Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus - Яремчук, А.Д.; Коваленко, О.П.; Гудзера, О.И.; Тукало, М.А. (Вiopolymers and Cell, 2011)
Цель. Клонирование и секвенирование лейцил-тРНК синтетазы T. thermophilus (ЛейРСТТ) с последующим созданием генно-инженерной конструкции для экспрессии белка в клетках E. coli и его выделение.
Методы. Поиск гена ЛейРСТТ проводили методом Саузерн-блот-гибридизации с хромосомной ДНК,
где в качестве зондов использованы меченные дигоксигенином ПЦР-фрагменты ДНК. Результаты. Ген
ЛейРС из клеток T. thermophilus HB27 клонирован и секвенирован. Открытая рамка считывания кодирует полипептид длиной 878 аминокислотных остатков (молекулярная масса 101 кДа). Сравнение аминокислотной последовательности ЛейРСТТ с таковыми гомологичных ферментов из других организмов показало, что она входит в группу аналогичных ферментов прокариотов, образуемую белками протобактерий, риккетсий, а также митохондрий эукариотов. Полученное филогенетическое древо Лей
РС демонстрирует дихотомическое разветвление на две линии: прокариото/митохондриально-эукариотические и архейно/цитоплазмо-эукариотические белки. Отличия между прокариотической и архейной
ветвями филогенетического древа ЛейРС в первую очередь связаны со структурой двух доменов фермента – корректирующего и С-концевого. Для экспрессии гена ЛейРСТТ в клетках E. coli соответствующий ген клонирован в экспресирующий вектор pET29b. Выводы. Клонированный ген leuS T. thermophilus и экспрессирующийся рекомбинантный белок будут использованы для структурно-функциональных исследований ЛейРСТТ, включая рентгеноструктурный анализ фермента и его мутантных форм в
комплексе с различными субстратами.
Ключевые слова: аминоацил-тРНК синтетазы, лейцил-тРНК синтетаза Thermus thermophilus, филогенетическое древо. Мета. Клонування і секвенування лейцил-тРНК синтетази T. thermophilus (ЛейРСТТ) з наступним створенням генно-інженерної
конструкції для експресії білка в клітинах E. coli та його виділення. Методи. Пошук гена ЛейРСТТ проводили методом Саузернблот-гібридизації з хромосомною ДНК, зондами слугували мічені
дигоксигеніном ПЦР-фрагменти ДНК. Результати. Ген ЛейРС з
клітин T. thermophilus HB27 клоновано і секвеновано. Відкрита
рамка зчитування кодує поліпептид довжиною 878 амінокислотних залишків (молекулярна маса 101 кДа). Порівняння амінокислотної послідовності ЛейРСТТ з послідовностями гомологічних
ферментів з інших організмів показало, що вона входить до групи
аналогічних ферментів прокаріотів, c сформованої білками протобактерий, риккетсій, а також мітохондрій еукаріотів. Одержане філогенетичне дерево ЛейРС демонструє дихотомічне розгалуження на дві лінії: прокаріото/мітохондріально-еукаріотичні і архейно/цитоплазмо-еукаріотичні білки. Розбіжності між
прокаріотичною і архейною гілками філогенетичного дерева Лей
РС у першу чергу пов’язані зі структурою двох доменів ферменту – коректуючого і С-кінцевого. Для експресії гена ЛейРСТТ у
клітинах E. coli відповідний ген клоновано в експресуючий вектор
pET29b. Висновки. Клонований ген leuS T. thermophilus і рекомбінантний білок, який експресується, будуть використані для
структурно-функціональних досліджень ЛейРСТТ, включаючи
рентгеноструктурний аналіз ферменту і його мутантних форм у
комплексі з різними субстратами.
Ключові слова: аміноацил-тРНК синтетази, лейцил-тРНК
синтетаза Thermus thermophilus, філогенетичне дерево. Aim. Cloning and sequencing of the T. thermophilus leucyl-tRNA synthetase (LeuRSTT) followed by the creation of genetically engineered
construct for protein expression in E.coli cells and its purification.
Methods. Searching for the LeuRSTT gene was performed by Southern
blot hybridization with chromosomal DNA, where digoxigenin-labeled PCR fragments of DNA were used as probes. Results. The gene of
T. thermophilus HB27 leucyl-tRNA synthetase was cloned and sequenced. The open reading frame encodes a polypeptide chain of 878 aminoacid residues in length (molecular mass 101 kDa). Comparison of the
amino acid sequence of T. thermophilus LeuRS with that of the enzymesfrom other organismsshowed that LeuRSTT was a part of the group
of similar enzymes of prokaryotes, formed by the proteins of protobacteriae, rickettsia and mitochondria of eukaryotes. The resulting phylogenetic tree of LeuRSs reveals dichotomous branching into two lines:
prokaryotic/eukaryotic mitochondrial and arhaeal/eukaryotic cytosolic proteins. Differences between prokaryotic and arhaeal branches of
the LeuRSs phylogenetic tree are primarily due to the structure of two
domains of the enzyme – the editing and the C-terminal. T. thermophilus
LeuRS was expressed in E. coli cells by cloning the corresponding gene
into pET29b vector. Conclusions. The cloned T. thermophilusleuS gene
and expressed recombinant protein will be used for structural and
functional studies on LeuRSTT, including X-ray analysis of the enzyme
and its mutant forms in complex with different substrates.
Keywords: aminoacyl-tRNA synthetases, leucyl-tRNA synthetase
Thermus thermophilus, phylogenetic tree.