Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus
Цель. Клонирование и секвенирование лейцил-тРНК синтетазы T. thermophilus (ЛейРСТТ) с последующим созданием генно-инженерной конструкции для экспрессии белка в клетках E. coli и его выделение. Методы. Поиск гена ЛейРСТТ проводили методом Саузерн-блот-гибридизации с хромосомной ДНК, где в качестве...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Вiopolymers and Cell |
|---|---|
| Дата: | 2011 |
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2011
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156339 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus / А.Д. Яремчук, О.П. Коваленко, О.И. Гудзера, М.А. Тукало // Вiopolymers and Cell. — 2011. — Т. 27, № 6. — С. 436-441. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156339 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Яремчук, А.Д. Коваленко, О.П. Гудзера, О.И. Тукало, М.А. 2019-06-18T11:44:39Z 2019-06-18T11:44:39Z 2011 Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus / А.Д. Яремчук, О.П. Коваленко, О.И. Гудзера, М.А. Тукало // Вiopolymers and Cell. — 2011. — Т. 27, № 6. — С. 436-441. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000114 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156339 577.217 Цель. Клонирование и секвенирование лейцил-тРНК синтетазы T. thermophilus (ЛейРСТТ) с последующим созданием генно-инженерной конструкции для экспрессии белка в клетках E. coli и его выделение. Методы. Поиск гена ЛейРСТТ проводили методом Саузерн-блот-гибридизации с хромосомной ДНК, где в качестве зондов использованы меченные дигоксигенином ПЦР-фрагменты ДНК. Результаты. Ген ЛейРС из клеток T. thermophilus HB27 клонирован и секвенирован. Открытая рамка считывания кодирует полипептид длиной 878 аминокислотных остатков (молекулярная масса 101 кДа). Сравнение аминокислотной последовательности ЛейРСТТ с таковыми гомологичных ферментов из других организмов показало, что она входит в группу аналогичных ферментов прокариотов, образуемую белками протобактерий, риккетсий, а также митохондрий эукариотов. Полученное филогенетическое древо Лей РС демонстрирует дихотомическое разветвление на две линии: прокариото/митохондриально-эукариотические и архейно/цитоплазмо-эукариотические белки. Отличия между прокариотической и архейной ветвями филогенетического древа ЛейРС в первую очередь связаны со структурой двух доменов фермента – корректирующего и С-концевого. Для экспрессии гена ЛейРСТТ в клетках E. coli соответствующий ген клонирован в экспресирующий вектор pET29b. Выводы. Клонированный ген leuS T. thermophilus и экспрессирующийся рекомбинантный белок будут использованы для структурно-функциональных исследований ЛейРСТТ, включая рентгеноструктурный анализ фермента и его мутантных форм в комплексе с различными субстратами. Ключевые слова: аминоацил-тРНК синтетазы, лейцил-тРНК синтетаза Thermus thermophilus, филогенетическое древо. Мета. Клонування і секвенування лейцил-тРНК синтетази T. thermophilus (ЛейРСТТ) з наступним створенням генно-інженерної конструкції для експресії білка в клітинах E. coli та його виділення. Методи. Пошук гена ЛейРСТТ проводили методом Саузернблот-гібридизації з хромосомною ДНК, зондами слугували мічені дигоксигеніном ПЦР-фрагменти ДНК. Результати. Ген ЛейРС з клітин T. thermophilus HB27 клоновано і секвеновано. Відкрита рамка зчитування кодує поліпептид довжиною 878 амінокислотних залишків (молекулярна маса 101 кДа). Порівняння амінокислотної послідовності ЛейРСТТ з послідовностями гомологічних ферментів з інших організмів показало, що вона входить до групи аналогічних ферментів прокаріотів, c сформованої білками протобактерий, риккетсій, а також мітохондрій еукаріотів. Одержане філогенетичне дерево ЛейРС демонструє дихотомічне розгалуження на дві лінії: прокаріото/мітохондріально-еукаріотичні і архейно/цитоплазмо-еукаріотичні білки. Розбіжності між прокаріотичною і архейною гілками філогенетичного дерева Лей РС у першу чергу пов’язані зі структурою двох доменів ферменту – коректуючого і С-кінцевого. Для експресії гена ЛейРСТТ у клітинах E. coli відповідний ген клоновано в експресуючий вектор pET29b. Висновки. Клонований ген leuS T. thermophilus і рекомбінантний білок, який експресується, будуть використані для структурно-функціональних досліджень ЛейРСТТ, включаючи рентгеноструктурний аналіз ферменту і його мутантних форм у комплексі з різними субстратами. Ключові слова: аміноацил-тРНК синтетази, лейцил-тРНК синтетаза Thermus thermophilus, філогенетичне дерево. Aim. Cloning and sequencing of the T. thermophilus leucyl-tRNA synthetase (LeuRSTT) followed by the creation of genetically engineered construct for protein expression in E.coli cells and its purification. Methods. Searching for the LeuRSTT gene was performed by Southern blot hybridization with chromosomal DNA, where digoxigenin-labeled PCR fragments of DNA were used as probes. Results. The gene of T. thermophilus HB27 leucyl-tRNA synthetase was cloned and sequenced. The open reading frame encodes a polypeptide chain of 878 aminoacid residues in length (molecular mass 101 kDa). Comparison of the amino acid sequence of T. thermophilus LeuRS with that of the enzymesfrom other organismsshowed that LeuRSTT was a part of the group of similar enzymes of prokaryotes, formed by the proteins of protobacteriae, rickettsia and mitochondria of eukaryotes. The resulting phylogenetic tree of LeuRSs reveals dichotomous branching into two lines: prokaryotic/eukaryotic mitochondrial and arhaeal/eukaryotic cytosolic proteins. Differences between prokaryotic and arhaeal branches of the LeuRSs phylogenetic tree are primarily due to the structure of two domains of the enzyme – the editing and the C-terminal. T. thermophilus LeuRS was expressed in E. coli cells by cloning the corresponding gene into pET29b vector. Conclusions. The cloned T. thermophilusleuS gene and expressed recombinant protein will be used for structural and functional studies on LeuRSTT, including X-ray analysis of the enzyme and its mutant forms in complex with different substrates. Keywords: aminoacyl-tRNA synthetases, leucyl-tRNA synthetase Thermus thermophilus, phylogenetic tree. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Вiopolymers and Cell Structure and Function of Biopolymers Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus Молекулярне клонування, секвенування і експресія в клітинах Escherichia coli лейцил-тРНК синтетази Thermus thermophilus Molecular cloning, sequencing and expression in Escherichia coli cells Thermus thermophilus leucyl-tRNA synthetase Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus |
| spellingShingle |
Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus Яремчук, А.Д. Коваленко, О.П. Гудзера, О.И. Тукало, М.А. Structure and Function of Biopolymers |
| title_short |
Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus |
| title_full |
Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus |
| title_fullStr |
Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus |
| title_full_unstemmed |
Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus |
| title_sort |
молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках escherichia coli лейцил-трнк синтетазы thermus thermophilus |
| author |
Яремчук, А.Д. Коваленко, О.П. Гудзера, О.И. Тукало, М.А. |
| author_facet |
Яремчук, А.Д. Коваленко, О.П. Гудзера, О.И. Тукало, М.А. |
| topic |
Structure and Function of Biopolymers |
| topic_facet |
Structure and Function of Biopolymers |
| publishDate |
2011 |
| language |
Russian |
| container_title |
Вiopolymers and Cell |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Молекулярне клонування, секвенування і експресія в клітинах Escherichia coli лейцил-тРНК синтетази Thermus thermophilus Molecular cloning, sequencing and expression in Escherichia coli cells Thermus thermophilus leucyl-tRNA synthetase |
| description |
Цель. Клонирование и секвенирование лейцил-тРНК синтетазы T. thermophilus (ЛейРСТТ) с последующим созданием генно-инженерной конструкции для экспрессии белка в клетках E. coli и его выделение.
Методы. Поиск гена ЛейРСТТ проводили методом Саузерн-блот-гибридизации с хромосомной ДНК,
где в качестве зондов использованы меченные дигоксигенином ПЦР-фрагменты ДНК. Результаты. Ген
ЛейРС из клеток T. thermophilus HB27 клонирован и секвенирован. Открытая рамка считывания кодирует полипептид длиной 878 аминокислотных остатков (молекулярная масса 101 кДа). Сравнение аминокислотной последовательности ЛейРСТТ с таковыми гомологичных ферментов из других организмов показало, что она входит в группу аналогичных ферментов прокариотов, образуемую белками протобактерий, риккетсий, а также митохондрий эукариотов. Полученное филогенетическое древо Лей
РС демонстрирует дихотомическое разветвление на две линии: прокариото/митохондриально-эукариотические и архейно/цитоплазмо-эукариотические белки. Отличия между прокариотической и архейной
ветвями филогенетического древа ЛейРС в первую очередь связаны со структурой двух доменов фермента – корректирующего и С-концевого. Для экспрессии гена ЛейРСТТ в клетках E. coli соответствующий ген клонирован в экспресирующий вектор pET29b. Выводы. Клонированный ген leuS T. thermophilus и экспрессирующийся рекомбинантный белок будут использованы для структурно-функциональных исследований ЛейРСТТ, включая рентгеноструктурный анализ фермента и его мутантных форм в
комплексе с различными субстратами.
Ключевые слова: аминоацил-тРНК синтетазы, лейцил-тРНК синтетаза Thermus thermophilus, филогенетическое древо.
Мета. Клонування і секвенування лейцил-тРНК синтетази T. thermophilus (ЛейРСТТ) з наступним створенням генно-інженерної
конструкції для експресії білка в клітинах E. coli та його виділення. Методи. Пошук гена ЛейРСТТ проводили методом Саузернблот-гібридизації з хромосомною ДНК, зондами слугували мічені
дигоксигеніном ПЦР-фрагменти ДНК. Результати. Ген ЛейРС з
клітин T. thermophilus HB27 клоновано і секвеновано. Відкрита
рамка зчитування кодує поліпептид довжиною 878 амінокислотних залишків (молекулярна маса 101 кДа). Порівняння амінокислотної послідовності ЛейРСТТ з послідовностями гомологічних
ферментів з інших організмів показало, що вона входить до групи
аналогічних ферментів прокаріотів, c сформованої білками протобактерий, риккетсій, а також мітохондрій еукаріотів. Одержане філогенетичне дерево ЛейРС демонструє дихотомічне розгалуження на дві лінії: прокаріото/мітохондріально-еукаріотичні і архейно/цитоплазмо-еукаріотичні білки. Розбіжності між
прокаріотичною і архейною гілками філогенетичного дерева Лей
РС у першу чергу пов’язані зі структурою двох доменів ферменту – коректуючого і С-кінцевого. Для експресії гена ЛейРСТТ у
клітинах E. coli відповідний ген клоновано в експресуючий вектор
pET29b. Висновки. Клонований ген leuS T. thermophilus і рекомбінантний білок, який експресується, будуть використані для
структурно-функціональних досліджень ЛейРСТТ, включаючи
рентгеноструктурний аналіз ферменту і його мутантних форм у
комплексі з різними субстратами.
Ключові слова: аміноацил-тРНК синтетази, лейцил-тРНК
синтетаза Thermus thermophilus, філогенетичне дерево.
Aim. Cloning and sequencing of the T. thermophilus leucyl-tRNA synthetase (LeuRSTT) followed by the creation of genetically engineered
construct for protein expression in E.coli cells and its purification.
Methods. Searching for the LeuRSTT gene was performed by Southern
blot hybridization with chromosomal DNA, where digoxigenin-labeled PCR fragments of DNA were used as probes. Results. The gene of
T. thermophilus HB27 leucyl-tRNA synthetase was cloned and sequenced. The open reading frame encodes a polypeptide chain of 878 aminoacid residues in length (molecular mass 101 kDa). Comparison of the
amino acid sequence of T. thermophilus LeuRS with that of the enzymesfrom other organismsshowed that LeuRSTT was a part of the group
of similar enzymes of prokaryotes, formed by the proteins of protobacteriae, rickettsia and mitochondria of eukaryotes. The resulting phylogenetic tree of LeuRSs reveals dichotomous branching into two lines:
prokaryotic/eukaryotic mitochondrial and arhaeal/eukaryotic cytosolic proteins. Differences between prokaryotic and arhaeal branches of
the LeuRSs phylogenetic tree are primarily due to the structure of two
domains of the enzyme – the editing and the C-terminal. T. thermophilus
LeuRS was expressed in E. coli cells by cloning the corresponding gene
into pET29b vector. Conclusions. The cloned T. thermophilusleuS gene
and expressed recombinant protein will be used for structural and
functional studies on LeuRSTT, including X-ray analysis of the enzyme
and its mutant forms in complex with different substrates.
Keywords: aminoacyl-tRNA synthetases, leucyl-tRNA synthetase
Thermus thermophilus, phylogenetic tree.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156339 |
| citation_txt |
Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus / А.Д. Яремчук, О.П. Коваленко, О.И. Гудзера, М.А. Тукало // Вiopolymers and Cell. — 2011. — Т. 27, № 6. — С. 436-441. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT âremčukad molekulârnoeklonirovaniesekvenirovanieiékspressiâvkletkahescherichiacolileiciltrnksintetazythermusthermophilus AT kovalenkoop molekulârnoeklonirovaniesekvenirovanieiékspressiâvkletkahescherichiacolileiciltrnksintetazythermusthermophilus AT gudzeraoi molekulârnoeklonirovaniesekvenirovanieiékspressiâvkletkahescherichiacolileiciltrnksintetazythermusthermophilus AT tukaloma molekulârnoeklonirovaniesekvenirovanieiékspressiâvkletkahescherichiacolileiciltrnksintetazythermusthermophilus AT âremčukad molekulârneklonuvannâsekvenuvannâíekspresíâvklítinahescherichiacolileiciltrnksintetazithermusthermophilus AT kovalenkoop molekulârneklonuvannâsekvenuvannâíekspresíâvklítinahescherichiacolileiciltrnksintetazithermusthermophilus AT gudzeraoi molekulârneklonuvannâsekvenuvannâíekspresíâvklítinahescherichiacolileiciltrnksintetazithermusthermophilus AT tukaloma molekulârneklonuvannâsekvenuvannâíekspresíâvklítinahescherichiacolileiciltrnksintetazithermusthermophilus AT âremčukad molecularcloningsequencingandexpressioninescherichiacolicellsthermusthermophilusleucyltrnasynthetase AT kovalenkoop molecularcloningsequencingandexpressioninescherichiacolicellsthermusthermophilusleucyltrnasynthetase AT gudzeraoi molecularcloningsequencingandexpressioninescherichiacolicellsthermusthermophilusleucyltrnasynthetase AT tukaloma molecularcloningsequencingandexpressioninescherichiacolicellsthermusthermophilusleucyltrnasynthetase |
| first_indexed |
2025-11-24T16:09:58Z |
| last_indexed |
2025-11-24T16:09:58Z |
| _version_ |
1850850929181458432 |
| fulltext |
STRUCTURE AND FUNCTION OF BIOPOLYMERS
Мо ле ку ляр ное кло ни ро ва ние, сек ве ни ро ва ние и
экс прес сия в клет ках Escherichia coli лей цил-тРНК
син те та зы Thermus thermophilus
А. Д. Ярем чук1, 2, О. П. Ко ва лен ко1, О. И. Гуд зе ра1, М. А. Ту ка ло1, 2
1Го су да рствен ная клю че вая ла бо ра то рия мо ле ку ляр ной и кле точ ной би о ло гии
Инсти тут мо ле ку ляр ной би о ло гии и ге не ти ки НАН Укра и ны
Ул. Академика За бо лот но го, 150, Киев, Укра и на, 03680
2ЕМБЛ
Ул. Жюли Го ро виц, 6, Гре нобль, Фран ция
mtukalo@imbg.org.ua
Цель. Кло ни ро ва ние и сек ве ни ро ва ние лей цил-тРНК син те та зы T. thermophilus (ЛейРСТТ) с по сле ду ю -
щим со зда ни ем ген но-ин же нер ной ко нструк ции для экс прес сии бел ка в клет ках E. coli и его вы де ле ние.
Ме то ды. По иск гена ЛейРСТТ про во ди ли ме то дом Са у зерн-блот-гиб ри ди за ции с хро мо сом ной ДНК,
где в ка чес тве зон дов ис поль зо ва ны ме чен ные ди гок си ге ни ном ПЦР-фраг мен ты ДНК. Ре зуль та ты. Ген
ЛейРС из кле ток T. thermophilus HB27 кло ни ро ван и сек ве ни ро ван. Откры тая рам ка счи ты ва ния ко ди -
ру ет по ли пеп тид дли ной 878 ами но кис лот ных остат ков (мо ле ку ляр ная мас са 101 кДа). Срав не ние ами -
но кис лот ной по сле до ва тель нос ти ЛейРСТТ с та ко вы ми го мо ло гич ных фер мен тов из дру гих орга низ-
мов по ка за ло, что она вхо дит в груп пу ана ло гич ных фер мен тов про ка ри о тов, об ра зу е мую бел ка ми про -
то бак те рий, рик кет сий, а так же ми то хон дрий эу ка ри о тов. По лу чен ное фи ло ге не ти чес кое дре во Лей
РС де мо нстри ру ет ди хо то ми чес кое раз вет вле ние на две ли нии: про ка ри о то/ми то хон дри аль но-эу ка рио-
ти чес кие и ар хей но/ци топ лаз мо-эу ка ри о ти чес кие бел ки. Отли чия меж ду про ка ри о ти чес кой и ар хей ной
вет вя ми фи ло ге не ти чес ко го дре ва ЛейРС в пер вую оче редь свя за ны со струк ту рой двух до ме нов фер -
мен та – кор рек ти ру ю ще го и С-кон це во го. Для экс прес сии гена ЛейРСТТ в клет ках E. coli соответ-
ствующий ген кло ни ро ван в экс пре си ру ю щий век тор pET29b. Вы во ды. Кло ни ро ванный ген leuS T. thermo-
philus и экс прес си ру ю щий ся ре ком би нан тный бе лок бу дут ис поль зо ва ны для структур но-функ ци о наль -
ных ис сле до ва ний ЛейРСТТ, вклю чая рен тге нос трук тур ный ана лиз фер мен та и его му тан тных форм в
ком плек се с раз лич ны ми суб стра та ми.
Клю че вые сло ва: ами но а цил-тРНК син те та зы, лей цил-тРНК син те та за Thermus thermophilus, фи ло ге -
не ти чес кое дре во.
Вве де ние. Аминоацил-тРНК син те та зы (АРСазы)
иг ра ют клю че вую роль в про цес се де ко ди ро ва ния
ге не ти чес кой ин фор ма ции, ка та ли зи руя при со е ди -
не ние го мо ло гич ной ами но кис ло ты к спе ци фи чес -
кой тРНК.
На осно ва нии стро е ния их ка та ли ти чес ких до -
ме нов АРСазы раз де ля ют на два струк тур ных клас -
са [1, 2]. Вхо дя щие в под класс 1а пер во го структур -
но го клас са лей цил-, ва лил- и изо лей цил-тРНК син-
те та зы (ЛейРС, ВалРС и ИлеРС со от ве тствен но) осо-
бен но тес но свя за ны и, ве ро ят но, эво лю ци о ни ро ва -
ли от об ще го пред шес твен ни ка. Эти три фер мен та
яв ля ют ся крупными мо но ме ра ми (око ло 100 кДа) со
сложной муль ти до мен ной струк ту рой. Большой кор-
рек ти ру ю щий до мен (или CP1), яв ля ю щий ся уни -
каль ным для ЛейРС, ВалРС и ИлеРС, вы пол ня ет
гид ро ли ти чес кую функ цию в от ношении ошибоч-
но син те зи ро ван ных про дук тов.
436
ISSN 0233–7657. Biopolymers and Cell. 2011. Vol. 27. N 6. P. 436–441
Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine, 2011
Крис тал лог ра фи чес ки ми ис сле до ва ни я ми струк-
ту ры ЛейРСТТ [3] вы яв ле но, что ее кор рек ти ру ю -
щий до мен на хо дит ся в дру гом по ло же нии в пер -
вич ной струк ту ре по срав не нию с ИлеРС [4]. Ока -
за лось, что у бак те ри аль ных и ми то хон дри аль ных
ЛейРС этот до мен рас по ло жен по сле до ме на Zn-1,
тог да как у ар хе бак те ри аль ных и эу ка ри о ти чес ких
ЛейРС, а так же у всех ИлеРС и ВалРС кор рек ти ру -
ю щий до мен на хо дит ся межу дву мя час тя ми Zn-1-
до ме на. Пред сто ит вы яс нить, свя за но это с осо бен -
нос тя ми узна ва ния тРНК про ка ри о ти чес ки ми Лей-
РС или с кор рек ти ру ю щей ак тив нос тью упо мя ну -
тых фер мен тов.
ЛейРС про ка ри о тов яв ля ет ся од ной из АРСаз,
узна ю щих тРНК с длин ной ва ри а бель ной пет лей.
Одна ко в от ли чие от двух дру гих – се рил- и ти ро зил-
тРНК син те таз [5, 6] – она не вза и мо де йству ет с
длин ной ва ри а бель ной пет лей тРНКЛей [7] и не ис-
по льзу ет ее в ка чес тве узна ю ще го эле мен та [8]. Оче-
вид но, что из-за слож нос ти лей ци но вой сис те мы для
по лно го по ни ма ния мо ле ку ляр ных ме ха низ мов
функ ци о ни ро ва ния ЛейРСТТ в про цес сах ами но-
аци ли ро ва ния и ре дак ти ро ва ния не об хо ди мо из -
учить це лый ряд ком плек сов фер мен та с раз лич-
ны ми суб стра та ми с уче том дан ных по му та ге не зу
и биохи ми чес ких ре зуль та тов. В свя зи с этим кло ни -
ро ва ние ге на leuS T. thermophilus ста ло не об хо ди -
мой час тью струк тур но-функ ци о наль ных ис сле до -
ва ний ЛейРСТТ.
В этой ра бо те пред став ле ны дан ные по кло ни-
ро ва нию, сек ве ни ро ва нию и ана ли зу по сле до ва тель-
нос ти лей цил-тРНК син те та зы T. thermophilus, а
так же по ее эк прес сии в клет ках E. coli.
Ма те ри а лы и ме то ды. В ра бо те ис поль зо ва ли
трис, HEPES («ICN Biomedicals», США); ДЭAЭ-се -
фа ро зу, ге па рин-се фа ро зу («Pharmacia», Шве ция);
MgCl2, ЭДТА, тРНК E. сoli, фер мен ты рес трик ции,
Т4-ДНК-ли га зу, ли зо цим, на бор для ме че ния и де -
тек ции ДНК ди гок си ге ни ном («Boehringer», ФРГ);
14С-лей цин, 238 мКи/ммоль (Инсти тут ис сле до ва -
ния про из во дства и ис поль зо ва ния изо то пов, Че -
хия); 35S-dATP, 50 Ки/ммоль («Amersham», Анг-
лия); на бор для сек ве ни ро ва ния ДНК («US Bioche-
mical Corp.», США); век тор для пря мо го кло ни ро -
ва ния про дук тов по ли ме раз ной цеп ной ре ак ции
(ПЦР) – pCRII («Invitrogen», США). Pfu и Taq ДНК-
по ли ме ра зы («Stratagen», США). Все осталь ные ре -
а ген ты име ли ква ли фи ка цию «осч» и «хч».
ЛейРС вы де ля ли из кле ток T. thermophilus HB27,
как опи са но на ми в [9 ].
Ге ном ную ДНК из кле ток T. thermophilus по лу -
ча ли по [10].
ПЦР про во ди ли по сле ду ю щей про грам ме: де -
на ту ра ция – 1 мин, 94 °С; от жиг – 1 мин, 50 °С;
поли ме ри за ция – 1 мин, 72 °С (все го 30 цик лов) в
100 мкл ре ак ци он но го бу фе ра, со дер жа ще го 50 мМ
трисHCl, pH 9,0, 1,5 мМ MgCl2, 20 мМ суль фат ам-
мо ния, 1 мкл ге ном ной ДНК, 0,2 мМ dNTP, по
40 пмоль оли го нук ле о тид ных прай ме ров и 2,5 еди -
ни цы Taq ДНК-по ли ме ра зы.
Обе це пи ДНК leuS ге на сек ве ни ро ва ли ме то -
дом Сен ге ра (ме тод тер ми на ции це пи). Фи ло ге не-
ти чес кое дре во Лей РСаз по стро е но с ис поль зо ва ни-
ем про грам мы MegAlign (вер сия 5.1), вхо дя щей в
па кет про грамм DNASTAR.
Ре зуль та ты и об суж де ние. Кло ни ро ва ние и сек-
ве ни ро ва ние ге на leuS T. thermophilus. Кло ни ро ва -
ние ге на ЛейРС leuS вы пол ня ли в два эта па. Схе ма
кло ни ро ва ния пред став ле на на рис. 1. Вна ча ле вы -
де ля ли лей цил-тРНК син те та зу из кле ток T. ther-
mophilus HB27 c вы со кой сте пенью чис то ты. За тем
ана ли зи ро ва ли N-кон це вую ами но кис лот ную по -
сле до ва тель ность пер вых 45 ами но кис лот ных ос-
тат ков (а. о.) (MEKYNPHAIEAKWQRFEEKGFMK
AKDLPGGRGKQYVLVMFPYPS). На осно ве ин -
формации о N-кон це вой после до ва тель нос ти Лей-
РСТТ син те зи ро ва ли два оли го нук ле о тид ных прай-
ме ра (5'-GGGATTCATGGAGAAGTACAACCC-3'
и 5'-GGGAATTCTTSGCCTTCATGAASCC-3'), от -
ве ча ю щих ами но кис лот ным остат кам 1–6 и 21–26
со от ве тствен но с уче том пре и му щес твен но го ис -
поль зо ва ния ко до нов T. thermophilus, в ко то рых
треть им нук ле о зи дом яв ля ет ся G или C. С по мо-
щью этих прай ме ров в ПЦР ам пли фи ци ро ван ДНК-
фраг мент дли ной 78 пар нук ле о ти дов (п. н.).
Даль ней шее кло ни ро ва ние в плаз ми ду pUC19 и
сек вени ро ва ние это го фраг мен та под твер ди ли, что
он со от ве тству ет 5'-кон цу струк тур но го ге на Лей
РСТТ. Ме чен ный ди гок си ге ни ном ПЦР-фраг мент
ис поль зо ван в ка чес тве зон да (зонд 1) для по ис ка со -
от ве тству ю ще го ге на ме то дом Са у зерн-блот-гиб ри -
ди за ции с хро мо сом ной ДНК, рас щеп ля е мой раз-
437
ЭКС ПРЕС СИЯ В КЛЕТ КАХ Escherichia coli ЛЕЙ ЦИЛ-тРНК СИН ТЕ ТА ЗЫ Thermus thermophilus
лич ны ми рес трик та за ми и фрак ци о ни ро ван ной в
ага роз ном ге ле. В ито ге с по мощью рес трик та зы
BamHI об на ру жен фраг мент ДНК дли ной 1300 п.
н., эф фек тив но гиб ри ди зу ю щий ся с про бой. За тем
этот фраг мент элю и ро ва ли из ге ля и кло ни ро ва ли в
плаз ми ду pUC19. Пос ле транс фор ма ции ком пе -
тентных кле ток E. coli про во ди ли по иск ко ло ний,
не су щих плаз ми ду с дан ным фраг мен том, ме то дом
гиб ри ди за ции ко ло ний с зон дом 1. В ре зуль та те
сек ве ни ро ва ния ука зан но го фраг мен та ДНК вы яс-
нилось, что в его со став вхо дит 5'-кон це вая после-
до ва тель ность ис ко мо го ге на дли ной 720 п. н., что
со став ля ет око ло 25 % по лной дли ны струк тур но го
ге на ЛейРСТТ.
Вто рой этап кло ни ро ва ния ге на ЛейРСТТ свя -
зан с по ис ком фраг мен тов, со дер жа щих не дос та ю -
щую ин фор ма цию о его по сле до ва тель нос ти. Для
это го на осно ве по сле до ва тель нос ти на й ден ной ра -
нее час ти ге на син те зи ро ва ны оли го нук ле о тид ные
прай ме ры и с по мощью ПЦР по лу чен фраг мент дли-
ной 110 п. н., ис поль зо ван ный в ка чес тве но во го
зон да (зонд 2) для Са у зерн-гиб ри ди за ции (рис. 1,
б). При гиб ри ди за ции по ло жи тель ный сиг нал дал
фраг мент хро мо сом ной ДНК T. thermophilus KpnI/
HindIII дли ной 2,8 тыс. п. н. Кло ни ро ва ние это го
фраг мен та в плаз ми ду pUC19 и его по сле ду ю щее
сек ве ни ро ва ние по ка за ли, что он со дер жит осталь-
ную часть ге на leuS дли ной 1334 п. н. Откры тая рам-
ка счи ты ва ния по лно го ге на leuS T. thermophilus
вклю ча ет 2634 п. н.
Анализ ами но кис лот ной по сле до ва тель нос ти
ЛейРСТТ. Ген leuS ко ди ру ет по ли пеп тид ную цепь
дли ной 878 а. о. (рис. 2). Рас чет ная мо ле ку ляр ная
мас са ЛейРСТТ со став ля ет 101 кДа, что со впа да ет
со зна че ни ем мо ле ку ляр ной мас сы, уста нов лен ным
элек тро фо ре зом в SDS-ПААГ для ЛейРСТТ [11].
Срав не ние ами но кис лот ной по сле до ва тель нос ти
ЛейРС T. thermophilus с та ко вы ми го мо ло гич ных
фер мен тов из дру гих орга низ мов по ка за ло, что она
вхо дит в груп пу ана ло гич ных фер мен тов про ка ри -
о тов, об ра зу е мую бел ка ми про то бак те рий (Helico-
bacter pylori, E. coli, Haemophilus influenzae и др.),
рик кет сий (Rickettsia prowazekii), а так же ми то хон -
дрий эу ка ри о тов (рис. 3).
Вто рая груп па про ка ри о ти чес ких ЛейРС об ра -
зо ва на в основ ном фер мен та ми из грамм-по ло жи -
тель ных бак те рий (Bacillus subtilis, Streptococcus
pyrogenes, Mycobacterium tuberculosis и др.), ми -
коп лазм (Mycoplasma genitalium, M. pneumoniae),
спи ро хет (Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum)
и хла ми дий (Chlamydia trachomatis, C. pneumonis).
Пер вич ная струк ту ра ЛейРСТТ име ет зна чи тель -
ную го мо ло гию с со от ве тству ю щи ми фер мен та ми
из дру гих бак те ри аль ных ис точ ни ков. Нап ри мер,
иден тич ность ЛейРСТТ с пред ста ви те лем той же
бак те ри аль ной суб груп пы, ЛейРС E. coli, со став ля ет
43 % , а с пред ста ви те лем вто рой суб груп пы, Лей
РС M. tuberculosis, – 37 %. В то же вре мя го мо ло гия
ЛейРСТТ с фер мен та ми ар хе бак те рий или ци то-
плаз мы эу ка ри о тов зна чи тель но ни же и иден тич -
ность с ни ми ко леб лет ся от 27 до 32 % в за ви си мос -
ти от ис точ ни ка бел ка. По лу чен ное фи ло ге не ти чес -
кое дре во Лей РСаз де мо нстри ру ет ди хо то ми чес кое
раз вет вле ние на две ли нии: про ка ри о то/ми то хонд-
ри аль но-эу ка ри о ти чес кие и ар хей но/ци топ лаз мо-
эу ка ри о ти чес кие фер мен ты (рис. 3).
438
ЯРЕМ ЧУК А. Д. И ДР.
a
б
← 2,8 тыс. п. н.
Зонд 2 (110 п. н.)
KpnI/HindIII
2800 п. н.
leuS 2634 п. н.
BamHI1300 п. н.BamHI
HindIIIKpnI
Рис. 1. Схе ма кло ни ро ва ния гена лей-
цил-тРНК син те та зи T. thermophilus:
a – фраг мен ты хромо сом ной ДНК
BamHI и KpnI/HindIII, пе ре кры ва ю -
щие всю по сле до ва тель ность гена
ЛейРСТТ и вто рой зонд, ис поль зо-
ван ный для по ис ка не дос та ю щей
части гена leuS; б – Са у зерн-блот-
ана лиз рес трик тных фраг мен тов хро-
мосом ной ДНК. Ука зан по ло жи тель-
ный сиг нал, по лу чен ный от фраг мен-
та хро мо сом ной ДНК T. thermophi-
lus KpnI/HindIII дли ной 2,8 тыс. п. н.
Та ким об ра зом, оче вид но, что эу ка ри о ти чес кие
ми то хон дри аль ные и ци топ лаз ма ти чес кие фор мы
ЛейРС про и зош ли со от ве тствен но от бак те ри аль -
ных и ар хей ных пред шес твен ни ков. Раз ли чия меж -
ду про ка ри о ти чес кой и ар хей ной вет вя ми фи ло ге -
не ти чес ко го дре ва Лей РСаз, в пер вую оче редь, свя -
за ны со струк ту рой двух до ме нов фер мен та –
кор рек ти ру ю ще го и С-кон це во го, при со е ди нив -
ших ся к ка та ли ти чес ко му до ме ну бел ка на по сле -
ду ю щих эта пах эво лю ции. Анализ пер вич ных
струк тур С-до ме на ЛейРС из про ка ри о то/ми то хон -
дри аль но-эука ри о ти чес кой и ар хей но/ци то паз мо-
эу ка ри о тичес кой вет вей вы я вил их зна чи тель ные
от ли чия. Это ука зы ва ет на воз мож ную раз лич ную
роль С-кон це во го до ме на в функ ци о ни ро ва нии Лей
РС раз но го про ис хож де ния.
Из экс пе ри мен таль ных дан ных мож но сде лать
вы вод о том, что С-кон це вой до мен лей цил-тРНК
439
ЭКС ПРЕС СИЯ В КЛЕТ КАХ Escherichia coli ЛЕЙ ЦИЛ-тРНК СИН ТЕ ТА ЗЫ Thermus thermophilus
MEKYNPHAIEAKWQRFWEEKGFMKAKDLPGGRGKQYVLVMFPYPSGDLHMGHLKNYTMGDVLARFRRMQGYEVLHPMGWD 80
AFGLPAENAALKFGVHPKDWTYANIRQAKESLRLMGILYDWDREVTTCEPEYYRRWNQWIFLKMWEKGLAYRAKGLVNWC 160
PKCQTVLANEQVVEGRCWRHEDTPVEKRELEQWYLRITAYAERLLKDLEGLNWPEKVKAMQRAWIGRSEGAEILFPVEGK 240
EVRIPVFTTRPDTLFGATFLVLAPEHPLTLELAAPEKREEVLAYVEAAKRKTEIERQAEGREKTGVFLGAYALNPATGER 320
IPIWTADYVLFGYGTGAIMAVPAHDQRDYEFARKFGLPIKKVIERPGEPLPEPLERAYEEPGIMVNSGPFDGTESEEGKR 400
KVIAWLEEKGLGKGRVTYRLRDWLHKPQRYWGTPIPMVHCEACGVVPVPEEELPVLLPDLKDVEDIRPKGKSPLEAHPEF 480
YETTCPSHGGPPADTDTMDTFFDSSWYYLRYTDPHNDRLPFDPEKANAWMPVDQYIGGVEHAVLHLLYSRFFTKFLHDLG 560
MVKVEEPFQGLFTQGMVLAWTDFGPVEVEGSVVRLPEPTRIRLEIPESALSLEDVRKMGAELRPHEDGTLHLWKPAVMSK 640
SKGNGVMVGPFVKEQGADIARITILFAAPPENEMVWTEEGVQGAWRFLNRIYRRVAEDREALLETSGVFQAEALEGKDRE 720
LYGKLHETLKKVTEDLEALRFNTAIAALMEFLNALYEYRKDRPVTPVYRTAIRYYLQMLFPFAPHLAEELWHWFWPDSLF 800
EAGWPELDEKALEKDVVEVAVQVNGRVRGTIHIPKDAPLEVARAEALKVRNVRAHLEGKEVVKEIYVPGKILNLVVRG 878
Рис. 2. Вы ве ден ная из
нук ле о тид ной по сле до ва-
тель нос ти гена leuS ами -
но кис лот ная по сле до ва-
тель ность ЛейРСТТ. Под-
чер кну та N-кон це вая по-
сле до ва тельсть бел ка, оп-
ре де лен ная пеп тид ным
сек ве ни ро ва ни ем
200,6
200 150 100 50 0
LeuRSSCm
LeuRSSSm
LeuRSSDm
LeuRSNCm
LeuRSHSm
LeuRSRP
LeuRSCB
LeuRSSySp
LeuRSEC
LeuRSVC
LeuRSHI
LeuRSHP
LeuRSTT
LeuRSMypn
LueRSMG
LeuRSBB
LeuRSChPn
LeuRSCT
LeuRRBS
LeuRSStPy
LeuRSAT
LeuRSMybo
LeuRSMyle
LeuRSMyTu
LeuRSTP
LeuRSTM
LeuRSSC
LeuRSSP
LeuRSNC
LeuRSCE
LeuRSPyAb
LeuRSPyHo
LeuRSMJ
LeuRSMHT
LeuRSAF
Рис. 3. Фи ло ге не ти чес кое древо по-
сле до ва тель нос тей лей цил-тРНК
син те таз. Из кор ня дре ва про ис хо -
дит раз вет вле ние меж ду бак те ри -
аль ны ми ЛейРС, вклю ча ю щи ми
ми то хон дри аль ные фер мен ты, и
ар хей ны мы ЛейРС, со дер жа щи ми
фер мен ты из ци топ лаз мы эу ка ри -
о тов. Обоз на че ния: LeuRSAF –
фер мент из Archaeoglobus ful-
gidus; ВВ – Borrelia burgdorferi;
BS – Bacillus subtilis; CT – Chlamy-
dia trachomatis; EC – Escherichia
coli; HI – Haemophilus influenzae;
HP – Helicobacter pylori; HSm –
Homo sapiens, ми то хон дри аль ная;
MTH – Methanobacterium thermo-
autotrophicum; MJ – Methanococ-
cus jannaschii; MG – Mycoplasma
genitalium; Mypn – Mycoplasma
pneumoniae; MyTu – Mycobacte-
rium tuberculosis; NC – Neurospora
crassa, ци топ лаз ма ти чес кая; NCm –
Neurospora crassa, ми то хон дри -
аль ная; PyAb – Pirococcus albia;
PyHo – Pyrococcus hоr ikоshi; RP –
Rickettsia prowazekii; SC – Sac-
charomyces cerevisiae, ци топ лаз ма-
ти чес кая; SCm – Saccharomyces ce-
revisiae, ми то хон дри аль ная; StPy –
Streptococcus pyrogenes; SySp –
Synechocystis species; TM – Ther-
motoga maritime; TP – Treponema
pallidum; TT – Thermus thermo-
philus; VC – Vibrio cholerae
син те таз T. thermophilus и E. coli (ве ро ят но, и дру -
гих ЛейРС про ка ри о тов) эво лю ци он но при об ре тен
для уси ле ния ско рос ти ка та ли за в ре ак ци ях ами но -
а ци ли ро ва ния и ре дак ти ро ва ния [12, 13]. В то же
вре мя де ле ция С-кон це во го до ме на ар хей ной Лeй
РС P. hоr ikоshi при во дит к по те ре ами но а ци ли ру ю -
щей ак тив нос ти, но прак ти чес ки не вли я ет на ее ре -
дак ти ру ю щую спо соб ность [14]. При этом из уче -
ние крис тал лог ра фи чес ких струк тур ком плек сов
ЛейРС с тРНК по ка за ло, что С-кон це вой до мен про-
ка ри о ти чес кой ЛейРСТТ вза и мо де йству ет с углом
L-фор мы тРНКLeu [7] , тог да как С-кон це вой до мен
ар хей ной ЛейРС P. hоr ikоshi свя зы ва ет ся с ва ри а -
бель ным стеб лем го мо ло гич ной тРНК [15]. Вслед-
ствие рас шиф ров ки про стра нствен ных струк тур
про ка ри о ти чес кой ЛейРС T. thermophilus [3] и ар -
хей ной ЛейРС P. hоr ikоshi [15] од но знач но уста -
нов ле но су щес тво ва ние двух раз лич ных вклю че -
ний в по ли пе пе тид ную цепь бел ка и, со от ве тствен -
но, двух раз ных ори ен та ций кор рек ти ру ю ще го до-
ме на. Сле ду ет от ме тить, что эу ка ри о ти чес кие ми то-
хон дри аль ные ЛейРС име ют ори ен та цию кор рек-
ти ру ю ще го до ме на, как у бак те ри аль ной ЛейРСТТ,
а эу ка риоти чес кие ци топ лаз ма ти чес кие ЛейРС –
ори ен та цию, ти пич ную для ЛейРС ар хе бак те рий.
Этот факт по лнос тью под твер жда ет раз де ле ние
ЛейРС на две со от ве тству ю щие вет ви в по стро ен -
ном фи ло ге не ти чес ком дре ве.
Экспрес сия ЛейРС T.thermophilus в клет ках E.
coli. Для по лу че ния боль ших ко ли честв ЛейРСТТ,
не об хо ди мых для струк тур но-функ ци о наль ных ис -
сле до ва ний, ген leuS ам пли фи ци ро ва ли с ис поль зо -
ва ни ем ПЦР и кло ни ро ва ли в век тор pCRII. Пос ле
про вер ки на ли чия нук ле о тид ной по сле до ва тель но-
сти ге на ЛейРСТТ в со от ве тству ю щей ко нструк ции
его пе ре кло ни ро ва ли в экс пре си ру ю щий век тор
pET29b, со дер жа щий про мо тор Т7 РНК-по ли ме ра -
зы. Ре ком би нан тный век тор ис поль зо ва ли для
транс фор ма ции кле ток E. coli штамм BL21(DE3)
pLysS. Бе лок очи ща ли тер ми чес кой де на ту ра ци ей
внут рик ле точ ных бел ков E. coli при тем пе ра ту ре 72
°С и дву мя по сле ду ю щи ми ко ло ноч ны ми хро ма -
тог ра фи я ми на ДЭАЭ-се фа ро зе и ге па рин-се фа ро -
зе. Ко неч ный вы ход пре па ра та ЛейРС ТТ со став ля -
ет око ло 20 мг бел ка из 1 л куль ту ры кле ток и име ет
чис то ту бо лее 95 % по дан ным элек тро фо ре за в
ПААГ (рис. 4).
Вы во ды. Ре ком би нан тный бе лок успеш но ис -
поль зо ван для крис тал ли за ции ЛейРСТТ в комп-
лек се с раз лич ны ми суб стра та ми [3, 16], вклю чая
тРНКЛей [7], а так же для из уче ния мо ле ку ляр ных ме-
ха низ мов де йствия но вых ан ти би о ти ков [17].
По лу чен ная ген но-ин же нер ная ко нструк ция
для экс прес сии ЛейРСТТ в клет ках E. coli очень
важ на для углуб ле ния струк тур но-функ ци о наль-
ных ис сле до ва ний функ ци о ни ро ва ния ЛейРС в про-
цес сах амино а ци ли ро а ния и ре дак ти ро ва ния, связа -
нных с про ве де ни ем ин тен сив но го му та ге не за
ЛейРСТТ, по лу че ни ем но вых струк тур ных и би о -
хи ми чес ких ре зуль та тов при ана ли зе му тан тных
форм фер мен та.
A. D. Yaremchuk1, 2, O. P. Kovalenko1, О. I. Gudzera1, M. A. Tukalo1, 2
Molecular cloning, sequencing and expression in Escherichia coli
cells Thermus thermophilus leucyl-tRNA synthetase
1State key laboratory of molecular and cellular biology, Institute
of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine
150, Academika Zabolotnoho Str., Kyiv, Ukraine, 03680
2EMBL
6, rue Jules Horowitz, 38042 Grenoble Cedex 9, France
Summary
Aim. Cloning and sequencing of the T. thermophilus leucyl-tRNA syn-
thetase (LeuRSTT) followed by the creation of genetically engineered
construct for protein expression in E.coli cells and its purification.
Methods. Searching for the LeuRSTT gene was performed by Southern
blot hybridization with chromosomal DNA, where digoxigenin-labe-
led PCR fragments of DNA were used as probes. Results. The gene of
T. thermophilus HB27 leucyl-tRNA synthetase was cloned and sequen-
ced. The open reading frame encodes a polypeptide chain of 878 amino
440
ЯРЕМ ЧУК А. Д. И ДР.
←45
1 2 3 4 5
←66
←97
←116
←200
кДа
Рис. 4. Ре зуль та ты елек тро фо ре за в 10 %-м SDS-ПААГ алик вот,
по лу чен ных при экс прес сии и очис тке ЛейРС T. thermophilus: 1 –
фрак ция рас тво ри мых бел ков по сле раз ру ше ния кле ток; 2 – фрак -
ция рас тво ри мых бел ков по сле про гре ва ния при тем пе ра ту ре 72
°С; 3, 4 – фрак ции, по лу чен ные в ре зуль та те по сле до ва тель ных
хро ма тог ра фий на DЭAЭ- и ге па рин-се фа ро зе со от ве тствен но;
5 – мар кер мо ле ку ляр ной мас сы бел ков
acid residues in length (molecular mass 101 kDa). Comparison of the
amino acid sequence of T. thermophilus LeuRS with that of the enzy-
mes from other organisms showed that LeuRSTT was a part of the group
of similar enzymes of prokaryotes, formed by the proteins of protobac-
teriae, rickettsia and mitochondria of eukaryotes. The resulting phylo-
genetic tree of LeuRSs reveals dichotomous branching into two lines:
prokaryotic/eukaryotic mitochondrial and arhaeal/eukaryotic cytoso-
lic proteins. Differences between prokaryotic and arhaeal branches of
the LeuRSs phylogenetic tree are primarily due to the structure of two
domains of the enzyme – the editing and the C-terminal. T. thermophilus
LeuRS was expressed in E. coli cells by cloning the corresponding gene
into pET29b vector. Conclusions. The cloned T. thermophilus leuS gene
and expressed recombinant protein will be used for structural and
functional studies on LeuRSTT, including X-ray analysis of the enzyme
and its mutant forms in complex with different substrates.
Keywords: aminoacyl-tRNA synthetases, leucyl-tRNA synthetase
Thermus thermophilus, phylogenetic tree.
Г. Д. Ярем чук, О. П. Ко ва лен ко, О. І. Гуд зе ра, М. А. Ту ка ло
Мо ле ку ляр не кло ну ван ня, сек ве ну ван ня і експресія в кліти нах
Escherichia coli лей цил-тРНК син те та зи Thermus thermophilus
Ре зю ме
Мета. Кло ну ван ня і сек ве ну ван ня лей цил-тРНК синте та зи T. ther-
mophilus (ЛейРСТТ) з на ступ ним ство рен ням ген но-інже нер ної
ко нструкції для експресії білка в кліти нах E. coli та його виділен -
ня. Ме то ди. По шук гена ЛейРСТТ про во ди ли ме то дом Са у зерн-
блот-гібри ди зації з хро мо сом ною ДНК, зон да ми слу гу ва ли мічені
ди гок си геніном ПЦР-фраг мен ти ДНК. Ре зуль та ти. Ген ЛейРС з
клітин T. thermophilus HB27 кло но ва но і сек ве но ва но. Відкри та
рам ка зчи ту ван ня кодує поліпеп тид дов жи ною 878 аміно кис лот -
них за лишків (мо ле ку ляр на маса 101 кДа). Порівнян ня аміно кис -
лот ної послідов ності ЛейРСТТ з послідов нос тя ми го мо логічних
фер ментів з інших організмів по ка за ло, що вона вхо дить до гру пи
ана логічних фер ментів про каріотів, c сфор мо ва ної білка ми про -
то бак те рий, рик кетсій, а та кож міто хондрій еу каріотів. Одер -
жа не філо ге не тич не де ре во ЛейРС де мо нструє ди хо томічне роз-
га лу жен ня на дві лінії: про каріото/міто хондріаль но-еу каріотич-
ні і ар хей но/ци топ лаз мо-еу каріот ичні білки. Розбіжності між
про каріот ич ною і ар хей ною гілка ми філо ге не тич но го де ре ва Лей
РС у пер шу чер гу по в’я зані зі струк ту рою двох до менів фер мен -
ту – ко рек ту ю чо го і С-кінце во го. Для експресії гена ЛейРСТТ у
кліти нах E. coli відповідний ген кло но ва но в експре су ю чий век тор
pET29b. Вис нов ки. Кло но ва ний ген leuS T. thermophilus і ре комбі-
на нтний білок, який експре сується, бу дуть ви ко рис тані для
структур но-функціональ них досліджень ЛейРСТТ, вклю ча ю чи
рен тге нос трук тур ний аналіз фер мен ту і його му тан тних форм у
ком плексі з різни ми суб стра та ми.
Клю чові сло ва: аміно а цил-тРНК син те та зи, лей цил-тРНК
син те та за Thermus thermophilus, філо ге не тич не де ре во.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Eriani G., Delarue M., Poch O., Gangloff J., Moras D. Partition
of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclu-
sive sets of sequence motifs // Nature.–1990.–347, N 6289.–
P. 203–206.
2. Cusack S., Berthet-Colominas C., Hartlein M., Nassar N., Leber-
man R. A second class of synthetase structure revealed by X-ray
analysis of Escherichia coli seryl-tRNA synthetase at 2.5 C //
Nature.–1990.–347, N 6290.–P. 249–255.
3. Cusack S., Yaremchuk A., Tukalo M. The 2 C crystal structure of
leucyl-tRNA synthetase and its complex with a leucyl-adenylate
analogue // EMBO J.–2000.–19, N 10.–P. 2351–2361.
4. Nureki O., Vassylyev D. G., Tateno M., Shimada A., Nakama T.,
Fukai S., Konno M., Hendrickson T. L., Schimmel P., Yokoyama
S. Enzyme structure with two catalytic sites for double-sieve se-
lection of substrate // Science.–1998.–280, N 5363.–P. 578–582.
5. Biou V., Yaremchuk A., Tukalo M., Cusack S. The 2.9 C crystal
structure of T. thermophilus seryl-tRNA synthetase complexed
with tRNA(Ser) // Science.–1994.–263, N 5152.–P. 1404–1410.
6. Yaremchuk A., Kriklivyi I., Tukalo M., Cusack S. Class I tyro-
syl-tRNA synthetase has a class II mode of cognate tRNA recog-
nition // EMBO J.–2002.–21, N 14.–P. 3829–3840.
7. Tukalo M., Yaremchuk A., Fukunaga R., Yokoyama S., Cusack
S. The crystal structure of leucyl-tRNA synthetase complexed
with tRNALeu in the post-transfer-editing conformation // Nat.
Struct. Mol. Biol.–2005.–12, N 10.–P. 923–930.
8. Asahara H., Himeno H., Tamura K., Hasegawa T., Watanabe
K., Shimizu M. Recognition nucleotides of Escherichia coli
tRNALeu and its elements facilitating discrimination from tRNASer
and tRNATyr // J. Mol. Biol.–1993.–231, N 2.–P. 219–229.
9. Yaremchuk A., Cusack S., Gudzera O., Grotli M., Tukalo M. Cry-
stallization and preliminary crystallographic analysis of Ther-
mus thermophilus leucyl-tRNA synthetase and its complexes
with leucine and a non-hydrolysable leucyl-adenylate analogue
// Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr.–2000.–56, Pt 5.–
P. 667–669.
10. Marmur J. A. A procedure for the isolation of deoxyribonuc-
leic acid from micro-organisms // J. Mol. Biol.–1961.–3, N 2.–
P. 208–218.
11. Yaremchuk A. D., Gudzera O. I., Egorova S. P., Rozhko D. I., Kri-
klivy I. A., Tukalo M. A. Leucyl-tRNA synthetase from Thermus
thermophilus. Purification and some properties of the crystal-
lizing enzyme // Biopolym. Cell.–2001.–17, N 3.–P. 216–220.
12. Gudzera O. I., Yaremchuk A. D., Tukalo M. A. Functional role of
C-terminal domain of Thermus thermophilus leucyl-tRNA syn-
thetase // Biopolym. Cell.–2010.–26, N 6.–P. 478–485.
13. Hsu J. L., Rho S. B., Vannella K. M., Martinis S. A. Functional
divergence of a unique C-terminal domain of leucyl-tRNA syn-
thetase to accommodate its splicing and aminoacylation roles //
J. Biol. Chem.–2006.–281, N 32.–P. 23075–23082.
14. Fukunaga R., Yokoyama S. The C-terminal domain of the archae-
al leucyl-tRNA synthetase prevents misediting of isoleucyl-
tRNA(Ile) // Biochemistry.–2007.–46, N 17.–P. 4985–4996.
15. Fukunaga R., Yokoyama S. Crystal structure of leucyl-tRNA
synthetase from the archaeon Pyrococcus horikoshii reveals a
novel editing domain orientation // J. Mol. Biol.–2005.–346,
N 1.–P. 57–71.
16. Lincecum T. L. Jr., Tukalo M., Yaremchuk A., Mursinna R. S.,
Williams A. M., Sproat B. S., Van Den Eynde W., Link A., Van
Calenbergh S., Grotli M., Martinis S. A., Cusack S. Structural
and mechanistic basis of pre- and posttransfer editing by leucyl-
tRNA synthetase // Mol. Cell.–2003.–11, N 4.–P. 951–963.
17. Rock F. L., Mao W., Yaremchuk A., Tukalo M., Crepin T., Zhou
H., Zhang Y. K., Hernandez V., Akama T., Baker S. J., Plattner
J. J., Shapiro L., Martinis S. A., Benkovic S. J., Cusack S., Alley
M. R. An antifungal agent inhibits an aminoacyl-tRNA synthe-
tase by trapping tRNA in the editing site // Science.–2007.–316,
N 5832.–P. 1759–1761.
UDC 577.217
Received 11.03.11
441
ЭКС ПРЕС СИЯ В КЛЕТ КАХ Escherichia coli ЛЕЙ ЦИЛ-тРНК СИН ТЕ ТА ЗЫ Thermus thermophilus
|