Лизогения у фага MS2. Синтез фагоспецифичной РНК на клеточной ДНК
При помощи не реплицирующегося Ар-фрагмента создана клонотека EcoRI-фрагментов ДНК MS2-индуцированного лизирующего мутанта Escherichia coli АВ259 Hfr3000. Тотальная РНК, выделенная из плазмидосодержащих клеток, гибридизована с ДНК pMS27, содержащей ДНК-копию РНК фага MS2, и с частью этой ДНК-копии,...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Дата: | 1993 |
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1993
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156266 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Лизогения у фага MS2. Синтез фагоспецифичной РНК на клеточной ДНК / Т.П. Перерва, Н.Ю. Мирюта, А.Ю. Мирюта // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 1. — С. 45-50. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156266 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Перерва, Т.П. Мирюта, Н.Ю. Мирюта, А.Ю. 2019-06-18T10:30:57Z 2019-06-18T10:30:57Z 1993 Лизогения у фага MS2. Синтез фагоспецифичной РНК на клеточной ДНК / Т.П. Перерва, Н.Ю. Мирюта, А.Ю. Мирюта // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 1. — С. 45-50. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00034D 577.21 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156266 При помощи не реплицирующегося Ар-фрагмента создана клонотека EcoRI-фрагментов ДНК MS2-индуцированного лизирующего мутанта Escherichia coli АВ259 Hfr3000. Тотальная РНК, выделенная из плазмидосодержащих клеток, гибридизована с ДНК pMS27, содержащей ДНК-копию РНК фага MS2, и с частью этой ДНК-копии, свободной от векторной последовательности. Полученные результаты свидетельствуют о считывании фагоспецифичной РНК с хромосомной ДНК Е. coli АВ259 Hfr3000, проклонированной в составе гибридной плазмиды. Фрагмент ДНК, що контролює основні фенотипові властивості MS2-індукованого лізуючого мутанту E. coli 3000, проклоновано у складі гібридної плазміди. В клітинах, трансформованих цією плазмідою, накопичується MS2-специфічна РНК, що свідчить про міцне включення фагового генетичного матеріалу до складу клітинної ДНК. A fragment of DNA that controls the basic phenotypic properties MS2-induced lysis mutants of E. coli 3000, has been cloned as part of a hybrid plasmid. In cells transformed with this plasmid accumulated MS2-specific RNA, indicating that the inclusion of a strong phage genetic material into the cell DNA. Авторы выражают глубокую благодарность Т. С. Даниленко за выделение общей клеточной РНК из Е. coli 3000 и /?L26-coдержащих клеток. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Генно-инженерная биотехнология Лизогения у фага MS2. Синтез фагоспецифичной РНК на клеточной ДНК Лізогенія у фага MS2. Синтез фагоспеціфічной РНК на клітинній ДНК MS2 phage lysogeny. Phage-specific RNA synthesis on cell DNA Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Лизогения у фага MS2. Синтез фагоспецифичной РНК на клеточной ДНК |
| spellingShingle |
Лизогения у фага MS2. Синтез фагоспецифичной РНК на клеточной ДНК Перерва, Т.П. Мирюта, Н.Ю. Мирюта, А.Ю. Генно-инженерная биотехнология |
| title_short |
Лизогения у фага MS2. Синтез фагоспецифичной РНК на клеточной ДНК |
| title_full |
Лизогения у фага MS2. Синтез фагоспецифичной РНК на клеточной ДНК |
| title_fullStr |
Лизогения у фага MS2. Синтез фагоспецифичной РНК на клеточной ДНК |
| title_full_unstemmed |
Лизогения у фага MS2. Синтез фагоспецифичной РНК на клеточной ДНК |
| title_sort |
лизогения у фага ms2. синтез фагоспецифичной рнк на клеточной днк |
| author |
Перерва, Т.П. Мирюта, Н.Ю. Мирюта, А.Ю. |
| author_facet |
Перерва, Т.П. Мирюта, Н.Ю. Мирюта, А.Ю. |
| topic |
Генно-инженерная биотехнология |
| topic_facet |
Генно-инженерная биотехнология |
| publishDate |
1993 |
| language |
Russian |
| container_title |
Биополимеры и клетка |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Лізогенія у фага MS2. Синтез фагоспеціфічной РНК на клітинній ДНК MS2 phage lysogeny. Phage-specific RNA synthesis on cell DNA |
| description |
При помощи не реплицирующегося Ар-фрагмента создана клонотека EcoRI-фрагментов ДНК MS2-индуцированного лизирующего мутанта Escherichia coli АВ259 Hfr3000. Тотальная РНК, выделенная из плазмидосодержащих клеток, гибридизована с ДНК pMS27, содержащей ДНК-копию РНК фага MS2, и с частью этой ДНК-копии, свободной от векторной последовательности. Полученные результаты свидетельствуют о считывании фагоспецифичной РНК с хромосомной ДНК Е. coli АВ259 Hfr3000, проклонированной в составе гибридной плазмиды.
Фрагмент ДНК, що контролює основні фенотипові властивості MS2-індукованого лізуючого мутанту E. coli 3000, проклоновано у складі гібридної плазміди. В клітинах, трансформованих цією плазмідою, накопичується MS2-специфічна РНК, що свідчить про міцне включення фагового генетичного матеріалу до складу клітинної ДНК.
A fragment of DNA that controls the basic phenotypic properties MS2-induced lysis mutants of E. coli 3000, has been cloned as part of a hybrid plasmid. In cells transformed with this plasmid accumulated MS2-specific RNA, indicating that the inclusion of a strong phage genetic material into the cell DNA.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156266 |
| citation_txt |
Лизогения у фага MS2. Синтез фагоспецифичной РНК на клеточной ДНК / Т.П. Перерва, Н.Ю. Мирюта, А.Ю. Мирюта // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 1. — С. 45-50. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT perervatp lizogeniâufagams2sintezfagospecifičnoirnknakletočnoidnk AT mirûtanû lizogeniâufagams2sintezfagospecifičnoirnknakletočnoidnk AT mirûtaaû lizogeniâufagams2sintezfagospecifičnoirnknakletočnoidnk AT perervatp lízogeníâufagams2sintezfagospecífíčnoirnknaklítinníidnk AT mirûtanû lízogeníâufagams2sintezfagospecífíčnoirnknaklítinníidnk AT mirûtaaû lízogeníâufagams2sintezfagospecífíčnoirnknaklítinníidnk AT perervatp ms2phagelysogenyphagespecificrnasynthesisoncelldna AT mirûtanû ms2phagelysogenyphagespecificrnasynthesisoncelldna AT mirûtaaû ms2phagelysogenyphagespecificrnasynthesisoncelldna |
| first_indexed |
2025-11-25T21:04:13Z |
| last_indexed |
2025-11-25T21:04:13Z |
| _version_ |
1850543603384844288 |
| fulltext |
УДК 577.21
Т. П. Перерва, Н. Ю. Мирюта, А. Ю. Мирюта,
ЛИЗОГЕНИИ У ФАГА MS2.
СИНТЕЗ ФАГОСПЕЦИФИЧНОЙ РНК НА КЛЕТОЧНОЙ ДНК
При помощи не реплицирующего с я Ар-фрагмента создана клонотека EcoRI-фрагментов
ДНК MS2-индуцированного лизирующего мутанта Escherichia coli АВ259 Hfr3000. То-
тальная РНК, выделенная из плазмидосодержащих клеток, гибридизована с ДНК
pMS27, содержащей ДНК-копию РНК фага MS2, и с частью этой ДНК-копии, свобод-
ной от векторной последовательности. Полученные результаты свидетельствуют о счи-
тывании фагоспецифичной РНК с хромосомной ДНК Е. coli АВ259 Hfr3000, проклони-
рованной в составе гибридной плазмиды.
Введение. Благодаря своей популярности в качестве модели при иссле-
довании тонких механизмов трансляции РНК-содержащие фаги пред-
ставляют собой один из наиболее полно изученных объектов. В то же
время интереснейшие особенности их биологии — эволюционная и функ-
циональная связь с ^-фактором чувствительной клетки, а также проб-
лема лизогении у этой группы фагов — остаются областью, практиче-
ски неизученной. Если кодирование /^-фактором половых фимбрий,
обеспечивающих все стадии заражения чувствительной клетки донор-
специфичными фагами, видится достаточно понятным, то возможное
влияние РНК-содержащих фагов на половой фактор в процессе инфек-
ции остается предметом единичных экспериментальных работ [1—3].
Что касается лизогении у РНК-содержащих фагов, то в пользу ее воз-
можности косвенно свидетельствует настораживающе легкое приобре-
тение устойчивости к этим фагам клетками зараженной фагочувстви-
тельной популяции в условиях, препятствующих быстрому клеточному
делению. К сожалению, вопрос лизогении у РНК-содержащих фагов
трудно разрешим классическими тестами: особенности инфекционного
цикла и наличие у РНК-содержащих фагов состояния носительства за-
трудняют интерпретацию опытов, где наблюдалась секреция фага за-
раженной бактериальной культурой; с другой стороны, спонтанные му-
тации в F-факторе способны привести клетку в состояние устойчивос-
ти к донорспецифичным фагам, что ограничивает возможности теста
на иммунность, обусловленную лизогенией.
Несмотря на это, в одной из предшествующих работ [4]· нам уда-
лось показать, что примерно 1,3 % потомков инфицированной бактерии
Escherichia coli АВ259 HfrЗООО приобретают М52-устойчивость, не свя-
занную с селекцией предшествующих ^--клеток. Впоследствии оказа-
лось, что индуцированные фагом мутанты не являются окончательной
формой изменения и выщепляют новые типы мутантов — несколько
промежуточных и два конечных [5]. Процесс выщепления сопровождает-
ся усугублением мутаций в F-факторе — от неспособности F-фимбрий
обеспечить фаговую адсорбцию до полного их исчезновения.
Клетки одного из конечных мутантов, будучи устойчивыми к за-
ражению интактным фагом, характеризуются проницаемостью для нук-
леиновых кислот за счет дефектов клеточной стенки [6]. На сплошном
газоне таких клеток клетки второго конечного мутанта, названного на-
ми лизирующим, формируют колонии, окруженные зоной лизиса. На
газоне клеток дикого типа они растут как отдельные колонии, но без
зоны лизиса. Препарат суммарной РНК, выделенной из лизирующих
клеток фенольно-детергентным методом, при высеве на чувствительный
газон вызывает образование прозрачных негативных колоний. Количе-
ство плякообразующих единиц, содержащихся в этих колониях, колеб-
лется от 25 до 380. Эти наблюдения позволяют предположить, что ли-
тическое начало представлено или некой формой фаговой РНК, на-
пример, рибонуклеопротеидным комплексом, или очень неустойчивыми
дефектными частицами фага. Однако присутствие в мутантной клетке
(g) Т. П. Перерва, Н. Ю. Мирюта, А. Ю. Мирюта, 1993
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Ns 1 45
подобных структур не является свидетельством истинно лизогенного
состояния как встраивания фагового генома в клеточную хромосому,
поскольку не исключает вероятности персистентной инфекции, обуслов-
ленной происхождением мутантов.
Помимо персистенции существует еще одно серьезное возражение
по поводу возможности лизогении у ίΡΗΚ-содержащих фагов. Оно за-
ключается в отсутствии гомологии между фаговой РНК и Д Н К чувст-
вительной клетки, которую не удалось установить методами, достаточ-
но тонкими для обнаружения гибридов, даже если бы Д Н К содержа-
ла комплементарные РНК-последовательности в количестве, эквива-
лентном 1/10 молекулы фаговой РНК на один ДНК-геном [7].
Однако, располагая коллекцией полученных нами М52-индуциро-
ванных мутантов с весьма необычными свойствами, мы попытались вы-
яснить, не обусловлены ли эти свойства структурной связью фагового
генома с клеточной хромосомой. Выявление такой связи могло бы про-
лить свет на труднообъяснимые стороны взаимодействия РНК-содер-
жащих фагов с клеткой-хозяином и явиться доказательством способ-
ности фага MS2 устанавливать истинную лизогению как состояние,
основанное на физическом объединении фагового генома с клеточ-
ной ДНК.
В настоящей работе произведено клонирование £со/?/-фрагмен-
тов Д Н К хромосомы М52-индуцированного лизирующего мутанта ки-
шечной палочки и показан синтез М52-специфической РНК в клетках,
трансформированных рекомбинантными плазмидами.
Материалы и методы. Б а к т е р и и . Е. coli АВ259 ШгЗООО (Е. coli
3000) получены из Ин-та молекуляр. биологии РАН; Е. coli НВ101 —
из Ин-та биохимии и физиологии микроорганизмов РАН. Проницаемый
и лизирующий мутант Е. coli 3000 выделены нами самостоятельно как
сегреганты М52-индуцированного первично устойчивого мутанта [4, 5].
Π л а з м и д ы. Штамм, содержащий плазмиду pCV16 [8], передан
нам из Ин-та биохимии и физиологии микроорганизмов РАН; штамм,
включающий плазмиду pMS27 [8—10], предоставлен д-ром Р. Дево-
сом (Кентский ун-т, Бельгия).
Ф а г и . Фаг MS2 получен из Ин-та молекуляр. биологии РАН.
П и т а т е л ь н ы е с р е д ы . Использовали аминопептидный агар
(ΑΠΑ), 1,2 и 0,6 %, а также аминопептидный бульон (АПБ).
Всю работу проводили с фагом по [11].
Чувствительность к фагу и литической активности, содержащейся
в мутантных и плазмидных культурах, исследовали методом спот-тес-
та: клетки дикого типа Е. coli 3000 или ее проницаемого мутанта вы-
севали сплошным слоем на поверхность плотной питательной среды и
петлей наносили сверху маленькую каплю исследуемого матерлала
(фаг или бактериальную взвесь). Через сутки роста на чувствитель-
ной культуре появлялось четкое пятно или кольцевая зона лизиса, от-
сутствующие при нанесении материала на устойчивую культуру.
Выделение РНК из фага MS2 и хромосомной Д Н К из бактерий,
получение плазмид, клонирование, рестрикционный анализ и блот-гиб-
ридизацию проводили по [12]; выделение суммарной Р Н К из бакте-
рий— литиевым методом по [13], физическое картирование плазмид
осуществляли методом совместных и одиночных переваров [14].
Результаты и обсуждение. П о л у ч е н и е р е к о м б и н а н т н ы х
п л а з м и д с л и т и ч е с к и м и с в о й с т в а м и м у т а н т а л и -
з и р у ю щ е г о т и п а . Поскольку мутации, определяющие биологиче-
ские свойства мутанта лизирующего типа, связаны с областью иници-
ации репликации встроенного в хромосому F-фактора [5], клонирова-
ние интересующего нас участка клеточной Д Н К проводили с исполь-
зованием нереплицирующего Ар-фрагмента плазмиды pCV16, несуще-
го ген устойчивости к ампициллину. Хромосомную Д Н К мутанта, об-
работанную рестриктазой EcoRI, лигировали с изолированным Ар-
фрагментом, вырезанным из плазмиды при помощи этого же фермен-
та, и лигированной смесью трансформировали реципиентные клетки
46 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Ns 1 46
Ε. coli HB101. Первично клоны отбирали по устойчивости к ампицил-
лину. Теоретически полученная таким методом клонотека содержала
плазмиды, включающие в себя области инициации репликации клеточ-
ной хромосомы или интегрированного с ней /^-фактора. Дальнейшая
задача состояла в отборе клонов, способных продуцировать литическую
активность того же типа, что и исходный лизирующий мутант. Для
этой цели мы использовали клетки проницаемого мутанта, при высеве
на которые лизирующий мутант образует колонии, окруженные зоной
лизиса.
Отобранные по устойчивости к ампициллину клоны отсевали в от-
дельные пробирки в АПБ и выращивали первые сутки при 37 °С, а за-
тем несколько суток при комнатной температуре. Для проверки лити-
Рис. 1. Лигические свойства плазмидосодержащей культуры, лизирующего мутанта и
фага MS2 на стандартном для РНК-содержащих фагов хозяине Е. coli 3000 и его
проницаемом мутанте: а — газон клеток Е. coll 3000; б — газон клеток проницаемого
мутанта (1 — капля бульонной культуры, содержащей плазмиду pL26; 2 — капля
бульонной культуры лизирующего мутанта; 3 — капля суспензии фага MS2)
Рис. 2. Электрофореграммы Д Н К плазмид pL26 и рСУІб, обработанных эндонуклеаза-
ми рестрикции: / — Д Н К λ, обработанная HindIII и EcoRI (маркер); 2 — Д Н К pL26;
Я — Д Н К pL26, обработанная EcoRi; 4 — Д Н К pL26, обработанная PstI; 5 — Д Н К
pL26, обработанная PstI и EeoRI; 6 — Д Н К pCV16\ 7 — Д Н К pCV16, обработанная
EcoRI; 8 — Д Н К PCV16, обработанная PstI; 9 — Д Н К pCV16, обработанная PstI и
EcoRI
ческих свойств отобранных культур материал из каждой пробирки на-
носили петлей на свежевысеянный газон клеток проницаемого мутан-
та. Оказалось, что значительная часть всех Ар-устойчивых клонов (око-
ло одной трети) способна в течение нескольких суток накапливать ли-
тическую активность и при нанесении на тест-газон образовывать или
пятно, или зону лизиса вокруг зоны клеточного роста. Способность к
накоплению литической активности у разных клонов была неодинако-
вой — у одних это происходило быстро и сопровождалось медленным
ростом клеток и скорым их отмиранием, у других накопление литиче-
ского начала шло медленно, бактериальная суспензия мутнела с обыч-
ной для кишечной палочки скоростью и отмирание клеток не отлича-
лось интенсивностью. При работе с плазмидами первого типа наблю-
дались определенные трудности — низкий выход при выделении и сла-
боэффективная трансформация. Плазмиды второго типа легко выделя-
лись стандартными методами, эффективно трансформировали Е. coli
НВ101 и при каждой повторной трансформации позволяли получать
бактериальные культуры со свойствами первичного трансформирован-
ного клона. В настоящей работе использована плазмида pL26, относя-
щаяся ко второму типу. Литические свойства описываемой нами экс-
периментальной системы наследуются стабильно и выглядят очень чет-
ко (рис. 1).
ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Ns 1 47
Как можно судить по данным рис. 1, литические свойства, а имен-
но: специфичность к определенному хозяину плазмидосодержащего
клона совпадают с таковыми исходного лизирующего мутанта и отли-
чаются от подобных свойств фага MS2. Неспособность фага MS2 ли-
зировать проницаемый мутант объясняется отсутствием у мутантных
клеток F-фимбрий. Таким образом, биологические характеристики ре-
Рис. 3. Физические карты плазмид по PstI и EcoRI: l — pCV16 [8]; 2—pL26. За-
штрихованная часть — фрагмент, содержащий ген устойчивости к ампициллину
комбинантных плазмид позволяют считать, что нам удалось прокло-
нировать область хромосомы, определяющую фенотип ранее описанно-
го лизирующего мутанта Е. coli 3000.
Р е с т р и к ц и о н н ы й а н а л и з р е к о м б и н а н т н о й п л а з -
м и д ы pL26. Результаты рестрикционного анализа рекомбинантной
плазмиды pL26 в сравнении с векторной плазмидой pCV16 показаны
на рис. 2.
Как видно из этого рисунка, нерестрицированная рекомбинантная
плазмида выглядит стандартным образом. При обработке pCV16 и
pL26 EcoRI оказалось, что фрагмент pCV16 размером 1,7 тыс. п. н.,
содержащий ген устойчивости к ампициллину, не совпадает по разме-
ру ни с одним из двух £со/?/-фрагментов pL26. Физическая карта pL26,
построенная методом одиночных и совместных переваров эндонуклеа-
зами рестрикции [14] EcoRI и PstIy приведена на рис. 3 вместе с кар-
той pCV16, представленной в работе [8]. Как видно из сравнения фи-
зических карт pCV16 и pL26, фрагмент pCV16 с геном устойчивости к
ампициллину размером 1,7 тыс. п. н. претерпел изменения при обра-
зовании плазмиды pL26. Можно предположить, что он утратил либо
фрагмент величиной 0,5 тыс. п. н., содержащий Ps/7-сайт, либо фраг-
мент, включающий EeoRI-сайт (правый). Второй вариант более веро-
ятен, так как утрата PstI-сайта, находящегося в середине фрагмента
гена устойчивости к ампициллину, привела бы к нарушению работы
этого гена в отличие от утраты EeoRI-сайта в концевой части этого
фрагмента. Согласно физической карте рекомбинантной плазмиды
pL26, более мелкий EсоRI-фрагмент размером 1,2 тыс. п. н. не имеет
отношения к Ар-фрагменту, точные размеры которого при помощи ре-
стриктаз EeoRI и PstI определить не удалось.
О п р е д е л е н и е п р и с у т с т в и я MS2-C Π е ц и Φ и ч н о й Р Н К
в п л а з м и д о с о д е р ж а щ и х к л е т к а х . Присутствие М52-специ-
фической Р Н К в клетках, содержащих плазмиду pL26, определяли ме-
тодом блот-гибридизации. Все препараты суммарной клеточной РНК,
подвергнутые блот-гибридизации, проанализированы предварительно
электрофорезом в агарозном геле с 6 M мочевиной. Результаты элек-
трофореза показаны на рис. 4. Данные электрофореграммы свидетель-
ствуют о том, что и РНК MS2, и суммарная РНК, выделенная из раз-
48 I S S N 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 1 4 — 2-708 48
личных бактериальных культур, соответствуют ожидаемым параметрам.
Блот-гибридизацию изучаемых препаратов Р Н К осуществляли с
использованием различных зондов. На рис. 5 показаны результаты гиб-
ридизации Р Н К с 3 2 Р-ДНК плазмид pL26 и pCV16. Плазмида pL26
выбрана нами в связи с тем, что в клетках, ее содержащих, накапли-
валась литическая активность. Представляло интерес выяснить, содер-
Рис. 4. Электрофореграмма суммарных РНК в агарозном геле с 6 M мочевиной: /—·
рибосомная 28S и 18S Р Н К (маркер); 2 — РНК MS2; 3 — РНК /?Ш>-содержащих кле-
ток; 4 - РНК Е. coli 3000
Рис. 5. Радиоавтограф блот-гибридизации 3 2 P-ДНКpL26 с суммарной Р І Ж ; / — - M S 2 ;
2 — РНК из /;/„26-содержащих клеток; 3, 4 — РНК Е. coli 3000. Гибридизации а Ф - Д Н К
pCVK) с этими препаратами РНК не обнаружено
жит ли pL26 последовательность, комплементарную Р Н К MS2. Плаз-
мпду pCV16 использовали в качестве контроля.
Как видно из результатов этого опыта, Д Н К плазмиды pL26 гиб-
ридпзуется с Р Н К pL-26-содержащей культуры, а также с РНК-кон-
трольного штамма Е. coli 3000. С
PIIK φ ага MS2 гибридизация от- q $ Ί
сутствует, так же как она отсутст- ' ί 2 3 / 2
вуст со всеми образцами Р Н К при
использовании в качестве зонда
плазмиды pCV16. Гибридизацию
Д Н К pL26 с Р Н К контрольной
культуры можно объяснить тем, что
в pL26 включился участок хромосо-
мы мутанта Е. coli 3000, и гибриди-
зация осуществляется с клеточной
РНК, гомологичной одному и тому
же фрагменту плазмидной Д Н К .
Рис. 6. Радиоавтограф блот-гибридизации
3 2P-JIHK pMS27 (а) и 3 2Р-ДНК фрагмента
pMS2/, содержащего часть кДНК РНК фа-
га MS2 (б), с суммарной РНК: / — Р Н К
MS2; 2 — РНК pL26-содержащих клеток;
3 — РНК Е. coli 3000
Отсутствие гибридизации pL26 с Р Н К фага MS2 побудило нас к
использованию в качестве зонда плазмиды pMS27, содержащей ДНК-
копию Р Н К MS2, и EcoRI-фрагмента этой копии, содержащего только
МБЗ-специфичную последовательность, свободную от векторной части.
Результаты гибридизации показаны на рис. 6. Полученные данные сви-
ISSN 0233-7G57. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 1 4 — 2-708 49
детельствуют о наличии гибридизации Р Н К MS2 и суммарной Р Н К
p L ^ - с о д е р ж а щ и х клеток как с зондовой плазмидой pMS27, так и с
отдельным фрагментом, содержащим часть ДНК-копии Р Н К фага MS2,
свободную от векторной последовательности. Расположение сигналов
совпадает и отличается только интенсивностью. Гибридизация с РНК
контрольного штамма Е. coli 3000 отсутствует, что указывает на спе-
цифичность связывания Д Н К обоих зондов с Р Н К фага MS2 и Р Н К
pL26-содержащих клеток.
Таким образом, выполненные в настоящей работе исследования
приводят к двум основным выводам: 1) в клетках, несущих плазмиду
pL26, включившую часть хромосомы описанного ранее М52-индуциро-
ванного лизирующего мутанта Е. coli АВ259 ШгЗООО, накапливается
М52-специфическая РНК; 2) ДНК плазмиды pL26 с РНК фага MS2
не гибридизуется.
Из этого следует, что генетический материал РНК-содержащего
фага MS2 может вступать в прочную структурную связь с хромосом-
ной Д Н К Hfr-штамма Е. coli, что соответствует классическому пред-
ставлению об основах фаговой лизогении. В то же время отсутствие
гибридизации плазмидной Д Н К с Р Н К MS2 позволяет предположить,
что плазмида содержит или плюс-цепочку РНК-подобной ДНК, или
же саму фаговую РНК- Возможно, что протяженность фагоспецифич-
ного генетического материала, включенного в состав клеточной и со-
ответственно плазмидной ДНК, короче нативной фаговой РНК, о чем
можно судить по расположению положительных сигналов (см. рис. 6),
а также по отсутствию жизнеспособного фага как в клетках лизирую-
щего мутанта, так и в клетках плазмидосодержащих культур.
Авторы выражают глубокую благодарность Т. С. Даниленко за вы-
деление общей клеточной Р Н К из Е. coli 3000 и /?L26-coдержащих клеток.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Widmer Н. R. Lebee G. Der Einfluss von RNS-Phagen u η с! Konjugationsfacloren//
Pathol, et Microbiol.— 1974.—40, N 3—4.—S. 153—154.
2. Widmer Η. R., Lebee G. Weitere Ergebnisse zur Wechselwirkung zwischen RNS-Pha-
gen und ^ F a c t o r e n / / I b i d — 4 1 , N 3—4.—S. 194—195.
3. Zfraga V. Lysogeny by F2 phage? // Nature.— 1977.— 267, N 5614.—P. 860—861.
4. Перерва Т. П. УСТОЙЧИВОСТЬ К фагу M S 2 , индуцированная у Е. coli при заражении
этим фагом//Цитология и генетика.— 1977.— Π, Л? 1.— С. 3—9.
5. Перерва Т. П., Малюта С. С. Система М52-индуцированных мутантов Е. coli по
/^-фактору//Молекуляр. биология.— 1984.— 38.— С. 81—90.
6. Перерва T. П., Бух И. Г., Даниленко Т. С. Изучение проницаемости М52-индуциро-
ванных мутантов Е. coli для нуклеиновых кислот//Вирусы и вирус, заболевания.—
1985.— 13.—С. 22—26.
7. Спигелман С. Внеклеточная стратегия реплицирующегося РНК-генома // Стратегия
вирус, генома.—-М. : Медицина, 1975.— С. 45—67.
8'. Копылова-Свиридова Т. П., Фодор П., Баев А. А. Новые векторные плазмиды для
селекции рекомбинантных клонов Е. coli 11 Докл. АН СССР.— 1979.— 245, № 5.—
С. 1250—1253.
9. Devos R., Van Emmelo J., Contreras R., Fiers W. Construction and characterization
of a plasmid containing a nearly full-size DNA copy of bacteriophage MS2 RNA / / J .
Мої. B i o L - 1979.— 128, N 4.—P. 595—619.
10. Devos R., Contreras R., Van Emmelo J., Fiers W. Identification of the translocatable
element ISl in a molecular chimera constructed with plasmid pBR322 DNA into which
a bacteriophage MS2 copy was inserted by the poly(dA) poly(dt) linker method //
Ibid.—P. 621—632.
11. Адаме Μ. Бактериофаги.— Μ. : Изд-во иностр. лит., 1961.— 527 с.
12. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование — М. : Мир, 1984.—
479» с.
13. Chirguin /. M., Przybyla A. E., MacDonald R. J., Rutter W. / . Isolation of biological-
ly active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease // Biochemistry.—
1979.— 18, N 24.—P. 5294—5298.
14. Fitch W. MSmith T. F., Ralph W. W. Mapping the order of DNA restriction frag-
ments/ /Gene.—1983.—22, N 1.—P. 19—29.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН Украины, Киев Получено 06.08'.92
50 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Ns 1 50
|