, Н. А. СТЕПАНЕНКО, Д. А. ДОЛГИХ, 2002
[6 ]. Введение олигонуклеотида, кодирующего
фрагмент LKDRHDF из ИФН-а 2, в ген альбеферо
на проводили с помощью полимеразной цепной
реакции (ПЦР).
Экспрессия рекомбинантных генов и выделе
ние искусственных белков. Экспрессию осуществ
ляли в клетках штамма Escherichia coli BL-21 (DE3)
pLysS («Novagen», США) в среде ТВ с антибиоти
ками [5]. Белки выделяли с помощью хроматогра
фии на анионообменном (Mono Q HR, «Віо-Rad»,
США) и металл-хелатном (Ni-NTA-SF, «Qiagen»,
США) сорбентах. Протеолиз гибридного белка про-
теазой «фактор Ха» («New England Biolabs», США)
и очистку целевых белков на Ni-NTA-SF проводи
ли согласно протоколам фирм-изготовителей.
Определение противовирусных и цитотокси-
ческих свойств. Клетки линий L-41 (мононуклеар-
ного лейкоза человека) и VERO (клетки почки
зеленой мартышки) культивировали в атмосфере
5 % С 0 2 при температуре 37 °С в среде RPMI-1640
с 10 мМ HEPES, 0,2 % NaHC0 3 , 2 мМ L-Gln,
2 мМ пируват натрия, 50 мкг/мл гентамицина,
10 %-й эмбриональной сывороткой теленка. Кон
центрация клеток для инициации роста составляла
2 10 клеток в 1 мл. Противовирусную активность
препаратов определяли по минимальной концент
рации, при которой наблюдается задержка цитопа-
тического действия (ЦПД 5 0) тест-вируса энцефало-
161
ЧЕРТКОВА Р. В., СТЕПАНЕНКО Н. А., ДОЛГИХ Д. А.
миокардита мышей (ЕМС) на 50 % [7 ]. Цитоток-
сические дозы (ЦТД 5 0) определяли аналогично, но
в отсутствие вируса [7 ].
Результаты и обсуждение. Олигонуклеотид,
кодирующий фрагмент LKDRHDF из ИФН-а 2, вво
дили в области гена альбеферона, соответствующие
N- и С-концевым последовательностям альбеферо
на, путем амплификации в ходе ПЦР обеих цепей
плазмидной ДНК. В качестве матричной ДНК для
ПЦР использовали вектор рЕТ32 1ЛС («Novagen»),
несущий ген альбеферона под контролем промотора
бактериофага Т7 совместно с геном тиоредоксина и
участками, кодирующими шесть остатков His и
участок узнавания IEGR протеазы «фактор Ха». В
ходе оптимизации экспрессии генов в клетках Е.
coli подобраны условия, при которых максималь
ный выход гибридных белков составлял 80—100 мг
на 1 л клеточной суспензии. Разработанная схема
выделения белков включала этапы хроматографии
на анионообменном и металл-хелатном сорбентах,
расщепление протеазой «фактор Ха», очистку це
левого белка на металл-хелатном сорбенте и позво
ляла получать до 12 мг/л клеточной суспензии.
Согласно данным масс-спектрометрии, значения
молекулярных масс полученных белков отвечали
рассчитанным (9,3 и 9,8 кДа для ABBI-I и ABBI-II
соответственно). Гомогенность полученных препа
ратов была подтверждена анализом последователь
ности девяти N-концевых аминокислотных остат
ков Met-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Tyr-Ser-Pro-.
При тестировании биологических свойств про
демонстрировано наличие потенциальной противо
вирусной активности у двух вариантов искусствен
ного белка (рисунок, а и б). Однако в обеих
клеточных культурах активность ABBI-I, в котором
фрагмент LKDRHDF располагается в С-концевой
последовательности альбеферона, на порядок ниже
по сравнению с ABBI-II, в котором фрагмент рас
полагается в N-концевой последовательности после
LKEKKYSP. По-видимому, расположение пептид
ных фрагментов в варианте ABBI-II в большей
степени способствует формированию специфиче
ского центра, необходимого для эффективного свя
зывания с рецептором интерферона. Эффектив
ность действия ABBI-II на обеих клеточных куль
турах сопоставима с действием препаратов ИФН-а 2,
ИФН-у и вместе с тем заметно ниже по сравнению
с интерлейкинами IL-2, IL-4 и фактором некроза
опухоли человека (TNF-a). Альбеферон, использо
ванный в качестве стандарта, также обнаружил
слабые противовирусные свойства, которые, по-ви
димому, опосредованы наличием у него иммуномо-
дулирующей активности. Все четыре искусствен
ных белка проявляли цитотоксические свойства
лишь при сравнительно высоких концентрациях
(таблица).
ЛВВІ ABBI-1 Ш-* 11^4
ADD ABBI-II FFN-a IL-2 TNF-v
Противовирусная активность искусственных белков. Противови
русные свойства в культурах клеток VERO (а) и L-41 (б)
определены по минимальной концентрации препарата, вызыва
ющей задержку цитопатического действия вируса ЕМС на
50 %. Приведены средние значения трех независимых экспери
ментов; стандартные отклонения не превышали 47 %
Цитотоксические свойства искусственных белков
П р и м е ч а н и е . Приведены цитотоксические дозы,
определяемые как минимальные концентрации препаратов, вы
зывающие деструкцию 50 % клеточного монослоя в отсутствие
вируса ЕМС.
Таким образом, в результате работы сконстру
ированы два искусственных белка с заданными
противовирусными свойствами. Получены генно-
инженерные конструкции и разработана эффектив
ная система биосинтеза, выделения и очистки этих
белков, что позволило наработать оба варианта в
162
ПРОТИВОВИРУСНЫЕ СВОЙСТВА НОВЫХ ИСКУССТВЕННЫХ БЕЛКОВ
количествах, достаточных для анализа антивирус
ных и цитотоксических свойств. Показано, что оба
белка обладают антивирусной активностью, что
позволяет предположить возможность использова
ния этих белковых препаратов в биотехнологии,
фармакологии и биомедицине. Полученные резуль
таты служат основанием для дальнейших исследо
ваний (как in vitro, так и in vivo) биологических
свойств наших белков, а также изучения их струк
турных особенностей.
Авторы выражают благодарность В. П. Завья
лову за предложение использовать фрагмент (30—
36) из ИФН-а 2 для конструирования искусствен
ных белков, а также В. М. Абрамову и М. В.
Мезенцевой — за ценные советы и помощь при
исследовании биологической активности белков.
R. V. Chertkova, N. A Stepanenko, D. A. Dolgikh
Antiviral properties of de novo designed proteins based on the
albeferon and the fragment LKDRHDF (30—36) from human
interferon-^
Summary
Two biologically active de novo proteins, ABB1-11 and ABBJ-I,
were engineered by including the fragment LKDRHDF (30—36)
from human interferon-a2 (HuIFN-a2) into the N- and C-termini
of albeferon —de novo protein with pre-designed structure and
function. It was shown that both proteins prevented the destruction
of the L-41 and VERO cell monolayers generated by cytopathical
action of a virus with the efficiency of native HuIFN-a2 and did not
possess cytotoxicological properties.
P. В. Черткова, H. О. Степаненко, Д. А. Долгих
Противірусні властивасті нових штучних білків, створених на
основі альбеферону і фрагмента LKDRHDF (30—36) з
інтерферону а2-людини
Резюме
Роботу присвячено отриманню і дослідженню біологічних вла
стивостей двох штучних білків із заданою функцією, створе
них шляхом включення фрагмента LKDRHDF (30—36) з
інтерферону аг-людини в N- і С-кінцеві послідовності альбефе
рону — штучного білка з заданою структурою і функцією. На
клітинних культурах L-41 та VERO показано, що обом білкам
притаманна противірусна активність і вони майже зовсім не
проявляють цитотоксичних властивостей.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Dolgikh D. A., Uversky V. N.t Gabrielyan A E., Chemeris V.
V., Fedorov A N.t Navolotskaya Y. V., ZaVyalov V. P.,
Kirpichnikov M. P. The de novo protein with grafted biological
function: transferring of the interferon blast-transforming ac
tivity to albebetin / / Protein Eng.—1996.—9, N 2.—P. 195—
201.
2. Fedorov A. N., Dolgikh D. A., Chemeris V. V., Chernov В. К,
Finkelstain A. V., Schulga A. A , Alakhov Yu. В., Kirpich
nikov M. P., Ptitsyn О. B. De novo design, synthesis and study
of albebetin, a polypeptide with a predetermined three-dimen
sional structure / / J. Мої. Biol.—1992. —225. —P. 927—931.
3. ZaVyalov V. P., Navolotskaya E. V, Vasilenko R. N,
Abramov V. M., Volodina E. Y., Roslovtseva O. A., Prusakov
A N., Kaurov O. A. The sequence 130—137 of human
interferon-^ is involved in the competition of interferon,
pro thymosin and holera toxin B subunit for common receptors
on human fibroblasts / / Мої. Immunol.—1995.—32, N 6.—
P. 425—431.
4. ZaVyalov V. P. Interferons a/f$ and their receptors: from
structure-function studies to the design of de novo protein with
the grafted active site of human interferon-a2 / / Proc. of the
first ISTC Symp. ^Immunoglobulins, molecular chaperones and
immunity*.—Turku, 1995.—P. 45—68.
5. Aphsizheva /. Yu., Dolgikh D. A , Abdullaev Z. 1С, Uversky V.
N., Kirpichnikov M. P., Ptitsyn О. B. Can grafting of an
octapeptide improve of a de novo protein? / / FEBS Lett.—
1998.—N 425/1.—P. 101—104.
6. Maniatis Т., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning: A
laboratory manual.—New York: Cold Spring Harbor Lab.
press, 1982.
7. Чижов H. П., Ершов Ф. И., Индулен М. 1С Основы
экспериментальной химиотерапии вирусных инфекций.—
Рига: «Зинатне», 1988.
УДК 577.322
Надійшла до редакції 22.10.01
163
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155991 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:21:08Z |
| publishDate | 2002 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Черткова, Р.В. Степаненко, Н.А. Долгих, Д.А. 2019-06-17T16:19:07Z 2019-06-17T16:19:07Z 2002 Противовирусные свойства новых 
 искусственных белков, созданных на 
 основе альбеферона и фрагмента LKDRHDF 
 (30–36) из интерферона-α2
 человека / Р.В. Черткова, Н.А. Степаненко, Д.А. Долгих, // Вiopolymers and Cell. — 2002. — Т. 18, № 2. — С. 
 161-163. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0005F9 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155991 577.322 Настоящая работа посвящена получению и исследованию биологических свойств двух искусственных белков с заданной функцией, созданных путем включения фрагмента LKDRHDE (30–36) из интерферона-α2 человека в N- и С-концевые последовательности альбеферона–искусственного белка с заданной структурой и функцией. На клеточных культурах L-41 и VERO показано, что оба белка обладают противовирусной активностью и практически не обнаруживают цитотоксических свойств. Роботу присвячено отриманню і дослідженню біологічних властивостей двох штучних білків із заданою функцією, ствоних шляхом включення фрагмента LKDRHDF (30–36) з інтерферону α2-людини в N- і С-кінцеві послідовності альбеферону – штучного білка з заданою структурою і функцією. На клітинних культурах L-41 та VERO показано, що обом білкам притаманна противірусна активність і вони майже зовсім не проявляють цитотоксичних властивостей. Two biologically active de novo proteins, ABB1-11 and ABBI-1, were engineered by including the fragment LKDRHDF (30–36) from human interferon-α2 (HuJFN-α2) into the N- and C-termini of albeferon – de novo protein with predesigned structure and function. It was shown that both proteins prevented the destruction of the L-41 and VERO cell monolayers generated by cytopathical action of a virus with the efficiency of native HuIFN-α2 and did not possess cytotoxicological properties. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Біополімери і клітина Матеріали конференції Противовирусные свойства новых искусственных белков, созданных на основе альбеферона и фрагмента LKDRHDF (30–36) из интерферона-α2 человека Противірусні властивасті нових штучних білків, створених на основі альбеферону і фрагмента LKDRHDF (30–36) з інтерферону α2-людини Antiviral properties of de novo designed proteins based on the albeferon and the fragment LKDRHDF (30–36) from human interferon-α2 Article published earlier |
| spellingShingle | Противовирусные свойства новых искусственных белков, созданных на основе альбеферона и фрагмента LKDRHDF (30–36) из интерферона-α2 человека Черткова, Р.В. Степаненко, Н.А. Долгих, Д.А. Матеріали конференції |
| title | Противовирусные свойства новых искусственных белков, созданных на основе альбеферона и фрагмента LKDRHDF (30–36) из интерферона-α2 человека |
| title_alt | Противірусні властивасті нових штучних білків, створених на основі альбеферону і фрагмента LKDRHDF (30–36) з інтерферону α2-людини Antiviral properties of de novo designed proteins based on the albeferon and the fragment LKDRHDF (30–36) from human interferon-α2 |
| title_full | Противовирусные свойства новых искусственных белков, созданных на основе альбеферона и фрагмента LKDRHDF (30–36) из интерферона-α2 человека |
| title_fullStr | Противовирусные свойства новых искусственных белков, созданных на основе альбеферона и фрагмента LKDRHDF (30–36) из интерферона-α2 человека |
| title_full_unstemmed | Противовирусные свойства новых искусственных белков, созданных на основе альбеферона и фрагмента LKDRHDF (30–36) из интерферона-α2 человека |
| title_short | Противовирусные свойства новых искусственных белков, созданных на основе альбеферона и фрагмента LKDRHDF (30–36) из интерферона-α2 человека |
| title_sort | противовирусные свойства новых искусственных белков, созданных на основе альбеферона и фрагмента lkdrhdf (30–36) из интерферона-α2 человека |
| topic | Матеріали конференції |
| topic_facet | Матеріали конференції |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155991 |
| work_keys_str_mv | AT čertkovarv protivovirusnyesvoistvanovyhiskusstvennyhbelkovsozdannyhnaosnovealʹbeferonaifragmentalkdrhdf3036izinterferonaα2čeloveka AT stepanenkona protivovirusnyesvoistvanovyhiskusstvennyhbelkovsozdannyhnaosnovealʹbeferonaifragmentalkdrhdf3036izinterferonaα2čeloveka AT dolgihda protivovirusnyesvoistvanovyhiskusstvennyhbelkovsozdannyhnaosnovealʹbeferonaifragmentalkdrhdf3036izinterferonaα2čeloveka AT čertkovarv protivírusnívlastivastínovihštučnihbílkívstvorenihnaosnovíalʹbeferonuífragmentalkdrhdf3036zínterferonuα2lûdini AT stepanenkona protivírusnívlastivastínovihštučnihbílkívstvorenihnaosnovíalʹbeferonuífragmentalkdrhdf3036zínterferonuα2lûdini AT dolgihda protivírusnívlastivastínovihštučnihbílkívstvorenihnaosnovíalʹbeferonuífragmentalkdrhdf3036zínterferonuα2lûdini AT čertkovarv antiviralpropertiesofdenovodesignedproteinsbasedonthealbeferonandthefragmentlkdrhdf3036fromhumaninterferonα2 AT stepanenkona antiviralpropertiesofdenovodesignedproteinsbasedonthealbeferonandthefragmentlkdrhdf3036fromhumaninterferonα2 AT dolgihda antiviralpropertiesofdenovodesignedproteinsbasedonthealbeferonandthefragmentlkdrhdf3036fromhumaninterferonα2 |