Бактеріальна експресія та мічення ізотопами ¹³C/¹⁵N цитокіну EMAP II для структурних досліджень методом ЯМР-спектроскопії - Ложко, Д.М.; Жуков, I.Ю.; Корнелюк, О.І. (Вiopolymers and Cell, 2011)
Мета. Отримання рекомбінантного цитокіна EMAP II в препаративних кількостях з використанням
бактеріальної експресії та його ізотопне мічення для дослідження просторової структури методами
мультивимірної ЯМР-спектроскопії. Методи. EMAP II експресовано в клітинах Еscherichia соli BL21 (DE3)pLysE на мінімальному середовищі з міченням ізотопами ¹³C/¹⁵N та очищено методом метал-хелатуючої хроматографії на Ni-NTA-агарозі. Для перевірки маси і чистоти мічених рекомбінантних
білків застосовано метод мас-спектрометрії. Одержано двомірні ЯМР-спектри рекомбінантного цитокіну EMAP II у розчині. Результати. Отримано препарати рекомбінантного білка EMAP II, мічені ізотопами ¹³C/¹⁵N, які проаналізовано методом ЯМР-спектроскопії. Висновки. Дисперсія сигналів ЯМР у двомірних спектрах ¹H/¹⁵N і
¹³C/¹⁵N-HSQC підтверджує наявність компактної тривимірної структури
білка. Ізотопно мічені препарати EMAP II зберігають стабільність протягом 5–6 днів, що дає можливість подальшого визначення просторової структури білка в розчині методом ЯМР-спектроскопії.
Ключові слова: цитокін, EMAP II, ізотопне мічення, мас-спектрометрія, ЯМР-сектроскопія, двомірні спектри. Цель. Получение рекомбинантного цитокина EMAP II в препаративных количествах с использованием бактериальной экспрессии и его изотопное мечение для исследования пространственной структуры методами мультимерной ЯМР-спектроскопии. Методы. EMAP II экспрессирован в клетках Еscherichia соli BL21
(DE3)pLysE на минимальной среде с мечением изотопами ¹³C/¹⁵N, а также очищен методом металл-хелатирующей хроматографии на Ni-NTA-агарозе. Для проверки массы и чистоты меченых рекомбинантных белков применен метод масс-спектрометрии. Получены двухмерные ЯМР-спектры рекомбинантного цитокина EMAP II в растворе. Результаты. Выделены препараты
рекомбинантного белка EMAP II, меченные изотопами ¹³C/¹⁵N,
которые исследовали методом двухмерной ЯМР-спектроскопии.
Выводы. Дисперсия сигналов ЯМР в спектрах ¹H/¹⁵N и
¹³C/¹⁵NHSQC подтверждает наличие компактной трехмерной структуры белка. Изотопно меченные препараты EMAP II сохраняют
стабильность на протяжении 5–6 дней, что дает возможность
дальнейшего определения пространственной структуры белка в
растворе методом ЯМР-спектроскопии.
Ключевые слова: цитокин, EMAP II, изотопное мечение, массспектрометрия, ЯМР-спектроскопия, двухмерные спектры. Aim. Bacterial expression and isotopic labeling of recombinant EMAP
II in preparative scale with the aim to study its spatial structure by
NMR spectroscopy. Methods. The recombinant ¹⁵N, ¹³C/¹⁵-double labeled
EMAP II protein was expressed in Еscherichia соli BL21(DE3) pLysE
on M9 minimal medium and purified by metal-chelated chromatography on Ni-NTA agarose. Quality of obtained for NMR studies ¹H/¹⁵N і ¹³C/¹⁵-double labeled EMAP II was confirmed by mass spectroscopy and used for preparation of NMR samples. Results. The preparations of ¹⁵N and ¹³C/¹⁵N double labelled EMAP II were obtained.
The recorded NMR spectra of EMAP II were analyzed. Conclusions.
Dispersion of NMR signals in two-dimensional ¹H/¹⁵N і ¹³C/¹⁵NHSQC spectra confirm the presence of compact three-dimensional
structure of the protein. The NMR samples were stable at least for 5–6
days at chosen conditions. These results will be used as a starting point
for determination of high resolution three-dimensional structure of
recombinant EMAP II cytokine in solution by NMR spectroscopy.
Keywords: cytokine, EMAP II, isotopic labeling, mass
spectroscopy, NMR spectroscopy, two-dimensional spectra.