Биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс

Охарактеризованы фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени интактных крыс. Разница в транскрипционной активности между фракциями обусловлена, по всей вероятности, различиями в белковом компоненте хроматина, а именно: повышенной концентрацией РНК-полимераз в активном хром...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1993
Hauptverfasser:	Левицкий, Е.Л., Губский, Ю.И., Чабанный, В.Н., Волков, Г.Л., Новикова, С.Н.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1993
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Обзоры
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156272
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс / Е.Л. Левицкий, Ю.И. Губский, В.Н. Чабанный, Г.Л. Волков, С.Н. Новикова // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 6. — С. 13-21. — Бібліогр.: 27 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156272
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1562722025-02-09T12:06:46Z Биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс Біохімічна характеристика фракції транскрипційно активного і репресованого хроматину печінки щурів Biochemical characteristics of the rat liver transcriptionally active and repressed chromatin Левицкий, Е.Л. Губский, Ю.И. Чабанный, В.Н. Волков, Г.Л. Новикова, С.Н. Обзоры Охарактеризованы фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени интактных крыс. Разница в транскрипционной активности между фракциями обусловлена, по всей вероятности, различиями в белковом компоненте хроматина, а именно: повышенной концентрацией РНК-полимераз в активном хроматине. Показатели уровня синтеза ДНК in vivo и in vitro, процесс термоденатурации, чувствительности фракций и экзо- и эндогенным ДНКазам разнятся незначительно, что позволяет предполагать сходство упаковки ДНК в транскрипционно активном и репрессированном хроматине. Кроме того, возможно, что отличия в фосфолипидном и жирнокислотном составе между фракциями могут обусловливать участие липидов хроматина в реализации его генетической активности. Охарактеризовано фракції транскрипційно активного та репресованого хроматину печінки інтактних щурів. Різницю у транскрипційній активності між фракціями обумовлено, скоріш за все, розбіжностями у білковому компоненті хроматину, а саме: збільшеною концентрацією РНК-полімераз в активному хроматині. Показники синтезу ДНК in vivo та in vitro, процесу термоденатурації, чутливості фракцій до ендота екзогенних ДНКаз різняться незначно, що дозволяє припустити подібність укладання структури ДНК у транскрипційно активному та репресованому хроматині. Крім того, можливо, що розбіжності у фосфоліпідному та жирнокислотному складі між фракціями здатні зумовити участь ліпідів хроматину у реалізації його генетичної активності. The intact rat liver trancriptionally active and repressed chromatin fractions have been characterized. The transcriptionally activity differences between the fractions may be conditioned by distinctions in the chromatin protein component, that is increased RNA-polymerases concentration in active chromatin. Differences between in vivo and in vitro DNA synthesis, thermodenaturation process and susceptibility to endo- and exogenous DNA-ases are insignificant and so it may be thought the DNA structure similarity in active and repressed chromatin. Moreover it may be thought that differences between phospholipid and fatty acids fractions compositions may be a cause of the chromatin realization of its genetic activity. 1993 Article Биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс / Е.Л. Левицкий, Ю.И. Губский, В.Н. Чабанный, Г.Л. Волков, С.Н. Новикова // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 6. — С. 13-21. — Бібліогр.: 27 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00037B https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156272 615.357.631:577.157 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Обзоры Обзоры
spellingShingle	Обзоры Обзоры Левицкий, Е.Л. Губский, Ю.И. Чабанный, В.Н. Волков, Г.Л. Новикова, С.Н. Биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс Биополимеры и клетка
description	Охарактеризованы фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени интактных крыс. Разница в транскрипционной активности между фракциями обусловлена, по всей вероятности, различиями в белковом компоненте хроматина, а именно: повышенной концентрацией РНК-полимераз в активном хроматине. Показатели уровня синтеза ДНК in vivo и in vitro, процесс термоденатурации, чувствительности фракций и экзо- и эндогенным ДНКазам разнятся незначительно, что позволяет предполагать сходство упаковки ДНК в транскрипционно активном и репрессированном хроматине. Кроме того, возможно, что отличия в фосфолипидном и жирнокислотном составе между фракциями могут обусловливать участие липидов хроматина в реализации его генетической активности.
format	Article
author	Левицкий, Е.Л. Губский, Ю.И. Чабанный, В.Н. Волков, Г.Л. Новикова, С.Н.
author_facet	Левицкий, Е.Л. Губский, Ю.И. Чабанный, В.Н. Волков, Г.Л. Новикова, С.Н.
author_sort	Левицкий, Е.Л.
title	Биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс
title_short	Биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс
title_full	Биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс
title_fullStr	Биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс
title_full_unstemmed	Биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс
title_sort	биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1993
topic_facet	Обзоры
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156272
citation_txt	Биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс / Е.Л. Левицкий, Ю.И. Губский, В.Н. Чабанный, Г.Л. Волков, С.Н. Новикова // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 6. — С. 13-21. — Бібліогр.: 27 назв. — рос.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT levickijel biohimičeskaâharakteristikafrakciitranskripcionnoaktivnogoirepressirovannogohromatinapečenikrys AT gubskijûi biohimičeskaâharakteristikafrakciitranskripcionnoaktivnogoirepressirovannogohromatinapečenikrys AT čabannyjvn biohimičeskaâharakteristikafrakciitranskripcionnoaktivnogoirepressirovannogohromatinapečenikrys AT volkovgl biohimičeskaâharakteristikafrakciitranskripcionnoaktivnogoirepressirovannogohromatinapečenikrys AT novikovasn biohimičeskaâharakteristikafrakciitranskripcionnoaktivnogoirepressirovannogohromatinapečenikrys AT levickijel bíohímíčnaharakteristikafrakcíítranskripcíjnoaktivnogoírepresovanogohromatinupečínkiŝurív AT gubskijûi bíohímíčnaharakteristikafrakcíítranskripcíjnoaktivnogoírepresovanogohromatinupečínkiŝurív AT čabannyjvn bíohímíčnaharakteristikafrakcíítranskripcíjnoaktivnogoírepresovanogohromatinupečínkiŝurív AT volkovgl bíohímíčnaharakteristikafrakcíítranskripcíjnoaktivnogoírepresovanogohromatinupečínkiŝurív AT novikovasn bíohímíčnaharakteristikafrakcíítranskripcíjnoaktivnogoírepresovanogohromatinupečínkiŝurív AT levickijel biochemicalcharacteristicsoftheratlivertranscriptionallyactiveandrepressedchromatin AT gubskijûi biochemicalcharacteristicsoftheratlivertranscriptionallyactiveandrepressedchromatin AT čabannyjvn biochemicalcharacteristicsoftheratlivertranscriptionallyactiveandrepressedchromatin AT volkovgl biochemicalcharacteristicsoftheratlivertranscriptionallyactiveandrepressedchromatin AT novikovasn biochemicalcharacteristicsoftheratlivertranscriptionallyactiveandrepressedchromatin
first_indexed	2025-11-25T22:55:35Z
last_indexed	2025-11-25T22:55:35Z
_version_	1849804808748269568
fulltext	УДК 615.357.631:577.157 Ε. Л. Левицкий, Ю. И. Губский, В. Н. Чабанный, Г. Л. Волков, С. Н. Новикова БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФРАКЦИИ ТРАНСКРИПЦИОННО АКТИВНОГО И РЕПРЕССИРОВАННОГО ХРОМАТИНА ПЕЧЕНИ КРЫС О характеризованы фракции транскрипционно активного и репрессированного хромати- на печени интактных крыс. Разница в транскрипционной активности между фракциями обусловлена, по всей вероятности, различиями в белковом компоненте хроматина, а именно: повышенной концентрацией РНК-полимераз в активном хроматине. Показатели уровня синтеза ДНК in vivo и in vitro, процесс термоденатурации, чувствительности фракций и экзо- и эндогенным ДНКазам разнятся незначительно, что позволяет предпо- лагать сходство упаковки ДНК в транскрипционно активном и репрессированном хрома- тине. Кроме того, возможно, что отличия в фосфолипидном и жирнокислотном составе между фракциями могут обусловливать участие липидов хроматина в реализации его генетической активности. Введение. Несмотря на значительные успехи, достинутые в последнее время в изучении структурно-функциональной организации ядерного хроматина в интактных клетках, многие аспекты этой проблемы оста- ются неясными. Один из них — функционирование молекулярных меха- низмов, определяющих структурные и функциональные различия между активными и низкоактивными в отношении матричных синтезов уча- стками ядерного хроматина. О действии механизмов активации хрома- тина в интактных клетках известно, что функциональные различия меж- ду активно транскрибирующимися последовательностями и низкоактив- ными участками в геноме обусловлены в основном высшими порядками структурной организации хроматина [1—3]. Однако при этом остается невыясненным вклад отдельных компонентов хроматина в механизмы его активации. В соответствии с этим в настоящей работе определены некоторые биохимические различия между фракциями транскрипционно активного (TAX) и репрессированного (PX) хроматина печени интактных крыс. Материалы и методы. В работе использовали крыс-самцов линии Вистар 3-месячного возраста (150—200 г). Животных декапитировали в утренние часы под легким эфирным наркозом, учитывая периодич- ность митотического цикла. Фракции PX и TAX выделяли, как прави- ло, по методу [4]. Структурно-функциональное состояние фракций хро- матина анализировали, как описано нами ранее [5—7]. Полученные данные обрабатывали с помощью методов непараметрической ста- тистики [8]. Результаты и обсуждение. Структурно-функциональную организа- цию фракций ядерного хроматина печени интактных животных исследо- вали с помощью биохимических методов. Известно, что важнейшими функциями ядерного хроматина являются процессы репликации и транс- крипции. Для выяснения интенсивности этих процессов в хроматине оценивали активности эндогенных ДНК- и РНК-полимераз во фрак- циях PX и TAX. В некоторых экспериментах параллельно регистриро- вали включение 3Н-тимидина в Д Н К фракций ядерного хроматина. Ме- тоды определения ферментативной чувствительности PX и TAX, про- центного соотношения между фракциями, отношения белок/ДНК, содер- жания ионов металлов дают возможность в значительной степени уста- новить структурную организацию фракций. Анализ изменения содержа- ния сАМР и активности АТРаз во фракциях позволяет судить о звень- ях регуляции активности ядерного генома [9]. Результаты определения доли каждой фракции в препаратах ядер- ного хроматина свидетельствуют о том, что соотношение (%) между фракциями, различающимися по уровню транскрипционной активности (Cj Е. л . Левицкий, Ю. И. Губский, В. Н. Чабанный, Г. Л. Волков, С. Н. Новикова, 1993 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 6 2-3-757 13 (η = 32), составляет для PX 91,7; TAX — 8,3 ( р < 0 , 0 1 по сравнению с PX). В хроматине печени интактных крыс на долю TAX приходится незначительная часть ядерного генома. Это соответствует данным лите- ратуры о том, что длина активно транскрибируемых генов равняется приблизительно 10 % длины генома [10, 11]. Авторы указанного метода получения фракционированного хроматина показали, что данные фрак- ции хроматина обладают различной степенью транскрипционной актив- ности: включение 14С-оротовой кислоты в РНК TAX печени крыс было в 6—10 раз выше относительно PX [4]. Логично предположить, что неодинаковая транскрипционная активность фракций ядерного хрома- тина обусловлена различной активностью эндогенных РНК-полимераз. Результаты определения их активности вофракциях PX и TAX печени интактных крыс приведены в табл. 1. Активность эндогенных РНК-по- лимераз в TAX выше по сравнению с PX: тотальная — в 6,2; фракции, обогащенной РНК-полимеразой I,— в 11,3; фракции, обогащенной PHK- полимеразой II,— в 4,6 раза. Эта разница в активности ключевых фер- ментов синтеза РНК соответствует приведенным выше показателям уровня включения 14С-оротовой кислоты во фракциях ядерного хрома- тина. В PX доля фракции, обогащенной РНК-полимеразой I, составля- ет 24,0%, а РНК-полимеразой II — 76,0%, в TAX — соответственно 43,7 и 56,3 % от общей РНК-полимеразной активности. Таким образом, значительные различия в уровне транскрипционной активности данных фракций ядерного хроматина, проявившиеся в условиях in vivo и in Vitroj обусловлены неодинаковой активностью эндогенных РНК- полимераз. Авторы оригинальной методики показали, что через 20 ч после час- тичной гепатэктомии включение 3Н-тимидина происходит приблизитель- но в 3 раза интенсивнее в Д Н К фракции TAX по сравнению с PX [4]. В наших экспериментах уровень эндогенной ДНК-полимеразной актив- ности определяли во фракциях ядерного хроматина печени интактных крыс. Результаты этих исследований приведены в табл. 2. Различия между активностями эндогенных ДНК-полимераз во фракциях PX и TAX незначительны. В целом ДНК-полимеразная активность несколько выше во фракции TAX: тотальная — на 15 %; ДНК-полимеразы а — на 7 ,0%; ДНК-полимеразы β — на 28,0%. Повышение активности ДНК- полимеразы β в TAX по сравнению с PX может быть связано с защит- ной реакцией клетки, обусловленной большей «открытостью» структуры TAX относительно PX и, следовательно, большей вероятностью повре- ждения TAX. Для сопоставления уровня синтеза Д Н К во фракциях хроматина в условиях in vivo и in vitro проведены эксперименты, в которых опре- деляли интенсивность включения 3Н-тимидина в Д Н К PX и TAX пе- чени интактных крыс. Уровень синтеза Д Н К (удельная радиоактив- ность, расп/мин на 1 мг ДНК) (п = Ъ) во фракции P X - 29682; TAX — 30912. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что по уровню синтеза Д Н К в условиях in vivo данные фракции хроматина практиче- ски не различаются. Эти данные соответствуют примерно одинаковому Т а б л и ц а 1 Эндогенная PHК-полимеразная активность фракционированного хроматина печени интактных крыс (расп/мин на 1 мг ДНК) (ri=28) Т а б л и ц а 2 Эндогенная ДHК-полимеразная активность фракционированного хроматина печени интактных крыс (расп/мин на 1 мг ДНК) п = 28) Активность РНК-полимеразы Активность ДНК-полимеразы Фракция хроматина Тоталь- ная I II Фракция хроматина Тотальная α β PX TAX 370875 2295728 88958 1003124* 282047 1292711* PX TAX 1590792 1828161 988712 1061777 600184 795487* :0,0'1 (по сравнению с PX). : р<с0,01 (по сравнению с PX). 14 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 6 2-3-757 14 уровню тотальной ДНК-полимеразной активности в анализируемых фракциях (см. табл. 2). Итак, изложенное выше подтверждает существование определенных различий в функциональной активности исследованных фракций хрома- тина. Прежде всего, они касаются уровня транскрипционной активности PX и TAX. По всей вероятности, в основе специфики функциональной активности этих фракций лежат особенности их структурной организа- ции. В данном случае структурную организацию фракционированного хроматина анализировали, основываясь на чувствительности ДНК к перевариванию эндо- и экзогенными ДНКазами (табл. 3). Из приведен- HJ.. Н4 Т а б л и ц а 3 Нуклеолитическое расщепление (%)3Н-ДНК фракций хроматина печени интактных крыс (п=3) Обработка PX TAX Эндогенное самоперевари- вание 78,5 32,9* ДНКаза I: 5' мин, 21 °С 16,7 20,4 15 мин, 37 °С 76,4 80,2 Si-нуклеаза: без денатурации Ο- 32,7* денатурация Ι 5,2 79,7* * р < 0 , 0 б (по сравнению с PX). Электрофореграмма белков фрак- ционированного хроматина печени интактных крыс: 1 — фракция PX; 2 — фракция TAX; 3 — маркеры молекулярной массы белков (-103); НГБ — негистоновые бел- ки, остальные обозначения — гис- тоновые белки хроматина ных данных видно, что Д Н К PX обладает большей чувствительностью к перевариванию эндогенными нуклеазами по сравнению с TAX. Это может быть обусловлено либо особенностями структуры Д Н К этих фракций, либо различиями в концентрации экзогенных нуклеаз. Резуль- таты расщепления Д Н К обеих фракций хроматина эндогенными нукле- азами показывают, что по чувствительности к ДНКазе I (переварива- ющей как одно-, так и двунитчатые участки ДНК) данные фракции хроматина не различаются. Это касается и щадящего (5 мин, 21 °С), и более жесткого (15 мин, 37 °С) переваривания. Интактная структура PX не содержит однонитчатых последовательностей ДНК, чувствитель- ных и к Si-нуклеазе. В Д Н К TAX обнаружено определенное количест- во таких последовательностей. При денатурации изменение структуры обеих фракций хроматина приводит к открытию однонитчатых последо- вательностей, чувствительных к этому ферменту. Однако их количество больше в TAX по сравнению с PX. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о незна- чительности отличий интактной структуры Д Н К между PX и TAX. Это предположение подтверждается одинаковой степенью переваривания Д Н К этих фракций экзогенными нуклеазами. Дифференциальная чув- ствительность Д Н К PX и TAX к экзогенным нуклеазам может быть обусловлена действием на Д Н К хроматина других видов нуклеаз, от- личных от ДНКазы I. Нельзя также исключить возможности влияния большей концентрации этих нуклеаз в структуре PX по сравнению с TAX. Различия в интактной структуре Д Н К PX и TAX, по всей вероят- ности, не приводят к заметной разнице во включении 3Н-тимидина в Д Н К этих фракций. Однако увеличенное количество однонитчатых по- следовательностей в интактной структуре Д Н К TAX и еще большее их содержание в этой фракции по сравнению с PX после денатурации мо- гут иметь важное значение, например, определять дифференциальную чувствительность этих фракций к повреждающим факторам [5—7]. ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 6 2-3-757 15 Для анализа белковой составляющей хроматина использовали не- сколько подходов. Важнейшей характеристикой структуры хроматина является соотношение белок/ДНК. Анализируемые фракции ядерного хроматина печени интактных крыс резко различаются по этому показа- телю {п=32): в PX он равен 1,4; в TAX — 9,7 ( р < 0 , 0 1 по сравнению с PX). В обеих фракциях хроматина содержание белка превышает та- ковое ДНК, однако в P X - в 1,4 раза; в TAX — в 9,7 раза. Фракция PX содержит гораздо больше Д Н К (1,0—1,5 мг/мл), чем TAX (0,2— 0,4 мг/мл). Известно, что в активно транскрибируемом хроматине основ- ную массу белков составляют негистоновые белки, многие из которых являются либо непосредственными участниками процесса транскрипции (ферменты транскрипции) и репликации, либо их регуляторами, в то время как в репрессированном хроматине главной составной частью белкового компонента служат гистоны, молекулы которых наряду с ни- тями Д Н К представляют собой основные компоненты, формирующие структуру нуклеосом [12—14]. В целом TAX, где процесс транскрипции протекает более интенсивно, чем в PX, вероятно, содержит намного больше белков, требующихся для осуществления и регуляции этого процесса. Можно ожидать, что различная структурная упаковка PX и TAX будет оказывать влияние на процесс термоденатурации фракций хро- матина. Структура PX должна быть более конденсированной, в то вре- мя как TAX — более релаксированной (ввиду большей интенсивности процесса транскрипции). Отличия в белковом компоненте и спирализо- ванности этих фракций хроматина [12—14] также должны определен- ным образом сказываться на поотекании процесса термоденатурации. Явление термоденатурации хроматина основано на том, что с повы- шением температуры начинают денатурировать различные его компонен- ты, составляющие спирализованную белково-нуклеиновую структуру. Это отражается величиной гиперхромного эффекта, регистрируемого спектрофотометрически. Анализ кривых термоденатурации позволяет также установить вклад различных ДНК-белковых взаимодействий в исследованных фракциях ядерного хроматина. Результаты такого ана- лиза приведены в табл. 4, откуда следует, что имеются (хотя и не очень значительные) различия в характере процесса термоденатурации ана- лизируемых фракций ядерного хроматина. Интегральная температура плавления несколько выше для фракции PX, что в какой-то мере отра- жает более конденсированный характер упаковки этой фракции [12—14]. Тем не менее, величины подобного показателя достаточно близки для обеих фракций. Что касается вклада различных ДНК-бел- ковых взаимодействий и плавления «чистой» Д Н К в суммарный про- цесс термоденатурации, то здесь имеются существенные отличия меж- Т а б л и ц а 4 Параметры термоденатурации фракций PX и TAX из печени интактных крыс (результаты типичного эксперимента) Фракция хроматина Интегральная Температурные переходы ДНК (относительно общего гиперхромизма, %) Фракция хроматина температура плавления, °С I II III IV V VI PX TAX 79,1 78,6 5 5 3 11 Ί2 28 24 24 28 16 10 П р и м е ч а н и е . I (50—60 °С) —,плавление дестабилизированной ДНК; II (65— 70 °С)— плавление свободной ДНК; III (71—75 °С) — плавление линкерной ДНК, умеренно стабилизированной ДНК-белковыми взаимодействиями с гистонами Hl и Н3; IV (76—80 0C) — плавление коровой ДНК нуклеосом; V (81—85 °С) — плавление ДНК в участках интенсивного ДНК-гистонового взаимодействия; VI (85—98 °С) — плав- ление ДНК, стабилизированной структурными негистоновыми белками. 16 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 6 2-3-757 16 ду PX и TAX. Это прежде всего относится к вкладу плавления деста- билизированной Д Н К в общий гиперхромизм. Если в PX вклад такого типа плавления в общий гиперхромизм отсутствует, то в TAX он со- ставляет 5 %, что означает наличие Д Н К указанного типа в TAX и от- сутствие ее в PX. Присутствие дестабилизированной Д Н К является, по-видимому, важным фактором, определяющим повышенный уровень транскрипции в TAX. В PX содержится несколько больше свободной ДНК, чем в TAX (II переход). Это соответствует данным о более упо- рядоченной нуклеосомной организации транскрипционно менее актив- ной фракции ядерного хроматина [15]. Структура Д Н К TAX тесно связана взаимодействиями с регуляторными негистоновыми белками, что приводит к снижению доли свободной ДНК. Вклад линкерной Д Н К (III переход) в процесс плавления хроматина примерно одинаков в обеих фракциях. В отношении плавления тугоплавких компонентов хро- матина (переходы IV—VI) показано, что суммарный их вклад в общий гиперхромизм составляет в PX 68 %, в TAX — 62 %, т. е. первая фрак- ция является несколько более тугоплавкой, чем вторая. Особенно су- щественные различия отмечаются в случае самого тугоплавкого компо- нента, связанного с плавлением ДНК, стабилизированной структурны- ми негистоновыми белками. Вклад этого компонента в общий гиперхро- мизм составляет в PX 16 %, в то время как в TAX— 10 %. В целом фракция PX — более тугоплавкая по сравнению с TAX, что, по всей вероятности, является одной из причин большей транскри- бируемое™ последней. Однако в основном характер термоденатурации изученных фракций хроматина довольно сходен. Это может свидетель- ствовать о том, что упаковка структурных компонентов данных фрак- ций хроматина имеет подобную природу, и за различный уровень транс- крипции могут быть ответственными другие факторы, в частности, не- одинаковые соотношения между различными типами и группами бел- ков в изученных фракциях ядерного хроматина. Выраженные отличия, наблюдающиеся между величинами соотно- шения белок/ДНК в анализируемых фракциях ядерного хроматина (см. выше), позволяют предположить наличие существенной разницы в элек- трофоретических спектрах белков между PX и TAX. Результаты элек- трофоретического исследования компонентов фракционированного хро- матина печени интактных животных приведены на рисунке, откуда вы- текают следующие положения. Фракция PX содержит типичный набор коровых гистонов и гистон Hl , являющийся важнейшим структурным компонентом массы хроматина и препятствующий процессу транскрип- ции [16, 17]. В состав этой фракции хроматина входит малое количест- во негистоновых белков. Фракция TAX, полученная с помощью допол- нительного озвучивания, значительно обогащена негистоновыми белка- ми (ряд белков присутствует в эквимолярных с гистонами количест- вах), содержит структуры ядерного матрикса с зонами присоединения петель Д Н К и ламино-поровый комплекс. В ее состав входят также фер- менты — ДНК- и РНК-полимеразы, связанные с элементами ядерного матрикса [16, 17]. Обогащенность этой фракции негистоновыми белка- ми и низкое содержание Д Н К приводят к повышению (по сравнению с PX) соотношения белок/ДНК. Таким образом, анализ белкового состава фракций ядерного хрома- тина печени интактных крыс позволил выявить существенные отличия этого показателя в PX и TAX, которые определяют, в основном, их раз- личную функциональную активность. Ионы металлов, содержащиеся в ядерном хроматине, являются важ- ными составляющими генетического аппарата клетки, обеспечивающи- ми структурную специфичность и различную функциональную актив- ность его компонентов [18]. Общеизвестно значение ионов кальция как универсальных регуляторов клеточных функций [19], в том числе и генетической активности [20]. Кроме того, они принимают участие в структурной упаковке хроматина [21, 22]. Ионы переменной валентно- сти (железа, меди, никеля, цинка), входящие в состав хроматина, иг- ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 6 2 - 3 - 7 5 7 17 рают важную роль в реакциях, протекающих с участием кислорода [23]. В настоящей работе определяли содержание ионов некоторых из этих металлов во фракциях PX и TAX печени интактных крыс. Резуль- таты этих исследований приведены в табл. 5, откуда следует, что коли- чество ионов кальция приблизительно одинаково в обеих фракциях хроматина. Что касается ионов металлов переменной валентности, то их количество существенно выше во фракции TAX. Это подтверждает обнаруженные нами ранее различия в интенсивности и характере окислительно-восстановительных процессов во фракциях ядерного хроматина [24]. Известно, что в хроматине выявлена значительная АТРазная ак- тивность [10], коррелирующая с содержанием ионов Ca и Mg как со- ставных частей генетического аппарата клетки, а также с наличием системы местной энергообеспеченности репликации и транскрипции [17]. По-видимому, подобный факт может быть связан с известными энергозатратами, требующимися для протекания этих процессов в хро- матине. Показана также роль циклических нуклеотидов в регуляции функциональной активности хроматина [9, 19]. Однако что касается их содержания в хроматине, то данные подобного рода в литературе от- сутствуют, вероятно, ввиду чрезвычайно малых количеств этих внутри- клеточных регуляторов в генетической субстанции клетки. В табл. 6 приведены сведения об активности АТРаз и содержания сАМР в препаратах фракций хроматина. Видно, что по указанным па- раметрам фракции существенно не различаются. Тем не менее несколь- ко меньшее содержание сАМР и сниженная активность Mg-АТРазы в TAX могут иметь важное функциональное значение. Однако для подтверждения этого предположения необходимы специальные исследования. Ранее нами были получены данные, указывающие на существова- ние липидного бислоя во фракциях PX и TAX печени интактных крыс [25]. Для анализа составных частей липидного компонента фракциони- рованного хроматина проведено исследование его фосфолипидного со- става и входящих в фосфолипиды жирнокислотных остатков, что не- обходимо для выяснения действия механизмов липопереокисления в хроматине [26]. Результаты подобного исследования свидетельствуют о том, что общее содержание фосфолипидов во фракциях хроматина печени интактных крыс (нмоль/мг белка, п = 4 ) составляет в PX — 28,0; в TAX — 68,0 ( р < 0 , 0 5 по сравнению с PX). Из этого следует, что фракция TAX включает несколько большее количество фосфолипидов по сравнению с PX. Входящие в состав фосфолипидов остатки ненасыщен- ных жирных кислот являются субстратами для реакций липопереокис- ления, в результате которых наблюдается образование свободных ра- дикалов и повреждение хроматина [9, 26]. Результаты определения жирнокислотного состава фракций PX и TAX в печени интактных крыс (табл. 7, 8) подтверждают тот факт, что в состав обеих фракций хроматина входят насыщенные и ненасыщен- ные жирные кислоты, причем относительное количество последних вы- Т а б л и ц а 5 Содержание ионов металлов во фракциях хроматина печени интактных крыс (мкг/'мг белка) (п = 6) Фракция хроматина Ca Fe Cu PX TAX 52,2 61,8 1,3 2,5* 2,5 4,9* * ρ <0,05' (по сравнению с PX). Т а б л и ц а 6 АТРазная активность (мкмоль Фн/мг белка) и содержание сAMP (пмоль/мг белка) во фракциях хроматина печени интактных крыс (п — 9) АТРазная активность Фракция хроматина Общая Mg-зави- симая Са-зави- симая Содержа- ние сАМР PX TAX 1,415 1,216 1,310 1,100 0,105 0,116 0,0751 0,059 L 18 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 6 2-3-757 18 шс во фракции TAX. Эта разница обусловлена повышенным содержа· нием линолевой и арахидоновой кислот, являющихся, как известно, ос- новными субстратами липопереокисления [26]. Возможно, что различия в жирнокислотном составе PX и TAX могут быть связаны с уровнями их транскрипционной активности. Следовательно, исследованные фракции ядерного хроматина со- держат определенное количество фосфолипидов и их ненасыщенных жирнокислотных остатков. Количество этих структурных компонентов генетического аппарата и субстратов реакций липопереокисления не- сколько выше во фракции TAX, что согласуется с обнаруженным ранее более высоким уровнем реакций П О Л в этой фракции хроматина [24], Таким образом, представленные в настоящей работе сведения поз- воляют заключить следующее. Использован набор тестов, с помощью которых можно оценить в первом приближении структурно-функцио- нальное состояние фракций PX и TAX. В результате показано сущест- вование принципиальных различий в функциональной активности и структурной организации исследованных фракций ядерного хроматина. Прежде всего это касается уровня транскрипционной активности [5]. Уровень эндогенного синтеза РНК, измеренный в условиях in vitro, свидетельствует о том, что этот процесс протекает намного интенсивнее во фракции TAX. Возможно, это обусловлено обнаруженными нами существенными различиями в белковом и липидном составе и струк- турной организации этих компонентов хроматина. По ряду характерис- тик (уровень синтеза Д Н К , характер процесса термоденатурации, чув- ствительность Д Н К к эндонуклеолитическому расщеплению) отличия между фракциями носят более умеренный характер. То есть эти данные показывают, что, очевидно, разный уровень транскрипционной активно- сти исследованных фракций хроматина печени интактных крыс обус- ловлен, в основном, изменениями белкового и липидного компонентов хроматина (прежде всего, концентрацией РНК-полимераз) . Тем не ме- нее, нельзя исключить вероятности того, что различия в показателях, характеризующих состояние Д Н К во фракциях, вносят заметный вклад в уровень их транскрипционной активности. Приведенные данные о состоянии липидного компонента хромати- на во фракциях PX и TAX указывают также на принципиальную воз- можность протекания реакций ПОЛ в изученных фракциях ядерного хроматина печени [24], являющихся одним из возможных механизмов повреждения генетического аппарата клетки и основных его компонен- тов [5—7, 9]. Существует также вероятность того, что уровень реакций ПОЛ в хроматине может определенным образом влиять на его транс- крипционную активность по аналогии с обнаруженным ранее нами влиянием этих реакций на ДНК-полимеразную активность PX и TAX [27]. Т а б л и ц а 8 Содержание ацильных остатков липидов /'% ) во фракциях хроматина печени интактных крас (п=4) Т а б л и ц а 7 Относительное содержание жирных кислот (%) во фракциях хроматина печени интактных крыс (п=8) Ацильные остатки липидов PX ТА 12 : О 14 : O1 15 :0 16 : О 49,6 1,4 17,5 18,9 Жирные кислоты PX TAX 16: 1; 7 18 : О 18 : 1; 9 18 : 2; 6 20 : 4; 6 Насыщенные 54,4 40,9* Ненасыщенные 45,6 59,1* 8,5 2,8 * р < 0 , 0 5 (по сравнению с PX). * ρ<0,05/ (по сравнению с PX); ** положение ато- ма углерода с первой двойной связью. ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 6 2-3-757 19 Р е з ю м е . Охарактеризовано фракції транскрипційно активного та репресованого хроматину печінки інтактних щурів. Різницю у транскрипційній активності між фракці- ями обумовлено, скоріш за все, розбіжностями у білковому компоненті хроматину, а саме: збільшеною концентрацією РНК-полімераз в активному хроматині. Показники синтезу ДНК in vivo та in vitro, процесу термоденатурації, чутливості фракцій до ендо- та екзогенних ДНКаз різняться незначно, що дозволяє припустити подібність укладан- ня структури ДНК у транскрипційно активному та репресованому хроматині. Крім то- го, можливо, що розбіжності у фосфоліпідному та жирнокислотному складі між фрак- ціями здатні зумовити участь ліпідів хроматину у реалізації його генетичної активності. S u m m a r y . The intact rat liver trancriptionally active and repressed chromatin fractions have been characterized. The transcriptionally activity differences between the fractions may be conditioned by distinctions in the chromatin protein component, that is increased RNA-polymerases concentration in active chromatin. Differences between in vivo and in vitro DNA synthesis, thermodenaturation process and susceptibility to en- do- and exogenous DNA-ases are insignificant and so it may be thought the DNA structu- re similarity in active and repressed chromatin. Moreover it may be thought that differen- ces between phospholipid and fatty acids fractions compositions may be a cause of the chromatin realization of its genetic activity. ОПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Студитский В. M., Белявский А. В., Мельников А. Ф. и др. Структура минимальных нуклеосом, расположенных на транскрибируемых участках генома // Молекуляр. биология.— 1988.—22, JMb 3.— С. 706—717. 2. Reeves R. Transcriptionally active chromatin //· Biochim. et biophys. acta.— 1984.— 782, N 2,— P. 343—393. 3. Reeves R., Jones A. Genomic transcriptional activity and the structure of chroma- tin // Nature.— 1976.—260, N 5551.—P. 495—500. 4. Чихиржина Г. И., Домкина Л. КЧигарева Н. Г. и др. Солюбилизация хроматина эндогенным Ca2+, А^2+-зависимым фактором. Активность труднорастворимого хроматина//Молекуляр. биология.—1976.—10, № 6 . — С. 1303—1310. 5. Губский Ю. И., Левицкий Е. JI., Чабанный В. Н. и др. Перекисное окисление липи- дов и параметры термоденатурации фракций хроматина печени крыс//Укр. биохим. журн.—1990.—62, № 2.—С. 76—82. 6. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Волков Г. Л. Жирнокислотный состав фракций хроматина печени крыс в условиях стимуляции перекисного окисления липидов/ / Там же.—1991.—63, № 1.—С. 87—91. 7. Губский Ю. ИЛевицкий Е. Л., Жила В. А. и др. Молекулярные механизмы по- вреждения фракционированного хроматина печени тетрахлорметаном / / Вопр. мед. химии.—1992.—38, № 3.—С. 54—58. 8. Ашмарин И. П., Васильев Н. H., Амбросов В. А. Быстрые методы статистической об- работки и планирование экспериментов.— JI.: Изд-во ЛГУ, 1975.—78 с. 9. Левицкий Е. Л., Губский Ю. И. Регуляторное влияние ионов кальция и цикличе- ских нуклеотидов на синтез ДНК в клетках млекопитающих // Биохимия животных и человека,—1990.—№ 14.—С. 33—44. 10. Збарский И. Б. Организация клеточного ядра.— М. : Медицина, 1988.—368 с. 11. Храпунов С. П., Драган А. И., Бердышев Г. Д. Структура и функции хроматина.— Киев : Вища шк., 1987.—167 с. 12. Восток КСамнер Э. Хромосома эукариотической клетки.— М.: Мир, 1981.—600 с. 13. Кучеренко Н. E., Цудзевич Б. А., Блюм Я. Б. Биохимическая модель регуляции ак- тивности хроматина.— Киев : Наук, думка, 1983.—248 с. 14. Лыоин Б. Гены.—М. : Мир, 1987—544 с. 15. Elgin S. С. Workshop on chromosome structure and gene express ion/ /Meeting Rev.— 1990.— P. 2—12. (6. Elgin S. C. Chromatin structure and gene activity// Curr. opinion in cell biol.— 1990.— 2.— P. 437—445. 17. Корнберг А. Синтез ДНК.—Μ.: Мир, 1977.—359 с. 18. Иванов В. И. О роли металлов в дезоксирибонуклеиновой кислоте / / Биофизика.— 1965.—10, № 1 — С. 11—16. 19 Whitfield J. F., Boynton A. L., MacManus J. P. The regulation of cell proliferation by calcium and cyclic A M P / / М о ї . and Cell. Biochem.—1979.—27, N 3.—P. 155— 179. 20.. Sikorska MBelle I., Whitfield J. F. et al. Regulation of the synthesis of DNA poly- merase α in regenerating liver by calcium and 1,2,5-dihydroxy vitamin D 3 / / B i o c h e m . and Cell. Biol.—1989.—67, N 7.—P. 345—351. 21. Lebkowsky J. S., Laemmli U. K. Evidence for two levels of DNA folding in histone- depleted HeLa interphase n u c l e i / / J . Мої. Biol.—1982.—156, N 2.—P. 309—324. 2 0 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 6 2-3-757 20 22. Lebkowsky J. S., Laemmli U, К. Non-histone porteins and long-range organization of HeLa interphase DNA / / Ibid.— P. 325—344. 23. Shires Т. K. Iron-induced DNA damage and synthesis in isolated rat liver nuclei / / Biochem. J.—1982.—205, N 2 .—P. 321—329. 24. Губский Ю. И., Левицкий Ε. Л., Гольдиїтейн Η. Б. и др. Перекисное окисление ли- пидов фракций хроматина печени крыс/ /Докл. АН УССР, сер. Б.—1989.— № 2.— С. 70—72. 25. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л., Примак Р. Г. и др. Конформационные характерис- тики и упаковка эндогенных липидов фракций транскрипционно активного и репрес- сированного хроматина//Укр. біиохим. журн.—1991.—63, JMb 2.— С. 83—89. 26. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах.— М.: Наука, 1972.—252 с. 27. Губский Ю. И., Левицкий Е. Л*, Гольдиїтейн Η. Б. и др. Перекисное окисление липи- дов и эндогенная ДНК-полимеразная активность фракций изолированного хромати- на печени крыс / / Бюл. эксперим. биологии и медицины.—1989.—57, № 3.— С. 296— 298. Ин-т фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев Получено 30.03.93 Ин-т биохимии им. А. В. Палладина АН Украины, Киев НИИ геронтологии АМН Украины, Киев УДК 577.161.2:577.112.828 JI. Б. Бондаренко СВОЕОБРАЗИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ОСНОВНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ВИТАМИНА D3 В обзоре обобщены экспериментальные результаты изучения своеобразия биологических эффектов основных метаболитов витамина Dz — 1,25-диоксивитамина D3 и 24,25-диок- сивитамина D3. Рассмотрены вопросы синергизма и антагонизма их действия в орга- низме и в отдельных клетках-мишенях. Проанализированы данные о зависимости харак- тера биологического эффекта каждого из производных от его дозы и физиологического состояния клетки. Открытие и изучение метаболитов витамина D3 коренным образом из- менило научные представления о его действии на организм. Выясни- лось, что 1,25-диоксивитамин D3 (1,25 (OH)2D3) и 24,25-диоксивитамин D3 (24,25 (ОН)2D3) —основные активные формы витамина, в виде ко- торых проявляется его биологический эффект [1]. Дальнейшее иссле- дование их антирахитической активности выявило ключевую роль 1,25(0Н)г03 в регуляции гомеостаза Ca. Традиционно эффект соединений D-витаминного ряда связывали исключительно с обеспечением минерального обмена и формированием скелета. В связи с этим внимание исследователей вначале было скон- центрировано на участии основных метаболитов витамина D в регуля- ции обмена кальция. Однако в последующем изучение данных соедине- ний показало, что в организме они способны регулировать пролифера- цию и дифференциацию самых различных клеток (в том числе клеток иммунной системы) и совершенно необходимы для нормального течения процессов эмбриогенеза, цитодифференцировки, гемопоэза, формирова- ния иммунной системы и скелета организма, поддержания его гормо- нального статуса [1]. С развитием представлений о значении соединений D-витаминной природы в организме эволюционировали и взгляды исследователей на биологическую роль его основных метаболитов—l,25(OH) 2D 3 И 24,25 (ОН) 2D3. Пока изучение ограничивалось областью кальциевого об- мена, преобладало мнение, что 24,25(0Н)г0 3 не присуща самостоятель- ная биологическая функция и он может рассматриваться как первый © Л. Б. Бондаренко, 1993 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 6 2-3-757 21

Биохимическая характеристика фракции транскрипционно активного и репрессированного хроматина печени крыс

Institution

Ähnliche Einträge