Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. Ядерная ДНК как составная часть ДНК-топоизомеразного комплекса
Приведены результаты исследований по влиянию различных воздействий на распределение дискретных фрагментов ДНК. появляющихся при фракционировании препаратов интактных ядерных ДНК в инвертируемом электрическом поле. Показано, что дискретное расщепление ядерной ДНК зависит от DS-Na в Mg²⁺-содержащем бу...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1993 |
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1993
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156247 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. Ядерная ДНК как составная часть ДНК-топоизомеразного комплекса / В.Т. Соловьян, И.О. Андреев, В.А. Кунах // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 5. — С. 44-51. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860240624189440000 |
|---|---|
| author | Соловьян, В.Т. Андреев, И.О. Кунах, В.А. |
| author_facet | Соловьян, В.Т. Андреев, И.О. Кунах, В.А. |
| citation_txt | Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. Ядерная ДНК как составная часть ДНК-топоизомеразного комплекса / В.Т. Соловьян, И.О. Андреев, В.А. Кунах // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 5. — С. 44-51. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Приведены результаты исследований по влиянию различных воздействий на распределение дискретных фрагментов ДНК. появляющихся при фракционировании препаратов интактных ядерных ДНК в инвертируемом электрическом поле. Показано, что дискретное расщепление ядерной ДНК зависит от DS-Na в Mg²⁺-содержащем буфере и не зависит от него в Ca²⁺-содержащей среде. Ингибиторы топоизомеразы II тенипозид (VM-26) и амсакрин (m-AMSA) усиливают упорядоченное расщепление ядерной ДНК, в то время как NaCl стимулирует лигирование расщепленной ДНК. Предложенные данные позволяют рассматривать ДНК в клеточном ядре как составную часть ДНК-топоизомеразного комплекса, основное свойство которого состоит в способности осуществлять равновесную реакцию разрыва – воссоединения. Подобное представление открывает дополнительные возможности для исследования роли топоизомераз II типа в реализации структурных и функциональных характеристик эукариотического генома.
Викладено результати досліджень з впливу різних чинників на розподіл дискретних фрагментів ДНК, які з'являються при фракціонуванні препаратів інтактних ядерних ДНК в інвертованому електричному полі. Показано, що дискретне розщеплення ядерної ДНК залежить від DS-Na у буфері з вмістом Mg²⁺ і не залежить від нього у середовищі з Ca²⁺. Інгібітори топоізомерази II теніпозид (VM-26) та амсакрин (m-AMSA) посилюють впорядковане розщеплення ядерної ДНК, тоді як NaCl стимулює лігування розщепленої ДНК. Отримані дані дозволяють розглядати ДНК у клітинному ядрі як складову частину ДНК-топоізомеразного комплексу, головна властивість якого полягає у здатності здійснювати рівноважну реакцію розривання – з'єднання. Таке уявлення відкриває додаткові можливості для дослідження ролі топоізомераз II типу в реалізації структурових та функціональних характеристик еукаріотичного геному.
We investigated the pattern variation of discrete DNA fragments resulted from fractionation of nuclear DNA preparations by field inversion gel electrophoresis in response to different influences. The discrete cleavage of nuclear DNA has been shown to be SDS-dependent in Mg²⁺-containing medium and SDS-independent in Ca²⁺-containing one. Topoisomerase II specific poisons teniposide (VM-26) and amsacrine (m-AMSA) have been shown to increase the SDS-dependent nuclear DNA cleavage while NaCl promotes to rejoining of cleaved DNA. The data presented allow to considere the nuclear DNA organization as constituent component of topoisomerase II/DNA complex the main property of which is its ability to mediate the cleavage/rejoining equilibrium-reactions. The involvement of nuclear DNA in functioning topoII/DNA complex offers the possibility to investigate the role of topoll enzyme in structural organization and functioning of eukaryotic genome.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:29:45Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 575.113/577.21
В. Т. Соловьян, И. О. Андреев, В. А. Кунах
ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ДНК ЭУКАРИОТ
В ПУЛЬСИРУЮЩЕМ ЭЛЕКТРИЧЕСКОМ ПОЛЕ.
1. ЯДЕРНАЯ ДНК КАК СОСТАВНАЯ ЧАСТЬ
ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗНОГО КОМПЛЕКСА
Приведены результаты исследований по влиянию различных воздействий на распределение
дискретных фрагментов ДНК. появляющихся при фракционировании препаратов интак-
тных ядерных ДНК в инвертируемом электрическом поле.
Показано, что дискретное расщепление ядерной ДНК зависит от DS-Na в Mg2+-
содержащем буфере и не зависит от него в Ca2+-содержащей среде. Ингибиторы топо-
изомеразы II тенипозид (VM-26) и амсакрин (m-AMSA) усиливают упорядоченное рас-
щепление ядерной ДНК, в то время как NaCl стимулирует лигирование расщепленной
ДНК.
Предложенные данные позволяют рассматривать ДНК в клеточном ядре как состав-
ную часть ДНК-топоизомеразного комплекса, основное свойство которого состоит в
способности осуществлять равновесную реакцию разрыва — воссоединения. Подобное
представление открывает дополнительные возможности для исследования роли топо-
изомераз II типа в реализации структурных и функциональных характеристик эукарио-
тического генома.
Введение. Основой выполнения многочисленных физиологических функ-
ций топоизомеразой II является ее способность осуществлять реакцию
разрыва — воссоединения двуцепочечной Д Н К . На модельных систе-
мах механизм этой реакции в достаточной степени изучен. Предполага-
ется, что ковалентный расщепляемый комплекс Д Н К — фермент слу-
жит ключевым интермедиатом в опосредованных топоизомеразой пре-
вращениях Д Н К и находится в равновесии с нерасщепляемым ком-
плексом [3, 4]. В отличие от других комплексов Д Н К — белок, а так-
же от нерасщепляемого ДНК-топоизомеразного комплекса обработка
белок-денатурирующими агентами расщепляемого комплекса приводит
к появлению двуцепочечных разрывов Д Н К . Характерной особен-
ностью этой реакции является то, что субъединицы фермента остаются
ковалентно связанными с 5'-концами расщепленной Д Н К [4, 5].
К настоящему времени известен ряд ингибиторов топоизомеразы
II типа, эффект которых коррелирует с их возможностью стабилизиро-
вать расщепляемый ДНК-топоизомеразный комплекс,[6—9]. Как уста-
новлено в опытах in Vitro1 эти ингибиторы увеличивают опосредованное
топоизомеразой II расщепление Д Н К , сдвигая равновесную реакцию
разрыва — воссоединения в сторону разрыва Д Н К [4, 9].
С другой стороны, понижение температуры реакции, а также до-
бавление NaCl или ЭДТА к установившемуся in vitro равновесному
ДНК-топоизомеразному комплексу сдвигает равновесие в сторону ли-
гирования расщепленной Д Н К [10—12].
В предыдущем сообщении нами показано, что набор дискретных
фрагментов Д Н К , выявляемый фракционированием препаратов лизи-
рованных ядер с помощью гель-электрофореза в инвертируемом элек-
трическом поле, является результатом специфической DS-Na-зависи-
хмой деградации ядерной Д Н К [1]. Зависимый от тенипозида характер
распределения дискретных фрагментов, а также наличие белок-ассо-
циированных разрывов Д Н К предполагают непосредственное участие
ДНК-топоизомеразы II в упорядоченном расщеплении интактной ядер-
ной Д Н К [2].
Топоизомераза II является основным компонентом ядерного мат-
рикса и остова хромосом )[13—15]. Из этого следует, что ядерная Д Н К
может быть частью ДНК-топоизомеразного комплекса, свойства кото-
рого, по-видимому, сходны с таковыми, описанными для систем in vitro.
В настоящей работе мы приводим данные, подтверждающие это пред-
положение.
© В. Т. Соловьян, И. О. Андреев, В. А. Кунах, 1993
44 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 5
Материалы и методы. Объектом исследования служили 5-дневные
проростки кукурузы.
Препараты интактных ядер получали, как описано ранее [1, 2],
в буфере, содержащем 5 мМ MgCl2 (Mg-ядра) или 5 мМ CaCl2
(Са-ядра).
Для изучения функционирования ДНК-топоизомеразного комплек-
са в ядрах последние, заплавленные в агарозу, инкубировали в течение
10 мин при 30 °С в присутствии 10 мМ Mg2+, 50 мкМ тенипозида,
10 мМ ЭДТА, 250 мМ NaCl, приготовленных на ТЕ-буфере (10 мМ
трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА).
Препараты лизированных ядер фракционировали по методу [2],
используя постоянный режим инверсии электрического поля (24 с «впе-
ред» и 8 с «назад»).
Д Н К из заплавленных в агарозу образцов ядер после фракциониро-
вания их импульсным гель-электрофорезом выделяли, инкубируя рас-
плавленные образцы при 55 0lC в присутствии 1 %-го DS-Na и 200 мкг/
/мл портеиназы К с последующим анализом их с помощью обычного
гель-электрофореза.
Результаты и обсуждение. Как уже упоминалось, обработка ком-
плекса топоизомераза II — Д Н К белок-денатурирующими агентами
(DS-Na) является непременным условием выявления двуцепочечных
разрывов ДНК, катализируемых топоизомеразой [3—5].
Данные, представленные на рис. 1, показывают, что появление
дискретных фрагментов Д Н К из препаратов интактных ядер DS-Na-
зависимо. Инкубация ядер в присутствии ингибитора топоизомеразы
11 тенипозида приводит к усилению DS-Na-опосредуемого расщепления
ядерной ДНК, что проявляется в гидролизе крупных фрагментов раз-
мером ~ 300 тыс. п. о. на мелкие и в уменьшении количества ДНК,
оставшейся на старте (рис. 2).
Исходя из того факта, что при фракционировании препаратов ли-
зированных ядер лишь часть ядерной Д Н К перераспределяется в гель,
можно предположить, что ДНК, оставшаяся на старте, представляет
собой нерасщепленную ядерную ДНК, присутствие которой отражает
существующее равновесие между реакцией разрыва — воссоединения,
катализируемой топоизомеразой II. Действительно, инкубация препа-
ратов ядерной Д Н К в условиях, предотвращающих лигирование, при-
водит к практически полному переходу ядерной Д Н К в гель при пер-
вом цикле фракционирования (рис. 3).
Из данных рис. 4 следует, что добавление NaCl к ядрам, инкубиру-
емым в присутствии ионов Mg2+, вызывает лигирование расщепленной
ДНК. Это проявляется в восстановлении крупных фрагментов Д Н К
размером ~ 300 тыс. п. о. и в увеличении количества ДНК, оставшей-
ся на старте.
Сходный эфект наблюдается и при инкубации Mg-ядер в присут-
ствии ЭДТА (рис. 5).
Представленные данные показывают, что Д Н К в клеточном ядре
51вляется составной частью ДНК-топоизомеразного комплекса, способ-
ного осуществлять реакции разрыва — воссоединения.
Недавно предложен метод, позволяющий разъединить равновесную
реакцию расщепления — воссоединения ДНК, катализируемую топо-
изомеразой II. Такой подход основывался на наблюдении, что обра-
ботка ДНК-топоизомеразного комплекса в Са2+-содержащей среде
ЭДТА приводит не к лигированию расщепленной ДНК, а к стабилиза-
ции комплекса в расщепленном состоянии подобно тому, как это
происходит с комплексом в системе Mg2+—Ds-Na [10]. Подобный
комплекс оставался кинетически компетентным и при последующем
добавлении ионов Mg2+ был способен к лигированию расщеплен-
ной Д Н К [Ю].
Мы воспользовались этим приемом для изучения распределения
дискретных фрагментов ДНК, появляющихся при фракционировании
препаратов интактных Са-ядер (ядер, полученных в присутствии ионов
I S S N 4233-7657 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1903. Т. 9. № 5
4 о
Ca 2 + ) . Как следует из рис. 6, в Са-ядрах наряду с DS-Na-зависимым
происходит и независимое от DS-Na расщепление ядерной ДНК. Инку-
бация Са-ядер в присутствии ЭДТА стимулирует независимое от DS-
Na расщепление крупных фрагментов на мелкие (рис. 6, б, дорожка 1),
а в условиях, способствующих лигированию, мелкие DS-Na-независи-
Рис. 1. Зависимое от DS-Na дискретное расщепление ядерной Д Н К . Препараты заплав-
ленных в агарозу ядер (1) обрабатывали DS-Na (2) и фракционировали в инвертируе-
мом электрическом поле (здесь и на рис. 2—7 цифры слева — размеры фрагментов
в тыс. п. о.)
Рис. 2. Влияние тенипозида на набор дискретных фрагментов ДНК. Ядра проростков
кукурузы, полученные в М£ 2 +-содержащем буфере, инкубировали в отсутствие (1) или
в присутствии тенипозида (2), заплавляли в агарозу, лизировали и фракционировали в
инвертируемом электрическом поле. Здесь и на рис. 3* 4: верхняя и нижняя панели —
Д Н К , полученная из ядер и оставшаяся на старте соответственно
Рис. 3. Опосредуемое топоизомеразой II расщепление ядерной ДНК. Даные свидетель-
ствуют в пользу осуществления реакции разрыва — воссоединения. Ядра проростков
кукурузы, выделенные в М£ 2 + -содержащем буфере, инкубировали в отсутствие ( / ) или
в присутствии (2) 10 мкМ амсакрина. Ядра заплавляли в агарозу, обрабатывали 1 %-м
саркозилатом Na без ( / ) или с добавлением (2) протеиназы К
мые фрагменты превращаются в более крупную Д Н К или вовсе не вхо-
дят в гель (рис. 6, г, дорожка 1). Наконец, финальная обработка ЭДТА
вновь стимулирует DS-Na-независимое расщепление ядерной Д Н К
(рис. 6, д, дорожка 1).
Представленные данные показывают, что поведение DS-Na-незави-
симого продукта расщепления ядерной Д Н К напоминает поведение
ДНК-топоизомеразного комплекса в системе in vitro [10].
Поведение DS-Na-зависимого продукта расщепления отличается
от такового, независимого от DS-Na. Из рис. 6 следует, что в Са-ядрах
первый представлен фрагментами Д Н К размером 50 тыс. п. о., ясно
указывая на способность крупных (ЗОО тыс. п. о.) DS-Na-независимых
ДНК-фрагментов распадаться до мелких (50 тыс. п. о.) в присутствии
DS-Na (рис. 6, а). Обработка Са-ядер ЭДТА приводит к появлению
крупных фрагментов (рис. 6, б) и к увеличению доли ДНК, оставшей-
ся на старте (рис. 7), свидетельствуя об ингибировании ЭДТА DS-Na-
зависимого расщепления ядерной ДНК. Дальнейшая инкубация СаЭ-
ядер в присутствии ионов Mg2+ способствует расщеплению крупных
фрагментов Д Н К на мелкие (рис. 6, в), а добавление NaCl предотвра-
щает этот процесс (рис. 6, г).
46 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. ·λ N° 5
Повторное фракционирование образцов Ca- и СаЭ-ядер, оставших-
ся на старте после первого фракционирования, снова приводит к DS-
Na-независимому появлению набора фрагментов ДНК, однако только
из тех образцов, которые прежде были им обработаны (см. рис. 7). При
этом количество Д Н К из СаЭ-образцов значительно превышает тако-
Рис. 4. Опосредуемое топоизомеразой II лигирование расщепленной ядерной Д Н К . За -
плавленные в агарозу ядра, полученные в М £ 2 + - с о д е р ж а щ е м буфере, инкубировали в
присутствии IO1 мМ M g 2 + на холоду (1) и при 3 0 ° С (2, 3 ) . После инкубации ядра обра-
батывали 250 мМ NaCl (5) , лизировали и фракционировали в инвертируемом электри-
ческом поле
Рис. 5. Влияние Э Д Т А на распределение дискретных фрагментов Д Н К . Ядра из про-
ростков кукурузы, выделенные в присутствии 5 мМ Э Д Т А ( / ) или 5 мМ M g C l 2 (4) ин-
кубировали соответственно с добавлением 20 мМ MgCl 2 (Mg-ядра, 2) или 20 мМ Э Д Т А
( M g 3 ^ p a , 3) . Ядра заплавляли в агарозу, лизировали и фракционировали в инверти-
руемом электрическом поле
вое из Са-ядер (см. рис. 7), подтверждая способность ЭДТА уменьшать
DS-Na-зависимое расщепление Д Н К в интактных ядрах.
Приведенные данные показывают, что ионы Ca2+ стимулируют дис-
кретное расщепление ядерной ДНК, приводя к DS-Na-независимому
появлению ДНК-фрагментов. Остаются неясными, однако, резкие от-
личия в свойствах зависимых от DS-Na и независимых от него продук-
тов расщепления: первые не распадаются на мелкие фрагменты Д Н К
в присутствии ЭДТА, но способны к этому в случае добавления ионов
Mg2+, в то время как последние могут распадаться до мелких под дей-
ствием ЭДТА, но последующее добавление ионов Mg2+ стимулирует
лигирование расщепленной ДНК.
Представленные результаты свидетельствуют о том, что организа-
ция Д Н К в клеточном ядре может быть описана в терминах функцио-
нирующего ДНК-топоизомеразного комплекса.
Представляется вероятным, что в клеточном ядре ДНК-топоизо-
меразный комплекс может находиться как в расщепленном, так и в не-
расщепленном состоянии. Обработка расщепляемого комплекса белок-
денатурирующими агентами приводит к появлению расщепленного про-
дукта, перераспределяющегося в гель в виде дискретных фрагментов
ДНК. Нерасщепляемый комплекс не способен образовывать DS-Na-3a-
висимые разрывы, и часть ядерной ДНК, оставаясь нерасщепленной,
не входит в гель. Ингибиторы топоизомеразы II, вероятно, сдвигают
установившееся равновесие в строну расщепляемого комплекса, увели-
чивая количество расщепленного продукта, в то время как NaCl сти-
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 5 4 -3-705 49
мулирует обратную реакцию, способствуя возрастанию доли нерас-
щепленной Д Н К .
Возможно, что ДНК-топоизомеразный комплекс в ядрах, функцио-
нирующий подобно таковому в системе in vitro, реально существует в
клетках, а не является искусственным образованием, полученным в ре-
зультате приготовления образцов ядер. Недавно Филипски и соавт.
[16] показали, что набор фрагментов Д Н К , полученный из заплавлен-
Рис. 6. Влияние ЭДТА на распределение дискретных фрагментов Д Н К в Са2+-содержа-
щей среде: а — я д р а , выделенные в присутствии 5 мМ Ca2+ (Са-ядра), заплавляли в
агарозу и фракционировали в инвертируемом электрическом поле; б — С а - я д р а обраба-
тывали 10 мМ ЭДТА перед фракционированием (СаЭ-ядра); в — СаЭ-ядра инкубиро-
вали в присутствии 20 мМ Mg 2 + перед фракционированием ( C a 9 - M g ^ p a ) ; г — СаЭ-
ядра инкубировали в присутствии 250 мМ NaCl с последующей инкубацией в 20„ мМ
Mg 2 + ( C a 9 - M g - N a ^ p a ) ; д — C a 3 - M g - N a ^ p a инкубировали в присутствии 20 мМ
ЭДТА перед фракционированием. Инкубацию ядер на каждом этапе проводили в тече-
ние 20 мин при 20 °С; 1 и 2 — соответственно необработанные и обработанные DS-Na
ядра непосредственно перед фракционированием
ных в агарозу образцов клеток, существенно зависит от тенипозида.
Наши опыты, проведенные на культивируемых клетках млекопитаю-
щих, также подтвердили влияние тенипозида на характер распределе-
ния дискретных фрагментов Д Н К (результаты не представлены).
Несмотря на сходство в поведении ДНК-топоизомеразного ком-
плекса в ядрах и в условиях in Vitroy все же существуют некоторые
отличия.
Как было упомянуто ранее, добавление ЭДТА к комплексу в сис-
теме in vitro приводит к лигированию расщепленной Д Н К и диссо-
циации ДНК-топоизомеразного комплекса [10—12]. Это, однако, спра-
ведливо для комплексов, функционирующих в і \^ 2 + -содержащей реак-
ционной среде.
В присутствии ионов Ca2+ добавление ЭДТА вызывает не лигиро-
вание, а стабилизацию ДНК-топоизомеразного комплекса в расщеплен-
ном состоянии [12].
В нашем случае вследствие обработки ДНК-топоизомеразного ком-
плекса ЭДТА фрагменты Д Н К не исчезают при последующем фракци-
онировании препаратов лизированных ядер, а лишь уменьшается коли-
чество расщепленной Д Н К , что проявляется в увеличении доли круп-
ных фрагментов, входящих в гель, и в возрастании количества ДНК,
оставшейся на старте. Это относится к комплексам, формирующим
DS-Na-зависимые разрывы Д Н К в Са-ядрах (см. рис. 6). Обработка
же ЭДТА комплексов, способных к DS-Na-пезависимым разрывам
Д Н К , приводит к дальнейшему расщеплению ядерной Д Н К (см. рис.
6). То же происходит в результате инкубации в присутствии ионов
Mg2+ «СаЭ-комплексов», производящих DS-Na-зависимые разрывы
Д Н К (см. рис. 6).
48 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 5 4 -3-705 49
Эти данные показывают, что влияние ЭДТА на Са-ядра неодноз-
начно: с одной стороны, он ингибирует DS-Na-зависимое, с другой —
стимулирует DS-Na-независимое расщепление ядерной ДНК.
Вторая особенность функционирования ДНК-топоизомеразного
комплекса в ядрах связана с его способностью DS-Na-независимо рас-
щеплять ядерную Д Н К .
Вполне вероятно, что высвобождение фрагментов Д Н К из иа- и
СаЭ-ядер в отсутствие DS-Na действительно обусловлено независимым
от DS-Na расщеплением ядерной ДНК, а не связано с самопроизволь-
ным разрушением части интактных
ядер. На это указывает отсутствие
ДНК-фрагментов при фракционирова-
нии интактных Mg-ядер (см. рис. 1),
а также Э-ядер (рис. 1, / ) , несмотря
на то, что обработка ядер ЭДТА мо-
жет привести к их разрушению. Появ-
ление DS-Na-независимого продукта
расщепления в Са-ядрах не является
столь уж неожиданным. По-видимо-
му, оно обусловлено тем, что ионы
Рис. 7. Распределение фрагментов Д Н К при
повторном фракционировании образцов Са-
ядер. Оставшиеся на старте образцы Ca (а)
и СаЭ ( б ) ядер после первого фракционирова-
ния (см. рис. 6, а, б) инкубировали в присут-
ствии ионов M g 2 + с последующим фракциони-
рованием в инвертируемом электрическом по-
ле в отсутствие Ds-Na . Обозначения см. на
рис. 6, а, б
Ca2+, как и в системе in vitro, стабилизируют ДНК-топоизомеразный
комплекс в расщепленном состоянии, когда ДНК, как полагают, ра-
зорвана [12]. Обработка такого комплекса ЭДТА, очевидно, усиливает
этот процесс, приводя к расщеплению крупных фрагментов Д Н К на
мелкие (см. рис. 6). Однако, как следует из наших данных, доля DS-
Na-независимого расщепления ядерной Д Н К незначительна по сравне-
нию с DS-Na-зависимым (см. рис. 6). Вероятно, только часть ДНК-
топоизомеразных комплексов, функционирующих в ядрах, способна ин-
дуцировать DS-Na-независимое появление фрагментов Д Н К . Гораздо
более неожиданным свойством ДНК-топоизомеразного комплекса в
Са-ядрах, связанным с DS-Na-независимым расщеплением ДНК, явля-
ется приобретенная им способность DS-Na-независимо фрагментиро-
вать ядерную Д Н К после того, как комплекс обработан DS-Na. Так,
обработка СаЭ-ядер этим агентом приводит к гораздо более интенсив-
ному DS-Na-независимому расщеплению ядерной Д Н К при повторном
цикле инкубации/фракционирования (см. рис. 7). Создается впечатле-
ние, что DS-Na «замораживает» ДНК-топоизомеразный комплекс,
который остается кинетически компетентным и способен к дальней-
шей DS-Na-независимой фрагментации ядерной Д Н К в присутствии
ионов Mg2+.
Из приведенного выше следует, что фракционирование препаратов
«интактных ядерных Д Н К » вызывает появление двух основных типов
дискретных фрагментов Д Н К размером ~ 50 и 300 тыс. п. о. В свою
очередь, последние способны дискретно расщепляться до фрагментов
размером 50 тыс. п. о. в присутствии ионов Mg2+ и тенипозида (см. рис.
2, 4). После обработки ядер NaCl крупные ДНК-фрагменты восста-
навливаются (см. рис. 5), а ЭДТА, вероятно, предотвращает M g 2 + - 3 a -
висимую конверсию крупных фрагментов в мелкие (см. рис.
4, 6). Последнее обстоятельство указывает на двойственную природу
крупных фрагментов Д Н К размером — 300' тыс. п. о.: будучи продук-
том расщепления ядерной ДНК, они· в дополнение к этому представ-
ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 5 4 -3 -705
49
ляют собой интермедиа™, которые либо способны, либо не способны
превращаться в мелкие фрагменты размером 50 тыс. п. о. Иными сло-
вами, фрагменты размером ~ 300 тыс. п. о. могут быть либо расщеп-
ляемым, либо нерасщепляемым ДНК-топоизомеразпым комплексом по
отношению к расщепленному продукту размером 50 тыс. п. о.
С такой точки зрения становится понятным распределение дискрет-
ных фрагментов Д Н К в Са-ядрах. Так, продукт DS-Na-независимого
расщепления ядерной Д Н К размером ~ 300 тыс. п. о. является, оче-
видно, расщепляемым комплексом, который в присутствии DS-Na рас-
падается на мелкие фрагменты Д Н К размером 50 тыс. п. о. (см.
рис. 6, а).
Обработка Са-ядер ЭДТА, вероятно, превращает крупные фраг-
менты в нерасщепляемые интермедиа™, стабильные при воздействии
DS-Na (см. рис. 6, б). Дальнейшая инкубация СаЭ-ядер в среде с иона-
ми Mg2+, возможно, делает нерасщепляемые интермедиа™ расщепляе-
мыми, которые в присутствии DS-Na распадаются на мелкие фрагмен-
ты Д Н К (см. рис. 6, в), а добавление NaCl предотвращает этот процесс
(см. 6, г ) .
TeiM не менее, остается неясным противоположный эффект Mg2+
и ЭДТА на DS-Na-зависимое и DS-Na-независимое расщепление Д Н К
в Са-ядрах. Возможно, это связано с наличием в ядрах различных ва-
риантов ДНК-топоизомеразных комплексов, по-разному осуществля-
ющих реакции разрыва — воссоединения.
Суммируя изложенное, можно заключить, что Д Н К в клеточном
ядре организована в виде ДНК-топоизомеразного комплекса, основные
закономерности функционирования которого сходны с таковыми, опи-
санными для модельных систем. Это открывает дополнительные воз-
можности для исследования роли топоизомеразы II в реализации
структурных и функциональных характеристик эукариотического
генома.
Р е з ю м е . Викладено результати досліджень з впливу різних чинників на розпо-
діл дискретних фрагментів ДНК, які з'являються при фракціонуванні препаратів інтак-
тних ядерних Д Н К в інвертованому електричному полі.
Показано, що дискретне розщеплення ядерної Д Н К залежить від DS-Na у буфері
з вмістом M g 2 + і не залежить від нього у середовищі з Ca2+. Інгібітори топоізомерази
II теніпозид (VM-26) та амсакрин (m-AMSA) посилюють впорядковане розщеплення
ядерної ДНК, тоді як NaCl стимулює лігування розщепленої ДНК.
Отримані дані дозволяють розглядати Д Н К у клітинному ядрі як складову части-
ну ДНК-топоізомеразного комплексу, головна властивість якого полягає у здатності
здійснювати рівноважну реакцію розривання — з'єднання. Таке уявлення відкриває до-
даткові можливості для дослідження ролі топоізомераз II типу в реалізації структуро-
вих та функціональних характеристик еукаріотичного геному.
S u m m a r y . We investigated the pattern variation of discrete DNA fragments re-
sulted from fractionation of nuclear DNA preparations by field inversion gel electropho-
resis in response to different influences. The discrete c leavage of nuclear DNA has been
shown to be SDS-dependent in M g + + - c o n t a i n i n g medium and SDS-independent in Ca + + -
containing one. Topoisomerase II specific poisons teniposide (VM-26) and amsacrine
(m-AMSA) have been shown to increase the SDS-dependent nuclear DNA cleavage while
NaCl promotes to rejoining of cleaved DNA.
The data presented allow to considere the nuclear DNA organization as constituent
component of topoisomerase II /DNA complex the main property of which is its ability
to mediate the cleavage/rejoining equilibrium· reactions. The involvement of nuclear DNA
in functioning topoII/DNA complex offers the possibility to investigate the role of topo l l
enzyme in structural organization and functioning of eukaryotic genome.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Соловьян, В. Т., Кунах В. А. Фракционирование Д Н К зукариот в пульсирующем
электрическом поле. Обнаружение и свойства дискретных фрагментов Д Н К // Mo-
лекуляр. биология — 1991.— 25, № 4 .—С. 1071—1079.
50 ISSN 0233-7657 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. N° 5
2. Соловьян В. Т., Андреев И. О., Кунах В. А. Фракционирование Д Н К эукариот б
пульсирующем электрическом поле. II. Дискретные фрагменты Д Н К и уровни струк-
турної! организации х р о м а т и н а / / Т а м же.— № 6.— С. 43—51.
3. Nelson Ε. M., Teweij I\. M., Eiu Ε. F. Mechanism of an t i tumor d r u g action: po isoning
of mammal i an DNA topoisomerase ЇІ on DNA bv 4 / - (9 -ac r id inv!amino) -methanesu i -
fon-n-anis idide // Proc. Nat . Acad. Sci. USA.— 1984,— 8 1 . — P . 1361 — 1365.
4. Eiu L. F. DNA topoisomerase poisons as an t i tumor d r u g s / / A n n u . Rev. Biochem.—
1989 .—58.—P. 351—375.
5. ItalligLiii B. D., Edwards Κ. A., Eiu L. F. Pur i f i ca t ion and charac ter iza t ion of a type
Ii DNA topoisomerase f rom bovine calf t h y m u s // J . Biol. Chem.— 1985,— 260.—
P. 2475-2-182.
6. Zwelliiio- L. A. DNA topoisomerase II as a t a rge t of an t ineoplas t ic d r u g t h e r a p y / /
Cancer M e l a s l a s i s Rev.— 1985.—4.— P. 263—276.
7. GliSSGii B. S., Ross W. E. DNA topoisomerase II: a pr imer on the enzyme and its uni-
que role as a mu l t i d rug t a rge t in cancer chemotherapy // P h a r m . Ther.— 1987.— 32.—
P. 89—106.
8 Ross W. /:. DNA topoisomerases as t a rge t for cancer t h e r a p v / / B i o c h e m . Pha rm.—
1984.— 34.— P. 4191—4195.
9. OsiieroU N. Ef fec t of an t ineoplas t ic agen t s on the DNA c leavage / re l iga t ion reaction
oi eukarvot ic topoisomerase II: inhibit ion of DNA re l iga t ion by e t o p o s i a e / / B i o c h e m i -
stry.— 1989,— 2 8 , — P . 6157—6160.
10 Sander M., Hsieh T.-S. Double-s t rand DNA. c leavage bv type II DNA topoisomerase
• f rom Drosophila melanogasler /'./ J. Biol. Chem.—1983. - 2 5 8 , — P . 8421—8428.
11. Eiu E. F., Rowe T. C., Yang E. ei al. C leavage of DNA by m a m m a l i a n DNA topoisome-
rase И / / I b i d . — P . 15365—15370.
12. Osheroji N., Zechiedrich Ε. E. Calc ium-promoted DNA c leavage by eukarvot ic topo-
isomerase II: t r app ing the covalcnt enzvme-DNA complex in an active f o r m / / B i o c h e -
mist ry .— 1987,— 26,— P. 4303—4309.
13. Eurnshirw Ψ. C., Heck M. M. S. Local izat ion of topo isomerase II in mitot ic chromo-
s o m e s / / J . Cell. Biol .—1985,— 190 ,—P. 1716—1725.
14. Gasscr S. MEaemmli U. K. The o rgan iza t ion of chromat in loops: charac te r iza t ion
of a scaffold a t t achment s i t e / / E M B O J.— 1986 — 5 , — P . 511—518.
15. Bcrrios M., Osherofi N., Fisher P. A. In situ local izat ion of DNA topoisomerase IIf
a ma jo r polvpept ide comoonent of Drosophila nuclear mat r ix f r a c t i o n , / / P r o c . Nat .
A c a d / S c i . ' U S A . — 1985.— 82.— P. 4142—4146. .
16. Filipsky J., Leblanc J., Youdale T. ei al. Periodici ty of DNA fo ld ing and higher order
chromat in s t r u c t u r e s / / E M B O J.— 1990 .—9.—P. 1319—1327.
Ин-т молекудяр. биологии и генетики Получено 11.12.Э2
АН Украины, Киев
У Д К 577.161.2
Л. Б. Бондаренко, Р. И. Яхимович
ВЛИЯНИЕ ИЗБЫТКА Ca И РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ СОЕДИНЕНИЙ
D-ВИТАМИННОЙ ПРИРОДЫ НА ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ
СПЕКТРЫ КОЛЛАГЕНОВ I ТИПА КОЖИ ЦЫПЛЯТ
В опытах на цыплятах изучено влияние избытка Ca и различных доз соединений D-eu-
таминной природы на изоэлектрические спектры коллагенов I типа кожи.
Установлены значения pi коллагенов I типа кожи цыплят и показано, что при ра-
хите коллагеновая спираль имеет более сильный положительный заряд, чем в случае
нормального белка. Избыток Ca в рационе не оказывал заметного воздействия на pi
молекул коллагенов I типа кожи. Влияние производных витамина D3, хотя и было ана-
логичным по характеру его действия, но отличалось степенью выраженности.
Введение. Одним из основных путей обеспечения животного организма
витамином D является его фотобиогенез в коже под влиянием ультра-
фиолетовых лучей. Регуляторами этого процесса выступают концентра-
ция Ca и метаболитов витамина D3 в плазме крови, интенсивность УФ-
облучения, пигментированность кожных покровов [1].
Нельзя исключить также вклада в регуляторный процесс колла-
геновых структур, служащих ориентиром для клеток кожи и своеоб-
разным «триггерным механизмом», возможно, непосредственно влия-
ющим на обменные процессы, в том числе обмен Ca и витамина D3 в
© Л . Б. Бондаренко, Р. И. Яхимович, 1993
I S S N 0233-7657 Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 5 4 -3-705 49
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156247 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:29:45Z |
| publishDate | 1993 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Соловьян, В.Т. Андреев, И.О. Кунах, В.А. 2019-06-18T10:21:24Z 2019-06-18T10:21:24Z 1993 Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. Ядерная ДНК как составная часть ДНК-топоизомеразного комплекса / В.Т. Соловьян, И.О. Андреев, В.А. Кунах // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 5. — С. 44-51. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000370 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156247 575.113/577.21 Приведены результаты исследований по влиянию различных воздействий на распределение дискретных фрагментов ДНК. появляющихся при фракционировании препаратов интактных ядерных ДНК в инвертируемом электрическом поле. Показано, что дискретное расщепление ядерной ДНК зависит от DS-Na в Mg²⁺-содержащем буфере и не зависит от него в Ca²⁺-содержащей среде. Ингибиторы топоизомеразы II тенипозид (VM-26) и амсакрин (m-AMSA) усиливают упорядоченное расщепление ядерной ДНК, в то время как NaCl стимулирует лигирование расщепленной ДНК. Предложенные данные позволяют рассматривать ДНК в клеточном ядре как составную часть ДНК-топоизомеразного комплекса, основное свойство которого состоит в способности осуществлять равновесную реакцию разрыва – воссоединения. Подобное представление открывает дополнительные возможности для исследования роли топоизомераз II типа в реализации структурных и функциональных характеристик эукариотического генома. Викладено результати досліджень з впливу різних чинників на розподіл дискретних фрагментів ДНК, які з'являються при фракціонуванні препаратів інтактних ядерних ДНК в інвертованому електричному полі. Показано, що дискретне розщеплення ядерної ДНК залежить від DS-Na у буфері з вмістом Mg²⁺ і не залежить від нього у середовищі з Ca²⁺. Інгібітори топоізомерази II теніпозид (VM-26) та амсакрин (m-AMSA) посилюють впорядковане розщеплення ядерної ДНК, тоді як NaCl стимулює лігування розщепленої ДНК. Отримані дані дозволяють розглядати ДНК у клітинному ядрі як складову частину ДНК-топоізомеразного комплексу, головна властивість якого полягає у здатності здійснювати рівноважну реакцію розривання – з'єднання. Таке уявлення відкриває додаткові можливості для дослідження ролі топоізомераз II типу в реалізації структурових та функціональних характеристик еукаріотичного геному. We investigated the pattern variation of discrete DNA fragments resulted from fractionation of nuclear DNA preparations by field inversion gel electrophoresis in response to different influences. The discrete cleavage of nuclear DNA has been shown to be SDS-dependent in Mg²⁺-containing medium and SDS-independent in Ca²⁺-containing one. Topoisomerase II specific poisons teniposide (VM-26) and amsacrine (m-AMSA) have been shown to increase the SDS-dependent nuclear DNA cleavage while NaCl promotes to rejoining of cleaved DNA. The data presented allow to considere the nuclear DNA organization as constituent component of topoisomerase II/DNA complex the main property of which is its ability to mediate the cleavage/rejoining equilibrium-reactions. The involvement of nuclear DNA in functioning topoII/DNA complex offers the possibility to investigate the role of topoll enzyme in structural organization and functioning of eukaryotic genome. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. Ядерная ДНК как составная часть ДНК-топоизомеразного комплекса Фракціонування ДНК еукаріот в пульсуючому електричному полі. 1. Ядерна ДНК як складова частина ДНК-топоізомеразного комплексу The fractionation of eukaryotic dna by pulsed field gel electrophoresis. Evidence for nuclear DNA organization as constituent component of topoisomerase II/DNA complex Article published earlier |
| spellingShingle | Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. Ядерная ДНК как составная часть ДНК-топоизомеразного комплекса Соловьян, В.Т. Андреев, И.О. Кунах, В.А. Структура и функции биополимеров |
| title | Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. Ядерная ДНК как составная часть ДНК-топоизомеразного комплекса |
| title_alt | Фракціонування ДНК еукаріот в пульсуючому електричному полі. 1. Ядерна ДНК як складова частина ДНК-топоізомеразного комплексу The fractionation of eukaryotic dna by pulsed field gel electrophoresis. Evidence for nuclear DNA organization as constituent component of topoisomerase II/DNA complex |
| title_full | Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. Ядерная ДНК как составная часть ДНК-топоизомеразного комплекса |
| title_fullStr | Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. Ядерная ДНК как составная часть ДНК-топоизомеразного комплекса |
| title_full_unstemmed | Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. Ядерная ДНК как составная часть ДНК-топоизомеразного комплекса |
| title_short | Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. Ядерная ДНК как составная часть ДНК-топоизомеразного комплекса |
| title_sort | фракционирование днк эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. ядерная днк как составная часть днк-топоизомеразного комплекса |
| topic | Структура и функции биополимеров |
| topic_facet | Структура и функции биополимеров |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156247 |
| work_keys_str_mv | AT solovʹânvt frakcionirovaniednkéukariotvpulʹsiruûŝemélektričeskompole1âdernaâdnkkaksostavnaâčastʹdnktopoizomeraznogokompleksa AT andreevio frakcionirovaniednkéukariotvpulʹsiruûŝemélektričeskompole1âdernaâdnkkaksostavnaâčastʹdnktopoizomeraznogokompleksa AT kunahva frakcionirovaniednkéukariotvpulʹsiruûŝemélektričeskompole1âdernaâdnkkaksostavnaâčastʹdnktopoizomeraznogokompleksa AT solovʹânvt frakcíonuvannâdnkeukaríotvpulʹsuûčomuelektričnomupolí1âdernadnkâkskladovačastinadnktopoízomeraznogokompleksu AT andreevio frakcíonuvannâdnkeukaríotvpulʹsuûčomuelektričnomupolí1âdernadnkâkskladovačastinadnktopoízomeraznogokompleksu AT kunahva frakcíonuvannâdnkeukaríotvpulʹsuûčomuelektričnomupolí1âdernadnkâkskladovačastinadnktopoízomeraznogokompleksu AT solovʹânvt thefractionationofeukaryoticdnabypulsedfieldgelelectrophoresisevidencefornucleardnaorganizationasconstituentcomponentoftopoisomeraseiidnacomplex AT andreevio thefractionationofeukaryoticdnabypulsedfieldgelelectrophoresisevidencefornucleardnaorganizationasconstituentcomponentoftopoisomeraseiidnacomplex AT kunahva thefractionationofeukaryoticdnabypulsedfieldgelelectrophoresisevidencefornucleardnaorganizationasconstituentcomponentoftopoisomeraseiidnacomplex |