Термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(ApCpGpT)

Термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(ApCpGpT)

На импульсном ЯMP спектрометре (500 МГц) исследованы температурные зависи­мости химических сдвигов необменивающихся протонов бромистого этидия в смеси с дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатом 5'-d(ApCpGpT) в водном растворе. Исполь­зованы оригинальные методики расчета термодинамических параметров...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Published in:Биополимеры и клетка
Date:1995
Main Authors: Веселков, А.Н., Дымант, Л.Н., Болотин, П.А., Барановский, С.Ф., Дэвис, Д.
Format: Article
Language:Russian
Published: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1995
Online Access:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156183
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(ApCpGpT) / А.Н. Веселков, Л.Н. Дымант, П.А. Болотин, С.Ф. Барановский, Д. Дэвис // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 5. — С. 37-45. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156183
record_format dspace
spelling Веселков, А.Н.
Дымант, Л.Н.
Болотин, П.А.
Барановский, С.Ф.
Дэвис, Д.
2019-06-18T09:43:38Z
2019-06-18T09:43:38Z
1995
Термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(ApCpGpT) / А.Н. Веселков, Л.Н. Дымант, П.А. Болотин, С.Ф. Барановский, Д. Дэвис // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 5. — С. 37-45. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.
0233-7657
DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0003F9
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156183
577.113
На импульсном ЯMP спектрометре (500 МГц) исследованы температурные зависи­мости химических сдвигов необменивающихся протонов бромистого этидия в смеси с дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатом 5'-d(ApCpGpT) в водном растворе. Исполь­зованы оригинальные методики расчета термодинамических параметров комплексообразования, которые позволяют в условиях сложного равновесия в растворе выделить вклад в результирующее изменение энтальпии (ΔН) и энтропии (ΔS) каждой из реак­ции, приводящих к формированию комплексов 1:1, 2:1, 1:2 и 2:2 молекул красителя и тетрануклсотида. Определены свободные энергии Гиббса, энтальпии и энтропии для реакций.
На імпульсному ЯМР спектрометрі (500 МГц) досліджено температурні залежності хімічних зсувів протонів, що не обмінюються, бромистого стидію в суміші з дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатом 5' -d (ApCpGpT) у водному розчині. Використано ори­гінальні методики розрахунку термодинамічних параметрів комплексоутворепня, які дозволяють за умов складної рівноваги у розчині вирізнити внесок у результуючу зміну ентальпії (ΔH) і ентропії (ΔS) кожної з реакцій, які призводять до форму­вання комплексів 1:1, 2:1, 1:,2 і 2:2 молекул барвника і тетрануклеотиду. Визначено вільні енергії Гіббса, ентальпії і ентропії для цих реакцій.
Temperature dependences of the chemical shifts of non-exchangeable ethidium bromide protons in a mixture with the deoxytetranucleoside triphosphate 5'-d(ApCpGpT) in aqueous solution have been investigated with a pulsed n. m. r. spectrometer (500 MHz). Original methods of calculation of thermodynamic parameters of complexing, which gives an opportunity to get individual contributions of each reaction leading to the formation of 1:1, 1:2, 2:1 and 2:2 complexes of dye and tetranucleotide molecules in conditions of the composite equilibrium in solution, have been used. The free Qibbs energies, enthalpies and entropies of these reactions have been determined.
ru
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Биополимеры и клетка
Термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(ApCpGpT)
Термодинаміка взаємодії фенантридинового барвника бромистого етидію з дезокситетрануклеотидом 5'-d(ApCpGpT)
Thermodynamics of phenantridinium dye ethidium bromide interaction with deoxytetranucleotide 5'-d(ApCpGpT)
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(ApCpGpT)
spellingShingle Термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(ApCpGpT)
Веселков, А.Н.
Дымант, Л.Н.
Болотин, П.А.
Барановский, С.Ф.
Дэвис, Д.
title_short Термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(ApCpGpT)
title_full Термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(ApCpGpT)
title_fullStr Термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(ApCpGpT)
title_full_unstemmed Термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(ApCpGpT)
title_sort термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(apcpgpt)
author Веселков, А.Н.
Дымант, Л.Н.
Болотин, П.А.
Барановский, С.Ф.
Дэвис, Д.
author_facet Веселков, А.Н.
Дымант, Л.Н.
Болотин, П.А.
Барановский, С.Ф.
Дэвис, Д.
publishDate 1995
language Russian
container_title Биополимеры и клетка
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format Article
title_alt Термодинаміка взаємодії фенантридинового барвника бромистого етидію з дезокситетрануклеотидом 5'-d(ApCpGpT)
Thermodynamics of phenantridinium dye ethidium bromide interaction with deoxytetranucleotide 5'-d(ApCpGpT)
description На импульсном ЯMP спектрометре (500 МГц) исследованы температурные зависи­мости химических сдвигов необменивающихся протонов бромистого этидия в смеси с дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатом 5'-d(ApCpGpT) в водном растворе. Исполь­зованы оригинальные методики расчета термодинамических параметров комплексообразования, которые позволяют в условиях сложного равновесия в растворе выделить вклад в результирующее изменение энтальпии (ΔН) и энтропии (ΔS) каждой из реак­ции, приводящих к формированию комплексов 1:1, 2:1, 1:2 и 2:2 молекул красителя и тетрануклсотида. Определены свободные энергии Гиббса, энтальпии и энтропии для реакций. На імпульсному ЯМР спектрометрі (500 МГц) досліджено температурні залежності хімічних зсувів протонів, що не обмінюються, бромистого стидію в суміші з дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатом 5' -d (ApCpGpT) у водному розчині. Використано ори­гінальні методики розрахунку термодинамічних параметрів комплексоутворепня, які дозволяють за умов складної рівноваги у розчині вирізнити внесок у результуючу зміну ентальпії (ΔH) і ентропії (ΔS) кожної з реакцій, які призводять до форму­вання комплексів 1:1, 2:1, 1:,2 і 2:2 молекул барвника і тетрануклеотиду. Визначено вільні енергії Гіббса, ентальпії і ентропії для цих реакцій. Temperature dependences of the chemical shifts of non-exchangeable ethidium bromide protons in a mixture with the deoxytetranucleoside triphosphate 5'-d(ApCpGpT) in aqueous solution have been investigated with a pulsed n. m. r. spectrometer (500 MHz). Original methods of calculation of thermodynamic parameters of complexing, which gives an opportunity to get individual contributions of each reaction leading to the formation of 1:1, 1:2, 2:1 and 2:2 complexes of dye and tetranucleotide molecules in conditions of the composite equilibrium in solution, have been used. The free Qibbs energies, enthalpies and entropies of these reactions have been determined.
issn 0233-7657
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156183
citation_txt Термодинамика взаимодействия фенантридинового красителя бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5-d(ApCpGpT) / А.Н. Веселков, Л.Н. Дымант, П.А. Болотин, С.Ф. Барановский, Д. Дэвис // Биополимеры и клетка. — 1995. — Т. 11, № 5. — С. 37-45. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.
work_keys_str_mv AT veselkovan termodinamikavzaimodeistviâfenantridinovogokrasitelâbromistogoétidiâsdezoksitetranukleotidom5dapcpgpt
AT dymantln termodinamikavzaimodeistviâfenantridinovogokrasitelâbromistogoétidiâsdezoksitetranukleotidom5dapcpgpt
AT bolotinpa termodinamikavzaimodeistviâfenantridinovogokrasitelâbromistogoétidiâsdezoksitetranukleotidom5dapcpgpt
AT baranovskiisf termodinamikavzaimodeistviâfenantridinovogokrasitelâbromistogoétidiâsdezoksitetranukleotidom5dapcpgpt
AT dévisd termodinamikavzaimodeistviâfenantridinovogokrasitelâbromistogoétidiâsdezoksitetranukleotidom5dapcpgpt
AT veselkovan termodinamíkavzaêmodíífenantridinovogobarvnikabromistogoetidíûzdezoksitetranukleotidom5dapcpgpt
AT dymantln termodinamíkavzaêmodíífenantridinovogobarvnikabromistogoetidíûzdezoksitetranukleotidom5dapcpgpt
AT bolotinpa termodinamíkavzaêmodíífenantridinovogobarvnikabromistogoetidíûzdezoksitetranukleotidom5dapcpgpt
AT baranovskiisf termodinamíkavzaêmodíífenantridinovogobarvnikabromistogoetidíûzdezoksitetranukleotidom5dapcpgpt
AT dévisd termodinamíkavzaêmodíífenantridinovogobarvnikabromistogoetidíûzdezoksitetranukleotidom5dapcpgpt
AT veselkovan thermodynamicsofphenantridiniumdyeethidiumbromideinteractionwithdeoxytetranucleotide5dapcpgpt
AT dymantln thermodynamicsofphenantridiniumdyeethidiumbromideinteractionwithdeoxytetranucleotide5dapcpgpt
AT bolotinpa thermodynamicsofphenantridiniumdyeethidiumbromideinteractionwithdeoxytetranucleotide5dapcpgpt
AT baranovskiisf thermodynamicsofphenantridiniumdyeethidiumbromideinteractionwithdeoxytetranucleotide5dapcpgpt
AT dévisd thermodynamicsofphenantridiniumdyeethidiumbromideinteractionwithdeoxytetranucleotide5dapcpgpt
first_indexed 2025-11-26T08:33:08Z
last_indexed 2025-11-26T08:33:08Z
_version_ 1850615817475981312
fulltext УДК 577.113 А. Н. Веселков, Л. Н. Дымант, П. А. Болотин, С. Ф. Барановский, Д. Дэвис ТЕРМОДИНАМИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕНАНТРИДИНОВОГО КРАСИТЕЛЯ БРОМИСТОГО ЭТИДИЯ С ДЕЗОКСИТЕТРАНУКЛЕОТИДОМ 5-d(ApCpGpT) На импульсном Я MP спектрометре (500 МГц) исследованы температурные зависи­ мости химических сдвигов необменивающихся протонов бромистого этидия в смеси с дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатом 5'-d(ApCpGpT) в водном растворе. Исполь­ зованы оригинальные методики расчета термодинамических параметров комплексооб- разования, которые позволяют в условиях сложного равновесия в растворе выделить вклад в результирующее изменение энтальпии (АН) и энтропии (AS) каждой из реак­ ции, приводящих к формированию комплексов 1:1, 2:1, 1:2 и 2:2 молекул красителя и тетрануклсотида. Определены свободные энергии Гиббса, энтальпии и энтропии для реакций. Введение. Ранее [1] методом одномерной и двухмерной спектроскопии !Н-ЯМР изучено комплексообразование фенантридинового красителя бромистого этидия с самокомплементарным дезокситетрарибонуклео- зидтрифосфатом 5'-d(ApCpGpT) при фиксированной температуре. На основе исследований концентрационных зависимостей химических сдви­ гов ядер взаимодействующих молекул и двухмерных спектров NOE оп­ ределены типы образующихся в растворе комплексов, найдены их рав­ новесные концентрации и построены наиболее вероятные структуры этих комплексов. Термодинамические исследования важны для анали­ за характера межмолекулярных взаимодействий в процессе связыва­ ния лигандов с олигонуклеотидными последовательностями. В недавно опубликованном обзоре [2], посвященном исследованию взаимодейст­ вия лигандов с ДНК методом ЯМР спектроскопии, отмечается, что для лучшего понимания процессов узнавания на молекулярном уровне тре­ буется более детальное по сравнению с имеющимся в настоящее вре­ мя термодинамическое описание, включающее анализ закономерностей изменения как энтальпии Д#, так и энтропии AS при связывании ли­ гандов с ДНК и коррелирующее с соответствующими структурными исследованиями. В настоящей работе для определения термодинамических характе­ ристик реакций комплексообразования изучены температурные зави­ симости химических сдвигов протонов молекул в растворе бромистого этидия и дезокситетрануклеотида 5'-d(ApCpGpT). Использованы пред­ ложенные ранее [3] методики расчета термодинамических парамет­ ров комплексообразования, которые позволяют в аддитивном прибли­ жении дифференцированно оценить вклады реакций, приводящих к формированию различных типов комплексов в условиях равновесия в растворе. _ ^ Методика эксперимента. Одномерные спектры *Н-ЯМР измерены на импульсном спектрометре «JEOL GSX 500» с резонансной частотой 500 МГц в диапазоне температур от 283 до 353 К. Двухмерные гомо- ядерные COSY- и NOESY-эксперименты, использованные для отнесе­ ния сигналов всех необменивающихся протонов в ПМР спектрах сме­ шанных растворов, выполнены при фиксированной температуре Т= = 298 К па спектрометре «Bruker WHX» (600 МГц). Химические сдви­ ге) Д. II. ИР.СЛ-ДКОВ. Л. П. ДЫЛШ1Т, П. Л. БОЛОТИН, С. Ф. БАРАНОВСКИЙ, Д. ДЭВИС, 1995 ISSN 1Ш,3-70Г),. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, ІУУ5. Т. 11, № 5 37 ги необменивающихся протонов определяли относительно ДСС (2,2- диметил-2-силапентан-5-сульфокислота); в качестве внутреннего стан­ дарта использовали ТМА (бромид тетраметиламмония). Методика приготовления образцов и проведения эксперимента описана в [1]. Образцы бромистого этидия («Sigma», США) и дезокситетрарибонук- леозидтрифосфата 5'-d(ApCpGpT), синтезированного «Oswel DNA Ser­ vice» (Великобритания), лиофилизировали из D2O с изотопной чисто- Рис. 1. Спектры ]Н-ЯМР (600 МГц) водного раствора бромистого этидия и тетра- нуклеотида 5'-d(ApCpGpT) (D0= 1,23-10~3 М, N0 = 2,I4-10~3 М) при различных тем­ пературах: / — 40; 2 — 60; 3 — 80 °С той 99,95 % и растворяли в дейтерированном 0,1 М Na-фосфатном бу­ фере (pD = 7,l). Температуру в процессе измерений стабилизировали терморегулятором «JEOL NM-GVT3» с точностью ±0,2 °С. Результаты и обсуждение. Сигналы в ПМР спектрах смешан­ ных растворов бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5'-сЦАрСрСрТ) отождествляли на основе двухмерных гомоядерных COSY- и NOESY-экспериментов [,1, 4, 5]. На рис. 1 представлены из­ меренные при различных температурах одномерные спектры 'И-ЯМР раствора тетрануклеотида с красителем в области слабого поля, вклю­ чающего в себя резонансы ароматических протонов иуклеотидов, ИГ иезоксирибозных колец и протонов бромистого этидия. Видно, что паи- 38 ISSN 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1995. Т. Il.JVsS большие изменения положения резонансных линий в спектрах с по­ вышением температуры наблюдаются для всех необменивающихся протонов красителя, резонансы протонов тетрануклеотида испытыва­ ют значительно меньшие смещения. Существенно зависит от темпера­ туры и ширина спектральных линий, их тонкая структура отчетливо проявляется в области высоких температур. Следует отметить, что ка­ чественно аналогичный характер температурных изменений *Н-ЯМР 6, млн~1 Рис. 2. Экспериментальные температурные зависимости химических сдвигов протонов бромистого этидия в растворе красителя с тетрануклеотидом 5'-d(ApCpGpT) (D0 = -1,23-10-з М, W0 = 2,14-10-3 М): / — Н І ; 2 — Н10; 3 — Н9; 4 — Н4; 5 —Н2; 6 — Н7 Рис. 3. Расчетные зависимости мольных долей бромистого этидия и комплексов кра­ сителя с тетрануклеотидом 5'-d(ApCpGpT.) от температуры: 1 — мономер бромистого этидия; 2 — комплекс 1:1; 5 — 2 : 1 ; 4 — 1:2; 5 — 2 : 2 спектров наблюдается и в водных растворах акридинового красите­ ля профлавина с 5'-d(ApCpGpT) в идентичных экспериментальных условиях [6]. На рис. 2 приведены температурные зависимости химических сдви­ гов протонов бромистого этидия в растворе с тетрануклеотидом. Об­ ращает на себя внимание тот факт, что эти экспериментальные кривые имеют явно выраженную S-образную форму. Последнее, очевидно, обу­ словлено кооперативным характером распада комплексов красителя с дуплексом тетрануклеотида при повышении температуры и выходом бромистого этидия в раствор. Ранее [1] на основании концентрацион­ ных зависимостей химических сдвигов протонов молекул и спектров 2M-NOE показано, что в растворе существует равновесие различных типов комплексов красителя с тетрануклеотидом, а также мономерных и ассоциированных форм взаимодействующих молекул. При этом в ра­ створе бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5'-d(ApCpGpT) при достаточно малых концентрациях образцов (•— 0̂,5- ІО^3 М) наибо­ лее вероятными являются процессы димеризации молекул и образова­ ние комплексов 1 : 1 , 2 : 1 , 1 : 2 и 2 : 2. Учитывали возможность форми­ рования комплекса 1 : 2 бромистого этидия с тетрануклеотидом d(ACGT), как и в случае с профлавином [6], двумя различными спо­ собами— непосредственное связывание красителя с дуплексом и об­ разование этого комплекса в результате взаимодействия мономера тетрануклеотида с 1 : 1-комплексом, где бромистый этидий играет роль «скрепки». Такие «скрепочные» 1 : 2-комплексы бромистого этидия с d(ACGT), в отличие от профлавина, не имеют существенного значе­ ния для суммарного равновесия в растворе, что определяется доста­ точно низкой вероятностью их формирования из-за особенностей хи­ мической структуры фенантридинового красителя. Последнее связано с наличием в молекуле бромистого этидия достаточно объемных боко- ЬНОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1995. Т. К. № 5 39 вых заместителей — фенольного кольца и этильной группы, располо­ женных в пространстве вне плоскости фенантридинового хромофора, которые создают определенные стерические препятствия для образова­ ния «скрепочного» комплекса в растворе [1]. Термодинамические параметры реакций комплексообразования оце­ нивали на основе аддитивной модели для наблюдаемого химического сдвига. Для этого определяли зависимости мольных долей различного типа комплексов от температуры [Э]: бі (Т) = / т (7) 8mi + fd (T) 8di + У fh (T) 8ki, (1) ГДЄ б т г , 8di, 8ц—б4г И fm(T), fd(T), f\{T) f±{T)—ЗНаЧЄНИЯ ХИМИЧЄ- ских сдвигов f-го протона бромистого этидия и равновесные мольные доли красителя при температуре Т для его моно- и димерной форм, а также для указанных выше комплексов с тетрануклеотидом соответ­ ственно. В соотношении (1) предполагается, что величины 8пи, 6̂ ,-, біг—б4г не зависят от температуры в исследованном температурном интервале. Допустимость такого приближения показана при исследо­ вании взаимодействия акридинового красителя профлавина с ди- и тетрануклеотидами [3, 7]. В предлагаемой модели (1) влияние тем­ пературы на значения б учитывается тем, что мольные доли fm, fd и f\—А, однозначно1 связанные с равновесными константами образования комплексов К\—КА, являются функцией температуры. Установление значений констант равновесия при различных температурах позволяет определить термодинамические параметры комплексообразования — энтальпию (АН) и энтропию (AS) для указанных типов комплексов. Величины АН и AS, как и в [3], рассчитывали двумя различными способами. С п о с о б 1. Расчетная методика предусматривает использование параметрических регрессионных уравнений для анализа зависимости мольных долей fm> fd, f\—/4 от температуры. Подробное описание ме­ тодики составления регрессионных уравнений для соответствующих ти­ пов комплексов дано в работе [3]. Вычислительный эксперимент по­ казал, что использование регрессионных уравнений в виде многочленов 2-го и 3-го порядков относительно температуры для анализа мольных долей димеров бромистого этидия и комплексов красителя с мономе­ ром тетрануклеотида, как это делалось ранее в случае комплексооб­ разования профлавина с дезокситетрануклеотидами [3], оказалось не­ достаточно эффективным для аппроксимации «явно выраженных» S- образных экспериментальных зависимостей (рис. 2). В связи с этим для мольных долей димерного комплекса красителя, а также для ком­ плексов 1 : 1 и 2 : 1 бромистого этидия с тетрануклеотидами использо­ вали экспоненциальные зависимости от температуры [8], что позволи­ ло получить более точную аппроксимацию экспериментальных кривых. Как и ранее [3], регрессионные уравнения конкретизировали с учетом известных мольных долей при температуре Ті = 298 К, найденных в процессе исследований концентрационных зависимостей химических сдвигов взаимодействующих молекул [1]. Учитывали также тот факт, что при высоких температурах (Г 0^373 К) практически весь краси­ тель в растворе находится в мономерной форме, т. е. /т(Г0) = 1. В ре­ зультате температурная зависимость химического сдвига протондв бромистого этидия может быть представлена в форме: S, (Т) = / т (Г) 6 т 1 + {/„ (Тг) ехр|а , ^ L ~ Г> вых заместителей — фенольного кольца и этильной группы, располо­ женных в пространстве вне плоскости фенантридинового хромофора, которые создают определенные стерические препятствия для образова­ ния «скрепочного» комплекса в растворе [1]. Термодинамические параметры реакций комплексообразования оце­ нивали на основе аддитивной модели для наблюдаемого химического сдвига. Для этого определяли зависимости мольных долей различного типа комплексов от температуры [Э]: где ady Яі, а2—параметры регрессионных уравнений для мольных до­ лей димеров красителя и комплексов 1:1 и 2 : 1 бромистого этидия с мономером тетрануклеотида: ф(Г) —параметрическое регрессионное соотношение в виде многочлена; SkT= (T/Qk)bb, Qk и bk— параметры регрессионных уравнений для мольных долей комплексов 1:2 и 2 : 2 бромистого этидия с дуплексом тетрануклеотида. Аппроксимирующие зависимости для fs(T) и !А{Т) представлены в форме, обычно исполь­ зуемой для описания кооперативных переходов типа «спираль — клу­ бок» [3]. Величина 9л при такой зап'иси регрессионного уравнения со­ ответствует температуре «плавления» комплекса, т. е. температуре, при которой мольная доля данного комплекса уменьшается в два раза по сравнению с его содержанием при низких температурах ( ~ 2 7 3 К) . Величину fm{T), входящую в уравнение (2), находили из соотношения L(T) + fd(T)+JZfh(T)=i. (3) / г = 1 Вычислительная процедура нахождения параметров регрессионных уравнений, основанная на минимизации квадратичного функционала невязки с использованием экспериментальных температурных зависи­ мостей химических сдвигов различных протонов красителя, достаточ­ но подробно описана в [3]. На рис. 3 представлены зависимости мольных долей различных типов комплексов, а также мономеров бромистого этидия от темпера­ туры. Характерно, что здесь во многом проявляются те же закономер­ ности, которые имели место при комплексообразовании акридинового красителя профлавппа с рассматриваемым тетрануклеотидом [6р. Видно, что при низких температурах краситель в основном находится в связанном состоянии. Содержание 1 : 1-комплексов монотонно умень­ шается с повышением температуры, но остается значительным вплоть до высоких температур ( 7 ^ 3 5 3 К), в то время как доля комплекса 2 : 1 достаточно мала во всем исследованном диапазоне температур. Бромистый этидий оказывает стабилизирующий эффект на двухспи- ральную структуру дезокситетрануклеотида 5'-d(ApCpGpT); харак­ терная температура перехода Тил (температура «плавления») для дуп­ лекса в растворе с бромистым этидием примерно па 16 °С превышает таковую для тетрамера без лиганда [5]. Величина Г„л, определяемая непосредственно по экспериментальным зависимостям химического сдвига (рис. 2), приблизительно на 4—5 °С меньше, чем температура «плавления» комплекса 1 :2 (кривая 3, рис. 3). В связи с этим важно отметить, что экспериментально наблюдаемые кривые «плавления» для подобных многокомпонентных систем имеют усредненный характер, и без соответствующего количественного анализа нельзя однозначно су­ дить о температурной стабильности того или иного ассоциата в ра­ створе. Как показано ранее [1, 9 ] , относительное содержание различ­ ного вида комплексов существенно зависит не только от температуры раствора, но и от соотношения исходных концентраций красителя и тетрануклеотида, а также от последовательности нуклеотидов в тетрамере. Равновесные константы комплекссобразованпя К\ ----- К\ при раз­личных температурах были рассчитаны из найденных значений .моль­ных долей с использованием закона сохранения массы и законов дей­ствия масс для рассматриваемых реакций [1]. Для оценки энтальпии и энтропии реакций образования комплексов бромистого этидия с тет­рануклеотидом d(ACGT) в растворе использовали формализм Вант-Гоффа. На рис. 4 приведены зависимости Вант-Гоффа In/С = / (1 /Г) , по которым определяли термодинамические параметры комплексооб­разовании молекул. Энтропию рассчитывали из свободной энергии Гиббса :\G = — RT\n К и энтальпии: A S - —(AG —Д/ / ) / 7 \ (4) KSS.V O-JXi-TCGT. БИОПОЛИМЕРЫ II К.ЧІУГКЛ. 1іі'.»П. Т. I !. Л» 5 4 1 где CLdy au a2—параметры регрессионных уравнений для мольных до­ лей димеров красителя и комплексов 1:1 и 2 : 1 бромистого этидия с мономером тстрануклеотида: ф(Г) —параметрическое регрессионное соотношение в виде многочлена; SkT= (T/Qk)bb, Qk и bk— параметры регрессионных уравнений для мольных долей комплексов 1:2 и 2 : 2 бромистого этидия с дуплексом тетрануклеотида. Аппроксимирующие зависимости для fs(T) и !А{Т) представлены в форме, обычно исполь­ зуемой для описания кооперативных переходов типа «спираль — клу­ бок» [3]. Величина 9л при такой зап'иси регрессионного уравнения со­ ответствует температуре «плавления» комплекса, т. е. температуре, при которой мольная доля данного комплекса уменьшается в два раза по сравнению с его содержанием при низких температурах (~273 К). Величину fm{T), входящую в уравнение (2), находили из соотношения Полученные значения свободной энергии, энтальпии и энтропии реак­ ций бромистого этидия с тетрануклеотидом 5'-d(ApCpGpT) в водном растворе приведены в таблице. С п о с о б 2. Данная методика определения термодинамических параметров комплексообразования молекул предусматривает исполь­ зование соотношения для- наблюдаемого химического сдвига протонов красителя в растворе с тетрануклеотидом 5'-d(ApCpGpT) при фикси­ рованной температуре Т [1]: б, == DID, (8mi + 2KdDSdi + K.N8,, + 2K±K2DN82t + КтК3^8зі + + 2KrK3KiDN%i)1 (5) где Kdy Кг — константы димеризации; £>, N — концентрации мономеров красителя и тетрануклеотида соответственно; D0 — исходная молярная концентрация красителя. Константы реакций комплексообразования /Сі — /С4, а также реакций димеризации красителя Kd и тетрамера Кт, входящие в (5), определяются через соответствующие термодинами­ ческие параметры АН и AS согласно соотношению „ /7Л / А5° АН0 \ К (Г) - ехр — —- (6) в предположении, что величины Н°а, S°(i не зависят существенным об­ разом от температуры в исследованном диапазоне температур. Термо­ динамические параметры самоассоциации бромистого этидия AH°d, AS°d и тетрануклеотида АН°Т, AS°T были найдены ранее [5, 10] при изучении температурных зависимостей химических сдвигов молекул в аналогичных экспериментальных условиях. Таким образом, если учесть известные значения бт , 8dy бі—б4 [1, 4], то наблюдаемый химический сдвиг в соотношении (5) является функцией восьми параметров Л#0,, AS0/ ( /=1—4). Минимизация функции невязки экспериментальных и Термодинамические параметры AG (ккал/моль), АН (ккал/моль) и AS (ккал/моль~] -К~]) реакций образования комплексов бромистого этидия с дезокситетраиуклеотидом 5'-d(ApCpGpT) в водном растворе Комплекс| 1:1 2:1 1:2 2:2 Комплекс 1:1 2:1 1:2 2:2 Химическая реакция* *1 D + N ^DN ko D + DN =F±: DoN D + N2*± DN2 D+DN2 ^D2N2 Химическая реакция* D + N ^ DN k2 D + DN ^D2N k3 D + N2 ^DNo D + DN2 =** DoN, Способ расчета 1-й AG (2(J8 K) лн — (6,60±0,15) —(22,7±3,8) — (5,89=b0,l) —(20,5±5,2) — (6,94 ±0,04) —(16,0 ±2,0) — (6,29±0,08) — (29,7±2,3) Способ рвсчета 2 - и АН0 — (26,4±3,5) — (22,5±3,б) — (18,9±3,0) — (27,6±5,2) AS (29 cS К) — (54,0 ±9,2) — (49,0±12,4) — (30,4±3,9) — (78,6±6,3) AS0 -(65,6 ±9,8) -(54,0±9,7) -(40,0±8,0) -(72,0±14,0) * D — молекула бромистого этидия; N и N^ однонитчатая (мономериая) и двухннт- чатая (дуплексная) формы тетрануклеотида. 42 ISSN 0233-7057. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1995 Т. 11. № где Kd, Кг — константы димеризации; £>, N — концентрации мономеров красителя и тетрануклеотида соответственно; D0 — исходная молярная концентрация красителя. Константы реакций комплексообразоваыия /Сі — /С4, а также реакций димеризации красителя Kd и тетрамера Кт, входящие в (5), определяются через соответствующие термодинами­ ческие параметры АН и AS согласно соотношению расчетных значений 6 позволяет установить оптимальные значения термодинамических параметров реакций образования комплексов в растворе. Важно отметить, что термодинамические параметры, най­ денные двумя различными способами, в пределах погрешности их оп­ ределения хорошо согласуются. Из таблицы видно, что все рассматриваемые реакции комплексе- образования бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5'- d(ApCpGpT) являются экзотермическими. Последнее характерно для процессов агрегации, включающих в себя стэкинг-взаимодействие сис­ тем с делокализованными я-элек- тронами «[11]. Сравнение термоди­ намических параметров комплексо- образования бромистого этидия и акридинового красителя профлави- на с d(ACGT) [6] при одинаковых условиях показывает, что образо­ вание комплексов 1:1 и 2 : 1 этих красителей с мономером тетранук- леотида характеризуется близкими значениями Д # и AS, в то время как при связывании бромистого Рис. 4. Зависимость \пК от 1/Т для реак­ ций комплексообразования бромистого этидия с тетрануклеотидом 5/-d(ApCpGpT): / — комплекс Ч : 2; 2 — 1 : '1; ,3 — 2 : 1; 4 — 2: 2 этидия с дуплексом тетрамера величины энтальпии и энтропии оказы­ ваются существенно более отрицательными, чем в случае профлавина. В целом термодинамические параметры реакций взаимодействий аро­ матического лиганда с олигонуклеотидами могут определяться следу­ ющими факторами [12]: 1) молекулярными взаимодействиями (водородными связями — Н-связи, гидрофобными, ван-дер-ваальсовыми и электростатическими); 2) конформационными изменениями в тетрануклеотиде и кра­ сителе; 3) изменением гидратации, высвобождением иона или протона при взаимодействии молекул. К сожалению, в литературе пет единого мнения о величине вкла­ да в измеряемые термодинамические параметры каждого из рассмо­ тренных выше факторов. Считается, что комплексообразование арома­ тических молекул происходит, главным образом, в результате диспер­ сионных вап-дер-ваальсовых взаимодействий, которые характеризуют­ ся отрицательными энтальпией и энтропией [13]. Сравнение структур 1 : 2-комплексов фенантридинового и акридинового красителей с рас­ сматриваемым дезокситетрануклеотидом [1, Ъу свидетельствует о су­ щественно большем взаимном перекрывании фенантридинового хромо­ фора с плоскостями ароматических азотистых оснований в месте ни теркаляцин, что предполагает большую роль дисперсионных сил при комплексообразовании бромистого этидия, чем акридинового красите­ ля профлавина. Следовательно, можно полагать, что основной вклад в отрицательные значения термодинамических параметров комплексо­ образования бромистого этидия с дезокситетрануклеотидом 5'-d(ACGT) вносят дисперсионные силы. Вместе с тем, при комплексообразовании возможны такие процес­ сы, которые вносят положительный вклад в суммарное изменение эн­ тальпии и энтропии [14]: а) раздвпженпе находящихся в состоянии стэкипг-взаимодепствия пар оснований в дуплексе с образованием полости для встраивающей­ ся молекулы; ISSN 0233-7057. ЫЮНОЛИМЕРЫ II КЛЕГКЛ. НШо. Т. 11. № 5 б) изменение сольватной оболочки при образовании комплекса; в) изменение конформации лиганда при связывании с олигонук- леотидным дуплексом. Положительный энтропийный вклад, прежде всего, определяется гидрофобными взаимодействиями, связанными с переносом молекулы красителя в место интеркаляции. Термодинамический анализ комплек- сообразования интеркалирующих лигандов — производных эллиптици- на с Д Н К [15] свидетельствует об определяющей роли гидрофобных взаимодействий в сравнении с другими видами взаимодействий, вклю­ чая электростатические. В случае коротких олигонуклеотидов, когда в растворе существует сложное равновесие молекулярных ассоциатов, влияние тех или иных сил при формировании комплексов лиганда с одно- и двухцепочечными последовательностями может быть существен­ но различным. Значительный вклад гидрофобных взаимодействий на­ блюдается в случае реакции образования комплексов 1 : 2 профлавина с дуплексом дезокситетрануклеотида d(ACGT) [6], характеризуемой положительным изменением энтропии. Что же касается формирования комплекса 1 : 2 бромистого этидия с d(ACGT), то здесь изменение эн­ тропии имеет достаточно большое отрицательное значение, но оно все же заметно меньше по абсолютной величине, чем AS для других ти­ пов комплексов лиганда с этим тетрамером. Это позволяет предполо­ жить, что гидрофобные взаимодействия также играют довольно значи­ тельную роль при формировании 1 : 2-комплексов бромистого этидия с тетрануклеотидом в растворе. Безусловно, в 1 : 2-комплексе бромис­ того этидия с d(ACGT) существенный вклад в отрицательное значение А5 может вносить возрастание жесткости спиральной структуры при встраивании молекулы красителя [16]. Энтропия при этом уменьша­ ется вследствие ограничения числа возможных конформацпонпых со­ стояний [17]. В случае же 2 : 2-комплекса, когда две молекулы лиган­ да присоединяются к дуплексу тетрануклеотида, довольно большие от­ рицательные значения АН и А5 по сравнению с 1 : 2-комплексом кос­ венно подтверждают высказанное в ,[1] предположение о наиболее ве­ роятном присоединении второй молекулы бромистого этидия к 1 : 2- комплексу снаружи за счет вертикального стэкинга к концевым парам оснований. Такой процесс комплексообразования не требует раздви- жения оснований в тетрануклеотиде, что привело бы к ослаблению дисперсионных взаимодействий и к соответствующему увеличению эн­ тальпии и энтропии. По-видимому, при формировании этого комплекса влияние фактора, связанного с увеличением жесткости спиральной структуры, может так же, как и в 1 : 2-комплексе, играть существенную роль и определять (дополнительно к дисперсионным взаимодействиям) отрицательное изменение энтропии. Авторы благодарны Объединенному исследовательскому центру Лондонского университета за предоставленную возможность использо­ вать для измерений ЯМР-спектрометры 500 и 600 МГц в Беркбек и Куин Мэри колледжах. Проведенные исследования частично финансировались Грантом N UD 7000 Международного научного фонда. О. И. Всселков, Л. М. Димант, П. О. Болотин, С. Ф. Бопановський, Д. Доніс ТЕРМОДИНАМІКА ВЗАЄМОДІЇ ФЕНАНТРИДИНОВОГО БАРВНИКА БРОМИСТОГО ЕТИДІЮ З ДЕЗОКСИТЕТРАНУКЛЕОТИДОМ 5'-d(ApCpGpT) Р е з ю м е На імпульсному ЯМР спектрометрі (500 МГц) досліджено температурні залежності хімічних зсувів протонів, що не обмінюються, бромистого стидію в суміші з дезокси- тетрарибонуклеозидтрифосфатом f> -d (ApCpGpT) у водному розчині. Використано ори­ гінальні методики розрахунку термодинамічних иарамегрів комплексоутворепня, які дозволяють за умов складної рівноваги у розчині вирізнити внесок у результуючу 44 ISSN 0233-71І57. ЫІОІ Ю.Ш1Д\ГРЫ И КЛЕТКА. 19U5. Т. І1.Л"'Ґ, аміну ентальпії (ЛЯ) і ентропії (А5) кожної з реакцій, які призводять до форму­ вання комплексів 1:1, 2:1, 1:,2 і 2:2 молекул барвника і тетрануклеотиду. Визначено вільні енергії Гіббса, ентальпії і ентропії для цих реакцій. А. N. Veselkov, L. N. Djimant, P. A. Boloiin, S. F. Baranovsky, D. Davies THERMODYNAMICS OF PHENANTRIDINIUM DYE ETHIDIUM BROMIDE INTERACTION WITH DEOXYTETRANUCLEOTIDE 5'-d(ApCpGpT) S u m m a r y Temperature dependences of the chemical shifts of non-exchangeable ethidium bromide protons in a mixture with the deoxytetranucleoside triphosphate 5/-d(ApCpGpT) in aqu­ eous solution have been investigated with a pulsed n. m. r. spectrometer (500 MHz). Original methods of calculation of thermodynamic parameters of complexing, which gives an opportunity to get individual contributions of each reaction leading to the formation of 1:1, 1:2, 2:1 and 2:2 complexes of dye and tetranucleotide molecules in conditions of the composite equilibrium in solution, have been used. The free Gibbs energies, enthalpies and entropies of these reactions have been determined. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Веселков А. И., Дымант Л. Н., Болотин П. А. и др. Исследование взаимодействия бромистого этидия ч с самокомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(ApCpGpT) в водном растворе методом *Н-ЯМР спектроскопии // Биополиме­ ры и клетка.— 1995.— 11, № 3—4.—С. 42—54. 2. Searle М. S. NMR studies of drug-DNA interactions // Progr. NMR Spectr.— 1993.—25.—P. 403—480. 3. Davies D. В., Djimant L. N., Veselkov A. N. JH NMR thermodynamical analysis of the interactions of proflavine with self-complementary deoxytetranucleotides of different base sequence // Nucleosides and Nucleotides.— 1994.— 13, N 1—3. 4. Веселков A. H., Дымант JI. H., Барановский С. Ф. и др. Исследование самоассо­ циации бромистого этидия в водном растворе методом ]Н-ЯМР спектроскопии // Хим. физика.—1994.—13, № П.—С. 72—80. 5. Веселков А. Н., Дэвис Д., Дымант Л. Н. и др. 1М- и 2М-1Н-ЯМР исследование самоассоциации дезокситетрануклеозидтрифосфатов различной последовательности оснований в водном растворе // Биополимеры и клетка.— 1991.— 7, № 5. 6. Дымант Л. Н., Веселков А. Н. Термодинамика взаимодействия акридинового кра­ сителя профлавина с дезокситетрануклеотидом 5'-d(ApCpGpT) // Хим. физика.— 1992.—И, № 7.—С. 921—927. 7. Веселков А. Н., Дымант Л. Н., Барановский С. Ф. Определение термодинамиче­ ских параметров взаимодействия профлавина с дирибонуклеозидмонофосфатами GpC и CpG в водном растворе по данным протонного магнитного резонанса // Молекуляр. биология.—1987.—21, № 4.—С. 1110—1116. 8. Евсеев А. М., Николаева Л. С. Математическое моделирование химических равно­ весий.—М. : Изд-во МГУ, 1988.— 192 с. 9. Davies D. В., Djimant L. N., Veselkov A. N. lH NMR structural analysis of the interactions of proflavine with self-complementary deoxytetranucleosides of diffe­ rent base sequence // Nucleosides and Nucleotides.— 1994.— 13, N 1—3.— P. 637. 10. Веселков А. H., Дымант Л. H., Завьялова О. С. и др. Термодинамические пара­ метры самоассоциации молекул бромистого этидия в растворе // Хим. физика.— 1994— 13, № 12.—С. 161—164. 11. Delbarre A., Roques В. P., Le Pecq I. В. et al. PMR studies of the self-association of DNA intercalating ellipticine derivatives in aqueous solution // Biophys. Chem.-— 1976.—4.—P. 275—279. 12. Charles / . B. Thermodynamics of the daunomycin DNA interaction: ionic strength dependence of the enthalpy and entropy // Biopolymers.—1985.—24.—P. 403—419. 13. Ross P. D., Subramanian S. Thermodynamics of protein association reaction: for­ ces contributing to stability // Biochemistry.—1981.—20.—P. 3096—3102. 14. Hopkins H. P., Fumero J., Wilson W. D. Temperature dependence of enthalpy chan­ ges for ethidium and propidium binding to DNA // Biopolymers.—1990.—29.— P. 445—459. 15. Schwaller M. A., Dodin G., Aubard J. Thermodynamics of drug-DNA interactions: Entropy-driven intercalation and enthalpy-driven outside binding in the ellipticine series // Ibid.—1991.—31.—P. 519—527. 16. Reinert К. Е. Antracycline binding induced DNA stiffening, binding and elonga­ tion. Stereochemical implications from viscometric investigation // Nucl. Acids Res.— 1983 —11.—P. 3411—3430. 17. Sturtevant J. M. Heat capacity and entropy changes in processes involving prote­ ins // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1977.—74.—P. 2236—2240. Севастополь, гос. техн. ун-т Получено 02.03.95 Беркбек колледж Лондон, ун-та, Великобритания XSS51 0233-7G57. БИОПОЛИМЕРЫ II КЛЕТКА. 1995. Т. И . № £ 45

Similar Items