Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации
Рекомбинантные молекулы на основе бактериофага лямбда отличаются высокой сегрегационной стабильностью в лизогенном состоянии и высоким уровнем амплификации фаговой ДНК и соответственно встроенного в нее целевого гена при литическом развитии фага, которое заканчивается лизисом бактериальной клетки и...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Біополімери і клітина |
|---|---|
| Дата: | 2003 |
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2003
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156371 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации / И.Ю. Славченко, В.А. Шмидт, С.И. Черных, В.А. Кордюм // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 1. — С. 81-88. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156371 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Славченко, И.Ю. Шмидт, В.А. Черных, С.И. Кордюм, В.А. 2019-06-18T12:08:45Z 2019-06-18T12:08:45Z 2003 Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации / И.Ю. Славченко, В.А. Шмидт, С.И. Черных, В.А. Кордюм // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 1. — С. 81-88. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.00063F https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156371 579.258+577.124 Рекомбинантные молекулы на основе бактериофага лямбда отличаются высокой сегрегационной стабильностью в лизогенном состоянии и высоким уровнем амплификации фаговой ДНК и соответственно встроенного в нее целевого гена при литическом развитии фага, которое заканчивается лизисом бактериальной клетки и высвобождением целевого продукта в культуральную среду. Это делает перспективным использование фага лямбда для получения рекомбинантных белков. В данном сообщении описано конструирование фага λpIF, несущего две копии искусственного гена интерферона (ИФН) человека под контролем тандема триптофановых промоторов. Экспрессию чужеродных генов осуществляли термоиндукцией клеток, несущих фаг с генами ИФН, а также инфекцией этим фагом реципиентных клеток. Показано, что выход рекомбинантного белка зависит от оптической плотности клеток при термоиндукции и последующего температурного режима культивирования продуцента Увеличение содержания ИФН в лизатах после индукции также наблюдали при использовании Q–R– амбер-мутантов фага λpIF. Показано, что инфицирование реципиентных клеток фагом λpIF обеспечивало более высокий выход ИФН (около 40 мг/л), чем термоиндукция клеток Escherichia coli, несущих фаг с целевыми генами. Рекомбінантні молекули на основі бактеріофага лямбда відрізняються високою сегрегаційною стабільністю у лізогенному стані і високим рівнем ампліфікації фагової ДНК та відповідно вбудованого в неї цільового гена за літичного розвитку фага, який закінчується лізисом бактеріальної клітини і вивільненням цільового продукту в культуральне середовище. Це робить перспективним використання фага лямбда для отримання рекомбінантних білків. У даному повідомленні описано конструювання фага λpIF, який несе дві копії штучного гена інтерферону (ІФН) людини під контролем тандему триптофанових промоторів. Експресію чужорідних генів здійснювали термоіндукціею клітин, які несуть фаг з генами ІФН, а також інфекцією цим фагом реципієнтних клітин. Показано, що вихід рекомбінантного білка залежить від оптичної густини клітин при термоіндукції і наступного температурного режиму культивування продуцента. Збільшення вмісту ІФН у лізатах після індукції також спостерігали при використанні Q– R– амбер-мутантів фага λpIF. Показано, що інфікування реципієнтних клітин фагом λpIF забезпечує вищий вихід ІФН (біля 40 мг/л), ніж термоіндукиія клітин Escherichia coli, які несуть фаг з цільовими генами. High stability of the cloned gene in the lysogenic state and high copy number in the lytic state suggest a potential use of phage λ as an expression vector for overproduction of the extracellular recombinant proteins which release to the growth medium as a result of lysis of E. coli cells by phage. This paper describes the construction and characterization of phage λpIF carrying the two copy of an artificial gene for human α2 interferon (IFN) under control of the Ptrp tandem promoter. The expression of the foreign genes realized by thermal induction cells carrying the phage λpIF as well as by infection of recipient cells with this phage. In this study it was shown that the recombinant protein yield is dependent on a cell density at the time of thermal induction and the following temperature of producer cultivation. The increase of soluble target protein concentration in lysates after induction of recombinant phage was also observed using the phage λpIF contains amber-mutations in genes Q and R. The infection of recipient cells by phage λpIF resulted in higher IFN yield (about 40 mg per l) than thermal induction of the cells carrying the phage λ with target genes. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Біополімери і клітина Молекулярна та клітинна біотехнології Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации Особливості експресії цільового гена у складі вектора на основі бактеріофага лямбда та вивчення шляхів її оптимізації Peculiarities of a target gene expression in the structure of the phage lambda-base vector and investigation of ways of its optimization Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации |
| spellingShingle |
Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации Славченко, И.Ю. Шмидт, В.А. Черных, С.И. Кордюм, В.А. Молекулярна та клітинна біотехнології |
| title_short |
Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации |
| title_full |
Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации |
| title_fullStr |
Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации |
| title_full_unstemmed |
Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации |
| title_sort |
особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации |
| author |
Славченко, И.Ю. Шмидт, В.А. Черных, С.И. Кордюм, В.А. |
| author_facet |
Славченко, И.Ю. Шмидт, В.А. Черных, С.И. Кордюм, В.А. |
| topic |
Молекулярна та клітинна біотехнології |
| topic_facet |
Молекулярна та клітинна біотехнології |
| publishDate |
2003 |
| language |
Russian |
| container_title |
Біополімери і клітина |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Особливості експресії цільового гена у складі вектора на основі бактеріофага лямбда та вивчення шляхів її оптимізації Peculiarities of a target gene expression in the structure of the phage lambda-base vector and investigation of ways of its optimization |
| description |
Рекомбинантные молекулы на основе бактериофага лямбда отличаются высокой сегрегационной стабильностью в лизогенном состоянии и высоким уровнем амплификации фаговой ДНК и соответственно встроенного в нее целевого гена при литическом развитии фага, которое заканчивается лизисом бактериальной клетки и высвобождением целевого продукта в культуральную среду. Это делает перспективным использование фага лямбда для получения рекомбинантных белков. В данном сообщении описано конструирование фага λpIF, несущего две копии искусственного гена интерферона (ИФН) человека под контролем тандема триптофановых промоторов. Экспрессию чужеродных генов осуществляли термоиндукцией клеток, несущих фаг с генами ИФН, а также инфекцией этим фагом реципиентных клеток. Показано, что выход рекомбинантного белка зависит от оптической плотности клеток при термоиндукции и последующего температурного режима культивирования продуцента Увеличение содержания ИФН в лизатах после индукции также наблюдали при использовании Q–R– амбер-мутантов фага λpIF. Показано, что инфицирование реципиентных клеток фагом λpIF обеспечивало более высокий выход ИФН (около 40 мг/л), чем термоиндукция клеток Escherichia coli, несущих фаг с целевыми генами.
Рекомбінантні молекули на основі бактеріофага лямбда відрізняються високою сегрегаційною стабільністю у лізогенному стані і високим рівнем ампліфікації фагової ДНК та відповідно вбудованого в неї цільового гена за літичного розвитку фага, який закінчується лізисом бактеріальної клітини і вивільненням цільового продукту в культуральне середовище. Це робить перспективним використання фага лямбда для отримання рекомбінантних білків. У даному повідомленні описано конструювання фага λpIF, який несе дві копії штучного гена інтерферону (ІФН) людини під контролем тандему триптофанових промоторів. Експресію чужорідних генів здійснювали термоіндукціею клітин, які несуть фаг з генами ІФН, а також інфекцією цим фагом реципієнтних клітин. Показано, що вихід рекомбінантного білка залежить від оптичної густини клітин при термоіндукції і наступного температурного режиму культивування продуцента. Збільшення вмісту ІФН у лізатах після індукції також спостерігали при використанні Q– R– амбер-мутантів фага λpIF. Показано, що інфікування реципієнтних клітин фагом λpIF забезпечує вищий вихід ІФН (біля 40 мг/л), ніж термоіндукиія клітин Escherichia coli, які несуть фаг з цільовими генами.
High stability of the cloned gene in the lysogenic state and high copy number in the lytic state suggest a potential use of phage λ as an expression vector for overproduction of the extracellular recombinant proteins which release to the growth medium as a result of lysis of E. coli cells by phage. This paper describes the construction and characterization of phage λpIF carrying the two copy of an artificial gene for human α2 interferon (IFN) under control of the Ptrp tandem promoter. The expression of the foreign genes realized by thermal induction cells carrying the phage λpIF as well as by infection of recipient cells with this phage. In this study it was shown that the recombinant protein yield is dependent on a cell density at the time of thermal induction and the following temperature of producer cultivation. The increase of soluble target protein concentration in lysates after induction of recombinant phage was also observed using the phage λpIF contains amber-mutations in genes Q and R. The infection of recipient cells by phage λpIF resulted in higher IFN yield (about 40 mg per l) than thermal induction of the cells carrying the phage λ with target genes.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156371 |
| citation_txt |
Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации / И.Ю. Славченко, В.А. Шмидт, С.И. Черных, В.А. Кордюм // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 1. — С. 81-88. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT slavčenkoiû osobennostiékspressiicelevogogenavsostavevektoranaosnovebakteriofagalâmbdaiizučenieputeieeoptimizacii AT šmidtva osobennostiékspressiicelevogogenavsostavevektoranaosnovebakteriofagalâmbdaiizučenieputeieeoptimizacii AT černyhsi osobennostiékspressiicelevogogenavsostavevektoranaosnovebakteriofagalâmbdaiizučenieputeieeoptimizacii AT kordûmva osobennostiékspressiicelevogogenavsostavevektoranaosnovebakteriofagalâmbdaiizučenieputeieeoptimizacii AT slavčenkoiû osoblivostíekspresíícílʹovogogenauskladívektoranaosnovíbakteríofagalâmbdatavivčennâšlâhívííoptimízacíí AT šmidtva osoblivostíekspresíícílʹovogogenauskladívektoranaosnovíbakteríofagalâmbdatavivčennâšlâhívííoptimízacíí AT černyhsi osoblivostíekspresíícílʹovogogenauskladívektoranaosnovíbakteríofagalâmbdatavivčennâšlâhívííoptimízacíí AT kordûmva osoblivostíekspresíícílʹovogogenauskladívektoranaosnovíbakteríofagalâmbdatavivčennâšlâhívííoptimízacíí AT slavčenkoiû peculiaritiesofatargetgeneexpressioninthestructureofthephagelambdabasevectorandinvestigationofwaysofitsoptimization AT šmidtva peculiaritiesofatargetgeneexpressioninthestructureofthephagelambdabasevectorandinvestigationofwaysofitsoptimization AT černyhsi peculiaritiesofatargetgeneexpressioninthestructureofthephagelambdabasevectorandinvestigationofwaysofitsoptimization AT kordûmva peculiaritiesofatargetgeneexpressioninthestructureofthephagelambdabasevectorandinvestigationofwaysofitsoptimization |
| first_indexed |
2025-11-25T22:29:22Z |
| last_indexed |
2025-11-25T22:29:22Z |
| _version_ |
1850563605297102848 |
| fulltext |
ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2003. Т. 19. № 1
Особенности экспрессии целевого гена
в составе вектора на основе бактериофага лямбда
и изучение путей ее оптимизации
И. Ю. Славченко1 2 , В. А. Шмидт 1 , С. И. Черных 1 , 2 , В. А. Кордюм 1 2
Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины
Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143, Украина
2
ПНИК «Биотехнолог»
Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143, Украина
Рекомбинантные молекулы на основе бактериофага лямбда отличаются высокой сегрегационной
стабильностью в лизогенном состоянии и высоким уровнем амплификации фаговой ДНК и
соответственно встроенного в нее целевого гена при литическом развитии фага, которое
заканчивается лизисом бактериальной клетки и высвобождением целевого продукта в культураль-
ную среду. Это делает перспективным использование фага лямбда для получения рекомбинантных
белков. В данном сообщении описано конструирование фага XpIF, несущего две копии искусствен
ного гена интерферона (ИФН) человека под контролем тандема триптофановых промоторов.
Экспрессию чужеродных генов осуществляли термоиндукцией клеток, несущих фаг с генами ИФН,
а также инфекцией этим фагом реципиентных клеток. Показано, что выход рекомбинантного
белка зависит от оптической плотности клеток при термоиндукции и последующего темпера
турного режима культивирования продуцента Увеличение содержания ИФН в лизатах после
индукции также наблюдали при использовании Q~R~ амбер-мутантов фага XpIF. Показано, что
инфицирование реципиентных клеток фагом XpIF обеспечивало более высокий выход ИФН (около
40 мг/л), чем термоиндукция клеток Escherichia coli, несущих фаг с целевыми генами.
Введение. Одним из способов повышения выхода
целевого продукта является увеличение в клетке
количества копий целевого гена. Для амплифика
ции генов в клетках Eschericha coli используют
векторы на основе мультикопийных плазмид, нит
чатых фагов (например, М13) и бактериофага лям
бда. Известны примеры эффективной экспрессии
нескольких копий целевого гена в составе вектора,
обеспечивающие повышение выхода рекомбинант
ного белка [1—4] . Так, при клонировании двух,
трех и четырех копий гена альфа-8 интерферона в
составе рекомбинантной плазмиды имело место
пропорциональное увеличение синтеза интерферо
на по сравнению с плазмидой, несущей одну копию
этого гена [1] . В работе [4] достигнут высокий
уровень экспрессии глицеролкиназы при клониро
вании четырех копий целевого гена в составе
© И. Ю. С Л А В Ч Е Н К О , В. А. Ш М И Д Т , С И. Ч Е Р Н Ы Х ,
В. А. К О Р Д Ю М , 2 0 0 3
вектора на основе бактериофага лямбда. Хотя име
ются примеры [5—8 ] успешного использования для
суперсинтеза целевых белков фагов лямбда, полу
ченных как in vivo, так и in vitro, тем не менее,
векторы на основе фага лямбда очень широко
применяют для клонирования целевого гена, а для
достижения высокоэффективной экспрессии, как
правило, гены встраивают в плазмидные векторы
под контроль сильных и регулируемых промоторов.
Прежде всего это обусловлено тем, что при выпол
нении генно-инженерных работ манипулировать
плазмидной ДНК более удобно, чем фаговой. Од
нако использование бактериофагов для биосинтеза
рекомбинантных белков имеет определенные пре
имущества. Как известно, выход целевых продук
тов во многом зависит от стабильности рекомби
нантных молекул в процессе хранения и культиви
рования клеток продуцента. Но исследователи час
то сталкиваются с проблемой сегрегационной не
стабильности рекомбинантных плазмид. Она при-
81
СЛАВЧЕНКО И. Ю. И Д Р .
водит к уменьшению числа репликонов, что увели
чивает образование в процессе деления бесплаз-
мидных клеток и соответственно уменьшению ко
нечного выхода целевого продукта.
В то же время рекомбинантные молекулы,
сконструированные на основе бактериофага лямб
да, не утратившего способности к интеграции в
бактериальную хромосому и дальнейшему исклю
чению из нее, характеризуются стабильностью в
лизогенном состоянии (интегрированном в бакте
риальную хромосому) [9, 10] и способностью к
100—200-кратной амплификации клонируемых ге
нов при литическом развитии фага.
Еще одним преимуществом использования фа
говых векторов в биотехнологическом процессе яв
ляется то, что литическое развитие фага заканчи
вается лизисом бактериальной клетки и в резуль
тате этого рекомбинантный белок самопроизвольно
высвобождается из клеток в культуральную среду.
А это позволяет избежать технологических сложно
стей, связанных с извлечением целевого продукта
из бактериальных клеток, особенно в условиях
крупномасштабного производства. Амплификация
генов в составе фага А достигается индукцией
лизогенных или инфекцией реципиентных клеток.
Выражение привнесенных генов может контроли
роваться как собственным промотором, так и одним
из фаговых.
В представленной работе исследовали эффек
тивность экспрессии рекомбинантного альфа-2Ь ин
терферона (ИФН) человека, информация о синтезе
которого привносилась в клетки Е. coli бактериофа
гом лямбда. В исследуемой нами системе биосинте
за рекомбинантного белка увеличение дозы целево
го гена достигалось путем амплификации фагового
вектора, несущего две копии гена ИФН. Изучение
эффективности различных подходов для оптимиза
ции экспрессии рекомбинантного гена в составе
лямбда-вектора и явилось основной целью данной
работы.
Материалы и методы. В работе использованы
следующие штаммы Е, coli и бактериофага лямбда:
К802 (hsdR+, hsdhf, gar, met', SupE), CA77 (#/rC,
B~, Mac), RLM1 (thr, leu, lac", tonA, SupE), SG30
(recA, F, araD139, A(argF lac)U169, flbB5301,
deoCl, rpsL150, relAl, Alon-J00, cps-50::Mu dl, Xs),
SG30 (pIF-16), несущий плазмиду с двумя генами
ИФН под контролем тандема триптофановых про
моторов и геном Ыа, Плазмида pIF-16 любезно
предоставлена В. Г. Коробко (Институт биооргани
ческой химии им. М. М. Шемякина РАН, Москва).
Источниками фагов Aplac5cI857Q~R~ (plac5cI857-
Qamll7Ram54), AcI857Q"R~ (cI857Qaml 17Ram54),
AcI857 (СІ857) и AAZUV5 (plac5cI857 A(sHindIII
X2-sHindIlA3) sRI A0 3sRI A0 4sRI A0 5A(sRJ lacZ-
sHaelll lacZ) UV5) служили лизогенные штаммы
K802 (Xplac5cI857Q~Rl, K802 {XcI857QR), K802
(XcI857) и штамм 300074 (Hfr, lac"74), лизогенный
по фагу AAZUV5. Штаммы получены из коллекции
культур отдела регуляторных механизмов клетки
ИМБиГ НАН Украины и ПНИК «Биотехнолог».
Среды. Для выращивания бактериальных кле
ток использовали жидкую питательную среду Ами-
нопептид производства Ленинградского завода мед-
препаратов, представляющую собой ферментатив
ный гидролизат белка. На ее же основе готовили
1,5 %-ю и 0,5 %-ю агаризованные среды. При
необходимости в среду добавляли ампициллин до
конечной концентрации 20 мкг/мл, а также MgS0 4
из расчета 1 мл 1 М раствора на 1 л среды и
10 %-й раствор мальтозы до конечной концентра
ции 0,5 г/л.
Получение фаголизатов. Фаголизаты получа
ли термоиндукцией лизогенных культур, как опи
сано в работе [11] . Титр определяли общеприня
тым двухслойным методом. В качестве индикатор
ной культуры при титровании фага использовали
штамм Е. coli RLM1. Как правило, получали (1,0—
2 ,5 ) -10 1 0 БОЕ/мл лизата.
Культивирование продуцента. Для получения
целевого продукта индукцией лизогенных клеток,
несущих в своем геноме рекомбинантные фаги с
генами ИФН, питательную среду засевали иноку-
лятом, предварительно выращенным в термостате
при температуре 28 °С в течение ночи. Соотноше
ние объема инокулята к объему среды составляло
1:5. Культуру выращивали на качалке в условиях
интенсивной (160 об/мин) аэрации при температу
ре 28 °С до оптической плотности 1,0. Затем
выдерживали при температуре 43 °С в течение
20 мин и помещали в условия интенсивной аэра
ции при температуре 37 °С до наступления полного
лизиса культуры (до 1,5 ч). В отдельных экспери
ментах изменяли оптическую плотность культуры
при термоиндукции и температуру последующего
культивирования продуцента, о чем отдельно ука
зано в тексте.
Инфицирование реципиентных клеток. Для
получения целевого продукта инфицированием ре
ципиентных клеток в питательную среду вносили
растворы мальтозы и MgS0 4 , засевали инокулятом
Е. coli SG30 или SG30 (pIF-Щ, предварительно
выращенным в термостате при температуре 37 °С в
течение ночи. Соотношение объема инокулята к
объему среды составляло 1:10. Культуру выращива
ли на качалке в условиях интенсивной (160
об/мин) аэрации при температуре 37 °С до оптиче
ской плотности 3,0. После этого инфицировали
82
фагом с множественностью 5—10 корпускул на
клетку и продолжали культивирование в течение
18 ч при температуре 21 °С.
Оптическую плотность (ОП) измеряли на фо
токолориметре КФК-3 (Россия) при Я = 540 нм в
кювете с длиной оптического пути 1 см.
Все генно-инженерные манипуляции, в том
числе приготовление компетентных клеток, транс
формацию и трансфекцию бактерий, выделение
плазмидной и фаговой ДНК, гидролиз эндонуклеа-
зами рестрикции, лигирование и электрофоретиче-
ское разделение фрагментов ДНК, проводили по
стандартным методикам |12 ] .
Рекомбинация in vivo фагов Xplac5cI857QR~ и
XpIF. Лизогенную культуру K802Wplac5cI857Q~R~)
выращивали в жидкой питательной среде при 28 °С
в условиях интенсивной аэрации до плотности
- 1 - Ю 8 клеток в 1 мл и заражали фагом XpIF с
множественностью 5 корпускул на клетку. Для
адсорбции фага на бактериальных клетках инфи
цированную культуру выдерживали 30 мин при
20 °С, а затем разводили ее в 100 раз 0,14 М
раствором NaCl. Для повышения частоты рекомби
нации культуру облучали ультрафиолетом, затем в
50 раз разводили питательной средой, 20 мин
выдерживали при 42 °С, интенсивно аэрировали в
течение 2 ч при 37 °С, после чего клетки разруша
ли хлороформом. Полученный таким образом ли-
зат титровали на газоне культуры K802(Su + ) . За
тем каждую из полученных бляшек откалывали на
две чашки с 1,5 %-й агаризованной средой, на
которую наслаивали 0,5 %-й бактериальный агар,
содержащий клетки Su штамма Е. coli К802 (одна
для дифференциации фагов, другая — как источ
ник отобранных фаговых клонов для дальнейшей
лизогенизации), и еще на одну чашку с агаром,
содержащим клетки Su штамма Е. coli СА77,
Клоны фага, образующие зоны лизиса на газо
не Е. coli K802(5w +), и не образующие зон лизиса
на газоне Е. coli СА77 (Su°), несли амбер-мутации
в Q и R генах. Для отбора пятен, образованных
фагами Яр1Р(3~ЬГ, на них наносили каплю раствора
(4 мг/мл в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0)
о-нитрофенил-^-Б-галактозид (ОНФГ), являюще
гося субстратом для /?-галактозидазы, информацию
о синтезе которой несет фаг Яр1ас5с1857(2~К~. Если
в месте нанесения появлялась желтая окраска, то
данная зона лизиса образована фагом Яр1ас5с1857(2~
R", в лизате которого присутствуют /?-галактозида-
за, расщепляющая ОНФГ с образованием нитрофе
нола, обусловливающего появление желтой окра
ски. Искомые фаги не содержат гена /3-галактози-
дазы и при нанесении раствора ОНФГ на зоны
лизиса, образованные ими, желтой окраски не
О С О Б Е Н Н О С Т И Э К С П Р Е С С И И Ц Е Л Е В О Г О ГЕНА В С О С Т А В Е ВЕКТОРА
появлялось. Для получения лизогенных культур,
несущих такие профаги, соответствующие пятна с
параллельной чашки откалывали в бактериальный
агар К802(£« + ) , содержащий ампициллин, и инку
бировали при температуре 28 °С в течение 1 сут.
Поскольку полученный фаг Яр1Р(3~К~ привносит в
клетку маркер устойчивости к ампициллину, то
вокруг места укола лизогенизированные им клетки
образовывали зону роста. Выросшие бактерии рас-
севали на агаризованную среду, содержащую ампи
циллин, и инкубировали при 28 °С. Затем отдель
ные колонии откалывали на две чашки, одну из
которых выдерживали при 28, а другую при 43 °С.
Колонии, выросшие на среде с антибиотиком при
28 °С и не выросшие при 43 °С, отбирали для
получения фаголизатов, которые затем титровали
на Su° и Su индикаторных культурах. Фаги, даю
щие на Ckll(Su) титр, на несколько порядков
ниже, чем на K802(£w + ), отбирали как несущие
фаги Яр1Р(3~К" и использовали в исследованиях.
Определение количественного содержания
ИФН в лизатах осуществляли методом иммуно-
ферментного анализа (ИФА) согласно [13] . Для
анализа использовали мышиные моноклональные и
кроличьи поликлональные антитела (AT) к альфа-
ИФН, антикроличьи AT, конъюгированные с пе-
роксидазой хрена производства ТОО «Протеиновый
контур» (Россия). В качестве стандарта использо
вали препарат а2-ИФН человека, полученный от
В. П. Кузнецова (Институт эпидемиологии и мик
робиологии им. Н. Ф. Гамалеи, Россия). Оптиче
скую плотность в лунках определяли при 492 нм на
приборе «Multiskan» («Flow-Lab», Великобрита
ния).
Результаты и обсуждение. Для изучения уров
ня экспрессии целевых генов в составе вектора на
основе бактериофага лямбда и путей ее оптимиза
ции нами сконструированы рекомбинантные фаги,
несущие тандем генов ИФН. В качестве лямбда-
вектора использовали вектор XAZUV5, содержащий
уникальный EcoRI сайт рестрикции и позволяю
щий встраивать в него клонируемые фрагменты
ДНК под контроль lac промотора, несущего UV5
мутацию [14] . В данном векторе 11,5 % генома
делетировано и поэтому его емкость позволяет
встраивать в него чужеродный фрагмент ДНК ве
личиной до 6,7 тыс п. н. Источником информации
для синтеза целевого продукта служила имеющая
ся в нашем распоряжении плазмида pIF-16, несу
щая тандем искусственных генов ИНФ (рис. 1).
Конститутивную экспрессию этих генов обеспечи
вает тандем триптофановых промоторов. Плазмида
сконструирована таким образом, что трансляция
целевых генов происходит по принципу сопряже-
83
СЛАВЧЕНКО И. Ю. И Д Р .
Рис. 1. Схема плазмиды pIF-16. Указаны EcoRI- и ЛТмУ-сайты
рестрикции, использованные при клонировании плазмидной
ДНК в лямбда-вектор. Рь.р и L — соответственно промотор и
часть гена лидерного пептида триптофанового оперона [15]
ния в искусственном полицистроне [15] . Размер
плазмиды pIF-16 (~ 4,8 тыс. п. н.) и наличие в ней
уникального EcoRI-сайта рестрикции, который не
затрагивает ни генов интерферона, ни тандема
триптофановых промоторов, делают возможным
встраивание в фаговый вектор всей плазмидной
ДНК, включая тандем генов ИФН, тандем трипто
фановых промоторов и ген Ыа, детерминирующий
устойчивость клеток к ампициллину. Для констру
ирования рекомбинантного фага, несущего плазми-
ду с двумя генами ИФН, можно также использо
вать и Xbal-сшт рестрикции, который в фаге
находится на расстоянии ~ 2 , 2 тыс. п. н. от EcoRI-
сайта (рис. 2). ДНК плазмиды pIF-16 имеет два
Xbal-cawva рестрикции на расстоянии всего 102 п.
н. друг от друга и 496 п. н. от EcoRI-саша (рис. 1).
В данной работе конструирование рекомбинантного
фага с генами ИФН проводили в двух вариантах.
В первом варианте предварительно выделен
ную фаговую и плазмидную ДНК подвергали гид
ролизу £соі?/-рестриктазой и полученные EcoRI-
фрагменты обрабатывали ДНК-лигазой. В этом
случае фаговый вектор использовали как вектор
внедрения. В сконструированных таким образом
рекомбинантных фагах гены интерферона могут
быть в двух различных ориентациях и в зависимо
сти от этого на их транскрипцию могут влиять
либо PL и Р 1 а с промоторы (рис. 3, я), либо PR,
промотор фага (рис. 3, б).
Во втором варианте ДНК фага и плазмиды
подвергали совместному гидролизу EcoRI- и Xbal-
рестриктазами и полученные EcoRI-ХЬаІ-фрагмен-
ты обрабатывали ДНК-лигазой. В этом случае
фаговый вектор использовали как вектор замеще
ния, меняя EcoRI-Xbal-djpparMtHT ДНК фага на
EcoRI-XbaI-фрагмтт ДНК плазмиды. При этом
фаг должен содержать вставку с заведомо извест
ной ориентацией. В таких рекомбинантных фагах
отсутствует Р 1 а с промотор, поскольку он входит в
состав замещенного EcoRI-XbaI-фратмтта фага и
поэтому на транскрипцию генов ИФН в фагах
такой конструкции может оказывать влияние толь
ко Ръ промотор (рис. 3, б).
Полученные, как описано выше, рекомбинант-
ные фаговые ДНК трансфицировали в реципиент-
ные клетки, размножали на бактериальном газоне
и использовали для лизогенизации клеток штамма
Е. coli К802. Лизогены, дающие рост при темпера
туре 28 °С на среде с ампициллином, отбирали
как содержащие рекомбинантные фаги. Поскольку
используемый нами в качестве вектора фаг
AAZUV5 несет ^-мутацию в с/-гене, кодирующем
репрессор, то термоиндукция этих лизогенов при
водит к литическому развитию фага, в ходе кото
рого происходит выщепление профага из бактери
альной хромосомы, амплификация фагового генома
и вновь синтезированные копии фаговой ДНК упа
ковываются в белковую оболочку. Из полученных
фаговых корпускул выделяли ДНК рекомбинант
ных фагов и анализировали ее с помощью эндонук-
леаз Xbal, Xhol, EcoRI, КрпІ. В результате отобра-
Рис. 2. Карта генома бактериофага
лямбда. Указаны наиболее важные ге
ны и их роль в развитии фага. На
правление транскрипции, инициируе
мой с PL, PR, Я К м промоторов, a
также с РїйС промотора в векторе
AAZUV5 указано толстыми стрелками.
Тонкими стрелками показано располо
жение уникальных EcoR J - и Xbal-
сайтов р е с т р и к ц и и в Д Н К фага
AAZUV5, использованных для клони
рования плазмидной ДНК, несущей
гены интерферона в данный вектор.
Масштаб не соблюден
84
О С О Б Е Н Н О С Т И Э К С П Р Е С С И И Ц Е Л Е В О Г О ГЕНА В С О С Т А В Е В Е К Т О Р А
Рис. 3. Схематическая карта
рекомбинантных молекул
ф а г а ApIF, п о л у ч е н н ы х
встраиванием ДНК плазми -
ды pIF-16 в лямбда-вектор
AAZUV5: а, б — плазмида
pIF-16 встроена по EcoRI-
сайту; направление транс
крипции генов интерферона
(ifn) в варианте а совпадает
с направлением транскрип
ции с промоторов PL и Р , а с ,
в варианте б — с промотора
PR-; в — EcoRl-Xbal-фраг
мент ДНК плазмиды заме
щ е н на EcoRI-Xbal-фраг
мент Д Н К фага AAZUV5;
направление транскрипции
генов интерферона совпада
ет с направлением транс
крипции с промотора Pi
ны все три ожидаемых варианта рекомбинантных
фагов, несущих вставку с двумя генами ИФН.
В ходе дальнейших исследований установлено,
что наличие в клетке профага с двумя генами
интерферона не оказывает на нее неблагоприятного
воздействия, в частности, не вызывает снижения
скорости роста культуры и накопления биомассы
при 28 ° С В случае выращивания лизогенной
культуры при такой температуре рекомбинантный
фаг интегрирован в бактериальную хромосому, ре
плицируется вместе с ней и передается дочерним
клеткам как часть родительского генома. При этом
PL и PR промоторы фага репрессированы и, следо
вательно, репрессировано выражение всех фаговых
генов, за исключением гена-репрессора сі (рис. 2).
Однако в сконструированных в данной работе фа
гах гены ИФН и Ыа находятся под контролем
собственных промоторов и поэтому конститутив
ный синтез продуктов этих генов может иметь
место как при лизогенном, так и при литическом
развитии фага. Если рекомбинантный фаг содер
жит /ас-промотор, то транскрипция, инициируемая
с этого промотора, также не подвержена фаговой
регуляции.
Хотя экспрессия целевого продукта возможна и
при лизогенном пути развития фагов с генами
ИФН, ожидать высокого выхода рекомбинантного
белка при культивировании лизогенных клеток нет
оснований, поскольку в лизогенной клетке присут
ствуют только две копии гена ИФН. Увеличения
выхода целевого продукта, синтезируемого на ос
нове генетической информации, привнесенной в
клетку бактериофагом, можно добиться индукцией
лизогенных или инфицированнием реципиентных
клеток, т. е. в таких условиях, при которых обес
печивается литическое развитие фага, заканчиваю
щееся лизисом клетки. В ходе литического разви
тия происходит амплификация фагового генома,
образуются 100—200 копий фаговой ДНК и, следо
вательно, встроенных в нее целевых генов. С
увеличением количества копий целевого гена дол
жно соответственно увеличиться и количество син
тезируемого целевого продукта.
Эффективность экспрессии генов интерферона
в составе полученных нами рекомбинантных фагов
регистрировали по количеству интерферона в лиза-
тах термоиндуцированных лизогенных культур, в
которых в результате повышения температуры
инактивировался термолабильный фаговый репрес-
сор и начиналось продуктивное развитие фага,
заканчивающееся лизисом бактериальной клетки.
Процесс проводили в стандартных условиях, опи
санных в разделе «Материалы и методы». Установ
лено, что выход ИФН при термоиндукции лизоген
ной культуры, содержащей фаг с двумя генами
интерферона, не зависит от их ориентации. Коли
чество ИФН в лизатах колебалось в пределах от
0,6 до 1,8 мг/л. Однако статистически достоверной
разницы в выходе ИФН, обеспечиваемом фагами
трех разных конструкций, не наблюдалось. На
основании полученных данных можно предполо
жить, что Ph , PR. и РЫс промоторы не влияют
положительно на синтез интерферона из-за конвер
гентной транскрипции, при которой синтез РНК
взаимно подавляется за счет столкновения молекул
РНК-полимераз, движущихся в противоположных
направлениях [16] .
Так, конструкция донорной плазмидной ДНК,
содержащей два гена ИФН, такова, что РНК-поли-
мераза, осуществляющая транскрипцию с фагового
85
СЛАВЧЕНКО И. Ю. И Д Р .
Титр ИФН,
мг/л
25
20
15-
10
1,0 2,0 4,0
017 при термоиндукции
Рис. 4. Влияние на выход И Ф Н оптической плотности лизоген-
ной культуры K802(ApIF-8) при термоиндукции и последующе
го температурного режима культивирования клеток (7 — 37;
2 — 28 °С)
промотора, направление которой совпадает с на
правлением транскрипции генов интерферонов, во
всех трех конструкциях рекомбинантных фагов
сталкивается с РНК-полимеразой, осуществляю
щей транскрипцию Ыа гена (рис. 3).
При получении рекомбинантного белка в сис
теме биосинтеза с использованием бактериофага
лямбда синтез целевого продукта прекращается в
результате лизиса бактериальной клетки. Однако
этот процесс можно отодвинуть во времени, тем
самым увеличив время экспрессии целевого гена,
биосинтеза целевого белка и соответственно его
выхода. Одним из таких подходов является исполь
зование фагов с мутациями в некоторых регулятор-
ных генах, а также в генах, ответственных за
лизис бактериальной клетки. Так, ранее нами по
казано, что введение амбер-мутаций в Q и R гены
фага лямбда приводит к увеличению выхода целе
вого продукта [17—19]. Очень важным моментом
является то, что фаги, несущие амбер-мутации в
этих генах, сохраняют способность лизировать
клетку, что обеспечивает накопление целевого про
дукта непосредственно в культуральной среде.
Для изучения эффективности использования в
биотехнологическом процессе фага лямбда с двумя
генами ИФН и амбер-мутациями в Q и R генах
нами получен фаг ApIFQ~R~ методом рекомбинации
in vivo фагов Aplac5cI857Q~R~ и фага ApIF-8, конст
рукция которого соответствует указанной на рис 2,
а. Уровень биосинтеза целевого продукта анализи
ровали в лизатах, полученных термоиндукцией
лизогенных культур. Согласно ИФА, количество
ИФН в фаголизате клеток Е. coli K802(ApIFQ~R~)
было более чем в три раза выше по сравнению с
лизатом культуры K802(AplF-8). При этом титр
фага в лизатах всех проанализорованных клонов
фага ApIFQ~R~ был на порядок ниже относительно
исходного фага ApIF-8 без мутаций в Q и R генах.
Нам также удалось достигнуть увеличения вы
хода ИФН при изменении температурного режима
культивирования лизогенной культуры K802(ApIF-
8) после термоиндукции. Как правило, для продук
тивного развития фага после термоиндукции бакте
риальные клетки выдерживают при 37 °С, мы же в
своих экспериментах снизили температуру до
28 °С. Такой подход для оптимизации экспрессии
рекомбинантного гена в составе лямбда-вектора
при термоиндукции лизогенной культуры исполь
зован впервые и, в отличие от введения амбер-му
таций в Q и R гены рекомбинантного фага, поло
жительный результат не был столь очевиден. С
одной стороны, снижение температуры культиви
рования клеток, в которых началось литическое
развитие фага, тоже должно замедлить лизис кле
ток. Так, если культуру культивировали при тем
пературе 37 °С, то полный лизис наблюдали через
60—80 мин, а при 28 °С — не менее чем через
120—180 мин. С другой стороны, хотя время рабо
ты целевого гена при этом продлевается, его экс
прессия проходит не при оптимальном температур
ном режиме. Тем не менее, такой подход также
позволил увеличить выход целевого белка прибли
зительно в 2,7 раза.
Неожиданный и интересный результат получен
нами при изучении влияния на выход ИФН опти
ческой плотности лизогенной культуры K802(ApIF-
8) при термоиндукции. В стандартных условиях
термоиндукцию начинали, когда ОП культуры до
стигала ~1 ,0 . Как известно, термоиндукция лизо
генной культуры при высокой плотности клеток
часто является причиной низкого титра фага. Поэ
тому исследователи отдают предпочтение именно
такой плотности клеток для получения фаголизата
с высоким титром фага. Однако, поскольку в дан
ной работе перед нами стояла задача изучения
условий, положительно влияющих на выход реком
бинантного белка, а не на титр фага, мы провели
серию экспериментов, в которых термоиндукцию
лизогенной культуры K802(ApIF-8) осуществляли
при ОП 1,0; 2,0 и 4,0, с последующим культивиро
ванием клеток как при температуре 37, так и
28 ° С Для количественного определения ИФН в
полученных лизатах их подвергали ИФА. Как
показывают результаты ИФА, представленные на
рис 4, увеличение ОП клеток при термоиндукции
86
О С О Б Е Н Н О С Т И Э К С П Р Е С С И И Ц Е Л Е В О Г О ГЕНА В С О С Т А В Е ВЕКТОРА
с 1,0 до 2,0 и 4,0 не привело к повышению титра
ИФН в лизатах, полученных при 37 °С. Однако в
лизатах, полученных при температуре 28 °С, вы
ход ИФН повысился на порядок, хотя ОП клеток
K802(ApIF-8) при термоиндукции увеличили толь
ко в два раза. Таким образом, манипулируя таки
ми параметрами, как оптическая плотность куль
туры при термоиндукции рекомбинантного фага и
температурный режим культивирования, нам уда
лось повысить выход целевого продукта до 20 мг/л
лизата.
В следующей серии экспериментов изучали
уровень синтеза целевого белка при инфицирова
нии реципиентных клеток рекомбинантным фагом
с генами ИФН. Для этого клетки штамма Е. coli
SG30 инфицировали фагом ApIF-8 с множественно
стью 5—10 корпускул на клетку. Использование
для этой цели фага ApIFQ~R~, у которого титр был
на порядок ниже, было нецелесообразным, по
скольку не обеспечивалась высокая множествен
ность инфекции, необходимая для эффективного
процесса синтеза целевого белка. В результате
проведенных исследований установлено, что инфи
цирование реципиентных клеток фагом ApIF-8
обеспечивало выход ИФН до 40 мг/л лизата, что
выше по сравнению с выходом целевого белка при
термоиндукции. Однако инфицирование клеток
штамма Е. coli SG30(pIF-16), несущего плазмиду с
двумя генами ИФН, фагом AcI857Q~R~ без генов
ИФН обеспечивало более высокий выход целевого
продукта — до 70 мг/л.
Мы предприняли попытку улучшить данный
результат, увеличив в клетке дозу целевого гена
путем заражения клеток SG30(pIF-16) фагом ApIF-
8. В такой системе экспрессируются четыре гена
ИФН — два в составе плазмиды и два в составе
фага. Однако в ходе исследований нами было
установлено, что увеличение в клетке штамма-про
дуцента дозы целевого гена за счет двух дополни
тельных копий в составе фага не привело к стати
стически достоверному повышению выхода целево
го продукта. При анализе этих данных, следовало
учесть то, что фаг AcI857Q~R" в отличие от фага
ApIF-8 несет мутации в Q и R генах, а это может
обеспечивать положительный эффект, равноцен
ный увеличению дозы гена. Поэтому мы провели
исследования, в которых сравнили выход ИФН при
инфицировании клеток штамма Е. coli SG30(pIF-
16) фагами AcI857Q~R~, AcI857 и ApIF-8. Получен
ные результаты показали, что выход рекомбинант
ного белка сопоставим при использовании в био
технологическом процессе каждого из этих фагов,
что свидетельствует об отсутствии положительного
эффекта при увеличении дозы гена и амбер-мута-
ций в Q и R генах фага в условиях данного
эксперимента.
Таким образом, в ходе работы сконструирова
ны фаги лямбда, несущие плазмиду с двумя генами
альфа-2Ь ИФН человека. Экспрессия целевых ге
нов в рекомбинантных молекулах находится под
контролем регуляторных элементов, локализован
ных на плазмиде, а именно — тандема триптофа-
новых промоторов. Показано, что экспрессия генов
ИФН не зависит от ориентации встроенной плаз
миды, а наличие Q и R мутаций в фаге с генами
ИФН существенно увеличивает выход ИФН при
термоиндукции лизогенов. Манипулирование таки
ми параметрами, как оптическая плотность лизо
генной культуры при термоиндукции рекомбинант
ного фага и последующий температурный режим
культивирования клеток, позволяет более чем на
порядок повысить выход целевого белка. Получе
ние альфа-2Ь ИФН человека путем инфицирова
ния реципиентных клеток также является одним из
эффективных подходов для оптимизации экспрес
сии целевых генов в составе фаговой ДНК и
технологически приемлемым способом получения
рекомбинантных белков.
Л Yu, Slavchenko, V. A. Shmidt, S. I. Chernykh, V. A. Kordyum
Peculiarities of a target gene expression in the structure of the phage
lambda-base vector and investigation of ways of its optimization
Summary
High stability of the cloned gene in the lysogenic state and high copy
number in the lytic state suggest a potential use of phage X as an
expression vector for overproduction of the extracellular recom
binant proteins which release to the growth medium as a result of
lysis of E. coli cells by phage. This paper describes the construction
and characterization of phage XpIF carrying the two copy of an
artificial gene for human a2 interferon (IFN) under control of the
Ptrp tandem promoter. The expression of the foreign genes realized
by thermal induction cells carrying the phage XpIF as well as by
infection of recipient cells with this phage. In this study it was
shown that the recombinant protein yield is dependent on a cell
density at the time of thermal induction and the following tempe
rature of producer cultivation. The increase of soluble target protein
concentration in lysates after induction of recombinant phage was
also observed using the phage XpIF contains amber-mutations in
genes Q and R. The infection of recipient cells by phage XpIF
resulted in higher I FN yield (about 40 mg per I) than thermal
induction of the cells carrying the phage X with target genes.
І. Ю. Славченко, В. А. Шмідт, С. I. Ч ер них, В. А. Кордюм
Особливості експресії цільового гена у складі вектора на основі
бактеріофага лямбда та вивчення шляхів її оптимізації
Резюме
Рекомбінантні молекули на основі бактеріофага лямбда відріз
няються високою сегрегаційною стабільністю у лізогенному
стані і високим рівнем ампліфікації фагової ДНК та від
повідно вбудованого в неї цільового гена за літичного розвитку
87
СЛАВЧЕНКО И. Ю. И Д Р .
фага, який закінчується лізисом бактеріальної клітини і
вивільненням цільового продукту в культуральне середовище.
Це робить перспективним використання фага лямбда для
отримання рекомбінантних білків. У даному повідомленні
описано конструювання фага XpIF, який несе дві копії штучно
го гена інтерферону (ІФН) людини під контролем тандему
триптофанових промоторів. Експресію чужорідних генів здій
снювали термоіндукціею клітин, які несуть фаг з генами
ІФН, а також інфекцією цим фагом реципієнтних клітин.
Показано, що вихід рекомбінантного білка залежить від оп
тичної густини клітин при термоіндукції і наступного тем
пературного режиму культивування продуцента. Збільшення
вмісту ІФН у лізатах після індукції також спостерігали при
використанні Q R амбер-мутантів фага XpIF. Показано, що
інфікування реципієнтних клітин фагом XpIF забезпечує ви
щий вихід ІФН (біля 40 мг/л), ніж термоіндукиія клітин
Escherichia сой, які несуть фаг з цільовими генами.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Lee N., Cozzitorto J., Wainwright N., Testa D. Cloning with
tandem gene systems for high level gene expression / / Nucl.
Acids Res .—1984.—12, N 17.—P. 6797—6812.
2. Sun H. Y., Liu X. H., Liang S. W. Gene construction,
expression, and characterization of double-copy truncated form
of human insulin-like growth factor I / / Acta Pharmacol,
s in .—2001.—22, N 7.—P. 624—628.
3. Lennick M., Haynes J. R., Shen S. H. High-level expression
of alpha-human atrial natriuretic peptide from multiple joined
genes in Escherichia coli II G e n e . — 1 9 8 7 . - 6 1 , N 1.—
P. 103—112.
4. Koyama Y., Nakano E. Cloning of the glpK gene of Es
cherichia coli K-12 and its overexpression using a «sleeper»
bacteriophage vector / / Agr. Biol. Chem.—1990.—54, N 5 .—
P. 1315—1316.
5. Moir A., Brammar W. J. The use of specialised transducing
phages in the amplification of enzyme production / / Мої. and
Gen. Genet .—1976.—149.—P. 87—99.
6. Drew R. E., Clarke P. H., Brammar W. J. The construction in
vitro of derivatives of bacteriophage lambda carrying the
amidase genes of Pseudomonas aeruginosa II Мої. and Gen.
Genet .—1980.—177, N 2.—P. 311—320.
7. А. с. СССР № 600175. Способ биосинтеза биологически
активного вещества / В. А. Кордюм, С. И. Черных / /
Опубл. в БИ № 12, 1978.
8. Steffen D., Schleif R. Overproducing araC protein with
lambda-arabinose transducing phage / / Мої. and Gen. Ge
net .—1977.—157, N 3 .—P. 333—339.
9. Park Т. H., Seo J.-H., Lim H. C. Two-stage fermentations with
bacteriophage X as an expression vector in Escherichia coli 11
Biotechnol. and Bioeng.—1991.—37.—P. 297—302.
10. Padukone N., Peretti S. W., О lis D. F. X vectors for stable
cloned gene expression / / Biotechnol. Progr.—1990.—6.—
P. 277—282.
11. Славченко И. Ю. Отбор чувствительных к бактериофагу X
клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli II
Біополімери і клітина.—2001.—17, № 2.—С. 160—165.
12. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической
инженерии. Молекулярное клонирование.—М.: Мир,
1984.—479 с.
13. Иовлев В. И., Соловьева И. Е., Степанов А. Н. Коли
чественное определение интерферона методом иммуно-
ферментного анализа / / Тр. Ленингр. НИИ эпидемиологии
и микробиологии.—1988.—64.—С. 108—113.
14. Charnay P., Ix>uise A., Fritsch A., Perrin IX, Tiollais Р
Bacteriophage lambda—Е. coli K12 vector-host system for
gene cloning and expression under lactose promoter control. II.
DNA fragment insertion at the vicinity of the lac UV5 promoter
/ / Мої. and Gen. Genet .—1979.—170, N 2.—P. 171 — 178.
15. Кравченко В. В., Гилева И. П., Шамин В. В., Куличков В.
А., Добрынин В. Н., Филиппов С. А., Чу впило С. А.,
Коробко В. Г. Дупликация синтетического гена лейкоци
тарного интерферона человека и его экспрессия в составе
полицистронных мРНК с сопряженной системой трансля
ции / / Биоорг. химия.—1987 .—13, № 9.—С. 1186—1 193.
16. Ward D. F., Murray N. Е. Convergent transcription in
bacteriophage: interference with gene expression / / J. Мої.
Biol .—1979.—133, N 2.—P. 249—266.
17. Глушакова Л. Г., Черных С. И., Стельмашенко Л. Н.,
Кордюм В. А. Суперсинтез /?-галактозидазы в клетках
Escherichia coli, индуцируемый некоторыми амбер-мутан-
тами фага Яр1ас5с1857 / / Молекуляр. биология.—1982.—
30 .—С. 37—47.
18. Славченко И. Ю., Черных С. И., Кордюм В. А. Иссле
дование сЬагозависимого синтеза /?-лактамазы в изогенных
Su+ и Su штаммах Е. coli при заражении их фагами АЫа
и AblaQ~R~ / / Ферменты микроорганизмов.—М.: ВНИИ-
СЭНТИ, 1989.—С. 31—36.
19. Славченко И. Ю. Исследование эффективности исполь
зования бактериофага X для получения а2-интерферона
человека в клетках Escherichia coli: Автореф. дис. ... канд.
биол. наук.—Киев, 1990.—19 с.
УДК 579.258+577.124
Надійшла до редакції 21.08.02
о о
|