Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Особенности поведения ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер

Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Особенности поведения ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер

зучены свойства ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер. Показано, что комплекс ядерная ДНК – топоизомераза II функционирует однотипно как в Mg2²⁺-, так и в Са2²⁺-содержащей среде. В отличие от комплекса в условиях in vitro, ядерный ДНК-топоизомеразный комплекс, обработанный Э...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Published in:Биополимеры и клетка
Date:1993
Main Authors: Соловьян, В.Т., Андреев, И.О.
Format: Article
Language:Russian
Published: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1993
Subjects:
Структура и функции биополимеров
Online Access:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156278
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Особенности поведения ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер / В.Т. Соловьян, И.О. Андреев // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 6. — С. 52-59. — Бібліогр.: 16 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156278
record_format dspace
spelling Соловьян, В.Т.
Андреев, И.О.
2019-06-18T10:43:16Z
2019-06-18T10:43:16Z
1993
Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Особенности поведения ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер / В.Т. Соловьян, И.О. Андреев // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 6. — С. 52-59. — Бібліогр.: 16 назв. — рос.
0233-7657
DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000381
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156278
575.113/577.21
зучены свойства ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер. Показано, что комплекс ядерная ДНК – топоизомераза II функционирует однотипно как в Mg2²⁺-, так и в Са2²⁺-содержащей среде. В отличие от комплекса в условиях in vitro, ядерный ДНК-топоизомеразный комплекс, обработанный ЭДТА, способствует не лигированию, а возрастанию расщепления ядерной ДНК. Зависимое от ЭДТА усиленное расщепление ДНК наблюдается в случае, если ядра, инкубируемые в Mg²⁺(Ca²⁺)- содержащей среде, были обработаны ЭДТА или при инкубации MgЭ(CaЭ)-ядep в при сутствии ионов Mg²⁺ . Показано, что ядерный комплекс, обработанный DS-Na, приобретает свойство DS-Nа-независимо расщеплять ядерную ДНК. Особенности поведения комплекса топоизомераза II – ядерная ДНК могут быть связаны с участием фермента в поддержании высших уровней структурной оранизации хроматина, что приводит к модификации комплекса в условиях in vivo. Высказано предположение о наличии в клетках различных вариантов ДНК-топоизомеразного комплекса, имеющих физиологическое значение.
Досліджено властивості ДНК-топоізомеразного комплексу в препаратах ізольованих ядер. Показано, що комплекс ядерна ДНК – топоізомераза II функціонує однаково як у середовищі з Mg²⁺, так і з Ca²⁺. На відміну від комплексу за умов in vitro, ядерний ДНК-топоізомеразний комплекс, оброблений ЕДТА, сприяє не лігуванню, а підсиленню розщеплення ядерної ДНК. Залежне від ЕДТА посилене розщеплення ДНК спостерігається, коли ядра, інкубовані у середовищі з Mg²⁺ (Ca ²⁺ ) , були оброблені ЕДТА або за інкубації MgE (CaE)ядер у присутності іонів Mg²⁺. Показано, що ядерний комплекс, оброблений Ds-Na, набуває властивості Ds-Na-незалежного розщеплення ядерної ДНК. Особливості поведінки комплексу топоізомераза II – ядерна ДНК можуть бути пов'язані з участю фермента у підтримці вищих рівнів структурової організації хроматину, що призводить до модифікації комплексу за умов in vivo. Зроблено припущення про наявність в клітинах різних варіантів ДНК-топоізомеразного комплексу, що може мати фізіологічне значення.
The properties of topoisomerase II/DNA complex in nuclear preparations have been investigated. It has been shown that topoII/nuclear DNA complex functiones unitypically both in Mg ²⁺ and in Ca ²⁺-containing media. Unlike to the in vitro assay the treatment of topoII/nuclear DNA complex with EDTA resulted in increase of nuclear DNA cleavage rather than its rejoining. The nuclear topoII/DNA complex treated with SDS was found to acquire the capacity to subsequent SDS-independent nuclear DNA cleavage. The salient features of topoisomerase II/nuclear DNA complex are supposed to be due to the topoII enzyme involvement in higher level's chromatin compactization leading to the initial stabilization of topoII/nuclear DNA complex in vivo conditions. The availability in cells the different topoII/DNA complex variants of possible physiological value has been proposed. Full text: (PDF, in Russian)
ru
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Биополимеры и клетка
Структура и функции биополимеров
Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Особенности поведения ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер
Фракціонування ДНК еукаріот в пульсуючому електричному полі. Особливості поведінки ДНК-топоізомеразного комплексу в препаратах ізольованих ядер
Fractionation of eukaryotic DNA by pulsed field gel electrophoresis. The peculiarities of topoisomerase / DNA complex behaviour in isolated nuclei
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Особенности поведения ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер
spellingShingle Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Особенности поведения ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер
Соловьян, В.Т.
Андреев, И.О.
Структура и функции биополимеров
title_short Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Особенности поведения ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер
title_full Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Особенности поведения ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер
title_fullStr Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Особенности поведения ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер
title_full_unstemmed Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Особенности поведения ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер
title_sort фракционирование днк эукариот в пульсирующем электрическом поле. особенности поведения днк-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер
author Соловьян, В.Т.
Андреев, И.О.
author_facet Соловьян, В.Т.
Андреев, И.О.
topic Структура и функции биополимеров
topic_facet Структура и функции биополимеров
publishDate 1993
language Russian
container_title Биополимеры и клетка
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format Article
title_alt Фракціонування ДНК еукаріот в пульсуючому електричному полі. Особливості поведінки ДНК-топоізомеразного комплексу в препаратах ізольованих ядер
Fractionation of eukaryotic DNA by pulsed field gel electrophoresis. The peculiarities of topoisomerase / DNA complex behaviour in isolated nuclei
description зучены свойства ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер. Показано, что комплекс ядерная ДНК – топоизомераза II функционирует однотипно как в Mg2²⁺-, так и в Са2²⁺-содержащей среде. В отличие от комплекса в условиях in vitro, ядерный ДНК-топоизомеразный комплекс, обработанный ЭДТА, способствует не лигированию, а возрастанию расщепления ядерной ДНК. Зависимое от ЭДТА усиленное расщепление ДНК наблюдается в случае, если ядра, инкубируемые в Mg²⁺(Ca²⁺)- содержащей среде, были обработаны ЭДТА или при инкубации MgЭ(CaЭ)-ядep в при сутствии ионов Mg²⁺ . Показано, что ядерный комплекс, обработанный DS-Na, приобретает свойство DS-Nа-независимо расщеплять ядерную ДНК. Особенности поведения комплекса топоизомераза II – ядерная ДНК могут быть связаны с участием фермента в поддержании высших уровней структурной оранизации хроматина, что приводит к модификации комплекса в условиях in vivo. Высказано предположение о наличии в клетках различных вариантов ДНК-топоизомеразного комплекса, имеющих физиологическое значение. Досліджено властивості ДНК-топоізомеразного комплексу в препаратах ізольованих ядер. Показано, що комплекс ядерна ДНК – топоізомераза II функціонує однаково як у середовищі з Mg²⁺, так і з Ca²⁺. На відміну від комплексу за умов in vitro, ядерний ДНК-топоізомеразний комплекс, оброблений ЕДТА, сприяє не лігуванню, а підсиленню розщеплення ядерної ДНК. Залежне від ЕДТА посилене розщеплення ДНК спостерігається, коли ядра, інкубовані у середовищі з Mg²⁺ (Ca ²⁺ ) , були оброблені ЕДТА або за інкубації MgE (CaE)ядер у присутності іонів Mg²⁺. Показано, що ядерний комплекс, оброблений Ds-Na, набуває властивості Ds-Na-незалежного розщеплення ядерної ДНК. Особливості поведінки комплексу топоізомераза II – ядерна ДНК можуть бути пов'язані з участю фермента у підтримці вищих рівнів структурової організації хроматину, що призводить до модифікації комплексу за умов in vivo. Зроблено припущення про наявність в клітинах різних варіантів ДНК-топоізомеразного комплексу, що може мати фізіологічне значення. The properties of topoisomerase II/DNA complex in nuclear preparations have been investigated. It has been shown that topoII/nuclear DNA complex functiones unitypically both in Mg ²⁺ and in Ca ²⁺-containing media. Unlike to the in vitro assay the treatment of topoII/nuclear DNA complex with EDTA resulted in increase of nuclear DNA cleavage rather than its rejoining. The nuclear topoII/DNA complex treated with SDS was found to acquire the capacity to subsequent SDS-independent nuclear DNA cleavage. The salient features of topoisomerase II/nuclear DNA complex are supposed to be due to the topoII enzyme involvement in higher level's chromatin compactization leading to the initial stabilization of topoII/nuclear DNA complex in vivo conditions. The availability in cells the different topoII/DNA complex variants of possible physiological value has been proposed. Full text: (PDF, in Russian)
issn 0233-7657
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156278
citation_txt Фракционирование ДНК эукариот в пульсирующем электрическом поле. Особенности поведения ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер / В.Т. Соловьян, И.О. Андреев // Биополимеры и клетка. — 1993. — Т. 9, № 6. — С. 52-59. — Бібліогр.: 16 назв. — рос.
work_keys_str_mv AT solovʹânvt frakcionirovaniednkéukariotvpulʹsiruûŝemélektričeskompoleosobennostipovedeniâdnktopoizomeraznogokompleksavpreparatahizolirovannyhâder
AT andreevio frakcionirovaniednkéukariotvpulʹsiruûŝemélektričeskompoleosobennostipovedeniâdnktopoizomeraznogokompleksavpreparatahizolirovannyhâder
AT solovʹânvt frakcíonuvannâdnkeukaríotvpulʹsuûčomuelektričnomupolíosoblivostípovedínkidnktopoízomeraznogokompleksuvpreparatahízolʹovanihâder
AT andreevio frakcíonuvannâdnkeukaríotvpulʹsuûčomuelektričnomupolíosoblivostípovedínkidnktopoízomeraznogokompleksuvpreparatahízolʹovanihâder
AT solovʹânvt fractionationofeukaryoticdnabypulsedfieldgelelectrophoresisthepeculiaritiesoftopoisomerasednacomplexbehaviourinisolatednuclei
AT andreevio fractionationofeukaryoticdnabypulsedfieldgelelectrophoresisthepeculiaritiesoftopoisomerasednacomplexbehaviourinisolatednuclei
first_indexed 2025-11-25T23:28:46Z
last_indexed 2025-11-25T23:28:46Z
_version_ 1850581575971897344
fulltext 2. Drabkiti D. The crystallographic and optical properties of the haemoglobin of man in the comparison with those of other species//Ibid.—1946.—164.— P. 703—706. 3. Davis B. Disk elecrtophoresis. II. Method and application to human serum p o r t e i n s / / Annu. N. Y. Acad. Sci.-1964.—121, N 11.—P. 404—406. 4. Ажицкий Г. Ю., Багдасарьян С. Η. Возможность выделения мономерного иммуно химически чистого сывороточного альбумина / / Лаб. дело.—1985.— № 12.— С. 712— 714. 5. Шорохов Ю. А. Спектрофотометрический метод определения кривой диссоциации оксигемоглобина в кювете десатураторов / / Физиол. журн.—1974.—9, № 4.— С. 654—657. 6. Benesch R. E., Benesch R., Yyng S. Egnations for the spectrophotometric analysis for haemoglobin m i x t u r e s / / A n a l . Biochem.—1973.—55, N 3 .—P. 245—248 7. Аксенов С. И. Исследование динамической структуры глобулярных белков импуль- сными методами ядерного магнитного резонанса / / Молекуляр. биология.—Ί983.—• 17, No 3.—С. 475—483. 8. Вашман А. А., Пронин И. С. Ядерная магнитная релаксационная спектроскопия.'— М. : Энергоатомиздат, 1986.—232 с. 9. Иванников А. И., Абрамов В. M., Волков В. П., Завьялов В. П. Сравнительное ис- следование динамических конфирмационных свойств миеломных иммуноглобулинов G человека разных подклассов импульсным методом Я М Р / / М о л е к у л я р . биоло- гия.—1983.—17, № 4.—С. 734—740. 10. Федотов В. Д. Ядерный магнитный резонанс и внутримолекулярная подвижность •белков / / Там же.— № 3.— С. 493—504. Симферопольский гос. ун-т Получено 09.10.92 УДК 575.113/577.21 В. Т. Соловьян, И. О. Андреев ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ДНК ЭУКАРИОТ В ПУЛЬСИРУЮЩЕМ ЭЛЕКТРИЧЕСКОМ ПОЛЕ. ОСОБЕННОСТИ ПОВЕДЕНИЯ ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗНОГО КОМПЛЕКСА В ПРЕПАРАТАХ ИЗОЛИРОВАННЫХ ЯДЕР Изучены свойства ДНК-топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер. Показано, что комплекс ядерная ДНК — топоизомераза II функционирует однотипно как в Mg2+-, так и в Са2+-содержащей среде. В отличие от комплекса в условиях in vitro, ядерный ДНК-топоизомеразный комплекс, обработанный ЭДТА, способствует не лигированию, а возрастанию расщепления ядерной ДНК. Зависимое от ЭДТА усилен- ное расщепление ДНК наблюдается в случае, если ядра, инкубируемые в Mg2+(Ca2+)- содержащей среде, были обработаны ЭДТА или при инкубации MgЭ(CaЭ)-ядep в при сутствии ионов Mg2+. Показано, что ядерный комплекс, обработанный DS-Na, приобре- тает свойство DS-Nа-независимо расщеплять ядерную ДНК. Особенности поведения комплекса топоизомераза II — ядерная ДНК могут быть связаны с участием фермента в поддержании высших уровней структурной ораниза- ции хроматина, что приводит к модификации комплекса в условиях in vivo. Высказано предположение о наличии в клетках различных вариантов ДН К-топоизомеразного ком- плекса, имеющих физиологическое значение. Введение. В предыдущем сообщении [1] мы привели данные, показы- вающие, что Д Н К в клеточном ядре является составной частью ДНК- топоизомеразного комплекса. Свойства его сходны с таковыми модель- ного комплекса, описанными для системы in vitro, главное из кото- рых заключается в способности внутриядерной топоизомеразы II осу- ществлять равновесную реакцию разрыва — воссоединения ядерной Д Н К [1]. В настоящей работе мы приводим данные, касающиеся особен- ностей функционирования ядерного ДНК-топоизомеразного комплекса. Материалы и методы. Препараты интактных ядер 5-дневных про- ростков кукурузы получали, как описано ранее [3], в буфере для вы- деления, содержащем 5 мМ MgCl2 (Mg-ядра) или 5 мМ CaCl2 (Ca- © В, т. Соловьян, И. О. Андреев, 1993 56 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb ft ядра). Непосредственно перед заплавлением в агарозу к суспензии ядер добавляли ЭДТА до конечной концентрации IO1 мМ (соответствен- но Mg3- и СаЭ-ядра). Равновесное состояние между «расщепляемым» и «нерасщепляе- мым» ДНК-топоизомеразным комплексом получали, инкубируя заплав- ленные в агарозу ядра в течение 20 мин при 30 °С в инкубационном буфере (20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 20 мМ NaCl), содержащем 10 мМ Mg2+ или 10 мМ ЭДТА. В некоторых случаях в инкубационный буфер добавляли NaCl и тенипозид (VM-26) до конечных концентраций 250 мМ и 50 мкМ соответственно. После инкубации ядра обрабатывали 1 %-м DS-Na и фракциони- ровали, как описано ранее [2]. Д Н К из заплавленных в агарозу образцов ядер после фракциони- рования их импульсным гель-электрофорезом выделяли, инкубируя Рис. 1. Влияние ЭДТА на распределение дискретных фрагментов ДНК (предотвраще- ние расщепления ядерной ДНК) : а — ядра, выделенные в присутствии ионов Mg2+, ин- кубировали в течение 20 мин при 30 0C с 10 мМ Mg2+ (J) или 10 мМ ЭДТА (2), лизи- ровали и фракционировали в инвертируемом электрическом поле; б —препараты, ос- тавшиеся на старте, инкубировали 20 мин при 30 °С с 10 мМ Mg2+, обрабатывали 1 %-м DS-Na и фракционировали в 'инвертируемом поле; в — те же препараты, не об- работанные DS-Na перед вторым фракционированием; г — препараты нелизироваьшых ядер, подвергшиеся второму циклу инкубации — фракционирования в отсутствие DS- Na; д— ДНК, полученная из оставшихся на старте образцов (в) после второго цикла инкубации—фракционирования (здесь и на рис. 2—6 цифры слева — размеры фрагмен- тов в тыс. п. о.) расплавленные образцы при 55 °С в присутствии 1 %-го DS-Na и 200 мкг/мл протеиназы К с последующим анализом их с помощью обычного гель-электрофореза. Результаты и обсуждение. В предыдущем сообщении мы показа- ли, что равновесие между реакциями разрыва —воссоединения ядерной Д Н К может быть смещено в сторону разрыва при инкубации заплав- ленных в агарозу ядер в присутствии ингибитора топоизомеразы II те- нипозида. С другой стороны, инкубация ядер в среде с NaCl смещает установившееся равновесие в сторону лигирования ядерной Д Н К [1]. Подобно NaCl, инкубация ядер с ЭДТА также приводит к умень- шению дискретного расщепления ядерной Д Н К [1]. Однако влияние ЭДТА на ядерный ДНК-топоизомеразный комплекс гораздо более сложно. Как было показано ранее, инкубация Mg-ядер как в присутствии ионов Mg2+, так и ЭДТА, в отличие от Са-ядер, не вызывает выхода в гель фрагментов Д Н К до тех пор, пока ядра не обработаны лизи- рующими агентами [1, 2]. Обработка ядер DS-Na приводит к переходу в гель типичного набора фрагментов Д Н К [1, 2]. При этом инкубация ядер в присутствии ЭДТА изменяет качественный и количественный состав фрагментов ДНК, увеличивая долю крупных фрагментов и уменьшая количество ДНК, входящее в гель (рис. 1, а). Повторное фракционирование оставшихся па старте образцов пос- ле реинкубации их в присутствии ионов Mg2 + снова приводит к рас- пределению в гель ДНК-фрагментов, причем лизирующие агенты уже 56 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb ft не являются необходимым условием для их появления (рис. 1, в) . При этом общее количество ДНК, полученное ИЗ MgS-HAep при повторном фракционировании, значительно превышает таковое из Mg-ядер даже после двух циклов инкубации — фракционирования (рис. 1). Представ- ленные данные показывают, что ЭДТА подавляет дискретное расщеп- ление ядерной Д Н К . Это проявляется как в сохранении крупных Д Н К - фрагм<ептов, так и в уменьшении количества Д Н К , переходящей в гель. Рис. L'. Влияние тенипозида (VM-26) на распределение дискретных фрагментов Д Н К в М^Э-ядрах: а — ядра, полученные в присутствии ионов Mg2+, обрабатывали ЭДТА, инкубировали в течение 20 мин при 30 °С с 10 мМ ЭДТ;А без ( / ) и с тенипозидом (2), лизировали и фракционировали в инвертируемом электрическом поле; б — образцы, оставшиеся на старте, инкубировали 20 мин при 30 °С с 10 мМ Mg2+ и фракционирова- ли в инвертируемом электрическом поле Рис. 3. Влияние ЭДТА на распределение дискретных фрагментов Д Н К (увеличение рас- щепления ядерной ДНК) . Ядра, выделенные в присутствии ионов Mg2+ инкубировали в буфере, содержащем 10 мМ Mg2+, на холоду (1) и при 30°С (2, 3). После инкуба- ции ядра обрабатывали 20 мМ ЭДТА (.3), лизировали и фракционировали, как описано в тексте. Здесь и на рис. 4—6 верхняя и нижняя панели — ДНК, полученная из ядер и оставшаяся на старте соответственно Появление набора ДНК-фрагментов при повторном фракциониро- вании в отсутствие белок-денатурирующих агентов свидетельствует о том., что сохранение на старте Д Н К не является следствием неполного лизиса ядер, а вновь появляющиеся фрагменты представляют собой результат повторного расщепления оставшейся на старте Д Н К . Инте- ресной особенностью этого расщепления является то, что из Mg3-o6- разцов выделяются преимущественно крупные фрагменты Д Н К , не- смотря на отсутствие ЭДТА при повторном цикле инкубации — фрак- ционирования. Это справедливо также и для образцов СаЭ-ядер, ко- торые продуцируют крупные фрагменты Д Н К при повторном цикле инкубации — фракционирования в отсутствие ЭДТА [1]. Обработка MgS-HAep тенипозидом не устраняет эффекта ЭДТА, однако влияет на распределение дискретных фрагментов Д Н К при повторном фракцио- нировании оставшихся на старте образцов, приводя к распаду крупных фрагментов на мелкие (рис. 2). Представленные данные показывают, что обработка Mg-ядер ЭДТА уменьшает не только дискретное расщепление Д Н К в ядрах, но и в оставшихся на старте образцах даже при инкубации их в отсутст- вие ЭДТА. Крупные фрагменты, являющиеся мажорным типом фраг- ментов при повторном фракционировании Mg9-o6pa3uoB, способны, 56 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb ft тем не менее, распадаться до мелких при условии, если интактные •ядра прежде были обработаны ингибиторами топоизомеразы II. Уменьшения дискретного расщепления ядерной ДНК, опосредуе- мого ЭДТА, не наблюдается, если ядра были обработаны ЭДТА после инкубации их в присутствии ионов Mg2+. Наоборот, в этих условиях ЭДТА стимулирует фрагмента- цию ядерной Д Н К (рис. 3). По сравнению с Mg-ядрами в А^Э-ядрах зависимое от ЭДТА усиление фрагментации ядерной Д Н К гораздо более выраженно (рис. 4). Оно наблюдается при инкубации М^Э-ядер в присутст- Pnc., 4. Зависимое от ЭДТА усиление рас- щепления Д Н К в Mg- и M g S ' ^ p a x . Яд- ра выделяли в присутствии 5 мМ Mg2+ (1) и обрабатывали 5 мМ ЭДТА (2). Образцы инкубировали на холоду (а) с 10 мМ Mg2+ (1) или 10 мМ ЭДТА (2)\ а также при 30 0C (б, в) с 10 мМ Mg2+. После инкубации ядра обрабатывали 20 мМ ЭДТА (в), лизировали и фракци- онировали в инвертируемом электриче- ском ноле вии ионов Mg2+ (рис. 4, б) и наиболее отчетливо проявляется в тех же ядрах при повторной обработке их ЭДТА вслед за инкубацией в Mg2+- содержащем буфере (рис. 4, в). Из данных, представленных на рис. 5, следует, что определяемое ЭДТА увеличение деградации Д Н К сопровождается утратой способ- Рис. 5. Влияние NaCl на распределение дискретных фрагментов Д Н К в Mg- (а, б) и MgS- (в) ядрах. Условия инкубации (длительность каждого этапа 10 мин)· ) 7 — 0°С, 10 мМ MgCl2; 2, 8 — 30 °С, 10 мМ MgCl2; 3, 9 — то же что 2 + 2 5 0 мМ NaCl; 4— 30 °С, 10 мМ M g C l 2 + 1 0 мМ ЭДТА; 5 — т о же, что 4 + 2 5 0 'мМ NaCl; 6 — то же, что 5 + 2 0 мМ MgCl2 . После инкубации образцы ядер обрабатывали 1 %-м DS-Na и фрак- ционировали в инвертируемом электрическом поле ности ДНК-топоизомеразного комплекса осуществлять лигирование расщепленной ДНК, стимулируемое NaCl. Все эти результаты показывают, что ЭДТА способен не только уменьшать, но и усиливать дискретную фрагментацию ядерной ДНК,. Опосредуемое ЭДТА усиление деградации Д Н К наблюдается в случа- 56 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb ft ях, когда ЭДТА добавляли после инкубации Mg- или Mg3-HAep б Mg2+-COAep^KanjeM буфере, или при последующей инкубации Mg3-H^ep в присутствии ионов Mg2+ Аналогичные эффекты обнаружены также на модели Са-ядер (рис. 6). Как и в случае Mg-ядер, усиление дискретной фрагментации ядерной Д Н К отмечено при обработке Са-ядер ЭДТА после инкуба- ции их в среде с ионами Ca2+ (или Mg2+), а также при инкубации СаЭ-ядер в присутствии ионов Mg2+ (см. рис. 6). Из вышеизложенного следует, что эффект ЭДТА на препараты Mg- и Са-ядер однотипен и сводится к усилению фрагментации ядерной Д Н К после инкубации их в присутствии ионов Mg2+. Рис. 6. Зависимое от ЭДТА усиление расщепления Д Н К в Ca- и СаЭ-ядрах: а — о б р а з ц ы Ca- (У) и СаЭ- (2) ядер инкубировали в присутствии ионов Ca2+ (1) или ЭДТА (2) на холоду (0°С); б — те же образцы инкубировали в течение 10 мин при 30 °С с 5 мМ CaCl2 (1) или 5 мМ ЭДТА (2). После инкубации ионы Ca 2 + замещали на 5 мМ ЭДТА (3) и продолжали инкуба- цию еще 10 мин; в — образцы Ca- ( / ) и СаЭ- (2) ядер инкубировали 10 мин при 30 0C в присутствии 10 мМ MgCI2. Затем ядра обрабатывали 1 %-м DS- Na и фракционировали в инвертируемом электрическом поле Данные, представленные нами, свидетельствуют о том, что пове- дение ДНК-топоизомеразного комплекса, функционирующего в ядрах, имеет особенности, отличающие его от такового, функционирующего in vitro. Одна из них связана с влиянием ЭДТА на равновесную реак- цию разрыва — воссоединения, катализируемую топоизомеразой II. Как было показано в опытах in vitro, понижение температуры ре- акции или обработка комплекса ЭДТА приводит к лигированих рас- щепленной Д Н К и диссоциации ДНК-топоизомеразного комплекса [4—6]. Это, однако, справедливо для комплексов, функционирующих в Mg2+-coдeρжaщeй реакционной среде. В присутствии ионов Ca2+ до- бавление ЭДТА вызывает не лигирование, а стабиилизацию Д Н К - топоизомеразного комплекса в расщепленном состоянии, что приводит к появлению двуцепочечных разрывов Д Н К в отсутствие DS-Na [6]. Такой комплекс остается способным к дальнейшему функционирова- нию и при последующем добавлении ионов Mg2+ может осуществлять лигирование расщепленной Д Н К [6, 7]. В отличие от системы in vitro инкубация образцов ядер с ЭДТА не устраняет DS-Na-зависимого расщепления Д Н К (см. рис. 1). Это означает, что обработка препаратов ядер ЭДТА (равно как и пони- жение температуры инкубации, рис. 3) не вызывает диссоциации Д Н К - топоизомеразного комплекса. Нам не удалось предотвратить DS-Na- зависимое расщепление Д Н К даже в Э-ядрах (т. е. в ядрах, выделен- ных в присутствии ЭДТА). Таким образом, неспособность к диссоциа- ции в присутствии ЭДТА представляет собой первую особенность ДНК- топоизомеразного комплекса в препаратах изолированных ядер. Вторая особенность ядерного ДНК-топоизомеразного комплекса связана с его однотипным поведением в Mg2+- и в Са2+-содержащей среде. Как видно, инкубация ядер с ЭДТА в обоих случаях уменьшает количество расщепленной Д Н К . Однако количественный и качествен- ный состав фрагментов Д Н К , полученных при инкубации Mg(Ca)-HAep в присутствии ЭДТА на холоду, практически не отличается от тако- 56 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb ft вого, выделенного из Mg (Ca)-ядер на холоду в отсутствие ЭДТА (рис. 4, а\ 6, а). Эти данные означают, что уменьшение количества расщепленной ядерной Д Н К при инкубации ядер с ЭДТА не связано с лигированием расщепленной ДНК. Вероятней всего, эффект ЭДТА обусловлен ингибированием реакции расщепления вследствие отсутст- вия ионов Mg2+ в реакционной среде. В то же время подавления рас- щепления ядерной Д Н К не происходит, если M g ( C a ) ^ p a обрабаты- вали ЭДТА после инкубации их в буфере для расщепления. В отличие от системы in vitro ЭДТА в этих условиях стимулирует фрагментацию ядерной ДНК, причем как в Mg2+-, так и в Са2+-содержащей среде (см. рис. 3, 6). Опосредуемое ЭДТА усиление фрагментации ядерной Д Н К наблюдается также и при последующей инкубации M g 3 ( C a 3 ) - ядер в присутствии ионов Mg2+ (см. рис. 4, 6). В обоих вариантах зависимое от ЭДТА усиление фрагментации ядерной Д Н К может быть объяснено модификацией ЭДТА ДНК-топоизомеразного комплекса, приводящей к неспособности топоизомеразы II эффективно осуществ- лять равновесный цикл разрыва — воссоединения. Вследствие этого, возможно, реакция расщепления становится превалирующей. Это пред- положение подтверждается тем фактом, что ядерный ДНК-топоизо- меразный комплекс, обработанный ЭДТА, теряет способность к лиги- рованию расщепленной Д Н К в присутствии NaCl (рис. 5). Таким образом, в отличие от системы in vitro обработка ядерного ДНК-топоизомеразного комплекса ЭДТА приводит не к лигированию расщепленной ДНК, а к модификации свойств комплекса, способствую- щей более эффективному расщеплению ядерной ДНК. Следующая особенность функционирующего ДНК-топоизомеразно- го комплекса в ядрах связана с приобретенной способностью произво- дить DS-Na-независимые разрывы Д Н К после того, как комплекс обработан DS-Na. Действительно, появление фрагментов Д Н К при повторном фракционировании оставшихся на старте образцов, наблю- даемое в отсутствие белок-денатурирующих агентов (см. рис. 1), ясно показывает, что вновь образующиеся фрагменты представляют собой результат повторного расщепления оставшейся на старте ДНК, а не являются следствием неполного лизиса ядер. Вызывает удивление, но тем не менее кажется правдоподобным то обстоятельство, что в ядрах ДНК-топоизомеразный комплекс не утрачивает способности к дальнейшему расщеплению Д Н К даже после его обработки DS-Na. Создается впечатление, что DS-Na, подобно ЭДТА, способен модифицировать комплекс топоизомераза II — не- расщепленная ДНК, придавая ему способность к дальней- шей фрагментации ядерной Д Н К DS-Na-независимым способом (см. рис. 1). Особенности функционирования ДНК-топоизомеразного комплек- са, обсуждаемые выше, очевидно, связаны с тем, что топоизомераза II, как полагают, может выполнять в клетке не только каталитическую, но и структурную роль [8—11], принимая участие в прикреплении ядерной Д Н К к скелетным образованиям интерфазного ядра и мета- фазных хромосом [12—16]. Из этого следует, что ДНК-топоизомераз- ный комплекс в клеточном ядре должен существовать постоянно, пред- ставляя собой основу для высших уровней компактизации хроматина. С такой точки зрения он изначально «уловлен», и различные агенты, такие, например, как ЭДТА, способны лишь стабилизировать его, но не вызывать диссоциации. Стабилизация комплекса, в свою очередь, нарушает устанавливаемое равновесие между расщепляемыми и нерас- щепляемыми состояниями, вызывая усиление DS-Na-зависимой фраг- ментации ядерной ДНК. В пользу того, что по меньшей мере часть ДНК-топоизомеразпых комплексов в ядрах действительно является изначально «стабилизи- рованной», свидетельствует факт появления типичного набора дискрет- ных фрагментов Д Н К при обработке ядер не только DS-Na, но и про- теиназой К при полном отсутствии белок-денатурирующих агентов 56 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb ft (см. [2]). Подобное явление отмечено для «стабилизированных» (trap- ped) ДНК-топоизомеразных комплексов in vitro [6]. Приведенные данные показывают, что в отличие от системы in vitro обработка комплекса топоизомераза I I — я д е р н а я Д Н К ЭДТА приводит к модификации его свойств, выражающейся в нарушении равновесного цикла разрыва — воссоединения ДНК. Это обстоятель- ство позволяет высказать предположение о том, что в условиях in vivo могут существовать различные варианты ДНК-топоизомеразного ком- плекса, отличающиеся по способности осуществлять равновесную реакцию разрыва — воссоединения. На это указывают также обнару- женные нами резкие отличия в поведении DS-Na-независимых и DS- Кта-зависимых продуктов расщепления в Са-ядрах, демонстрирующие неспособность последних лигировать расщепленную Д Н К в условиях, при которых лигирование DS-Na-независимого продукта расщепления происходит (рис. 6, предыдущее сообщение). Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что функциониро- вание ДНК-топоизомеразного комплекса в ядрах имеет свои особен- ности, отличающие его от комплекса в условиях in vitro. Вероятно, эти различия связаны со структурной ролью топоизомеразы II, кото- рая вместе с другими белками формирует основу для прикрепления петель Д Н К к ядерному матриксу [12—16], что изначально сказыва- ется на свойствах ДНК-топоизомеразного комплекса. Способность ядерной топоизомеразы II с различной эффективностью осуществлять равновесный цикл расщепления — воссоединения Д Н К свидетельствует о многообразии взаимодействий фермента с ядерной ДНК, выражаю- щемся в существовании различных вариантов комплекса Д Н К — то- поизомераза. Не исключено, что вариации во взаимодействии топоизо- меразы II и ядерной ДНК, ведущие к модификации равновесного цик- ла разрыва — воссоединения ядерной ДНК, могут иметь физиологи- ческое значение, которое еще предстоит выяснить. Р е з ю м е . Досліджено властивості ДНК-топоізомеразного комплексу в препаратах ізольованих ядер. Показано, що комплекс ядерна Д Н К — топоізомераза II функціонує однаково як у середовищі з Mg 2 +, так і з Ca2+. На відміну від комплексу за умов in Vitro, ядерний ДНК-топоізомеразний комплекс, оброблений ЕДТА, сприяє не лігуван- ню, а підсиленню розщеплення ядерної Д Н К . Залежне від ЕДТА посилене розщеплен- ня Д Н К спостерігається, коли ядра, інкубовані у середовищі з M g 2 + ( C a 2 + ) , були об- роблені ЕДТА або за інкубації M g E (CaE)ядер у присутності іонів Mg 2 +. Показано, що ядерний комплекс, оброблений Ds-Na, набуває властивості Ds-Na-незалежного роз- щеплення ядерної Д Н К . Особливості поведінки комплексу топоізомераза II — ядерна Д Н К можуть бути пов'язані з участю фермента у підтримці вищих рівнів структурової організації хрома- тину, що призводить до модифікації комплексу за умов in vivo. Зроблено припущення про наявність в клітинах різних варіантів ДНК-топоізомеразного комплексу, що може мати фізіологічне значення. S u m m a r y . The properties of topoisomerase I I / D N A complex in nuclear prepara- t ions have been invest igated. It ha s been shown tha t t opo l l / nuc l ea r DNA complex funct iones unitypically both in M g + + - and in C a + + - c o n t a i n i n g media. Unlike to the in vitro assay the t rea tment of t o p o l l / n u c l e a r DNA complex with EDTA resulted in increase of nuclear DNA cleavage ra ther than its re joining. The nuclear t opo I I /DNA complex treated with SDS was found to acquire the capaci ty to subsequent SDS-independent nuclear DNA cleavage. The salient fea tures of topoisomerase I I /nuc lea r DNA complex are supposed to be due to the topo l l enzyme involvement in higher levels chromatin compactizat ion leading to the initial s tabi l izat ion of t o p o l l / n u c l e a r DNA complex in vivo conditions. The availabil i ty in cells the different t o p o I I / D N A complex var ian ts of possible phy- siological value has been proposed. 56 ISSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. Nb ft СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Соловьян В. Т., Андреев И. О., Кунах В. А. Фракционирование Д Н К эукариот в пульсирующем электрическом поле. 1. Ядерная Д'НК как составная часть ДНК- топоизомеразного комплекса.— //Биополимеры и клетка.— 1993.— 9, № 5.— С. 44. 2. Соловьян В. Т., Кунах В. А. Фракционирование Д Н К эукариот в пульсирующем электрическом поле. Обнаружение и свойства дискретных фрагментов Д Н К / / Молекуляр. биология.—1991.-25, № 4.—С. 1071—4079. 3. Соловьян В. Т., Андреев И. О., Кунах В. А. Фракционирование Д Н К эукариот в пульсирующем электрическом поле. 2. Дискретные фрагменты Д Н К и уровни структурной организации хроматина / /Там же.— № 6.— С. 43—51. 4. Sander M., Hsieh T.-S. Double-strand DNA cleavage by type II DNA topoisomerase from Drosophila melanogaster / / J. Biol. Chem.—1983.—258.—P. 8421—8428. 5. Liu L. F., Rowe T. C., Yang L. et al. Cleavage of DNA by mammalian DNA topo- isomerase I I / / I b i d . — P . 15365—15370. f>. Osheroff N., Zechiedrich E. L. Calcium-promoted DNA cleavage by eukaryotic topo- isomerase II: trapping the covalent enzyme-DNA согцріех in an active f o r m / / B i o - chemistry.—1987,—26,—P. 4303—4309. /. Osheroff N. Effect of antineoplastic agents on the DNA cleavage religation reaction of eukarvotic topoisomerase II: inhibition of DNA religation by e toposide/ / Ib id .— 1989,—28,—P. 6157—6160. 8. Earnshaw W. C., Heck M. M. S. Localization of topoisomerase II in mitotic chromo- s o m e s / / J . Cell. Biol.—1985.—100.—P. 1716—1725. 9 Gasser S. M., Laemmli U. K. The organization of chromatin loops: characterization of a scaffold attachment s i t e / /EMBO J.— 1986.—5,—P. 511—518. 10. Berrios M., Osheroff N., Fisher P. A. In situ localization of DNA topoisomerase II, a major polypeptide component of Drosophila nuclear matrix fraction / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1985—82,—P. 4142—4146. Π Cockerill P. N., Garrard W. T. Chromosomal loop anchorage of the kappa immunoglo- bulin gene occurs next to the enhancer in a region containing topoisomerase II si- tes / / Cell.—1986,—44,— P. 273—283. 12 Eartishaw W. C., Halligan B., Cooke L. A. et al. Topoisomerase II is a structural com- ponent of mitotic chromosome scaffolds // J. Cell. Biol.— 1985.— 100.— P. 1706. 13. Uetnura T., Ohkura H., Adachi Y. et al. DNA topoisomerase II is required for conden- sation and segregation of mitotic chromosomes in 5. pombe / / Cell.—1987.—50.— P. 917—925. 14. Newport J. Nuclear reconstitiition in vitro: stages of assembly arround protein-free DNA/ / Ib id .—48.—P. 205—217. 15 Sperry A. O., Blasquez V. C., Garrard W. T, Disfunction of chromosomal loop attach- ment sites: Illegitimate recombination linked to matrix association region and topo- isomerase II / / Proc. Nat1. Acad. Sci. USA.—1989.—86.—P. 5497—5501. 10. Adachi Y., Kas E., Laemmli U. K. Preferential, cooperative binding of DNA topoiso- merase II to scaffold-associate reg ions / /EMBO J — 1989 — 8, N 13 — P . 3997—4006. И Η-τ молекуляр. биологии и генетики АН Украины, Киев Получено 11.12.92 УДК 535.34:615.015 А. Е. Болдескул, А. Н. Величко ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУР СТРУКТУРНО-ФАЗОВЫХ ПЕРЕСТРОЕК В МОДЕЛЬНЫХ И БИОМЕМБРАНАХ ПО СПЕКТРАЛЬНЫМ ХАРАКТЕРИСТИКАМ МЕРОЦИАНИНА 540 Изучены спектры поглощения и флюоресценции цианинового красителя мероцианина 540 (М540) в органических растворителях, липосомах из различных классов липидов, в микросомах печени крыс и эритроцитах. Показано, что наряду с известным способом определения температур фазовых переходов Tn по спектрам поглощения M540 воз- можно определение этого показателя по изменению квантового выхода мономеров, причем предлагаемый метод является более простым. Проведено сопоставление обоих методов. Введение. Среди структурных перестроек биомембран различной при- роды, вызываемых множеством физико-химических факторов, термо- индуцированные структурно-фазовые переходы являются наиболее неблагоприятными, а иногда и гибельными для организма [1]. Изу- чение механизмов переходов и динамической структуры бислоя воз- © А. Е. Болдескул, А. Н. Величко, 1993 3SS-N 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1993. Т. 9. № 6 59

Similar Items