Ингибирование вирусной инфекции 2'–5'-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля
Изучено влияние разных концентраций 2'–5'-олигоаденилата в культуральной среде на процесс регенерации мепистем и количество регенерантов. свободных от X-, S-, M- и F-вирусов картофеля. Подобраны концентрации препарата, угнетающие репродукцию вирусов не влияя при этом на развитие регенерант...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Datum: | 1993 |
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1993
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156262 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Ингибирование вирусной инфекции 2'–5'-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля / З.Ю. Ткачук, В.С. Артеменко, Л.И. Семерникова // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 2. — С. 9-18. — Бібліогр.: 40 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156262 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Ткачук, З.Ю. Артеменко, В.С. Семерникова, Л.И. 2019-06-18T10:27:24Z 2019-06-18T10:27:24Z 1993 Ингибирование вирусной инфекции 2'–5'-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля / З.Ю. Ткачук, В.С. Артеменко, Л.И. Семерникова // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 2. — С. 9-18. — Бібліогр.: 40 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000351 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156262 578.282+581.143.5+632.38 Изучено влияние разных концентраций 2'–5'-олигоаденилата в культуральной среде на процесс регенерации мепистем и количество регенерантов. свободных от X-, S-, M- и F-вирусов картофеля. Подобраны концентрации препарата, угнетающие репродукцию вирусов не влияя при этом на развитие регенерантов. Показано наличие сортовой зависимости при оздоровлении картофеля и универсальность противовирусного действия 2'–5'-олигоаденилата. Вивчено вплив різних концентрацій 2'-5'-олігоаденілат в культуральному середовищі на процес регенерації мепістем та кількість регенерантів. звільнених від X-, S-, M-і F-вірусів картоплі. Підібрано концентрації препарату, які пригнічують репродукцію вірусів не впливаючи при цьому на розвиток регенерантів. Показано наявність сортової залежності при оздоровленні картоплі та універсальність противірусної дії 2'-5'-олігоаденілата. The effect of 2'–5'-oliloadenylates taken at different concentrations on the process of meristems regeneration and the amount of regenerats free of potato viruses X, S, M and F in the culture medium was studied. The preparation concentrations inhibiting viruses reproduction without effecting the regenerates development were chosen. Variety dependence in the process of potato improvement and 2'–5'-oligoadenylates universal antiviral effect were shown. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Клеточная биология Ингибирование вирусной инфекции 2'–5'-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля Пригничення вірусної інфекції під впливом 2'-5'-олігоаденілата при регенерації меристеми картоплі Viral infection inhibition effected by 2'–5'-oligoadenylate in the process of potato meristems regeneration Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Ингибирование вирусной инфекции 2'–5'-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля |
| spellingShingle |
Ингибирование вирусной инфекции 2'–5'-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля Ткачук, З.Ю. Артеменко, В.С. Семерникова, Л.И. Клеточная биология |
| title_short |
Ингибирование вирусной инфекции 2'–5'-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля |
| title_full |
Ингибирование вирусной инфекции 2'–5'-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля |
| title_fullStr |
Ингибирование вирусной инфекции 2'–5'-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля |
| title_full_unstemmed |
Ингибирование вирусной инфекции 2'–5'-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля |
| title_sort |
ингибирование вирусной инфекции 2'–5'-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля |
| author |
Ткачук, З.Ю. Артеменко, В.С. Семерникова, Л.И. |
| author_facet |
Ткачук, З.Ю. Артеменко, В.С. Семерникова, Л.И. |
| topic |
Клеточная биология |
| topic_facet |
Клеточная биология |
| publishDate |
1993 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Пригничення вірусної інфекції під впливом 2'-5'-олігоаденілата при регенерації меристеми картоплі Viral infection inhibition effected by 2'–5'-oligoadenylate in the process of potato meristems regeneration |
| description |
Изучено влияние разных концентраций 2'–5'-олигоаденилата в культуральной среде на процесс регенерации мепистем и количество регенерантов. свободных от X-, S-, M- и F-вирусов картофеля. Подобраны концентрации препарата, угнетающие репродукцию вирусов не влияя при этом на развитие регенерантов. Показано наличие сортовой зависимости при оздоровлении картофеля и универсальность противовирусного действия 2'–5'-олигоаденилата.
Вивчено вплив різних концентрацій 2'-5'-олігоаденілат в культуральному середовищі на процес регенерації мепістем та кількість регенерантів. звільнених від X-, S-, M-і F-вірусів картоплі. Підібрано концентрації препарату, які пригнічують репродукцію вірусів не впливаючи при цьому на розвиток регенерантів. Показано наявність сортової залежності при оздоровленні картоплі та універсальність противірусної дії 2'-5'-олігоаденілата.
The effect of 2'–5'-oliloadenylates taken at different concentrations on the process of meristems regeneration and the amount of regenerats free of potato viruses X, S, M and F in the culture medium was studied. The preparation concentrations inhibiting viruses reproduction without effecting the regenerates development were chosen. Variety dependence in the process of potato improvement and 2'–5'-oligoadenylates universal antiviral effect were shown.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156262 |
| citation_txt |
Ингибирование вирусной инфекции 2'–5'-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля / З.Ю. Ткачук, В.С. Артеменко, Л.И. Семерникова // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 2. — С. 9-18. — Бібліогр.: 40 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT tkačukzû ingibirovanievirusnoiinfekcii25oligoadenilatompriregeneraciimeristemkartofelâ AT artemenkovs ingibirovanievirusnoiinfekcii25oligoadenilatompriregeneraciimeristemkartofelâ AT semernikovali ingibirovanievirusnoiinfekcii25oligoadenilatompriregeneraciimeristemkartofelâ AT tkačukzû prigničennâvírusnoíínfekcíípídvplivom25olígoadenílatapriregeneracíímeristemikartoplí AT artemenkovs prigničennâvírusnoíínfekcíípídvplivom25olígoadenílatapriregeneracíímeristemikartoplí AT semernikovali prigničennâvírusnoíínfekcíípídvplivom25olígoadenílatapriregeneracíímeristemikartoplí AT tkačukzû viralinfectioninhibitioneffectedby25oligoadenylateintheprocessofpotatomeristemsregeneration AT artemenkovs viralinfectioninhibitioneffectedby25oligoadenylateintheprocessofpotatomeristemsregeneration AT semernikovali viralinfectioninhibitioneffectedby25oligoadenylateintheprocessofpotatomeristemsregeneration |
| first_indexed |
2025-11-26T01:43:01Z |
| last_indexed |
2025-11-26T01:43:01Z |
| _version_ |
1850605679812804608 |
| fulltext |
Клеточная
биология
УДК 578.282+581.143.5+632.38
З. Ю. Ткачук, В. С. Артеменко, Л. И. Семерникова
ИНГИБИРОВАНИЕ ВИРУСНОЙ
ИНФЕКЦИИ 2 —5-ОЛИГОАДЕНИЛАТОМ
ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ МЕРИСТЕМ КАРТОФЕЛЯ
Изучено влияние разных концентраций 2'—5Г-олигоаденилата в культуральной среде на
процесс регенерации мепистем и количество регенерантов. свободных от X-, S-, M- и
F-вирусов картофеля. Подобраны концентрации препарата, угнетающие репродукцию
вирусов не влияя при этом на развитие регенерантов. Показано наличие сортовой за-
висимости при оздоровлении картофеля и универсальность противовирусного действия
2'—5Г-олигоаденилата.
Введение. Благодаря вегетативному размножению картофель, как и
другие подобные растения, накапливает большое количество разнооб-
разных патогенных микроорганизмов и вирусов. При благоприятных
условиях вирусы картофеля быстро распространяются и могут вызвать
потерю от 30 до 100 % урожая клубней.
Для освобождения картофеля от вирусных, бактериальных, гриб-
ковых и нематодных болезней самым эффективным является метод ре-
генерации меристем. Ранее показано, что вирусы плохо проникают в
клетки верхушки растений, в результате чего тонкий слой верхушки ме-
ристем часто бывает свободным от вирусной инфекции [1]. Выращивая
тонкий срез такой верхушки на питательной среде, позволяющей реге-
нерировать из нее растения, можно получить картофель с очень низким
содержанием вируса. Иногда подобным методом получают безвирусные
растения. Однако последние встречаются довольно редко, что свиде-
тельствует о несовершенстве данного метода.
Гипотетически можно предложить такие объяснения случаев появ-
ления безвирусных растений, которые в определенных условиях регене-
рируют из клеток, свободных от вирусов:
1) репликация вируса не поспевает за клеточным делением;
2) некоторые клетки приобретают устойчивость к вирусу путем
спонтанного мутагенеза;
3) устойчивость клеток к вирусу может существовать в одной и
той же ткани наряду с чувствительностью к нему; после дедйфферен-
циации как из устойчивых, так и из чувствительных клеток способны
регенерировать соответственно здоровые и инфицированные растениям.
Ванг и Хуанг [2] подтвердили возможность спонтанной утраты
растительной клеткой вирусов и показали, что частота возникновения
растений, свободных от Х-вируса картофеля, выше среди регенерантов
из меристемного каллуса (46 %), чем среди регенерантов из меристем.
Однако наряду со способностью освобождать от вирусов метод ре-
генерации каллуса не гарантирует генетической стабильности получен-
ных с его помощью растений, что исключает возможность применения
этого метода для оздоровления сортового материала. В этих случаях
более перспективными могут быть методы, обеспечивающие увеличение
© 3. Ю. ТКАЧУК, в . С. АРТЕМЕНКО, Л. И. СЕМЕРНИКОВА, 1993
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 2 2 - 2-904 9
частоты получения безвирусных растений за счет обработки эксплан-
татов противовирусными веществами.
Использование антивирусных препаратов в сочетании с методом
регенерации меристем позволяет получать безвирусные растения. Эф-
фективность антивирусных препаратов при этом оценивается по уве-
личению частоты выхода здоровых растений из меристем. Однако для
практического оздоровления важно также и увеличение количества
прижившихся эксплантатов, т. е. жизнеспособность меристем и время
с момента перенесения их на регенерационную среду до получения
взрослых растений. Эти показатели зависят в основном от размеров
эксплантатов. Применение антивирусных препаратов позволяет увели-
чить размеры эксплантатов, регенерирующих безвирусные растения.
Таким образом, для картофеля удалось увеличить размеры экспланта-
тов от 0,1 до 0,5 мм и этим сократить процесс регенерации до 2—1,5
месяца [3].
Ранее была показана высокая противовирусная эффективность T—
б'-олигоаденилатов на протопластах, листовых дисках и интактных рас-
тениях, зараженных вирусом табачной мозаики (BTM) [4]. Однако в
вышеназванной работе авторы не ставили перед собой цель получить
свободные от BTM растения. Они обнаружили только значительное
уменьшение концентрации вируса в обработанном материале непо-
средственно после действия 2'—5'-олигоаденилата и не определяли
количество безвирусных растений, тем более после длительного
культивирования.
После публикации Деваша и др. [4] не появлялось ни одной зна-
чительной работы, которая бы подтверждала или опровергала их до-
вольно сенсационные результаты. Известно также, что проблема про-
тивовирусных препаратов для растений с тех пор существенно не
прояснилась.
В то же время исследования противовирусного действия олигоаде-
нилатов на животных клетках успешно продолжаются [5—11].
Исходя из вышеизложенного нам кажется перспективным приме-
нение комбинированного метода, совмещающего метод культуры мери-
стем и химиотерапию 2'—5'-олигоаденилатами. Надеемся, что таким
способом можно достичь полного освобождения растений практически
от всех вирусов. Параллельно планировалось снижение до минимума
расхода веществ, угнетающих инфекцию, и таким образом удешевить
химиотерапию.
В связи с этим было изучено действие дефосфорилированного 2'—
б'-олигоаденилата (2'—5'-Аз) в разных концентрациях как ингибитора
репликации вирусов в меристеме нескольких сортов картофеля и воз-
можность регенерации безвирусных растений. Разработаны также ме-
тоды получения безвирусных растений из районированных сортов кар-
тофеля, зараженных природным комплексом вирусов этой культуры.
Материалы и методы. Меристему изолировали под бинокулярным
микроскопом с 24—48-кратным увеличением из верхушечных и пазуш-
ных почек растений стерильной культуры или побегов проросших клуб-
ней. У нас не возникала потребность в стерилизации нестерильного ма-
териала, как это рекомендуется основными методиками. Покровные ли-
стья неповрежденной почки защищали нижние слои и собственно
меристему от инфицирования. Отказ от стерилизации позволил уп-
ростить методику и избавиться от лишнего фактора влияния на
меристему.
Операцию проводили в ламинарном боксе. Оптическую систему
микроскопа МБС-10 разворачивали вокруг оси на 180° так, чтобы пе-
ред предметным столиком было свободное пространство. Это значи-
тельно уменьшало инфицирование. На предметном столике размещали
подставку из термостойкого пластика, которую стерилизовали после
каждой операции, обжигая в спирте. Почка придерживается на под-
ставке пинцетом с прикрепленными к его концам половинками пера
из нержавеющей стали. Микробиологическим петледержателем со
10 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 2 2 - 2-904 10
вставленным в него кусочком лезвия снимали покровные листья и отде-
ляли меристему с одним—двумя примордиями длиной до 0,3 мм.
Вычлененную меристему переносили на кончике осколка лезвия,
смоченного средой, и ставили на бумажные мостики в микропробирки
с жидкой средой (минеральная основа MS, мг/л: Bl — 1; В 6 — 1; P P —
0,5; С — 3 ; фолиевая кислота — 0,05; БАП — 0,1; аденин— 1; глицин —
2; гидролизат казеина — 30; дрожжевой экстракт — 20; агар — 500;
глюкоза — 8000; сахароза — 15 000; рН — 5,8), в которую добавляли
препарат 2'—5'-Аз в разных концентрациях. Среду наливали в микро-
пробирки диаметром 10 мм, длиной 30 мм с мостиками из фильтро-
вальной бумаги. Пробирки закрывали крышками из алюминиевой фоль-
ги и влагонепроницаемой пленкой.
На мостик можно высаживать до четырех меристем. Расход среды
при такой методике составлял около 150 мкл на одну меристему.
Небольшие затраты среды позволяют сократить до минимума коли-
чество используемых дорогостоящих олигонуклеотидов, а также улуч-
шить конденсирование среды меристемой.
Перед введением в среду препарат стерилизовали, растворяя и вы-
держивая его до этого в 50 %-м этиловом спирте не менее 96 ч при
температуре 22 °С, и после выпаривания спирта добавляли в стериль-
ную среду.
Через 3 месяца после высаживания меристем регенерировали рас-
тения высотой 10—15 мм, большинство из которых укоренилось. Д л я
дальнейшего доращивания черенки из этих растений рассаживали
в большие пробирки на ту же самую среду (но агаризованную и
без олигонуклеотидов) или в длинные тонкие пробирки с жидкой
средой.
Содержание X-, S-, M- и F-вирусов картофеля определяли в тече-
ние 9 месяцев методом иммуноферментного анализа [12]. Так были
отобраны клоны растений, в которых вирус не проявлялся на протя-
жении 10 пассажей.
Чтобы предупредить перезаражение растений вирусами во время
эксперимента особое внимание уделяли стерилизации инструментов
после пересадки каждого эксплантата. Инструменты выдерживали в
70 %-м спирте в течение 1 мин, потом погружали в 96 %-й спирт и
обжигали над спиртовкой не менее 30 с.
В опыте использовали районированные сорта картофеля Гатчин-
ский, Зов, Луговской, Невский.
Препарат 2'—б'-олигоаденилата любезно предоставлен нам
И. А. Михайлопуло (Ин-т биоорг. химии АН Беларуси).
Результаты опытов обрабатывали методами статистики по Зай-
цеву [13].
Результаты и обсуждение. Мы изучили и проверили предыдущий
опыт вычленения меристем картофеля и регенерации из них растений,
изложенный в основных публикациях по этому вопросу. Наши собствен-
ные исследования проводились по значительно модифицированной ме-
тодике, описанной в разделе «Материалы и методы».
В экспериментах использовано 1648 эксплантатов меристем из за-
раженных вирусами растений картофеля. Меристемы выращивали на
среде без олигонуклеотида (контроль) и с 2'—5'-Аз в концентрации
10 -7—10~4 M (от 200 до 400 эксплантатов в каждом варианте).
При исследованиях учитывали общее количество нормально раз-
вивающихся растений и количество оздоровленных растений, получен-
ных из меристем после обработки разными концентрациями 2'—5'-Аз.
Д л я того чтобы исключить влияние на результаты опыта таких факто-
ров, как сортовая принадлежность и происхождение материала, а так-
ж е специфичность действия препарата на разные вирусы, количество
нормально развитых регенерантов и оздоровленных растений учитыва-
ли в зависимости от сорта и происхождения материала и отдельно оп-
ределяли влияние препарата на освобождение от Х-вируса. Полученные
результаты приведены в табл. 1—7.
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 2 2 - 2-904 3
Прежде всего необходимо было ответить на вопрос: влияет ли на
регенерацию меристем 2'—5'-Аз? Поскольку в опыте использовали рас-
тения картофеля четырех сортов из разных областей Украины, нам
казалось необходимым исследовать зависимость от сорта и происхож-
дения выхода нормально развитых растений из меристем.
В табл. 1 приведены результаты, свидетельствующие об отсутствии
сортовой зависимости выхода нормально развитых растений, получен-
ных из меристемы четырех районированных сортов. Отличия в показа-
телях выхода растений не являются достоверными, так как ни один из
показателей критерия Стьюдента для сравниваемых совокупностей не
превышает значения 1,96.
Не обнаружено также зависимости между выходом нормально раз-
витых растений и происхождением исходного материала, из которого
брали меристему. Это видно из табл. 2, содержащей результаты сравне-
ния показателей выхода нормальных растений из меристем картофеля
сорта Невский, сгруппированных по происхождению^ Процент нормаль-
но развитых регенерантов из меристем, вычлененных из растений раз-
ного происхождения, колеблется Б пределах от 17,4 до 21,3 %, но зна-
чение показателей критерия Стьюдента указывают на отсутствие досто-
верной разницы между ними. Таким образом, показано, что жизнеспо-
собность регенерированных меристем одинакова в основных «карто-
фельных» регионах Украины.
Результаты, приведенные в табл. 1 и 2, позволяют утверждать, что
на выход нормально развитых растений при действии 2'—^-олигоаде-
нилата в разных концентрациях влияние происхождения и сортовой
принадлежности исходного материала исключено.
Поскольку для исследования противовирусного действия 2/—5'-Аз
планировалось использовать довольно значительные концентрации пре-
Т а б л и ц а 1
Выход нормально развитых регенерантов из меристем картофеля в зависимости
от сорта
Количество нормально Критерий Стьюдента
Количество развитых растений
Сорт высаженных
меристем Абсолют- 1 2 3 4
ная вели- %
. чина
Зов 644 118 18,3±3,0 1,09 1,30 0,33
Гатчинский 144 21 14,6±5,8 1,09 — 0,17 1,29
Луговской 144 20 13,9±5,7 1,30 0,17 — 1,51
Невский 716 136 19,0±2,9 0,33 1,29 1,51 —
Всего 1648 295 17,9±1,9 — — — . —
Т а б л и ц а 2
Выход нормально развитых регенерантов из меристем картофеля сорта Невский
в зависимости от происхождения
Количество нормально Критерий Стьюдента
Происхождение
Количество
развитых растений
Происхождение высаженных
меристем Абсолют-
%
1 2 3 4
ная вели- %
чина
Волынское НПО
«Элита» 216 39 18,1±5,1 — 0,83 0,17 0,12
Сумское НПО
«Элита» 216 46 21,3±5,7 0,83 — 0,91 0,62
Тернопольское НПО
0,26 «Элита» 144 25 17,4±6,2 0,17 0,91 — 0,26
Агрофирма «Прут» 140 26 18,6±6,5 0,12 0,62 0,26 —
Всего 716 136 19,0±2,9 — — — —
12 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 2 2 - 2-904 12
парата, необходимо было изучить его токсическое влияние на процесс
регенерации меристемы. Результаты опыта, приведенные в табл. 3,
показывают, что ни один из показателей критерия Стьюдента ни в конт-
роле, ни в случае использования разных концентраций препарата не
указывают на отличия между ними. Таким образом, можно с опреде-
ленностью утверждать, что препарат 2'—5'-олигоаденилата в изучен-
ных концентрациях не токсичен для меристемы картофеля и не влия-
ет на ее регенерацию.
Кроме того, из табл. 1 и 2 видно, что с использованием приведен-
ной методики можно получать в среднем 17,9±1,9 % нормально разви-
тых растений от высаженных меристем.
Для того, чтобы при изучении вопроса об ингибировании вируса
разными концентрациями 2'—5'-олигоаденилата не использовать те рас-
тения, процесс оздоровления которых зависит от их сортовой принад-
лежности или происхождения, мы убедились в наличии или отсутствии
влияния этих факторов (табл. 4, 5).
Результаты, приведенные в табл. 4, указывают на то, что количество
растений, оздоровленных методом регенерации меристемы, не зависит
от происхождения растений, из которых брали эксплантаты, и колеблет-
ся в пределах 9,5+2,2 %. В то же время показатели критерия Стьюден-
та в табл. 5 позволяют утверждать, что такая зависимость существует
для некоторых сортов картофеля. В нашем случае достоверно отлича-
ется от других низким выходом безвирусных регенерантов сорт
Луговской.
Таким образом, на следующем этапе при изучении влияния разных
концентраций 2'—5'-Аз на количество регенерантов, освобожденных от
Х-вируса и других вирусов картофеля, мы использовали только сорта
Зов, Гатчинский и Невский, чем исключили зависимость результатов
Т а б л и ц а 3
Влияние концентрации 2'—5'-олигоаденилата на выход нормально развитых
регенерантов из меристем
Критерий Стьюдента
2 3 4 5
Концентрация
2'-5' -АрАрА,
M
Количество
высаженных
меристем
Количество нормально
развитых растений
Абсолютная
величина %
0 416 72 17,3±3,6 — 0,36 0,27 0,45 0,80
IO-7 200 37 18,5±5,4 0,36 — 0,58 0,00 0,38
IO-6 416 69 16,6±3,6 0,27 0,58 — , 0,72 1,02
IO-5 416 77 18,5±3,7 0,45 0,00 0,72 — 0,44
IO-4 200 40 20,0±5,5 0,80 0,38 1,02 0,44 —
Всего 1648 295 17,9±1,9 — — — — —
Т а б л и ц а 4
Выход свободных от X-, S-, M- и F-вирусов картофеля регенерантов сорта Невский
из меристем в зависимости от происхождения
Происхождение материала
Количество
высаженных
меристем
Количество оздоров-
ленных растений
Критерий Стьюдента
Происхождение материала
Количество
высаженных
меристем
Количество оздоров-
ленных растений
1 2 3 4
Происхождение материала
Количество
высаженных
меристем Абсолют-
ная вели-
чина
%
1 2 3 4
Волынское НПО
«Элита» 216 19 8,8±3,9 — 0,67 0,51 0,30
Сумское НПО
«Элита» 216 23 10,7±4,2 0,67 — 0,08 0,89
Тернопольское НПО
0,67
«Элита» 144 15 10,4±5,1 0,51 0,08 — 0,73
Агрофирма «Прут» 140 11 7,9±4,5 0,30 0,89 0,73 —
Всего 716 68 9,5±2,2 — . — — . —
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 2 2 - 2-904 13
опытов от фактора сортовой принадлежности. Эти результаты пред-
ставлены в табл. 6 и 7. Показано, что выход оздоровленных растений
в контроле составляет 8 ,2±2,8 %, т. е. 46 % растений, развившихся из
меристем, свободны от X-, S-, M- и F-вирусов картофеля. При регене-
рации меристемы на среде с 2'—5'-Аз в оптимальной концентрации
10-5 M получено 13,3±3,5 % безвирусных растений.
Итак, на среде с оптимальной концентрацией препарата удалось
получить регенеранты из мерисгем, 72 % которых были свободными от
всех четырех изученных вирусов разной природы (табл. 6). Противо-
вирусную активность 2'—5'-олигоаденилата в данных условиях опыта
подтверждает концентрационная зависимость его действия. Показано,
что в концентрации 10-5 M препарат оказывает существенное влияние
на выход безвирусных растений, а дальнейшее увеличение концентра-
ции до 10-4 M не приводит к усилению его действия.
Влияние препарата на выход регенерантов, свободных от Х-виру-
са, подобно таковому на выход регенерантов без S-, M- и F-вирусов.
При сравнении табл. 6 и 7 видно, что оптимальной концентрацией как
для освобождения от Х-вируса, так и от S-, M- и F-вирусов является
10-5 М, а показатели выхода оздоровленных растений существенно не
отличаются между собой. Это дает основание предположить универ-
сальность действия препарата, что, в свою очередь, вероятно, поможет
выяснить механизмы его действия на вирусы.
Изучение возможности получения оздоровленных растений мето-
дом регенерации верхушечной меристемы началось с обнаружения того
Т а б л и ц а 5
Выход свободных от X-, S-, M- и F-вирусов картофеля регенерантов из меристем
в зависимости от сорта
Сорт
Количество
высаженных
меристем
Количество оздоровленных
растений
Абсолютная
величина %
Критерий Стьюдента
Зов ν 644 56 8,7±2,1 1,57 2,02* 0,52
Гатчинский 144 19 13,2±5,8 1,57 — 2,81* 1,28
Луговской 144 6 4 ,2±3,3 2,02* 2,81* — 2,34*
Невский 716 68 9 ,5±2,2 0,52 1,28 2,34* —
Всего 1648 149 9 ,0±1,3 — — — —
* Значения критерия Стьюдента >1,96, указывающие на достоверные отличия срав
ниваемых совокупностей на 95 %-м доверительном уровне.
Т а б л и ц а 6
Влияние концентрации 2'—5' олигоаденилата на выход свободных от X-, S-,
M- и F-вирусов картофеля регенерантов из меристем
Количество оздоровленных Критерий Стьюдента
Концентрация Количество
растений
2'-5' -АрАрА, высаженных
M меристем Абсолютная 1 2 3 4 5
величина %
О 368 30 8 ,2±2,8 0,98 0,00 2,25 1,08
IO-7 200 12 6 ,0±3,3 0,98 — 0,98- 2,87* 1,81
IO-6 368 30 8 ,2±2,8 0,00 0,98 — 2,25* 1,08
Ю- 5 368 49 13,3±3,5 2,25* 2,87* 2,25* — 4 0,81
IO-4 200 22 11,0±4,3 1,08 1,81 1,08 0,81 —
Всего 1504 143 9,5±1,5 — — — — —
* Значения критерия Стьюдента >1,96, указывающие на достоверные отличия срав-
ниваемых совокупностей на 95 %-м доверительном уровне.
14 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 2 2 - 2-904 14
факта, что условия культуры органов in vitro играют какую-то роль в
освобождении растений от вирусов. Так, Холлингс и Стоун [14] сооб-
щили, что соотношение меристем гвоздики, развивающихся в свободные
от вируса огуречной мозаики растения, было большим, чем ожидалось
исходя из кривой частоты появления инфицированных меристем. Это
подтвердили и результаты исследований, в которых Ванг и Xy [15]
регенерировали свободные от вируса мозаики гвоздики растения таба-
ка и петунии из эксплантатов меристем размером более чем 200 мкм, в
то время как Мори [16] с помощью иммуноферментных методов уста-
новил, что в верхушках побегов растений этих видов ниже 200 мкм уже
находится вирус.
Некоторые авторы связывали уменьшение количества вируса во
время культивирования с действием регуляторов роста, содержащихся
в среде [17, 18]. Уолкей [19], культивируя Nicotiana rusticum на среде
с большим количеством ауксинов и цитокининов, установил, что регуля-
торы роста могут уменьшать концентрацию вирусов в тканях, однако
полностью от вирусов растения они не освобождают.
В первых экспериментах по выращиванию меристемы картофеля
с целью получения здоровых растений Норрис использовал среду Уайта
с добавлением НУК и 2,4-Д по 0,1 мг/л. В этих опытах 2,5 % мери-
стем вырастали в нормальные растения [20]. Позднее Кассанису уда-
лось регенерировать на среде, модифицированной Мгорелем, около 10 %
высаженных меристем [21, 22]. Мэлор и Стейтс-Смит, сравнив выше-
описанные среды со средой Гудвина и Мурасиге—Скуга, пришли к вы-
воду о том, что среда с минеральной основой Мурасиге—Скуга являет-
ся лучшей для выращивания меристем картофеля [23—25]. Дальней-
шие работы по усовершенствованию метода позволили улучшить спо-
собы регенерации меристем и повысить выход оздоровленных растений
[26—31]. Мы, испытав среды, примененные в перечисленных работах,
а также несколько собственных модификаций этих сред, остановились
на варианте, приведенном в разделе «Материалы и методы».
Согласно общепринятым методикам, размеры высаженных эксплан-
татов составляют 100—150 мкм. Регенерация меристем при этом про-
должается 3—5 месяцев и около 90 % из них погибает. Использование
эксплантатов большего размера приводит к значительному сниже-
нию выхода безвирусных растений. В то же время приживление ме-
ристем улучшается, а продолжительность регенерации значительно
уменьшается.
Полученные нами показатели выхода нормально развитых регене-
рантов из меристем (в среднем 17=+= 1,9 %) более эффективны по
сравнению с таковыми, приведенными Морелем, Мюллером [22] и
Хромовой [29], у которых выход нормально развитых растений из та-
кого размера меристем не превышал 10 %. Увеличение вероятности по-
лучения нормально регенерированных меристем можно, скорее всего,
Т а б л и ц а 7
Влияние 2'—5'-олигоаденилата на количество свободных от Х-вируса картофеля
регенерантов из меристем
Концентрация
2'-5'-АрАрА,
M
К оличество
высаженных
меристем
Количество оздоровленных
растений
Абсолютная
величина
Критерий Стьюдента
0
10-6
10-5
Всего
368
368
368
1104
39
36
57
132
10,6±3,1
9 ,8±3,0
15,5±3,7
11,0±1,9
0,35
1,98*
0,35
2,33*
1,98*
2,33*
* Значения критерия Стьюдента >1,96, указывающие на доверительные отличия
сравниваемых совокупностей на 95 %-м доверительном уровне.
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 2 2 - 2-904 15
объяснить использованием исходного материала для вычленения мери-
стем, необработанного дезинфицирующими веществами, применением
среды нашей модификации и в значительной степени уменьшением
объема питательной среды почти в 50 раз, что способствовало ее луч-
шему конденсированию эксплантатами.
В литературе описано большое количество натуральных и синтети-
ческих соединений, угнетающих фитопатогенные вирусы, их реплика-
цию в растениях, инфекционность и проявление патогенных признаков.
В качестве ингибиторов вирусов изучали препараты из культураль-
ных сред микроорганизмов, высших растений, синтетические антибио-
тики, аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, производные мо-
чевины и т. д. Изучали также такие препараты, как циклогексамид, 2-
тиоурацил, хлорамфеникол, фенил-аллил-тиомочевина, додецил-Ы-эф-
федриниум бромид, 2,4-диоксогексагидротриазид, актиномицин, анили-
но-адамантил-тиодиазол, спиртовый экстракт Hedericum perforatum.
Кассанис и Тинслей освободили каллус табака от Y-вируса кар-
тофеля добавлением к культуральной среде 100 мкг/л 2-тиоурацила
[32]. Однако в этой работе авторы не регенерировали из оздоровленно-
го каллуса нормальные растения. Кроме того, получить свободные от
вируса растения можно регенерацией их из протопластов и каллусной
ткани без какой-либо обработки.
Согласно данным Хансена и Хилдебрандта [33], в каллусах, полу-
ченных из инфицированных тканей, не все клетки содержат вирус пато-
гена. Только 40 % растений, выращенных из отдельных клеток, кото-
рые были механически отделены от каллуса табака, инфицированного
ВТМ, содержали вирус. Свободные от вируса растения регенерировали
из меристемного каллуса нескольких видов растений [34—36].
Шепард [37], регенерируя растения из протопластов табака на
среде, содержащей 10 мг/л антивирусного препарата виразола (риба-
вирин),— эффективного ингибитора многих животных ДНКовых и
РНКовых вирусов, достиг 94 %-го выхода полностью свободных от X-
вируса картофеля регенерантов против 19 %-го выхода на средах без
виразола.
Однако антивирусный эффект вышеупомянутых препаратов при
оздоровлении целых растений имеет временный характер: через опреде-
ленное время репликация вируса и патологичные симптомы восстанав-
ливаются. В литературе не описан ни один достоверный способ, позво-
ляющий достичь полного освобождения зараженных растений с помо-
щью ингибиторов. Считается, что практическое применение антивирус-
ных препаратов способствует лишь снижению распространения вирус-
ной инфекции, а не ее уничтожению.
Полученные же нами данные дают основание утверждать, что, ис-
пользуя 2'—5'-олигоаденилат, можно регенерировать из меристемы ве-
гетативно размножающихся культур полностью безвирусные растения.
При сравнении наших результатов изучения действия 2'—5'-три-
олигоаденилатов на репродукцию Х-вируса картофеля с данными дру-
гих авторов [4, 38], исследовавших влияние 2'—5'-Аз на синтез ВТМ,
заслуживает внимания более слабое угнетение препаратом в нашем
случае. Деваш [4] показал, что 2'—5'-Аз ингибирует репродукцию BTM
в зависимости от условий опыга от 50 до 90 %.
В наших исследованиях выход регенерантов, не содержащих X-, S-,
M- и F-вирусов, при использовании среды с 2'—5'-олигоаденилатом в
концентрации 10-5 M составляет 13,3% от высаженных меристем или
72 % от нормально развитых растений, что только на 26 % больше,,
чем в контроле.
Это можно объяснить как различием в структуре Р Н К этих виру-
сов, так и отличиями в процессах синтеза вирусных белков, образую-
щихся при репликации.
Исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали воз-
можность непосредственного воздействия 2'—5'-Аз на двуспиральные
нуклеиновые кислоты [39]. Исходя из различий структур геномных
16 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 2 2 - 2-904 16
Р Н К этих вирусов, можно предположить и расхождения в действии
2'—5'-триолигоаденилатов на их нуклеиновые кислоты in vivo. Отличия
во влиянии олигоаденилатов могут проявиться и на уровне трансляции
в процессе синтеза вирусных белков субгеномными РНК.
Однако наиболее вероятной причиной является то, что в экспери-
менте мы использовали меристему из растений картофеля, реагирую-
щих системной инфекцией на заражение Х-вирусом картофеля. Авторы,
работавшие с ВТМ, изучали действие олигоаденилата на модели сверх-
чувствительных (N-ren содержащих) растений табака [4, 38].
Некоторые исследователи предполагают, что у так называемых
сверхчувствительных и иммунных растений собственный механизм об-
разования 2'—5'-олигоаденилатов включается на более ранних стади-
ях инфекционного процесса по сравнению с растениями, у которых на-
блюдается системное заражение [40]. Возможно, дополнительное вне-
сение 2'—5'-триолигоаденилата стимулирует дальнейшие этапы прояв-
ления механизхма стабильности, к тому же общий пул (собственных
и привнесенных) олигоаденилатов в этом случае выше.
В растениях с системным поражением механизм собственных за-
щитных реакций включается на более поздних этапах инфекционного
процесса, а общее количество их олигоаденилатов даже после обработ-
ки препаратами значительно ниже, чем в растениях, устойчивых и
сверхчувствительных к вирусам.
Использование 2/—5'-олигоаденилата в питательной среде позво-
ляет повысить процент выхода оздоровленных от X-, S-, M- и F-виру-
сов с 46 до 72 % от нормально развитых растений.
Таким образом, 2/—5'-олигоаденилат проявил универсальную про-
тивовирусную активность, и его можно рекомендовать для применения
в качестве противовирусного препарата при оздоровлении растений
комбинированным методом химиотерапии меристем во время их реге-
нерации.
S u m m a r y . The effect of 2 '—5'-oli loadenylates taken at different concentrations
on the process of meristems regeneration and the amount of regenerats free of potato
viruses X, S, M and F in the culture medium was studied. The preparation concentrations
inhibiting viruses reproduction without effecting the regenerants development were cho-
sen. Variety dependence in the process of potato improvement and 2'—5'-oligoadenylates
universal antiviral effect were shown.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Limasset P., Corriuet P. Recherche de virus de la mosaique du tabac (Marmor Tabaci,
Holmes) dans Ies ineristemes des plantes infec tees / /C. R. Acad. Sci. D.— 1949.—
228 — P . 1971 — 1972.
2. Wang P. J.f Huang L. C. Callus cultures from potato tissues and the exclusion of po-
tato virus X from plants regenerated from stem tips // Can. J. Bot.— 1975.— 53.—
P. 2565—2567.
3. Борисенко С. И., Шмыгля В. Α., Шустер Г. Эффективность оздоровления картофеля
методом культуры апексов с помощью ингибиторов в и р у с о в / / Д о к л . ВАСХНИЛ.—
1985.—№ 10.— С. 10—12.
4. Devash VGerh A., Willis D. И. et al. 5'-Dephosphorylated 2' ,5 '-adenylate trimer and
its analogs inhibition of tobacco mosaic virus-infected leaf discs, protoplasts, and
intact tobacco p l a n t s / / J . Biol. Chem — 1984.—259.—P. 3482—3486.
5. Hovanessiari A. G., Wood J. N. Anticellular and antiviral effects of pppA(2 'p5 'A)n / /
Virology.— 1980.— 101.— P. 81—90.
6. Iiigashi У., Sokawa У. Microinjection of interferon and 2' ,5 '-oligoadenylate into mou-
se L cells and their effects on virus g r o w t h / / J . Biochem — 1982 — 9 1 . — P . 2021—2028.
7. Cayiey P. /., Davies /. A., Mccullagh K. G., Kerr / . M. Activation of the ppp(A2'p)nA
system in the interferon-treated, herpes simplex virus-infected cells and evidence for
novel inhibitors of the ppp(A2'p)nA-dependent R N A s e / / E u r J. Biochem.— 1984.—
143.—P. 165—174.
8. Bayrd B., Leserman L. D., Bisbal C., Lebleu B. Antiviral activity in Ll210 cells of
liposome-encapsulated (2 '—5')ol igo(adenylate) analogues // Ibid.— 1985.— 151.—
P. 319—325.
9. Sharma O. K., Goswami В. B., Cohrs R. / . Mechanism of growth inhibition of DNA
containing viruses by interferon: Role of 2-5 A / / T h e 2-5 A system: Molecular and
clinical aspects of the interferon-regulated pathway — New York: Alan R. Liss, 1985 —
P. 317—324.
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 2 2 - 2-904 17
10. Kumar RChoubey DLengyel P., Sen G. C. Studies on the role of the 2 '—5'-ol igo·
adenylate synthetase-RNAse L-pathway in beta interferon-rnediated inhibition of ence-
phalomyocarditis virus rep l ica t ion/ / J . Virol — 1988.—62.·—P. 3175—3181.
11. Fujihara MMilligan J. RKaji A. Effect of 2' ,5 '-oligoadenylate on herpes simplex
virus-infected cells and preventive action of 2 / ,5 '-oligoadenylate on the lethal effect of
HSV-2//J. Interferon Res - 1989 —N 9 . -P . 691-707.
12. Пасте ρ Ε. У., Овод В. В., Позу ρ В. /С., Вихоть Η. Е. Иммунология: Практикум.—
Киев : Выща шк., 198©.— С. 162—174.
13. Зайцев Г. И. Математическая статистика в экспериментальной ботанике.— M : Нау-
ка, 1984.—424 с.
14. Hollings M., Sione О. М. Investigation of carnation viruses. 1. Carnation mottle / / A n n
Appl. Biol.— 1964.—53.—P. 103—118.
15. Wang P. J H u N. Y. Regeneration of virus-free plants through in vitro cu l ture / /
Adv. biochem. engineering: P lant cell culture —Berl in : Springer, 1980 — P t 2 —
P. 61—69.
16. Mori K. / /P roc . Kanto Plant S o c . - 1973.—20.—P. 74—76.
17. Johnstone G. R., Wade G. C. Therapy of virus-infected plants by heat treatment. IL
Host protein synthesis and multiplication of tomato aspermy virus at 3 6 ° C / / A u s t . J .
B o t . - 1974.—22 — P . 451—460.
18. Quak F. Heat treatment and substances inhibiting virus multiplication in meristem
culture to obtain virus free p l a n t s / / A d v . Hortic. Sci. Appl — 1961 — 1.— P. 144—148.
19. Walkey D. G. A. In vitro methods for virus e l iminat ion/ /Front ie rs in plant tissue
cul ture .—Calgary: Univ. Calgary press, 1978.—P. 245—254.
20. Norris D. O. Development of virus-free stock of green Mountain potato by treatment
with malachite green / /Aus t . J. Agr. Res — 1954.—5 — P . 658—663.
21. Kassanis B. A. The production of virus-free clones of some British potato variet ies/ /
Ann. Appl. Biol.— 1967.—59.—P. 3.
22. Morel G., Muller J. La culture in vitro du meristeme apical de la pomme de t e r r e / /
C. R. Acad. Sci. D.— 1964.—N 21.—P. 5250—5252.
23. Mellor F. C., Stace-Smith R. Development of excides potato buds in nutient cu l ture / /
Can. J. B o t . - 1969.—47.—P. 1617—1621.
24. Goodwin P. B. An improved medium for rapid growth of isolated potato buds / / J . Exp
B o t . - 1966.— 17, N 52.— P. 590—595.
25. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobac-
co tissue cultures // Physiol, plant — 1962 — 15, N 13.— P. 473—497.
26. Mellor F. C., Stace-Smith R. Virus-free potatoes by tissue culture // Appl. and funda-
mental aspects of plant cell, tissue, and organ c u l t u r e / E d s J. Reinert, Y. P. S. Bajaj .—
Berlin: Springer, 1977.—P. 616—636.
27. Трофимец JI. H., Князев Β. Α., Хромова Л. M., Егорова JI. И. Оздоровление карто-
феля от вирусных болезней методом верхушечной меристемы / С.-х. биология.—
1975.— 10, JMb 5.— С. 760—765.
28. Трофимец JI. H., Князев В. А., Хромова JI. M., Остапенко Д. П. Методические ука-
зания по оздоровлению и ускоренному размножению картофеля.— M., 1976.— 12 с.
29. Хромова JI. М. Культивирование верхушечных меристем картофеля для оздоровле-
ния сортов от вирусных болезней // Тканевые и клеточные культуры в селекции рас-
тений.— М. : Колос, 1979.—С. 128·—137.
30. Волкова Р. И., Курлович М. M., Бурова В. В. Технология производства элиты кар-
тофеля, оздоровленного методом апикальных меристем // Разрабтка и совершенство-
вание методов селекции и первичного семеноводства картофеля.— Л., 1988.— С. 110—
114.
31. Диба А., Айрапетян Э., Винклер Г., Бутенко Р. Освещение и морфогенез изолирован-
ных меристем // Картофель и овощи.—• 1972.— № 3.— С. 44.
32. Kassanis В., Tinsley Т. W. The freeing of tobacco tissue culture from potato virus
Y by 2 - th iou rac i l / /P roc . third conf. potato virus dis.— Lisse-Wageningen, 1957.—
P. 153—155.
33. Hansen J., Hildebrandt A. C. The distribution of tobacco mosaic virus in plant callus
culture 11 Virology.— 1966.— 28.— P. 15—21.
34. Pillai S. K., Hildebrandt A. C. Geranium plants differentiated in vitro from stemm tip
and callus cu l t u r e s / /P l an t dis. rep.— 1968.—52.—P. 600—601.
35. Abo El-Nil M. M., Hildebrandt A. C. Differentiation of virus-simptomless geranium
plants from anther c a l l u s / / P l a n t dis. rep — 1971.—55 — P . 1017—1020.
36. Simonsen L, Hildebrandt A. C. In vitro growth and differentiation of Gladiolus plants
from callus cu l tu re s / /Can . J. B o t . - 1971.— 49.— P. 1817—1819.
37. Shepard J. F. Regeneration of plants from protoplasts of potato virus X-infected to-
bacco leaves // Virology.— 1977.— 78.— P. 261—266.
38. Reichman M., Devach Y., Suhadolnik R., Sela I. Human leukocyte interferon and the
antiviral factor (AVF) from virus infected plants stimulate plant tissues to produce
nucleotides with antiviral ac t iv i ty / /Virology — 1983.— 128.—P. 240.
39. Matsuka G. KK Tkachuk Z. Y., Tkachuk L. V. et al. Influence of 2'—5' olgoadenyla-
tes on the secondary structure of nucleic acids // Structure of eukaryotic genome and
regulation of its expression: 2 nd bilateral symp. USSR—USA (Tbilisi, 16—20 Octo-
ber): Abstr .—Moscow, 1989.—P. 29—30.
40. Бабоша А. В., Трофимец Л. H., Ладыгина Μ. Ε. Олигиоденилаты и олигоаденилат-
синтетаза растений картофеля в защитных реакциях против вирусного патогена //
Докл. АН СССР.— 1990.—313, № 1.—С. 252—255.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН Украины, Киев Получено 23.10.92
18 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 2 2 - 2-904 18
|