Анализ антигенных свойств RGD-содержащего участка филаментозного гемагглютинина Bordetella pertussis, отвечающего за связывание с CR3-интегрином макрофагов
Локализована антигенная детерминанта в районе 1094–1102 полипептидной цепи филаментозного гемагглютинина (ФГА) В. pertussis, участвующего в адгезии бактериальных клеток на макрофагах. Для определения использованы нативный ФГА синтетический нонапептид TYGRGDPHQ, его конъюгаты с БСА (полученный глутар...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1993 |
| Hauptverfasser: | , , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1993
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156235 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Анализ антигенных свойств RGD-содержащего участка филаментозного гемагглютинина Bordetella pertussis, отвечающего за связывание с CR3-интегрином макрофагов / Е.Г. Пхакадзе, Э.М. Кавун, В.А. Чечот, А.В. Маринец, Ю.Л. Радавский, С.В. Комиссаренко // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 4. — С. 39-44. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156235 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Пхакадзе, Е.Г. Кавун, Э.М. Чечот, В.А. Маринец, А.В. Радавский, Ю.Л. Комиссаренко, С.В. 2019-06-18T10:15:09Z 2019-06-18T10:15:09Z 1993 Анализ антигенных свойств RGD-содержащего участка филаментозного гемагглютинина Bordetella pertussis, отвечающего за связывание с CR3-интегрином макрофагов / Е.Г. Пхакадзе, Э.М. Кавун, В.А. Чечот, А.В. Маринец, Ю.Л. Радавский, С.В. Комиссаренко // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 4. — С. 39-44. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. 0233-7657 http://dx.doi.org/10.7124/bc.000364 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156235 577.27 Локализована антигенная детерминанта в районе 1094–1102 полипептидной цепи филаментозного гемагглютинина (ФГА) В. pertussis, участвующего в адгезии бактериальных клеток на макрофагах. Для определения использованы нативный ФГА синтетический нонапептид TYGRGDPHQ, его конъюгаты с БСА (полученный глутаральдегидным методом) и с ЧСА (полученный с помощью N-оксисукцинимидил-2-(3-пиридилдитиопропионата)–SPDP). Эпитопспецифические AT исследовали с помощью иммуноаффинной хроматографии и иммуноферментного анализа. Наличие антигенной детерминанты в RGD-содержащем районе 1094–1102 ФГА указывает на возможность использования пептида, соответствующего данному эпитопу, в качестве компонента синтетической вакцины против коклюша. Виявлено антигенну детермінанту, що розпізнається антитілами, в районі 4094–1102 філаментозного гемаглютиніну В. pertussis. В дослідженнях використовували нативний ФГА, синтетичний нонапептид TVGRGDPHQ, його кон'югати з альбумінами із сироватки крові бика та людини. Перший кон'югат був одержаний за допомогою глютаральдегідного методу, другий – з використанням N-сукциніміділrL (3-пірідилдитіопропіонату)– SPDP. Епітопспецифічні антитіла вивчали за допомогою імуноафінної хроматографії та імуноферментного аналізу. Локалізація антигенної детермінанти в даному локусі ФГА вказує на можливість використання відповідного пептиду як складової частини синтетичної вакцини проти кашлюку. The antigen determinant distinguished by the antibodies was found in the region 1094–1102 of filamentous hemagglutinin from B. pertussis. The native FHA, nonapeptide TVQRGDPHQ, its conjugates with albumins from bovine and human sera were used in the experiments. The first conjugate was obtained with the glutaral-dehid, the another one with the use of SPDP. The immurioaffinity chromatography and ELISA were used for the determination of the epitope-specific antibodies. Localization of the antigen determinant in this site of FHA makes it possible to apply the peptide as a component of the synthetic vaccine against whooping-cough. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Анализ антигенных свойств RGD-содержащего участка филаментозного гемагглютинина Bordetella pertussis, отвечающего за связывание с CR3-интегрином макрофагов Аналіз антигенних властивостей RGD-що містить ділянки филаментозному гемаглютиніну Bordetella pertussis, що відповідає за зв'язування з CR3-інтегріном макрофагів Analysis of antigenic properties of B. pertussis filamentous hemagglutinin RGD-containing site responsible for the reaction with macrophages Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Анализ антигенных свойств RGD-содержащего участка филаментозного гемагглютинина Bordetella pertussis, отвечающего за связывание с CR3-интегрином макрофагов |
| spellingShingle |
Анализ антигенных свойств RGD-содержащего участка филаментозного гемагглютинина Bordetella pertussis, отвечающего за связывание с CR3-интегрином макрофагов Пхакадзе, Е.Г. Кавун, Э.М. Чечот, В.А. Маринец, А.В. Радавский, Ю.Л. Комиссаренко, С.В. Структура и функции биополимеров |
| title_short |
Анализ антигенных свойств RGD-содержащего участка филаментозного гемагглютинина Bordetella pertussis, отвечающего за связывание с CR3-интегрином макрофагов |
| title_full |
Анализ антигенных свойств RGD-содержащего участка филаментозного гемагглютинина Bordetella pertussis, отвечающего за связывание с CR3-интегрином макрофагов |
| title_fullStr |
Анализ антигенных свойств RGD-содержащего участка филаментозного гемагглютинина Bordetella pertussis, отвечающего за связывание с CR3-интегрином макрофагов |
| title_full_unstemmed |
Анализ антигенных свойств RGD-содержащего участка филаментозного гемагглютинина Bordetella pertussis, отвечающего за связывание с CR3-интегрином макрофагов |
| title_sort |
анализ антигенных свойств rgd-содержащего участка филаментозного гемагглютинина bordetella pertussis, отвечающего за связывание с cr3-интегрином макрофагов |
| author |
Пхакадзе, Е.Г. Кавун, Э.М. Чечот, В.А. Маринец, А.В. Радавский, Ю.Л. Комиссаренко, С.В. |
| author_facet |
Пхакадзе, Е.Г. Кавун, Э.М. Чечот, В.А. Маринец, А.В. Радавский, Ю.Л. Комиссаренко, С.В. |
| topic |
Структура и функции биополимеров |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| publishDate |
1993 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Аналіз антигенних властивостей RGD-що містить ділянки филаментозному гемаглютиніну Bordetella pertussis, що відповідає за зв'язування з CR3-інтегріном макрофагів Analysis of antigenic properties of B. pertussis filamentous hemagglutinin RGD-containing site responsible for the reaction with macrophages |
| description |
Локализована антигенная детерминанта в районе 1094–1102 полипептидной цепи филаментозного гемагглютинина (ФГА) В. pertussis, участвующего в адгезии бактериальных клеток на макрофагах. Для определения использованы нативный ФГА синтетический нонапептид TYGRGDPHQ, его конъюгаты с БСА (полученный глутаральдегидным методом) и с ЧСА (полученный с помощью N-оксисукцинимидил-2-(3-пиридилдитиопропионата)–SPDP). Эпитопспецифические AT исследовали с помощью иммуноаффинной хроматографии и иммуноферментного анализа. Наличие антигенной детерминанты в RGD-содержащем районе 1094–1102 ФГА указывает на возможность использования пептида, соответствующего данному эпитопу, в качестве компонента синтетической вакцины против коклюша.
Виявлено антигенну детермінанту, що розпізнається антитілами, в районі 4094–1102 філаментозного гемаглютиніну В. pertussis. В дослідженнях використовували нативний ФГА, синтетичний нонапептид TVGRGDPHQ, його кон'югати з альбумінами із сироватки крові бика та людини. Перший кон'югат був одержаний за допомогою глютаральдегідного методу, другий – з використанням N-сукциніміділrL (3-пірідилдитіопропіонату)– SPDP. Епітопспецифічні антитіла вивчали за допомогою імуноафінної хроматографії та імуноферментного аналізу. Локалізація антигенної детермінанти в даному локусі ФГА вказує на можливість використання відповідного пептиду як складової частини синтетичної вакцини проти кашлюку.
The antigen determinant distinguished by the antibodies was found in the region 1094–1102 of filamentous hemagglutinin from B. pertussis. The native FHA, nonapeptide TVQRGDPHQ, its conjugates with albumins from bovine and human sera were used in the experiments. The first conjugate was obtained with the glutaral-dehid, the another one with the use of SPDP. The immurioaffinity chromatography and ELISA were used for the determination of the epitope-specific antibodies. Localization of the antigen determinant in this site of FHA makes it possible to apply the peptide as a component of the synthetic vaccine against whooping-cough.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156235 |
| citation_txt |
Анализ антигенных свойств RGD-содержащего участка филаментозного гемагглютинина Bordetella pertussis, отвечающего за связывание с CR3-интегрином макрофагов / Е.Г. Пхакадзе, Э.М. Кавун, В.А. Чечот, А.В. Маринец, Ю.Л. Радавский, С.В. Комиссаренко // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 4. — С. 39-44. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT phakadzeeg analizantigennyhsvoistvrgdsoderžaŝegoučastkafilamentoznogogemagglûtininabordetellapertussisotvečaûŝegozasvâzyvaniescr3integrinommakrofagov AT kavuném analizantigennyhsvoistvrgdsoderžaŝegoučastkafilamentoznogogemagglûtininabordetellapertussisotvečaûŝegozasvâzyvaniescr3integrinommakrofagov AT čečotva analizantigennyhsvoistvrgdsoderžaŝegoučastkafilamentoznogogemagglûtininabordetellapertussisotvečaûŝegozasvâzyvaniescr3integrinommakrofagov AT marinecav analizantigennyhsvoistvrgdsoderžaŝegoučastkafilamentoznogogemagglûtininabordetellapertussisotvečaûŝegozasvâzyvaniescr3integrinommakrofagov AT radavskiiûl analizantigennyhsvoistvrgdsoderžaŝegoučastkafilamentoznogogemagglûtininabordetellapertussisotvečaûŝegozasvâzyvaniescr3integrinommakrofagov AT komissarenkosv analizantigennyhsvoistvrgdsoderžaŝegoučastkafilamentoznogogemagglûtininabordetellapertussisotvečaûŝegozasvâzyvaniescr3integrinommakrofagov AT phakadzeeg analízantigennihvlastivosteirgdŝomístitʹdílânkifilamentoznomugemaglûtinínubordetellapertussisŝovídpovídaêzazvâzuvannâzcr3íntegrínommakrofagív AT kavuném analízantigennihvlastivosteirgdŝomístitʹdílânkifilamentoznomugemaglûtinínubordetellapertussisŝovídpovídaêzazvâzuvannâzcr3íntegrínommakrofagív AT čečotva analízantigennihvlastivosteirgdŝomístitʹdílânkifilamentoznomugemaglûtinínubordetellapertussisŝovídpovídaêzazvâzuvannâzcr3íntegrínommakrofagív AT marinecav analízantigennihvlastivosteirgdŝomístitʹdílânkifilamentoznomugemaglûtinínubordetellapertussisŝovídpovídaêzazvâzuvannâzcr3íntegrínommakrofagív AT radavskiiûl analízantigennihvlastivosteirgdŝomístitʹdílânkifilamentoznomugemaglûtinínubordetellapertussisŝovídpovídaêzazvâzuvannâzcr3íntegrínommakrofagív AT komissarenkosv analízantigennihvlastivosteirgdŝomístitʹdílânkifilamentoznomugemaglûtinínubordetellapertussisŝovídpovídaêzazvâzuvannâzcr3íntegrínommakrofagív AT phakadzeeg analysisofantigenicpropertiesofbpertussisfilamentoushemagglutininrgdcontainingsiteresponsibleforthereactionwithmacrophages AT kavuném analysisofantigenicpropertiesofbpertussisfilamentoushemagglutininrgdcontainingsiteresponsibleforthereactionwithmacrophages AT čečotva analysisofantigenicpropertiesofbpertussisfilamentoushemagglutininrgdcontainingsiteresponsibleforthereactionwithmacrophages AT marinecav analysisofantigenicpropertiesofbpertussisfilamentoushemagglutininrgdcontainingsiteresponsibleforthereactionwithmacrophages AT radavskiiûl analysisofantigenicpropertiesofbpertussisfilamentoushemagglutininrgdcontainingsiteresponsibleforthereactionwithmacrophages AT komissarenkosv analysisofantigenicpropertiesofbpertussisfilamentoushemagglutininrgdcontainingsiteresponsibleforthereactionwithmacrophages |
| first_indexed |
2025-11-24T18:50:37Z |
| last_indexed |
2025-11-24T18:50:37Z |
| _version_ |
1850493038848114688 |
| fulltext |
8. Машковстй Μ. Д. Лекарственные средства.— М. : Медицина, 1985.— Ч. 1.—
624 с.
9. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Примак Р. Г. и др. Изменение структурного со-
стояния фракционированного хроматина печени при активации перекисного окис-
ления липидов // Биополимеры и клетка.— 1991.— 7, № 3.— С. 89і—94.
10. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л.,. Гольдштейн Н. Б. и др. Функциональная актив-
ность фракционированного хроматина печени крыс при однократном введении
тетрахлорметана // Вопр. мед. химии.— 19»89.— 35, № 4.— С. 119—Ί24.
11. Губский Ю. И.. Левицкий Е. JI., Примак Р. Г. и др. И н ф о р м а ц и о н н ы е характе-
ристики и характер упаковки эндогенных липидов фракций транскрипционно
активного и репрессированного хроматина / / Укр. биохим. журн.— 1991.— 63,
№ 2.— С. 83—891.
12. Ашмарин М. П., Васильев II. II., Амбросой В. А. Быстрые методы статистической
обработки и планирование эксперимента.— Л. : Изд-во ЛГУ, 1975.— 78 с.
1IG. Губский IO. И., Левицкий Е. Jl., Гольдштейн Н. Б. и др. Перекисное окисление
липидов фракций хроматина печени крыс // Докл . АН УССР, сер. Б.— 1989.—
№ 2,— С 70—72.
14. Лебедь О. П., Жирное В. В., Зуева II. А. и др. Структурные эффекты в сарколем-
ме кардиомиоцитов при добавлении модуляторов полифосфоинознтидной системы //
Физиол. ж у р н . — 1 9 9 0 . — 7 6 , № 10.—С. 1210—1297.
15. Свердлова О. В. Электронные спектры в органической химии.— М. : Химия, 1985.—·
248 с.
I1G. Bellami W. Т., Dalton W. S., Kailly І. Д1. et al. Verapamil reversal of doxorubicin
res is tance in mul t i -d rug- res i s tan t human myeloma cells and associat ion with d r u g
accumulat ion and DNA d a m a g e // Cancer. Res .—1988 .—48, N 2 2 , — P . 6303—6308.
17. Weber J., Scheid W., Traut H. Enhancement of bleomycin-induced DNA d a m a g e by
exposing isolated DNA to high concent ra t ions of the calcium an t agon i s t verapa-
mil // Arzneim. Forsch. D r u g Res.— 1989.—39, N 12 .—P. 1550—1554.
У к р Н И И фармакологии и токсикологии М З Украины, Киев Получено 12.01.93
УДК 577.27
Е. Г. Пхакадзе, Э. М. Кавун, В. А. Чечот,
А. В. Маринец, Ю. Л. Радавский, С. В. Комиссаренко
АНАЛИЗ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ RGD-СОДЕРЖАЩЕГО
УЧАСТКА ФИЛАМЕНТОЗНОГО ГЕМАГГЛЮТИНИНА
BORDETELLA PERTUSSIS, ОТВЕЧАЮЩЕГО ЗА СВЯЗЫВАНИЕ
С СRЗ-ИНТЕГРИНОМ МАКРОФАГОВ
Локализована антигенная детерминанта в районе 1094—1102 полипептидной цепи
фила мент озно го гемагглютинина (ФГА) В. pertussis, участвующего в адгезии бакте-
риальных клеток на макрофагах. Для определения использованы нативный ФГА син-
тетический нона пептид TY GRGDPHQ, его конъюгаты с БСА (полученный глутараль-
дсгидным методом) и с ЧСА (полученный с помощью Ы-оксисукцинимидил-2-(3-пири-
дилдитиопропионата)—SPDP). Эпитопспецифические AT исследовали с помощью
иммуноаффинной хроматографии и иммуноферментного анализа. Наличие антигенной
детерминанты в RGD-содержащем районе 1094—1102 ФГА указывает на возмож-
ность использования пептида, соответствующего данному эпитопу, в качестве компо-
нента синтетической вакцины против коклюша.
Введение. Д л я профилактики коклюша в настоящее время применяют
два вида вакцин: цельноклеточные (на основе убитых бактериальных
клеток В. pertussis) и ацеллюлярные субъединичные вакцины [1]. Не-
достатком их является остаточная АДФ-рибозилтрансферазная актив-
ность коклюшного токсина [2], что вызывает множество нежелательных
побочных эффектов при вакцинировании детей.
Д л я разработки полностью безопасных вакцин активно ведутся ра-
боты по двум основным направлениям, а именно: создание рекомби-
нантных аналогов Sl-субъединицы коклюшного токсина [3, 4] и выяв-
ление пептидов, которые можно использовать при создании синтетиче-
ских вакцин [5, 6]. Наиболее перспективными для дальнейшего поиска
Ε. Г. Пхакадзе, Э. М. Кавун, В. А. Чечот, А. В. Маринец, Ю. Л. Радавский,
С. В. Комиссаренко, 1993
ISSJST 0233-7(357. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 4 39
пептидов — компонентов синтетических вакцин являются три антигена
В. pertussis: коклюшный токсин, филаментозный гемагглютинин и пер-
тактин [7]. Ф Г А — а д г е з и в н ы й фактор, участвующий в прикреплении
В. pertussis к мембранам макрофагов и клеток эпителия трахеи [8]..
При этом он распознает на цитоплазматических мембранах макрофа-
гов два класса молекул: СИЗ-интегрин и галактозосодержащие глико-
липиды [9].
Найдено, что ФГА взаимодействует с СИЗ-интегрином через учас-
ток, содержащий характерный Arg-Gly-Asp-сайт, который находится в
районе остатков 1097—1099 молекулы ФГА [9].
Задача настоящей работы состояла в анализе антигенных свойств
RGD-содержащего фрагмента ФГА для выяснения его перспективности
в качестве компонента синтетической вакцины против коклюша.
Материалы и методы. Пептид с БСА конъюгировали с помощью
глутарового альдегида. БСА и пептид TVGRGDPHQ (моляр ное соот-
ношение носителя к пептиду 1/20) последовательно растворяли в 0,5 мл
физраствора, содержащего 0,02 M Na, К-фосфатный буфер, рН
7,5 ( Ф Р Б ) , и добавляли по каплям 0,1 мл 2,5 %-го раствора глутаро-
вого альдегида. Реакцию проводили при перемешивании в течение
30 мин. Оставшиеся активные группы блокировали в течение 30 мин
добавлением в реакционную смесь 0,06 мл 1 M раствора глицина, за-
тем диализовали против 0,03 %-го раствора аммиака с последующей
лиофилизацией.
А ц и л и р о в а н и е Ч С А . При ацилировании ЧСА придержива-
лись подходов, описанных в [10]. 50 мг ЧСА («Reanal», Венгрия) рас-
творяли в 1,5 мл 0,1 M Na-фосфатного буфера, содержащего 0,1 Al.
NaCl, рН 7,5 ( Ф Б ) . К раствору белка по каплям добавляли 40 мМ
раствор S P D P в 96 %-м этиловом спирте так, чтобы молярное соотно-
шение ЧСА: S P D P равнялось 1 : 50. Время реакции 2 ч при 20 °С. Аци-
лированный ЧСА (ЧСА-PDP) диализовали против 0,03 %-го расі вора
аммиака в дистиллированной воде с последующей лиофилизацией. Д л я
определения степени ацилирования 200 мкг ЧСА-PDP растворяли в
2 мл ФБ и добавляли 34 мкл 100 мМ дитиотреитола. Об освобождении
2-тиопиридона судили по увеличению экстинкции при 343 нм. Степень
ацилирования составила около 30 остатков S P D P на молекулу ЧСА.
П о л у ч е н и е к о н ъ ю г а т а п е п т и д а и з ф и л а м е н г о з -
и о г о г е м а г г л ю т и н и н а с Ч С А . Пептид TVGRGDPHQ из ФГА
В. pertussis (пФГА) получен от Вектор-Биопродукт LTD. 2 мг пФГА
растворяли в 0,1 M Na-ацетатиом буфере, рН 4,5. S P D P вносили в пя-
тикратном молярном избытке по отношению к пФГА. Реакцию прово-
дили при 20 °С в течение 2 ч. Ацилированный пептид отделяли от про-
дуктов реакции на колонке с сефадексом G-10 (d— 1 см; /г = 55 см) .
Д л я генерирования дополнительных SH-групп 6 мг ЧСА-PDP растворя-
ли в 1 мл ФБ, содержащего 50 мМ дитиотреитол. Реакцию проводили
в течение 30 мин при 20 °С, после чего ЧСА отделяли от продуктов
реакции на колонке с сефадексом G-25 Fine (d= 1 см; /г = 30 см), урав-
новешенным ФБ. Собирали первый пик и немедленно смешивали с аци-
лированным пептидом. Конъюгирование проводили при 20 °С в течение
24 ч. От низкомолекулярных продуктов избавлялись диализом против
0,03 %-го раствора аммиака.
Д л я п о л у ч е н и я а ф ф и н н о г о с о р б е н т а пФГА был им-
мобилизован на BrCN-агарозе, как описано в [11]. 1,5 мл BrCN-ara -
розы инкубировали с 1,5 мг пептида. По данным спектрофотометрпче-
ского анализа, с агарозой связалось 1,2 мг пептида.
И м м у н о а ф ф и н н у ю х р о м а т о г р а ф и ю специфичных к
RGD-содержащему пептиду антител проводили следующим образом.
Иммуноглобулиновую фракцию из иммунной сыворотки в ряде случаев
осаждали сульфатом аммония. Специфичные к пептиду антитела выде-
ляли либо из фракции иммуноглобулинов, либо непосредственно из им-
мунной кроличьей сыворотки. В последнем случае 0,35 мл иммунной
сыворотки разводили в 10 раз Ф Р Б и затем трижды пропускали через
40 ISSJST 0233-7(357. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 4 40
аффинный сорбент объемом 1,5 мл. Колонку тщательно промывали
ФРБ, после чего связавшиеся антитела элюировали 4 M KSCW π диа-
лизовали против Ф Р Б .
С о ρ б ц и о н н ы й и м м у н о φ е ρ м е н τ н ы й а η а л п з. План-
шеты Flow Laboratories (Великобритания) или «Экр ан» (Москва) сен-
сибилизировали в течение 2 ч при комнатной температуре соответству-
ющими антигенами в концентрации 2 мкг/мл в Ф Р Б . После их сорбции
в ряде случаев планшет блокировали 1 %-м БСА в Ф Р Б в течение 1 ч
при 37 °С. После каждого этапа сорбции планшет трижды промывали
водой. Антисыворотки или аффинноочищенные антитела разводили в
Ф Р Б с 0 ,05% твин-20 (ТФБ) и инкубировали в планшетах при 4 °С.
Антитела выявляли с помощью конъюгата AT овцы, специфичных к
IgG кролика, с пероксидазой (Вектор-Биопродукт LTD)) в разведении
1 : 4000 в ТФБ. В качестве субстрата использовали раствор ортофени-
лендиамина в 0,05 M Na, К-фосфатном буфере, рН 6,0 с 0,013 %-м рас-
твором перекиси водорода.
А н т и с ы в о р о т к у к Ф Г А получали, используя 2 схемы имму-
низации кроликов. Перед иммунизацией у животных брали кровь для
получения нормальной сыворотки. В одном случае кроликов иммуни-
зировали по 100 мкг ФГА в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 8,0, содержа-
щем 1 M NaCl (кролики № № 2—4, таблица) . Первую иммунизацию
проводили внутримышечно с ПАФ, последующие— внутривенно. Через
21 день после первой иммунизации животных иммунизировали вторич-
но, еще через месяц — третий раз и спустя 7,5 месяца — четвертый.
Кровь брали на 7-й день после каждой иммунизации. После 4-й имму-
низации антисыворотку получали на 7-й и 14-й дни.
По другой схеме кроликов иммунизировали шесть раз по 20 мкг
ФГА с интервалом в один месяц без использования адъювантов (кро-
лик № 1). Первую иммунизацию проводили внутримышечно, последую-
щие—внутривенно . Кровь брали на 7-й день, начиная со второй реим-
мунизации.
Результаты и обсуждение. Образование специфичных к ФГА анти-
тел анализировали с помощью сорбционного ИФА. В качестве антиге-
нов использовали нативный ФГА, пептид TVGRGDPHQ, а также его
конъюгаты с БСА (БСА—пФГА) и ЧСА (ЧСА—пФГА). Титры анти-
тел к нативному ФГА в антисыворотках отличались и зависели от схе-
мы иммунизации и количества инъекций. Распознавание пептида, сор-
бированного на планшете, было менее эффективным, хотя в целом кор-
релировало с общим уровнем антител к ФГА (см. таблицу) . В сыво-
ротках с более низким титром антител к ФГА антитела к БСА—пФГА
не обнаруживались, что может быть связано с генетической рестрик-
цией по главному комплексу гистосовместимости. Наиболее эффектив-
но пептид в составе конъюгата с БСА распознавался антителами из ан-
Cравнение титров антител к нативному ФГА и к его RG D-со держащему пептиду
в тесте ELISA
Десятичный логарифм титра
антител к
№ № Количество День получения
Кролика Сыворотки инъекций антисыворотки*
ФГА пФГА**
1 1 5 7 5,56 4,60
2 2 3 7 4,61 0
3 3 4 7 3,67 0
3 4 4 14 4,13 0
4 .) 7 5,56 4.13
4 6 '3 7 5,56 4,13
4 7 4 7 4,61 4,13
4 8 4 14 5,08 4,60
* После очередной иммунизации; ** титр антител к пептиду в антисыворотках опре-
деляли по их взаимодействию с конъюгатом БСА—пФГА.
ISSJST 0233-7(357. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 4 41
тисывороюк № 1 и № 8 (см. таблицу) , т. е. теми, которые лучше всего
распознавали и нативный АГ. Антитела контрольной сыворотки неим-
мунизированного кролика не распознавали вышеперечисленные
антигены.
Известно, что сорбция молекул пептида на твердой поверхности в
ряде случаев затрудняет их распознавание антителами. Это связано с
воздействием поверхности полистирола на конформацию полипептид-
ной цепи [12]. Д л я облегчения взаимодействия пептида с антителами
Рис. I. Взаимодействие антител из иммунной сыворотки кроликов с нативным ФГА
( I ) , RGD-содержащим пептидом из ФГА (2 ) , его конъюгатами с БСА (3) и ЧСА (4)
Рис. 2. Сравнение эффективности распознавания нативного ФГА, пептида
T V G R G D P H Q в свободной форме и в составе конъюганта с БСА эпитопспецифически-
ми антителами, выделенными на аффинном сорбенте агароза — пФГА. По оси абсцисс
указано разведение элюата после снятия антител с аффинного сорбента. Приведены
усредненные данные трех измерений
нами были получены два его конъюгата с белковыми носителями. В пер-
вом случае пептид конъюгировали с БСА, используя глутаральдегид-
ный метод, во втором — для конъюгирования пептида с ЧСА применя-
ли гетеробифункциональный реагент N-сукцинимидил-З- (2-пиридилди-
тиопропионат) — S P D P . С каждым из этих конъюгатов антитела из им-
мунной сыворотки взаимодействовали эффективнее, нежели с пепти-
дом, сенсибилизированным на планшете (рис. 1). В то же время анти-
тела из нормальной сыворотки с данными антигенами практически не
взаимодействовали. Таким образом, в иммунных сыворотках кроликов
присутствовали антитела, распознающие RGD-содержащий участок
ФГА. Более низкий уровень сигнала, полученный при взаимодействии
AT с пептидом и его конъюгатами, чем с нативным ФГА, связан с не-
большой удельной площадью данного эпитопа по отношению ко всей
молекуле. Известно, что практически вся поверхность белковых АГ яв-
ляется потенциально иммуногенной [13], а поскольку молекулярная
масса ФГА составляет 220 000, доля эпитопспецифических AT не долж-
на превышать нескольких процентов от всех AT, направленных к па-
ти в ном у ФГА.
Д л я более надежного подтверждения образования антител к участ-
ку 1094—1102 ФГА нами был синтезирован аффинный сорбент с иммо-
билизованным на BrCN-агарозе RGD-содержащим пептидом. В даль-
нейшем его применяли для выделения эпитопспецифических кроличьих
антител. При получении таких антител нами была использована сум-
марная антисыворотка двух кроликов, титр AT в каждой из них к на-
тивному белку в тесте ELISA был не менее 1 : 364 000, а к пептиду до-
стигал 1 : 40 500 (антисыворотки № № 1, 8, см. таблицу) . Полученные
антитела диализовали против Ф Р Б , а их специфичность по отношению
к пептиду, его конъюгату с БСА, к нативному ФГА и к контрольному
антигену (БСА) была проанализирована методом ELISA. Несмотря на
то, что антитела были аффинно очищены на сорбенте с иммобилизован-
42 ISSN 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы Ii КЛЕТКА. 1093. Т. 9. № 4
ним пептидом, они распознавали нативный ФГА значительно эффектив-
нее, нежели свободный пептид, перекрывающий его RGD-содержащий
участок, пли его конъюгат с белковым носителем (рис. 2) . Это, по-види-
мому, является результатом конформационных различий RGD-содер-
жащей последовательности в составе нативного белка, в составе конъю-
гата пептида с носителем и в свободной форме. Подобные отличия
участков полипептидных антигенов, находящихся в форме пептидов,
были показаны ранее и для других антигенов [14].
Известно, что последовательность Arg-Gly-Asp участвует в адгезии
целого ряда белков с антигенами цитоплазматической мембраны. Сре-
ди них фибриноген, фактор Ван Виллебранда (von Wiilebrand fac tor ) ,
RGD-содержащие пептиды которых распознаются мембранными бел-
ками тромбоцитов [15]. Фибриноген, кроме того, конкурирует с ФГА за
связывание с СИЗ-интегрином [9]. Участок фибронектина, содержащий
д.-"!иную последовательность, распознается мембранным рецептором к
вкгронектину [16]. Полагают, что пертактин из В. pertussis т акже рас-
познается CR3-HHTerpHHOM макрофагов [17]. Взаимодействие RGD-co-
держащих участков с рецепторами мембран связано с их аминокислот-
ным окружением. Так, у пертактина в районе 665—667 имеется еще
один участок с последовательностью Arg-Gly-Asp, который не взаимо-
действует с мембранами макрофагов [17]. Это, по-видимому, связано с
недостаточной степенью его экспонирования в растворитель и/или из-
мененной копформацией, которая недоступна для распознавания
имісгрииом.
Таким образом, эффективное распознавание эиитопепецифичеекпми
аі-пителами нативного антигена можно считать достаточным доказа-
тельством наличия антигенной детерминанты в районе 1094—1102
ФГА. Следовательно, локализация В-эпитопа в районе ФГА, отвечаю-
щем за связывание с СКЗ-интегрином макрофагов, свидетельствует о
возможности использования пФГА ε качестве компонента синтетиче-
ской вакцины против коклюша при условии, что антитела, направлен-
ные к пептиду, будут распознавать при этом и нативный антиген.
Р е з ю м е . Виявлено антигенну детермінанту, що розпізнається антитілами, в
районі 4094—1102 філаментозного гемаглютиніну В. pertussis. В дослідженнях вико-
ристовували нативний ФГА, синтетичний нонапептид TVGRGDPHQ, його кон'югати з
альбумінами із сироватки крові бика та людини. Перший кон'югат був одержаний
за допомогою глютаральдегідного методу, другий — з використанням N-сукциніміділ-
rL (3-пірідилдитіопропіонату)— S P D P . Епітопспецифічні антитіла вивчали за допомо-
гою імуноафінної хроматографії та імуноферментного аналізу. Локалізація антигенної
детермінанти в даному локусі ФГА вказує на можливість використання відповідного
гогіїнду як складової частини синтетичної вакцини проти кашлюку.
S u m m a r y . The ant igen determinant dist inguished by the antibodies was found
in the region 1094—1102 of f i lamentous hemagglut in in f rom B. pertussis. The nat ive
FHA, nonapept ide TVGRGDPHQ, its con juga tes with albumins from bovine and human
sere were used in the experiments. The first con juga te was obtained with the glutaral -
dehid, the another one with the use of S P D P . The immunoaff in i ty chromatography and
ELISA were used for the determinat ion of the epitope-specific antibodies. Localization
of the ant igen determinant in this site of FHA makes it possible to apply the peptide as
a component of the synthetic vaccine agains t whooping-cough.
СПИСОК Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Robinson Α., Ashworth L. Α. Ε. Acellular and defined-component vaccines aga ins t
pertussis // Pa thogenes is and immuni ty in pertussis / Eds. A. C. Wardlaw, R. Par -
t o n . — N e w Y o r k r J o h n Willy and Sons, 1988.—P. 399—417.
2. Ui M., Nogimori KTamura M. Is let-act ivat ing protein, pertussis toxin: subunit
s t ructure and mechanism for its multiple biological actions // Per tuss is toxin /
Eds. R. D. Sekura et a l . — N e w York : Acad, press, 1985,—P. 19—43.
3 Burns D. L., Manclark C. R. Role of cysteine 41 of the A subunit of pertussis to-
xin //J. Biol. C h e m . - 1 9 8 9 , — 2 6 4 , N 1 .—P. 564—568.
4. Barbiery J. Т., Moloney В. КMeride-Mueller L. Μ. Expression and secretion of the-
S-I subuni t and C180 peptide of per tuss is toxin in Escherichia coli • J Bac te r io l . - -
1989,— 171, N 8 . — P . 4362—4369.
5. Askelof P., Rodmalm K., Abens J. et al. Use of synthet ic peptides ;•_> map antige-
nic si tes of Bordelella pertussis toxin subuni t Sl // Л Infect. Diseases.—1988.-—
157, N 4 - P . 738-742.
6. Askelof P., Rodmalm K., Wragsell G. et al. Effect ive immunogenic!• у of two syn-
thetic peptides selected f rom the amino acid sequence of Bordetella pertussis Ьхіг»
subuni t Sl // Proc. Nat . Acad. Sci. USA.— 1990.—87, N 4 , — P . 1347—1351.
7. Mortimer Ε. A., Kimura M v Cherry J. D. Pro tec t ive eff icacy of the Takeda acellu-
iar per tussis vaccine combined with diphtheria and t e t anus toxoids fol lowing house-
hold exposure of J a p a n e s e children / / A I D C . - 1990.— 144 — P. 899—904.
8. Kitnura A., Mountzouros K., Reltnan D. et al. Bordetella pertussis fiIamenl.iy.iF
hemagg lu t in in evaluat ion as a protect ive an t igen and colonizat ion factor in a me use
resp i ra tory infection model / / Infect , and Immunol .— 1990.— 58, N 1— P. 7—16.
9. Rciman D., Tuomatien E., Falkow S. et al. Recognit ion of a bacterial adgesin by
an in tegr in : m a c r o p h a g e CR3 ( α π β ? , C D l l b / C D 1 8 ) binds f i l amentous hemagg lu t i -
nin of Bordeiella pertussis // Cell.— 1990.— 61, N 7 . — P . 1375—1382.
10. Carlsson ./., Drevin H., Axen R. Prote in thiolat ion and reversible protein-protein « on-
ju ra t ion . N-Succinimidvl 3-(2-pyr idyldi th io) propionate a new heierobifunct iona]
reagent // Bioehem. J .—1978.— 173, N 3 , — P . 723—737.
11. OrrepMUH JL А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот ,—Μ. . Наука ,
1935.— 536 с.
12. Mutter S., Briandt J. PPlane S. et al. Inimunochemical reactivity of synthet ic
peptides / / Pro t ides Biol. Fluids Proc. 34-th Colloq. (Oxford, sept. 1986) .—Oxford ,
1986,—P. 87—90.
13. Gevsen H. M., Jairier J. A., Rodda S. J. et al. Chemis t ry of ant ibody binding (о a
protein // Science.— 1987,— 235, N 4793 ,—P. 1184—1190.
14. Carbone F. R., Paterson G. Monoclonal ant ibodies to horse cytochrome с express ing
four dist inct idiotypes dis t r ibute a m o n g two sites on the nat ive protein // Л Itu-
m u n o l . — 1 9 8 5 — 135, N 4 , — P . 2609—2616.
15. Plow E. F., Pierschbaher M. D., Ruoslahti E. et al. The effect of Arg-Gly-Asp-conta-
ining peptides on f ibr inogen and von Wil lebrand factor b ind ing to platelets // Proc.
Nat. Acad. Sci. USA.— 1985,—82, N 2 3 . — P . 8057—8061.
16. Putela R., Pierchbacher M. D., Ruoslahti E. A 125/115 kDa cell sur iasc receptor
specific for vi t ronect in in teracts with the arg in ine-gi ic ine-aspar t ic acid adhesion
sequence f rom fibronectin / / Ibid.— N 17 ,—P. 5766—5770.
17. Leininger E., Roberts M., Kenimer J. D. el al. Per tact in , an Arg-Gly-Asp-conta in ing
Bordetella pertussis sur face protein that promotes adherence of mammal i an cells /I
Ib id .—1991 .—88, N 2 , — P . 345—349.
И і і - т биохимии им. А. В. Палладина АН Украины, Киев Получено 1 2 . 0 1 . 0 8
Ин-т биоорг. химии и нефтехимии АН Украины. Киев
УДК 577.112.5
JI. И. Пальчиковская, Т. JI. Левитина,
М. Т. Бобровская, Μ. II. Овандер, М. С. Кацман, Э. А. Козлов
УСКОРЕННЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ВЫСОКОГОМОЛОГИЧНЫХ БЕЛКОВ.
ПОЛНАЯ АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
ПОЛИЭДРИНА ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА (ВЯП)
КАПУСТНОЙ СОВКИ, MAMESTiRA BRASSICAE
Разработан ускоренный метод («препаративного картирования») определения амино-
кислотной последовательности высокогомологичных белков. Этим методом выяснена
первичная структура полиэдрина ВЯП М. brassicae, включающего 246 остатков амино-
кислот.
Введение. В течение ряда лет наша лаборатория занимается выяснени-
ем первичной структуры белков тел включений (ТВ) бакуловирусов —
ВЯП и вирусов гранулеза (ВГ) . Соответственно белки ТВ ВЯП назы-
ваются полиэдринами, а ТВ ВГ — гранулинами. К моменту публпка-
© Л. И. Пальчиковская, Т. Л. Левитина, М. Т. Бобровская, Μ. Н. Овандер,
М. С. Кацман, Э. А. Козлов, 1993
44 I S S N 0233-7657. Б И О П О Л И М Е Р Ы II К Л Е Т К А . 1993. Т. 0. 4
|