Получение рекомбинантного шаперона GroEL и его иммунологическая кросс-реактивность с Hsp60
Описан метод получения рекомбинантного шаперона GroEL (прокариотного гомолога эукариотного шаперона Hsp60), включающий экспрессию белка в клетках Escherichia coli с последующей очисткой белка градиентным высаливанием из лизата клеток-продуцентов, гель-фильтрацией на сефакриле-8300 и ионообменной хро...
Saved in:
| Published in: | Біополімери і клітина |
|---|---|
| Date: | 2006 |
| Main Authors: | , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2006
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156476 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Получение рекомбинантного шаперона GroEL и его иммунологическая кросс-реактивность с Hsp60 / Л.Н. Капустян, Р.Г. Киямова, В.С. Гришкова, А.Г. Терентьев, В.В. Филоненко, Л.Л. Сидорик // Біополімери і клітина. — 2006. — Т. 22, № 2. — С. 117-120. — Бібліогр.: 20 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860252590762098688 |
|---|---|
| author | Капустян, Л.Н. Киямова, Р.Г. Гришкова, В.С. Терентьев, А.Г. Филоненко, В.В. Сидорик, Л.Л. |
| author_facet | Капустян, Л.Н. Киямова, Р.Г. Гришкова, В.С. Терентьев, А.Г. Филоненко, В.В. Сидорик, Л.Л. |
| citation_txt | Получение рекомбинантного шаперона GroEL и его иммунологическая кросс-реактивность с Hsp60 / Л.Н. Капустян, Р.Г. Киямова, В.С. Гришкова, А.Г. Терентьев, В.В. Филоненко, Л.Л. Сидорик // Біополімери і клітина. — 2006. — Т. 22, № 2. — С. 117-120. — Бібліогр.: 20 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Біополімери і клітина |
| description | Описан метод получения рекомбинантного шаперона GroEL (прокариотного гомолога эукариотного шаперона Hsp60), включающий экспрессию белка в клетках Escherichia coli с последующей очисткой белка градиентным высаливанием из лизата клеток-продуцентов, гель-фильтрацией на сефакриле-8300 и ионообменной хроматографией на MonoQ HR 5/5. Данный метод позволяет эффективно наработать белок GroEL 95 %-й степени очистки в препаративных количествах. Рекомбинантный белок затем использовали для получения поликлональных анти-GroEL антител и синтеза аффинной колонки. Показан иммунологический перекрест аффинно очищенных поликлональных анти-GroEL антител с представителями семейства Hsp60 в лизатах органов и клеток различных видов млекопитающих — от мыши до человека, что позволяет использовать данные антитела при изучении изменения уровней экспрессии и клеточной локализации Hsp60 в случае аутоиммунных и раковых патологий человека
Описано метод одержання і очищення рекомбінантного шаперону GroEL (прокаріотного гомолога еукаріотного шаперону Hsp60), що включає експресію білка в клітинах Escherichia coli з наступним градієнтним висолюванням з лізату клітин-продуцентів, гель-фільтрацією на сефакрилі-SZQO та іонообмінною хроматографією на MonoQ HR 5/5. Такий метод дозволив ефективно напрацювати білок GroEL у препаративних кількостях, який потім використовували для отримання анmu-GroEL антитіл і синтезу афінної колонки. Показано імуно логічний перехрест афінно очищених поліклональних анти-GroEL антитіл з білком родини Hsp60 у лізатах органів і клітин різних видів ссавців — від миші до людини, що дозволяє використовувати ці антитіла при вивченні змін рівня експресії і клітинної локалізації Hsp60 в разі аутоімунних і ракових патологій людини.
The method of obtaining and purification of recombinant chaperon GroEL (prokaryotic homolog of eukaryotic chaperon Hsp60) including the protein expression in E. coli cells, precipitation with saturated ammonium sulphate from a producent lysate, gel-filtration on Sephacryl-300 column and ion-exchange chromatography on MonoQ HR 5/5 column, is described. The present method allows effective obtaining of the preparative amount of the GroEL protein of 95 % purity. The recombinant protein was used for the anti-GroEL antibodies production and synthesis of the affine column. The immunological cross-reactivity of polyclonal affinepurified anti-GroEL antibodies and members of Hsp60 family from different organs and cells lysates of different mammals, from mouse to human, have been revealed, which allows using these antibodies for research of Hsp60 expression alterations and cell localization at human autoimmune and cancer pathologies.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:45:21Z |
| format | Article |
| fulltext |
Ob tain ing re com bi nant chap eron GroEL and its
im mu no logic cross-re ac tiv ity with Hsp60
L.N. Kapustian, R.G. Kyyamova, V.S. Gryshkova, A.G. Terentiev, L.L. Sidorik
The In sti tute of Mo lec u lar Bi ol ogy and Ge net ics, NAS of Ukraine
150, Ac a de mi cian Zabolotny Str., Kyiv, 03143, Ukraine
The method for ob tain ing and pu ri fi ca tion of re com bi nant chap eron GroEL (prokaryotic homolog of eukaryotic chap eron Hsp60), in clud -
ing the pro tein ex pres sion in E.coli cells, pre cip i ta tion with sat u rated am mo nium sul phate from a producent lysate, gel-fil tra tion on
Sephacryl-300 col umn and ion-ex change chro ma tog ra phy on MonoQ HR 5/5 col umn, is de scribed. The method al lows ef fec tive ob tain ing
a pre para tive amount of the GroEL pro tein of 95% pu rity. The re com bi nant pro tein was used for the anti-GroEL an ti bod ies pro duc tion
and syn the sis of an af fine col umn.The im mu no logic cross-re ac tiv ity of polyclonal af fine-pu ri fied anti-GroEL an ti bod ies and mem bers of
Hsp60 fam ily from dif fer ent mam ma lian or gans and cells – from mouse to hu man, has been re vealed. This al lows us ing these an ti bod ies for
re search of the Hsp60 ex pres sion al ter ations and cell lo cal iza tion at hu man au to im mune and cancer pathologies.
Key words: chap eron, Hsp60, GroEL, chro mato graphic pu ri fi ca tion, bac te ri o log i cal pro ducer.
Introduction. Different types of physiological stress (heat
shock, virus infection, radiation, hemodynamic disorders,
ischemia, oxidative stress, etc) are able to cause multiple
changes within the cells, including those affecting the
structure and functions of proteins. A number of data
obtained in the recent years suggests that incorrect protein
folding (packing of new synthesized polypeptide chains) is a
molecular basis of many diseases [1-3]. One of the factors
influencing correct folding is functioning of molecular
chaperons – heat shock proteins (HSPs). HSPs are
responsible for the fidelity of protein folding and the import
of precursors of organnella proteins into the corresponding
cell compartments. Chaperons participate in reparation of
ionic channels, apoptosis, steroid receptors activation,
regulation of signaling cascades, in the process of collagen
synthesis at reparative fibrosis, presentation of intracellular
antigenes [4-6].
HSPs are divided into several families depending on
their molecular weight and specialized functions [7, 8]. The
Hsp60 family are proteins of mitochondrial matrix that
participate in assembling, transport of mitochondrial proteins
117
ISSN 0233-7657. Biopolymers and cell. 2006. Vol. 22 .¹ 2. Translated from Ukrainia.
ãL.N. Kapustian, R.G. Kyyamova, V.S. Gryshkova, A.G. Terentiev, L.L. Sidorik, 2006
Struc ture and Func tions of Biopolymers
and prevention of their aggregation. Both the level of
expression and cell localization of Hsp60 change at different
pathological states [9-12
Molecular chaperons Hsp60 of different taxonomic
groups belong to the highly conservative protein family with
homology level up to 50% [13]. In particular, E.coli GroEL is
a prokaryotic homologue of a mammalian Hsp60. The aim of
our work was the development of fast and effective method
of purification of the bacterial protein GroEL, obtaining
anti-GroEL antibodies, and the study on their possible
application to research the eukaryotic Hsp60 expression and
cellular localization at different human pathologies.
Materials and Methods. A recombinant plasmid
pT-GroEL, constructed on the basis of pACYC vector and
containing coding sequence of the GroEL gene under T7
promoter, p15a replicon and marker of chloramphenicol
resistance; cell strain E.coli BL21(DE3), control protein
GroEL (Sigma), and monoclonal antibodies to GroEL
(Sigma) were used in the work. The transformation was
performed by a standard method [14]. The purity of proteins
was analyzed by electrophoresis in the presence of sodium
dodecyl sulfate (DS-Na) in 12% polyacrylamide gel (PAAG)
according to Lammly [15]. The concentration of protein was
determined according to Bredford [16].The immunization of
rabbits was performed by the method earlier developed by us
[17]. The affine column was prepared as described in the
work [17]. Anti-GroEL affinity was tested by
immunoenzyme assay (ELISA) [18], the specificity was
determined by the method of immunoblotting (Western-blot)
[19]. Lysates of mammalian organs were obtained according
to [20].
Results and discussion.Several clones of E.coli cells
BL21(DE3), containing plasmid pT-GroEL, were obtained
by the transformation method. The induction of protein
expression in cells being in the logarithmic growth phase was
performed by addition of 1mM IPTG
(isopropyl-1-thio-â-D-galactosidase) with subsequent
incubation for a night at 37EC. The cells were precipitated,
resuspended in a lysis buffer A, containing 10mM Tris/HCl,
pH=8.0, 50mM NaCl, and proteases inhibitors (1mM PMSF,
0.2% Aprotinin, 5mM Benzamidine), and destroyed by
ultrasound in a disintegrator. The supernatant, obtained after
centrifugation, was used to purify GroEL by several methods
according to the following scheme: precipitation with
ammonium sulphate, gel filtration, HPLC ion-exchange
chromatography. The largest protein precipitate was
obtained at saturation by ammonium sulfate in the range of
43-55%. Gel-filtration was conducted on the column of
Sephacryl-S300, equilibrated with the buffer A. At
gel-filtration the chaperons (GroEL) were eluted in front of
the buffer (Fig.1).
The analysis of purity and specificity of fractions,
containing GroEL, was performed by electrophoresis of
proteins according to Lemmly (Fig.3a) and by Western-blot
analysis with commercial anti-GroEL antibodies (Fig.3b).
The fractions containing GroEL were collected and put on
the column with MonoQ HR 5/5 for ion-exchange
chromatography. The column was equilibrated with the
buffer A and elution was performed by a linear gradient of
NaCl [50-1000mM]. GroEL was eluted at NaCl
concentration of 500-600mM (Fig.2). The fractions,
containing the protein (not less than 95% of purity) were
selected according to the results of the electrophoresis, and
dialyzed against the buffer A. The specificity of obtained
protein was determined by immunoblotting method, using
commercial monoclonal anti-GroEL antibodies (Sigma)
(Fig.3b).
Rabbits were immunized with GroEL obtained to get
antibodies. After 7 days of the immunization of rabbits their
blood was taken to obtain antiserum. Immunoglobulin
precipitation was performed at 50% saturation of serum with
ammonium sulfate. The antibodies purification was
performed on DEAE cellulose. The column was equilibrated
with a PBS-buffer (0.75 M NaCl, 0.025 NaH
2
PO
4
H
2
O,
pH=7.4). The elution of antibodies was performed by
PBS-buffer, fractions volume of 0.5ml. The fractions in peak
area were collected and put on an affine column with
conjugated GroEL. The column was equilibrated with PBS
buffer. After the incubation with antibodies for 2 hours at the
room temperature the column was washed with the
PBS-buffer, antibodies were eluted by 0.2M glycine buffer,
pH 2.5 with subsequent neutralization by 1M Tris/HCl, pH
11. The fractions containing antibodies were dialyzed against
the PBS-buffer for a night at 4°C. The affinity of obtained
anti-GroEL antibodies was tested by ELISA, the specificity
was determined by Western-blot.
118
L.N. Kapustian, R.G. Kyyamova, V.S. Gryshkova, A.G. Terentiev, L.L. Sidorik
Fig.1. The pro file of gel chro mato graphic pu ri fi ca tion of GroEl on the
Sephacryl-S300 col umn (frac tions con tain ing GroEl, are marked dark).
As we used the recombinant protein, obtained by means
of the GroEL gene expression (bacterial chaperon
homologue of mammalian Hsp60), it was necessary to show
the immunologic cross-reactivity of the obtained antibodies
with chaperons of this family from different organisms –
from prokaryotes to various species of mammals, including
human cells. The results of study on immunoreactivity of
polyclonal affine-purified anti-GroEL antibodies are shown
in Figure 4. It is evident that anti-GroEL antibodies recognize
polypeptides with the molecular mass of about 60kDa in
heart lysates of all investigated species (from mice to
humans) and their immune reactivity is comparable with the
immune reactivity of commercial anti-GroEL antibodies
against a reference antigen (Fig.3b). These data and the
literature data, proving high homology of the Hsp60 family
chaperons and GroEL protein, allow using the recombinant
prokaryotic protein GroEL and the antibodies obtained
against it in the researches on eukaryotic material.
The analysis of time stability showed that the GroEL
protein expression remained relatively stable for 4-6
months while storing the cells suspension in 50% glycerol
and at -70°C.
The method of GroEL purification developed by us
allows fast and effective obtaining preparative quantity of the
high purity protein.
The recombinant prokaryotic protein GroEL is supposed
to be used for investigating a role of its eukaryotic
homologue Hsp60 at carcinogenesis and autoimmune human
pathologies.
Ë. Í. Êà ïóñ òÿí, Ð. Ã. Êè ÿ ìî âà, Â. Ñ. Ãðèø êî âà, À. Ã. Òå ðåí òüåâ, Â. Â.
Ôè ëî íåí êî, Ë. Ë. Ñè äî ðèê
ÏÎËÓ×ÅÍÈÅ ÐÅÊÎÌÁÈÍÀÍÒÍÎÃÎ ØÀÏÅÐÎÍÀ GROEL È ÅÃÎ
ÈÌÌÓÍÎËÎÃÈ×ÅÑÊÀß ÊÐÎÑÑ-ÐÅÀÊÒÈÂÍÎÑÒÜ Ñ HSP60
Ðå çþ ìå
Îïè ñàí ìå òîä ïî ëó ÷å íèÿ ðå êîì áè íàí òíî ãî øà ïå ðî íà GroEL (ïðî êà ðè -
îò íî ãî ãî ìî ëî ãà ýó êà ðè îò íî ãî øà ïå ðî íà Hsp60), âêëþ ÷à þ ùèé ýêñ -
ïðåñ ñèþ áåë êà â êëåò êàõ Escherichia coli ñ ïî ñëå äó þ ùåé î÷èñ òêîé
áåë êà ãðà äè åí òíûì âû ñà ëè âà íè åì èç ëè çà òà êëå òîê-ïðî äó öåí òîâ,
ãåëü-ôè ëüòðà öè åé íà ñå ôàê ðè ëå-S300 è èî íî îá ìåí íîé õðî ìà òîã ðà ôè -
119
Ob tain ing re com bi nant chap eron Groel (Hsp60)
Fig.2. The anal y sis of pu rity and spec i fic ity
of the pro tein GroEl: a–
electrophoregramme of frac tions, con tain -
ing GroEL, at dif fer ent stages of pu ri fi ca -
tion: 1-af ter pre cip i ta tion; 2-af ter gel-fil tra -
tion (peak frac tions) on the Sephacryl-S300
col umn; 3,4 – af ter ion-ex change chro ma -
tog ra phy on the MonoQ col umn; 5-con trol
GroEL (Sigma). b – West ern-blot anal y sis
of spec i fic ity of the ob tained re com bi nant
GroEL:1-pu ri fied GroEL (af ter ion-ex -
change chro ma tog ra phy on the Mono
Qcolumn; 2-con trol GroEL (Sigma).
Fig.3. The pro file of pro tein elu tion from the MonoQ col umn with lin ear gra di ent
of NaCl (50-1000mM). GroEL was eluated in the range of NaCl con cen tra tions
of 500-600mM.
Fig.4.Im mu no logic cross-re ac tiv ity of the Hsp60 chap er ons, de ter mined by
West ern-blot anal y sis us ing af fine pu ri fied polyclonal anti-GroEL an ti bod ies in
heart lysates of dif fer ent spe cies of mam mals: 1-BSA, 2-mouse Balb\c, 3-rab bit,
4-bull, 5-hu man, 6-E.coli, 7-con trol GroEL (Sigma).
åé íà MonoQ HR 5/5. Äàí íûé ìå òîä ïî çâî ëÿ åò ýô ôåê òèâ íî íà ðà áî -
òàòü áå ëîê GroEL 95 %-é ñòå ïå íè î÷èñ òêè â ïðå ïà ðà òèâ íûõ
êî ëè ÷åñ òâàõ. Ðå êîì áè íàí òíûé áå ëîê çà òåì èñ ïîëü çî âà ëè äëÿ ïî ëó ÷å -
íèÿ ïî ëèê ëî íàëü íûõ àíòè-GroEL àí òè òåë è ñèí òå çà àô ôèí íîé êî ëîí -
êè. Ïî êà çàí èì ìó íî ëî ãè ÷åñ êèé ïå ðå êðåñò àô ôèí íî î÷è ùåí íûõ
ïî ëèê ëî íàëü íûõ àíòè-GroEL àí òè òåë ñ ïðåä ñòà âè òå ëÿ ìè ñå ìå éñòâà
Hsp60 â ëè çà òàõ îðãà íîâ è êëå òîê ðàç ëè÷ íûõ âè äîâ ìëå êî ïè òà þ ùèõ –
îò ìûøè äî ÷å ëî âå êà, ÷òî ïî çâî ëÿ åò èñ ïîëü çî âàòü äàí íûå àí òè òå ëà
ïðè èçó÷åíèè èçìåíåíèÿ óðîâíåé ýêñïðåññèè è êëåòî÷íîé ëîêàëèçàöèè
Hsp60 â ñëó÷àå àóòîèììóííûõ è ðàêîâûõ ïàòîëîãèé ÷åëîâåêà.
Êëþ ÷å âûå ñëî âà: GroEL, Hsp60, èî íî îá ìåí íàÿ õðî ìà òîã ðà ôèÿ,
ãåëü-ôè ëüòðà öèÿ, ïî ëèê ëî íàëü íûå àí òè òå ëà, àó òî èì ìóí íûå ïà òî ëî -
ãèè ÷å ëî âå êà.
REFERENCES
1. Thomas P. J., Qu B. H., Pedersen P. L. De fec tive pro tein fold ing is a ba sis of hu -
man dis ease // Trends Biochem. Sci.-1995.-20.-P. 456-459.
2. Benjamin I. J., McMillan D. R. Stress (Heat shock) pro teins. Mo lec u lar chap -
er ons in car dio vas cu lar bi ol ogy and dis ease // Circ. Rec.-1998.-83.-P.
117-132.
3. Hartl F. U. Mo lec u lar chap er ons in cel lu lar pro tein fold ing // Na -
ture.-1994.-55.-P. 816-824.
4. Hubber M. M., Sievers R. E., Barbora V. Heat shock pro tein in duc tion in rat
hearts: a di rect cor re la tion be tween the amount of heat shock pro tein in -
duced and the de gree of myo car dial pro tec tion // Cir cu la -
tion.-1994.-89.-P. 355-360.
5. Benjamin I. J., Jalil J. E., Tan I. B., Cho K., Weber K. T., Clark W. A.
Isoproterenol-in duced myo car dial fi bro sis in re la tion to myocyte ne cro sis
// Circ. Res.-1989.-65.-P.657-670.
6. Sreedhar A. S., Csermely P. Heat shock pro teins in the reg u la tion of apoptosis:
new strat e gies in tu mor ther apy. A com pre hen sive re view // Phar ma col -
ogy and Ther a peu tics.-2004.-101.-P. 227-257.
7. Hendrick J. P., Hartl F. U. Mo lec u lar chaperone func tions of heat-shock pro -
teins // Annu. Rev. Biochem.-1993.-62.-Ð. 349-384.
8. Ellis R. J., van der Vies S. M. Mo lec u lar chaperones // Annu. Rev.
Biochem.-1991.-60.-P. 321-347.
9. Xu Q., Schett G., Seitz C. S., Hu Y., Gupta R. S., Wick G. Sur face stain ing and
cytotoxic ac tiv ity of heat shock pro tein 60 an ti body on stressed aor tic en -
do the lial cells // Cir cu la tion Res.-1994.-75.-P. 1078-1085.
10. Kaur I., Voss S. D., Gupta R. S., Schell K., Fisch P., Sondel P. M. Hu man pe -
riph eral T cells rec og nize HSP60 mol e cules on Daudi Bur kitt’s lym phoma
cells // J. Immunol.-1993.-150.-P. 2046-2055.
11. Soltys B. J., Gupta R. S. Cell sur face lo cal iza tion of the 60 kDa heat shock
chaperonin pro tein (Hsp60) in mam ma lian cells // Cell Biol.
Int.-1997.-21.-P. 315-320.
12. Belles C., Kuhl A., Nosheny R., Card ing S. R. Plasma mem brane ex pres sion of
heat shock pro tein 60 in vivo in re sponse to in fec tion // In fect.
Immunol.-1999.-67.-P. 4191-4200.
13. Sarto C., Binz P., Mocarelli P. Heat shock pro tein in hu man can cer // Elec -
tro pho re sis.-2001.-21.-P. 1218-1226.
14. Ìàíèàòèñ Ò., Ôðè÷ Ý., Ñýìáðóê Äæ. Ìåòîäû ãåíåòè÷åñêîé èíæåíåðèè.
Ìîëåêóëÿðíîå êëîíèðîâàíèå.Ì.: Ìèð, 1984.-480 ñ.
15. Laemmli U. K. Cleav age of struc tural pro teins dur ing the as sem bly of the
bacteriophage T4 // Na ture.-1970.-227.-P. 680-685.
16. Brad ford M. M. A repid and sen si tive method for quan ti ties of uti liz ing the
prin ci ple of pro tein bind ing // Anal. Biochem.-1976.-86.-P. 193-200.
17. Sidorik L. L., Gudzera O. I., Dragovoz V. A., Tukalo M. A., Beresten S. F. Im -
mu no chemi cal non-cross-re ac tiv ity be tween eukaryotic and prokaryotic
seryl-tRNA syn the tas es // FEBS Lett.-1991.-292.-P. 76-78.
18. Matsiota P., Druet P., Dosquent P., Guilbert B., Avrames P. Nat u ral
autoantibodies at sys temic lupus erythrematosus // Clin. Exp.
Immunol.-1987.-69.-P. 79-88.
19. Avrames S., Termynck T. Monoclonal IgG and autoantibodies ob tained af -
ter polyclonal ac ti va tion, show re ac tiv i ties sim i lar to those of polyclonal
nat u ral autoantibodies // Mol. Immunol.-1993.-30.-P. 119-127.
20. Favorova O. O., Zargarova T. A., Rukosuyev V. S., Beresten S. F., Kisselev L. L.
Mo lec u lar and cel lu lar stud ies of tryptophanyl-tRNA syn the tas es us ing
monoclonal an ti bod ies // Eur. J. Biochem.-1989.-184.-P. 583-588.
ÓÄÊ 577.21
Íàäiéøëà äî ðåäàêöi¿ 29.04.05
120
L.N. Kapustian, R.G. Kyyamova, V.S. Gryshkova, A.G. Terentiev, L.L. Sidorik
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156476 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:45:21Z |
| publishDate | 2006 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Капустян, Л.Н. Киямова, Р.Г. Гришкова, В.С. Терентьев, А.Г. Филоненко, В.В. Сидорик, Л.Л. 2019-06-18T14:33:29Z 2019-06-18T14:33:29Z 2006 Получение рекомбинантного шаперона GroEL и его иммунологическая кросс-реактивность с Hsp60 / Л.Н. Капустян, Р.Г. Киямова, В.С. Гришкова, А.Г. Терентьев, В.В. Филоненко, Л.Л. Сидорик // Біополімери і клітина. — 2006. — Т. 22, № 2. — С. 117-120. — Бібліогр.: 20 назв. — рос., англ. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000724 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156476 577.21 Описан метод получения рекомбинантного шаперона GroEL (прокариотного гомолога эукариотного шаперона Hsp60), включающий экспрессию белка в клетках Escherichia coli с последующей очисткой белка градиентным высаливанием из лизата клеток-продуцентов, гель-фильтрацией на сефакриле-8300 и ионообменной хроматографией на MonoQ HR 5/5. Данный метод позволяет эффективно наработать белок GroEL 95 %-й степени очистки в препаративных количествах. Рекомбинантный белок затем использовали для получения поликлональных анти-GroEL антител и синтеза аффинной колонки. Показан иммунологический перекрест аффинно очищенных поликлональных анти-GroEL антител с представителями семейства Hsp60 в лизатах органов и клеток различных видов млекопитающих — от мыши до человека, что позволяет использовать данные антитела при изучении изменения уровней экспрессии и клеточной локализации Hsp60 в случае аутоиммунных и раковых патологий человека Описано метод одержання і очищення рекомбінантного шаперону GroEL (прокаріотного гомолога еукаріотного шаперону Hsp60), що включає експресію білка в клітинах Escherichia coli з наступним градієнтним висолюванням з лізату клітин-продуцентів, гель-фільтрацією на сефакрилі-SZQO та іонообмінною хроматографією на MonoQ HR 5/5. Такий метод дозволив ефективно напрацювати білок GroEL у препаративних кількостях, який потім використовували для отримання анmu-GroEL антитіл і синтезу афінної колонки. Показано імуно логічний перехрест афінно очищених поліклональних анти-GroEL антитіл з білком родини Hsp60 у лізатах органів і клітин різних видів ссавців — від миші до людини, що дозволяє використовувати ці антитіла при вивченні змін рівня експресії і клітинної локалізації Hsp60 в разі аутоімунних і ракових патологій людини. The method of obtaining and purification of recombinant chaperon GroEL (prokaryotic homolog of eukaryotic chaperon Hsp60) including the protein expression in E. coli cells, precipitation with saturated ammonium sulphate from a producent lysate, gel-filtration on Sephacryl-300 column and ion-exchange chromatography on MonoQ HR 5/5 column, is described. The present method allows effective obtaining of the preparative amount of the GroEL protein of 95 % purity. The recombinant protein was used for the anti-GroEL antibodies production and synthesis of the affine column. The immunological cross-reactivity of polyclonal affinepurified anti-GroEL antibodies and members of Hsp60 family from different organs and cells lysates of different mammals, from mouse to human, have been revealed, which allows using these antibodies for research of Hsp60 expression alterations and cell localization at human autoimmune and cancer pathologies. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Біополімери і клітина Структура та функції біополімерів Получение рекомбинантного шаперона GroEL и его иммунологическая кросс-реактивность с Hsp60 Одержання рекомбінантного шаперону GroEL і його имунологічна крос-реактивність з Hsp60 Obtaining recombinant chaperon CroEL and its immunological cross-reactivity with Hsp60 Article published earlier |
| spellingShingle | Получение рекомбинантного шаперона GroEL и его иммунологическая кросс-реактивность с Hsp60 Капустян, Л.Н. Киямова, Р.Г. Гришкова, В.С. Терентьев, А.Г. Филоненко, В.В. Сидорик, Л.Л. Структура та функції біополімерів |
| title | Получение рекомбинантного шаперона GroEL и его иммунологическая кросс-реактивность с Hsp60 |
| title_alt | Одержання рекомбінантного шаперону GroEL і його имунологічна крос-реактивність з Hsp60 Obtaining recombinant chaperon CroEL and its immunological cross-reactivity with Hsp60 |
| title_full | Получение рекомбинантного шаперона GroEL и его иммунологическая кросс-реактивность с Hsp60 |
| title_fullStr | Получение рекомбинантного шаперона GroEL и его иммунологическая кросс-реактивность с Hsp60 |
| title_full_unstemmed | Получение рекомбинантного шаперона GroEL и его иммунологическая кросс-реактивность с Hsp60 |
| title_short | Получение рекомбинантного шаперона GroEL и его иммунологическая кросс-реактивность с Hsp60 |
| title_sort | получение рекомбинантного шаперона groel и его иммунологическая кросс-реактивность с hsp60 |
| topic | Структура та функції біополімерів |
| topic_facet | Структура та функції біополімерів |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156476 |
| work_keys_str_mv | AT kapustânln polučenierekombinantnogošaperonagroeliegoimmunologičeskaâkrossreaktivnostʹshsp60 AT kiâmovarg polučenierekombinantnogošaperonagroeliegoimmunologičeskaâkrossreaktivnostʹshsp60 AT griškovavs polučenierekombinantnogošaperonagroeliegoimmunologičeskaâkrossreaktivnostʹshsp60 AT terentʹevag polučenierekombinantnogošaperonagroeliegoimmunologičeskaâkrossreaktivnostʹshsp60 AT filonenkovv polučenierekombinantnogošaperonagroeliegoimmunologičeskaâkrossreaktivnostʹshsp60 AT sidorikll polučenierekombinantnogošaperonagroeliegoimmunologičeskaâkrossreaktivnostʹshsp60 AT kapustânln oderžannârekombínantnogošaperonugroelíiogoimunologíčnakrosreaktivnístʹzhsp60 AT kiâmovarg oderžannârekombínantnogošaperonugroelíiogoimunologíčnakrosreaktivnístʹzhsp60 AT griškovavs oderžannârekombínantnogošaperonugroelíiogoimunologíčnakrosreaktivnístʹzhsp60 AT terentʹevag oderžannârekombínantnogošaperonugroelíiogoimunologíčnakrosreaktivnístʹzhsp60 AT filonenkovv oderžannârekombínantnogošaperonugroelíiogoimunologíčnakrosreaktivnístʹzhsp60 AT sidorikll oderžannârekombínantnogošaperonugroelíiogoimunologíčnakrosreaktivnístʹzhsp60 AT kapustânln obtainingrecombinantchaperoncroelanditsimmunologicalcrossreactivitywithhsp60 AT kiâmovarg obtainingrecombinantchaperoncroelanditsimmunologicalcrossreactivitywithhsp60 AT griškovavs obtainingrecombinantchaperoncroelanditsimmunologicalcrossreactivitywithhsp60 AT terentʹevag obtainingrecombinantchaperoncroelanditsimmunologicalcrossreactivitywithhsp60 AT filonenkovv obtainingrecombinantchaperoncroelanditsimmunologicalcrossreactivitywithhsp60 AT sidorikll obtainingrecombinantchaperoncroelanditsimmunologicalcrossreactivitywithhsp60 |