Клонирование и экспрессия гена SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli

Цель. Клонировать ген SPAА – поверхностный антиген Er. rhusiopathiae – в плазмидный вектор и экспрессировать белок SpaА в E. coli. Методы. Расчет и синтез олигонуклеотидных праймеров, полиме - разная цепная реакция, клонирование, экспрессия рекомбинантных белков в E. coli, электрофорез в агарозе и...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Veröffentlicht in:	Вiopolymers and Cell
Datum:	2011
Hauptverfasser:	Дерябин, О.Н., Дерябина, Е.Г., Гильчук, П.В.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2011
Schlagworte:	Short Communications
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156390
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Клонирование и экспрессия гена SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli / О.Н. Дерябин, Е.Г. Дерябина, П.В. Гильчук // Вiopolymers and Cell. — 2011. — Т. 27, № 4. — С. 310-313. — Бібліогр.: 11 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156390
record_format	dspace
spelling	Дерябин, О.Н. Дерябина, Е.Г. Гильчук, П.В. 2019-06-18T12:36:14Z 2019-06-18T12:36:14Z 2011 Клонирование и экспрессия гена SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli / О.Н. Дерябин, Е.Г. Дерябина, П.В. Гильчук // Вiopolymers and Cell. — 2011. — Т. 27, № 4. — С. 310-313. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00010D https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156390 619:616.988:616-076 Цель. Клонировать ген SPAА – поверхностный антиген Er. rhusiopathiae – в плазмидный вектор и экспрессировать белок SpaА в E. coli. Методы. Расчет и синтез олигонуклеотидных праймеров, полиме - разная цепная реакция, клонирование, экспрессия рекомбинантных белков в E. coli, электрофорез в агарозе и полиакриламидном геле. Результаты. Полноразмерный и усеченный ген SPAА Er. rhusiopathiae клонирован в экспрессирующую плазмиду рЕТ24а(+). Экспрессия полного гена не сопровождается наработкой значительного количества рекомбинантного белка, предположительно, вследствие его токсичности для клеток E. coli. Элиминация из полноразмерного гена фрагмента, кодирующего насыщенную пролином область, и домена тандемных повторов, а также получение усеченного варианта гена приводят к устойчивому синтезу рекомбинантного продукта с ожидаемой молекулярной массой. Выводы. Получена рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент гена SPAА Er. rhusiopathiae, что позволяет выделять в препаративних количествах в E. coli рекомбинантный белок с м. м. 47 кДа. Ключевые слова: Erysipelothrix rhusiopathiae, ген SPAА, рекомбинантный белок. Aim. Cloning of Er. rhusiopathiae surface antigen – SPAА gene into plasmid vector and its expression in E. coli. Methods. Oligonucleotide primers design and synthesis, polymerase chain reaction, cloning, recombinant proteins expression in E. coli, electrophoresis in agarose, PAGE. Results. The full-size and truncated Er. rhusiopathiae SPAА genes were cloned into expression plasmid рЕТ24а(+). The expression of full-size gene didn't result in significant recombinant protein production, presumably due to its toxicity for E. coli cells. The elimination of fragment coding for proline-rich region and tandem repeats domain from full-size gene led to production truncated variant of recombinant protein with expected molecular mass. Conclusions. The recombinant plasmid containing fragment of Er. rhusiopathiae SPAА gene was constructed. It allows obtaining preparative amount recombinant protein with m. m. 47 kDa in E. coli. Keywords: Erysipelothrix rhusiopathiae, SPAА gene, recombinant protein. Мета. Клонувати ген SPAА – поверхневий антиген Er. rhusiopathiae – у плазмідний вектор та експресувати білок SpaА в E. coli. Методи. Розрахунок і синтез олігонуклеотидних праймерів, полімеразна ланцюгова реакція, клонування, експресія рекомбінантних білків у Е.coli, електрофорез в агарозі та поліакриламідному гелі. Результати. Повнорозмірний і усічений ген SPAА Er. rhusiopathiae клоновано в експресуючу плазміду рЕТ24а(+). Експресія повного гена не супроводжується синтезом значної кількості рекомбінантного білка, очевидно, внаслідок його токсичності для клітин E. coli. Елімінація з повнорозмірного гена фрагмента, що кодує насичену проліном ділянку, і домену тандемних повторів, а також одержання усіченого варіанта гена призводять до стабільного синтезу рекомбінантного продукту з очікуваною молекулярною масою. Висновки. Отримано рекомбінантну плазміду, яка містить фрагмент гена SPAА Er. rhusiopathiae, що дозволяє виділяти у препаративних кількостях в E. coli рекомбінантний білок з м. м. 47 кДа. Ключові слова: Erysipelothrix rhusiopathiae, ген SPAА, рекомбінантний білок ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Вiopolymers and Cell Short Communications Клонирование и экспрессия гена SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli Cloning and expression of Erysipelothrix rhusiopathiae SPAА gene in Escherichia coli Клонування та експресія гена SPAА Erysipelothrix rhusiopathiae в Escherichia coli Article published earlier
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
title	Клонирование и экспрессия гена SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli
spellingShingle	Клонирование и экспрессия гена SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli Дерябин, О.Н. Дерябина, Е.Г. Гильчук, П.В. Short Communications
title_short	Клонирование и экспрессия гена SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli
title_full	Клонирование и экспрессия гена SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli
title_fullStr	Клонирование и экспрессия гена SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli
title_full_unstemmed	Клонирование и экспрессия гена SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli
title_sort	клонирование и экспрессия гена spaа еrysipelothrix rhusiopathiae в еscherichia coli
author	Дерябин, О.Н. Дерябина, Е.Г. Гильчук, П.В.
author_facet	Дерябин, О.Н. Дерябина, Е.Г. Гильчук, П.В.
topic	Short Communications
topic_facet	Short Communications
publishDate	2011
language	Russian
container_title	Вiopolymers and Cell
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
format	Article
title_alt	Cloning and expression of Erysipelothrix rhusiopathiae SPAА gene in Escherichia coli Клонування та експресія гена SPAА Erysipelothrix rhusiopathiae в Escherichia coli
description	Цель. Клонировать ген SPAА – поверхностный антиген Er. rhusiopathiae – в плазмидный вектор и экспрессировать белок SpaА в E. coli. Методы. Расчет и синтез олигонуклеотидных праймеров, полиме - разная цепная реакция, клонирование, экспрессия рекомбинантных белков в E. coli, электрофорез в агарозе и полиакриламидном геле. Результаты. Полноразмерный и усеченный ген SPAА Er. rhusiopathiae клонирован в экспрессирующую плазмиду рЕТ24а(+). Экспрессия полного гена не сопровождается наработкой значительного количества рекомбинантного белка, предположительно, вследствие его токсичности для клеток E. coli. Элиминация из полноразмерного гена фрагмента, кодирующего насыщенную пролином область, и домена тандемных повторов, а также получение усеченного варианта гена приводят к устойчивому синтезу рекомбинантного продукта с ожидаемой молекулярной массой. Выводы. Получена рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент гена SPAА Er. rhusiopathiae, что позволяет выделять в препаративних количествах в E. coli рекомбинантный белок с м. м. 47 кДа. Ключевые слова: Erysipelothrix rhusiopathiae, ген SPAА, рекомбинантный белок. Aim. Cloning of Er. rhusiopathiae surface antigen – SPAА gene into plasmid vector and its expression in E. coli. Methods. Oligonucleotide primers design and synthesis, polymerase chain reaction, cloning, recombinant proteins expression in E. coli, electrophoresis in agarose, PAGE. Results. The full-size and truncated Er. rhusiopathiae SPAА genes were cloned into expression plasmid рЕТ24а(+). The expression of full-size gene didn't result in significant recombinant protein production, presumably due to its toxicity for E. coli cells. The elimination of fragment coding for proline-rich region and tandem repeats domain from full-size gene led to production truncated variant of recombinant protein with expected molecular mass. Conclusions. The recombinant plasmid containing fragment of Er. rhusiopathiae SPAА gene was constructed. It allows obtaining preparative amount recombinant protein with m. m. 47 kDa in E. coli. Keywords: Erysipelothrix rhusiopathiae, SPAА gene, recombinant protein. Мета. Клонувати ген SPAА – поверхневий антиген Er. rhusiopathiae – у плазмідний вектор та експресувати білок SpaА в E. coli. Методи. Розрахунок і синтез олігонуклеотидних праймерів, полімеразна ланцюгова реакція, клонування, експресія рекомбінантних білків у Е.coli, електрофорез в агарозі та поліакриламідному гелі. Результати. Повнорозмірний і усічений ген SPAА Er. rhusiopathiae клоновано в експресуючу плазміду рЕТ24а(+). Експресія повного гена не супроводжується синтезом значної кількості рекомбінантного білка, очевидно, внаслідок його токсичності для клітин E. coli. Елімінація з повнорозмірного гена фрагмента, що кодує насичену проліном ділянку, і домену тандемних повторів, а також одержання усіченого варіанта гена призводять до стабільного синтезу рекомбінантного продукту з очікуваною молекулярною масою. Висновки. Отримано рекомбінантну плазміду, яка містить фрагмент гена SPAА Er. rhusiopathiae, що дозволяє виділяти у препаративних кількостях в E. coli рекомбінантний білок з м. м. 47 кДа. Ключові слова: Erysipelothrix rhusiopathiae, ген SPAА, рекомбінантний білок
issn	0233-7657
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156390
citation_txt	Клонирование и экспрессия гена SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli / О.Н. Дерябин, Е.Г. Дерябина, П.В. Гильчук // Вiopolymers and Cell. — 2011. — Т. 27, № 4. — С. 310-313. — Бібліогр.: 11 назв. — рос.
work_keys_str_mv	AT derâbinon klonirovanieiékspressiâgenaspaaerysipelothrixrhusiopathiaevescherichiacoli AT derâbinaeg klonirovanieiékspressiâgenaspaaerysipelothrixrhusiopathiaevescherichiacoli AT gilʹčukpv klonirovanieiékspressiâgenaspaaerysipelothrixrhusiopathiaevescherichiacoli AT derâbinon cloningandexpressionoferysipelothrixrhusiopathiaespaageneinescherichiacoli AT derâbinaeg cloningandexpressionoferysipelothrixrhusiopathiaespaageneinescherichiacoli AT gilʹčukpv cloningandexpressionoferysipelothrixrhusiopathiaespaageneinescherichiacoli AT derâbinon klonuvannâtaekspresíâgenaspaaerysipelothrixrhusiopathiaevescherichiacoli AT derâbinaeg klonuvannâtaekspresíâgenaspaaerysipelothrixrhusiopathiaevescherichiacoli AT gilʹčukpv klonuvannâtaekspresíâgenaspaaerysipelothrixrhusiopathiaevescherichiacoli
first_indexed	2025-11-25T22:29:22Z
last_indexed	2025-11-25T22:29:22Z
_version_	1850563609563758592
fulltext	Кло ни ро ва ние и экс прес сия ге на SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli О. Н. Де ря бин, Е. Г. Де ря би на, П. В. Гиль чук1 Инсти тут ве те ри нар ной ме ди ци ни НААН Укра и ны Ул. До нец кая, 30, Киев, Укра и на, 01151 Инсти тут мо ле ку ляр ной би о ло гии и ге не ти ки НАН Укра и ны Ул. Академика За бо лот но го, 150, Киев, Укра и на, 03680 don.lmb@gmail.com Цель. Кло ни ро вать ген SPAА – по вер хнос тный ан ти ген Er. rhusiopathiae – в плаз мид ный век тор и экс - прес си ро вать бе лок SpaА в E. coli. Ме то ды. Рас чет и син тез оли го нук ле о тид ных прай ме ров, по ли ме - раз ная цеп ная ре ак ция, кло ни ро ва ние, экс прес сия ре ком би нан тных бел ков в E. coli, элек тро фо рез в ага ро зе и по ли ак ри ла мид ном геле. Ре зуль та ты. Пол но раз мер ный и усе чен ный ген SPAА Er. rhusiopathi- ae кло ни ро ван в экс прес си ру ю щую плаз ми ду рЕТ24а(+). Экспрес сия по лно го гена не со про вож да ет ся на - ра бот кой зна чи тель но го ко ли чес тва ре ком би нан тно го бел ка, пред по ло жи тель но, всле дствие его ток - сич нос ти для кле ток E. coli. Эли ми на ция из по лно раз мер но го гена фраг мен та, ко ди ру ю ще го на сы щен- ную про ли ном об ласть, и до ме на тан дем ных по вто ров, а так же по лу че ние усе чен но го ва ри ан та гена при во дят к устой чи во му син те зу ре ком би нан тно го про дук та с ожи да е мой мо ле ку ляр ной мас сой. Вы - во ды. По лу че на ре ком би нан тная плаз ми да, со дер жа щая фраг мент гена SPAА Er. rhusiopathiae, что поз- во ля ет вы де лять в пре па ра тив них ко ли чес твах в E. coli ре ком би нан тный бе лок с м. м. 47 кДа. Клю че вые сло ва: Erysipelothrix rhusiopathiae, ген SPAА, ре ком би нан тный бе лок. Введе ние. Грам по ло жи тель ная бак те рия Er. rhusio- pathiae при над ле жит к се ме йству Corynebacteria- ceae и яв ля ет ся воз бу ди те лем за бо ле ва ния – рожи сви ней (Erysipelas suum). Воз бу ди тель про яв ля ет вы со кую устой чи вость во внеш ней сре де, где ис - точ ни ком и ре зер ву а ром ин фек ции слу жат мно гие виды жи вот ных (свиньи, овцы, круп ный ро га тый скот, со ба ки, куры, утки, гры зу ны, рыбы, раки и т. д.). Основ ной спо соб борь бы с дан ным за бо ле ва ни - ем – это им му ноп ро фи лак ти ка с ис поль зо ва ни ем вак цин на осно ве жи вых ави ру лен тных штам мов воз бу ди те ля или инак ти ви ро ван ных вак цин на ос- нове бак те ри нов или ли за тов па то ген ных штам мов. Глав ную роль в фор ми ро ва нии устой чи во го про - тек тив но го им му ни те та при роже сви ней иг ра ют спе ци фи чес кие ан ти те ла [1]. Жи вые ат те ну и ро ван ные и инак ти ви ро ван ные вак ци ны с раз ной эф фек тив нос тю за щи ща ют жи - вот ных от острой, но не хро ни чес кой фор мы за бо - ле ва ния и спо соб ны вы зы вать ре ак ции по ти пу ги - пер чу встви тель нос ти вто ро го ти па. Ма ло и зу чен - ны ми оста ют ся воп ро сы бак те ри о но си т ельства и эво лю цон ной из мен чи вос ти воз бу ди те ля на фо не про дол жи тель но го и мас штаб но го при ме не ния тра - ди ци он ных вак цин; вы де ле ние бак те рий в окру жа - ю щую сре ду, где воз бу ди тель дли тель ное вре мя со - хра ня ет ся и да же раз мно жа ет ся в по чве, а так же пас си ру ет ся че рез орга низм гры зу нов, в по пу ля ции ко то рых про хо дит се лек цию по при зна кам виру - лен тнос ти. 310 ISSN 0233–7657. Biopolymers and Cell. 2011. Vol. 27. N 4. P. 310–313  Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine, 2011 Пре и му щес твом вак цин на осно ве ре ком би нан - тных ан ти ге нов яв ля ет ся их по лная бе зо пас ность для жи вот ных и че ло ве ка, а так же от су тствие за - гряз не ния окру жа ю щей сре ды. У Er. rhusiopathiae опи са ны не сколь ко по верх- нос тных бел ков, один из ко то рых – про тек тив ный ан ти ген SpaА [2–4], про ду ци ру ю щий ся все ми штам ма ми бак те рий Er. rhusiopathiae [5–7]. Ген бел ка SpaA ко ди ру ет по ли пеп тид с мо ле ку - ляр ной мас сой (м. м.) 64–69 кДа, со сто я щий из 597 ами но кис лот ных остат ков (а. о.) и 29 а. о. сиг наль - ной по сле до ва тель нос ти (рис. 1). Цель на сто я щей ра бо ты со сто я ла в кло ни ро ва - нии ге на бел ка SpaA Er. rhusiopathiae в плаз мид - ный век тор и по лу че нии ре ком би нан тно го про дук - та в сис те ме E. coli. Ма те ри а лы и ме то ды. В ро бо те ис поль зо ва ны штам мы бак те рии Er. rhusiopathiae из кол лек ции Инсти ту та ве те ри нар ной ме ди ци ны НААН Укра и - ны: «М-2ВК» (вак цин ный), «149» (ви ру лен тный для мы шей, го лу бей и сви ней), «К» (па то ген ный мес тный изо лят). Ген SPAА и его усе чен ный фраг мент – без сиг - наль ной по сле до ва тель нос ти и об лас ти тан дем ных по вто ров – по лу че ны в по ли ме раз ной цеп ной ре ак - ции (ПЦР) с ис поль зо ва ни ем ори ги наль ных прай - ме ров Bam625_F (5'-GCGGATCCATGAAAAA GA AAAAACAC-3') и Sal625_R (5'-GCTGTCGACTT TTAAACTTCCATCGTTC-3') для по лно го ге на, а для фраг мен та ге на SpaA – Bam625trF (5'-GCGGAT CCATGACTGATGCTTATATTG-3') и Sal625trR 5'- GCTGTCGACATGACTTTCAGGCTCT-3'. Секве - ни ро ва ние фраг мен тов ге на SPAА вы пол ня ли с при- ме не ни ем прай ме ров: spa652(388) (5'-ACCTAGC AACTAGAATCGGC-3'), spa652(795) (5'-GAACT TTATGCTATGCGGAG-3') и spa652(1241) (5'-AGT AGAGCCTGAAAGTCCCG-3') в Инсти ту те мо ле - ку ляр ной би о ло гии и ге не ти ки НАН Укра и ны. По лу чен ные в ПЦР про дук ты кло ни ро ва ли в плаз ми ды pUC19 (по лный ген) или pJET (усе чен - ный ген) с по сле ду ю щим пе ре кло ни ро ва ни ем в экс- пре сси ру ю щую плаз ми ду pET24a(+). Ре ком би нант- ные бел ки экс прес си ро ва ли в клет ках E. coli штам- ма BL21(DE3) с по мощью ау то ин дук ции [8], вы де - ле ние те лец вклю че ния осу ще ствля ли со глас но ме - то ди ке [9], по лу чен ный ма те ри ал рас тво ря ли в 6 М мо че ви не и очи ща ли ме то дом аф фин ной хро ма тог - ра фии [10] c ана ли зом ре зуль та тов методом электр- офо ре за в ПААГе. Ре зуль та ты и об суж де ние. Вна ча ле ам пли фи - ци ро ва ли ге ны SPAА штам мов «К» (1881 п. н.) и «М-2ВК» (до 2300 п. н. за счет на ли чия в ге не ин - сер ции в об лас ти тан дем ных по вто ров) [11]. Тран сфек ция ком пе тен тных кле ток E. coli штам- ма XL-1 с по сле ду ю щей на ра бот кой и вы де ле ни ем ре ком би нан тной плаз ми ды и ее рес трик ци он ный ана лиз под твер ди ли на ли чие встав ки, со от ве тству- ющей по раз ме ру и спе ци фи чес ким сай там рес трик- ции ге ну SPAА. Одна ко экс прес сия бел ка SpaА с ис - поль зо ва ни ем ре ком би нан тных плаз мид pET24a (+), не су щих ге ны SPAА ука зан ных штам мов Er. rhu- 311 КЛО НИ РО ВА НИЕ И ЭКС ПРЕС СИЯ ГЕ НА SPAА ЕRYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE В ЕSCHERICHIA COLI N C 1 2 3 4 5 6 7 8 1 29 414 447 607 627 Рис. 1. Схе ма ти чес кая ди аг рам ма до мен ной структуры мо ле ку лы бел ка SpaA: 1–29 а. о. – сигна льная по сле до ва тель ность; 29–414 – ва ри - а бель ный до мен, 414–447 – на сы щен ная про ли - ном об ласть; 447–626 – до мен тан дем ных по - вто ров M1 1 2 3 M2 500→ п.н. п.н. ←1000 ←2000 1000→ Рис. 2. Элек тро фо рег рам ма ам пли фи ци ро ван ных в ПЦР с прай - ме ра ми spa_652(388) и spa_652(1241) фраг мен тов (1085 п. н.) гена SPAА 3 штам мов Er. rhusiopathiae: М1 – мар кер раз ме ра ДНК «100bp Plus DNA Ladder» («Fermentas», Lithuania); 1 – штамм «К»; 2 – штамм «149»; 3 – штамм «М-2ВК»; М2 – мар кер «1 kbp DNA Ladder» («Fermentas») siopathiae, ока за лась сла бой. Пред по ло жи тель но, не зна чи тель ное на коп ле ние про дук та свя за но с его ток сич нос тью для кле ток E. coli. Исхо дя из пред по - ло же ния о том, что гид ро фоб ная об ласть тан дем - ных по вто ров бел ка SpaА не вли я ет на фор ми ро ва - ние его ан ти ген ной уни каль нос ти, бы ло при ня то ре ше ние по лу чить усе чен ный ген SPAА. Для это го в ПЦР вы де лен по лно раз мер ный ген SPAА штам ма «149», по сле ду ю щее сек ве ни ро ва ние под твер ди ло его иден тич ность ге ну SPAА ре фе рен тно го штам ма Fujsawa (се ро тип 1а) Er. rhusiopathiae. На нем, как на мат ри це, син те зи ро ва ли усе чен ный ген SPAА без сиг наль ной по сле до ва тель нос ти и об лас ти тан дем - ных по вто ров (рис. 2). По лу чен ный фраг мент кло - ни ро ва ли по ту пым кон цам в плаз ми ду pJET и пе - ре кло ни ро ва ли по сай там BamHI-SalI в плаз ми ду pET24a(+). В усе чен ной фор ме бел ка SpaА(tr) бы ли уда ле - ны а.а. с 1 по 29 и с 413 по 625. Пос ле кло ни ро ва ния на С-кон це бел ка при со е ди не ны еще 6 гис ти ди нов из век то ра рЕТ24. Па рал лель но про во ди ли экс прес сию ре ком би - нан тно го про дук та с ис поль зо ва ни ем ме то да ау то - ин дук ции и ин дук ции ИПТГ. В об оих слу ча ях на - блю да ет ся син тез в ви де те лец вклю че ния ре ком би - нан тно го бел ка с мо ле ку ляр ной мас сой 47 кДа SpaА(tr), со от ве тству ю щей ожи да е мой (рис. 3). Одна ко ме тод ау то ин дук ции об ес пе чи ва ет боль - шее на коп ле ние ре ком би нан тно го про дук та. Экспрес си ро ван ный ре ком би нан тный бе лок очи ща ли ме то дом им мо би ли зо ван ной ме тал лхела - ти ру ю щей хро ма тог ра фии в де на ту ри ру ю щих усло- ви ях (рис. 4). Та ким об ра зом, по ка за но, что эли ми на ция тан - дем ных по вто ров из ге на SPAА спо со бству ет син те - зу ре ком би нан тно го бел ка, что под твер жда ет пред - по ло же ние об их ро ли в при да нии ток сич нос ти про дук ту по лно раз мер но го ге на для кле ток E. coli. Вы во ды. Кло ни ро ва ны по лно раз мер ный ген SPAА штам мов «М-2ВК» и «К» Er. rhusiopathiae, а так же усе чен ный ген SPAА штам ма «149» Er. rhusio- pathiae без сиг наль ной по сле до ва тель нос ти и об - лас ти тан дем ных по вто ров. Исполь зо ва ние ре комби нан тных плаз мид, не - су щих встав ку по лно раз мерно го ге на SPAА Er. rhusiopathiae, со про вож да ет ся син те зом ток сич но - го для кле ток E. coli ре ком бина нтно го про дук та. С ис поль зо ва ни ем ре ком би нантной плаз ми ды, не су щей усе чен ный ген SPAА Er. rhusiopathiae, син те зи ро ван в E. coli ре ком би нан тный бе лок SpaА(tr)с молекулярной массой 47 кДа . На и бо лее эф фек тив ным ме то дом ин дук ции син те за ре ком би нантно го бел ка яв ля ет ся ау то ин - дук ция. 312 ДЕ РЯ БИН О. Н., ДЕ РЯ БИ НА Е. Г., ГИЛЬ ЧУК П. В. 1 2 3 4 5 6 SpaA(tr))→ ←70БСА→ кДа ←55 ←40 Рис. 3. Элек тро фо рег рам ма об раз цов ли за тов кле ток E. coli, в ко то рых ин ду ци ро ван син тез бел ка SpaА(tr) с м. м. 47 кДа ме - то дом ау то ин дук ции. Ва ри ан ты: 1, 2 – ли за ты кле ток (на не се но 0,010 и 0,002 см3 сус пен зии бак те ри аль ных кле ток со от ве - тствен но); 3–5 – БСА (на не се но – 3, 1,5 и 0,75 мкг со от ве - тствен но); 6 – мар керы PageRuler(tm) Prestained Protein Ladder Fermentas 1 2 3 M SpaA(tr)→ кДа ←70 ←55 ←40 Рис. 4. Элек тро фо рег рам ма об раз цов с основ ных эта пов по лу че - ния ре ком би нан тно го бел ка SpaА(tr): 1 – об щий ли зат кле ток E. coli; 2 – тель ца вклю че ния; 3 – аф фин но очи щен ный ре ком би нан - тный бе лок SpaА; 4 – мар ке ры PageRuler(tm) Prestained Protein Ladder Fermentas O. M. Deriabin, O. G. Deryabina, P. V. Gilchuk1 Cloning and expression of Erysipelothrix rhusiopathiae SPAА gene in Escherichia coli Institute of Veterinary Medicine NAAS of Ukraine 30, Donetska Str., Kyiv, Ukraine, 03151 1Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine 150, Akademika Zabolotnoho Str., Kyiv, Ukraine, 03680 Summary Aim. Cloning of Er. rhusiopathiae surface antigen – SPAА gene into plasmid vector and its expression in E. coli. Methods. Oligonucleotide primers design and synthesis, polymerase chain reaction, cloning, recombinant proteins expression in E. coli, electrophoresis in agarose, PAGE. Results. The full-size and truncated Er. rhusiopathiae SPAА genes were cloned into expression plasmid рЕТ24а(+). The expression of full-size gene didn't result in significant recombinant protein production, presumably due to its toxicity for E. coli cells. The elimination of fragment coding for proline-rich region and tandem repeats domain from full-size gene led to production truncated variant of recombinant protein with expected molecular mass. Conclusions. The recombinant plasmid containing fragment of Er. rhusiopathiae SPAА gene was constructed. It allows obtaining preparative amount recombinant protein with m. m. 47 kDa in E. coli. Keywords: Erysipelothrix rhusiopathiae, SPAА gene, recombinant protein. О. М. Де рябін, О. Г. Де рябіна, П. В. Гільчук Кло ну ван ня та експресія гена SPAА Erysipelothrix rhusiopathiae в Escherichia coli Ре зю ме Мета. Кло ну ва ти ген SPAА – по вер хне вий ан ти ген Er. rhusio- pathiae – у плазмідний век тор та експре су ва ти білок SpaА в E. co- li. Ме то ди. Роз ра ху нок і син тез оліго нук ле о тид них прай мерів, по- ліме раз на лан цю го ва ре акція, кло ну ван ня, експресія ре комбінант- них білків у Е.coli, елек тро фо рез в ага розі та поліак ри ламідно му гелі. Ре зуль та ти. Пов но розмірний і усіче ний ген SPAА Er. rhusio- pathiae кло но ва но в експре су ю чу плазміду рЕТ24а(+). Експресія по вно го гена не суп ро вод жується син те зом знач ної кількості ре - комбіна нтно го білка, оче вид но, внаслідок його ток сич ності для клітин E. coli. Елімінація з по вно розмірно го гена фраг мен та, що кодує на си че ну проліном ділян ку, і до ме ну тан дем них по вторів, а та кож одер жан ня усіче но го варіанта гена при зво дять до ста- більно го син те зу ре комбіна нтно го про дук ту з очіку ва ною мо ле - ку ляр ною ма сою. Вис нов ки. Отри ма но ре комбіна нтну плазмі- ду, яка містить фраг мент гена SPAА Er. rhusiopathiae, що доз во - ляє виділяти у пре па ра тив них кількос тях в E. coli ре комбінант- ний білок з м. м. 47 кДа. Клю чові сло ва: Erysipelothrix rhusiopathiae, ген SPAА, ре комбіна - нтний білок. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Wood R. L., Straw S., D’Allaire W. L., Wood R. L. Erysipelas // Diseases of swine. 8th ed.–Iowa: State University Press, Ames, 1999.–Р. 419–430. 2. Kitajima T., Oishi E., Amimoto K., Satoshi U., Nakamura H., Oda K., Katayama S., Izumida A., Shimizu Y. Quantitative diver- sity of 67 kDa protective antigen among serovar 2 strains of Ery- sipelothrix rhusiopathiae and its implication in protective im- mune response // J. Vet. Med. Sci.–2000.–62, N 10.–P. 1073– 1077. 3. Fidalgo S. G., Riley T. V. Detection of Erysipelothrix rhusiopa- thiae in clinical and environmental samples // Meth. Mol. Biol.–2004.–268.–Р. 199–205. 4. Ho To., Hagai S. Genetic and antigenic diversity of the surface protective antigen proteins of Erysipelothrix rhusiopathiae // Clin.Vaccine Immunol.–2007.–14, N 7.–P. 813–820. 5. Makino S. I., Yamamoto K., Asakura H., Shirahata T. Surface an- tigen, SpaA, of Erysipelothrix rhusiopathiae binds to Gram-po- sitive bacterial cell surfaces // FEMS Microbiol. Lett.–2000.– 186, N 2.–Р. 313–317. 6. Sawada T., Takahashi T. Cross protection of mice and swine ino- culated with culture filtrate of attenuated Erysipelothrix rhusio- pathiae and challenge exposed to strains of various serovars // Am. J. Vet. Res.–1987.–48, N 2.–P. 239–242. 7. Sato H., Miyazaki H., Sakakura H., Suzuki T., Saito H., Maehara N. Isolation and purification of a protective protein antigen of Ery- sipelothrix rhusiopathiae // Zentralbl. Veterinarmed.–1999.– 46, N 2.–Р. 73–84. 8. Studier F. W. Protein production by auto-induction in high densi- ty shaking cultures // Protein Expr. Purif.–2005.–41, N 1.–P. 207– 234. 9. Galan J. E., Timoney J. F. Cloning and expression in Esche- richia coli of a protective antigen of Erysipelothrix rhusio- pathiae // Infect. Immun.–1990.–58, N9.– P. 3116–3121. 10. Liu M., Wang X., Yin C., Zhang Z., Lin Q., Zhen Y., Huang H. One-step on-column purification and refolding of a single-chain variable fragment (scFv) antibody against tumour necrosis factor alpha //Biotechnol. Appl. Biochem. – 2006. – 43, Pt. 3. – P.137-145. 11. Obrazhey A., Deriabin O., Tarasov O., Deryabina O. Analysis of Erysiopelothrix rhusiopathiae protein SpaA gene polymor- phism // Interagency thematic scientific digest «Veterinary Me- dicine».– Kharkiv, 2007.–88.–P. 161–166. UDC 619:616.988:616-076 Received 30.05.11 313 КЛО НИ РО ВА НИЕ И ЭКС ПРЕС СИЯ ГЕ НА SPAА ЕRYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE В ЕSCHERICHIA COLI

Клонирование и экспрессия гена SPAА Еrysipelothrix rhusiopathiae в Еscherichia coli

Institution

Ähnliche Einträge