Іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону α2b людини
Представлено лабораторний метод отримання афінного імуносорбенту для хроматографічного очищення білків, який полягає в орієнтованій і нековалентній іммобілізації рекомбінантних фрагментів антитіл на целюлозному носії. На основі ДНК-послідовностей одноланцюгових антитіл (ScFv) до інтерферону IFN-α2b...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Біополімери і клітина |
|---|---|
| Дата: | 2006 |
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Ukrainian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2006
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156478 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону α2b людини / П.В. Гільчук, О.В. Окунєв, Д.М. Іродов, М.В. Павлова, О.Я. Яковенко // Біополімери і клітина. — 2006. — Т. 22, № 2. — С. 157-161. — Бібліогр.: 12 назв. — укр., англ |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156478 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Гільчук, П.В. Окунєв, О.В. Іродов, Д.М. Павлова, М.В. Яковенко, О.Я. 2019-06-18T14:34:36Z 2019-06-18T14:34:36Z 2006 Іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону α2b людини / П.В. Гільчук, О.В. Окунєв, Д.М. Іродов, М.В. Павлова, О.Я. Яковенко // Біополімери і клітина. — 2006. — Т. 22, № 2. — С. 157-161. — Бібліогр.: 12 назв. — укр., англ 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00072B https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156478 579.69 + 577.112 + 543.544.17 Представлено лабораторний метод отримання афінного імуносорбенту для хроматографічного очищення білків, який полягає в орієнтованій і нековалентній іммобілізації рекомбінантних фрагментів антитіл на целюлозному носії. На основі ДНК-послідовностей одноланцюгових антитіл (ScFv) до інтерферону IFN-α2b людини і целюлозозв'язувального домену (CBD) із целюлозолітичного комплексу Clostridium thermocellum сконструйовано злитий білок (ScFv-CBD). Після експресії гена ScFv-CBD в Escherichia coli і виділення цільового білка у функціонально активній формі здійснено його пряму іммобілізацію на мікрогранулярній целюлозі Целюлозу з іммобілізованим ScFv-CBD використано як афінний сорбент для очищення рекомбінантного IFN-α2b людини. A laboratory method for obtaining immunoaffine media for chromatographic purification of proteins based on orienting and non-covalent immobilization of recombinant antibody fragments on cellulose matrix is described. The single-chain antibody (ScFv) against human IFN-α2b was genetically fused to cellulose-binding domain (CBD) from cellulosome complex of Clostridium thermocellum and expressed in Escherichia coli. After the isolation of the target protein in functionally active form from bacteria cells the directed immobilization on microgranular cellulose has been carried out. The cellulose with immobilized ScFv-CBD-fusion was used as affinity medium to perform the purifications of recombinant human IFN-α2b Представлен лабораторный метод получения иммуноаффинного сорбента для хроматографической очистки белков, основанный на ориентированной и нековалентной иммобилизации рекомбинантных фрагментов антител на целлюлозном носителе. На основе ДНК-последовательностей однонитчатых антител (ScFv) к IFN-α2b человека и связывающего целлюлозу домена (CBD) из целлюлозолитического комплекса Clostridium thermocellum сконструирован слитый белок (ScFv-CBD). После экспрессии ScFv-CBD в клетках Escherichia coli и выделения целевого белка в функционально активной форме проведена его прямая иммобилизация на микрогранулированной целлюлозе. Целлюлоза с иммобилизованным ScFv-CBD использована как аффинный сорбент для очистки рекомбинантного IFN-α2b человека. Автори висловлюють щиру подяку співробітникам Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України С. І. Андріанову, О. Ю. Сломінському і проф. Г. Л. Волкову за методичні вказівки та можливість користування ультрафільтраційним і хроматографічним обладнанням, а також співробітникам ВНДК «Фарм Біотек» — за надання екстрактів білків — продуцентів Е. соїі для проведення очищення рекомбінантного IFN-a2b людини. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Біополімери і клітина Молекулярна та клітинна біотехнології Іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону α2b людини Иммобилизованные одноноцепочечные антитела для аффинной очистки рекомбинантного IFN-α2b человека Immobilized single chain antibodies for affinity purification of recombinant human IFN-α2b Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону α2b людини |
| spellingShingle |
Іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону α2b людини Гільчук, П.В. Окунєв, О.В. Іродов, Д.М. Павлова, М.В. Яковенко, О.Я. Молекулярна та клітинна біотехнології |
| title_short |
Іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону α2b людини |
| title_full |
Іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону α2b людини |
| title_fullStr |
Іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону α2b людини |
| title_full_unstemmed |
Іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону α2b людини |
| title_sort |
іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону α2b людини |
| author |
Гільчук, П.В. Окунєв, О.В. Іродов, Д.М. Павлова, М.В. Яковенко, О.Я. |
| author_facet |
Гільчук, П.В. Окунєв, О.В. Іродов, Д.М. Павлова, М.В. Яковенко, О.Я. |
| topic |
Молекулярна та клітинна біотехнології |
| topic_facet |
Молекулярна та клітинна біотехнології |
| publishDate |
2006 |
| language |
Ukrainian |
| container_title |
Біополімери і клітина |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Иммобилизованные одноноцепочечные антитела для аффинной очистки рекомбинантного IFN-α2b человека Immobilized single chain antibodies for affinity purification of recombinant human IFN-α2b |
| description |
Представлено лабораторний метод отримання афінного імуносорбенту для хроматографічного очищення білків, який полягає в орієнтованій і нековалентній іммобілізації рекомбінантних фрагментів антитіл на целюлозному носії. На основі ДНК-послідовностей одноланцюгових антитіл (ScFv) до інтерферону IFN-α2b людини і целюлозозв'язувального домену (CBD) із целюлозолітичного комплексу Clostridium thermocellum сконструйовано злитий білок (ScFv-CBD). Після експресії гена ScFv-CBD в Escherichia coli і виділення цільового білка у функціонально активній формі здійснено його пряму іммобілізацію на мікрогранулярній целюлозі Целюлозу з іммобілізованим ScFv-CBD використано як афінний сорбент для очищення рекомбінантного IFN-α2b людини.
A laboratory method for obtaining immunoaffine media for chromatographic purification of proteins based on orienting and non-covalent immobilization of recombinant antibody fragments on cellulose matrix is described. The single-chain antibody (ScFv) against human IFN-α2b was genetically fused to cellulose-binding domain (CBD) from cellulosome complex of Clostridium thermocellum and expressed in Escherichia coli. After the isolation of the target protein in functionally active form from bacteria cells the directed immobilization on microgranular cellulose has been carried out. The cellulose with immobilized ScFv-CBD-fusion was used as affinity medium to perform the purifications of recombinant human IFN-α2b
Представлен лабораторный метод получения иммуноаффинного сорбента для хроматографической очистки белков, основанный на ориентированной и нековалентной иммобилизации рекомбинантных фрагментов антител на целлюлозном носителе. На основе ДНК-последовательностей однонитчатых антител (ScFv) к IFN-α2b человека и связывающего целлюлозу домена (CBD) из целлюлозолитического комплекса Clostridium thermocellum сконструирован слитый белок (ScFv-CBD). После экспрессии ScFv-CBD в клетках Escherichia coli и выделения целевого белка в функционально активной форме проведена его прямая иммобилизация на микрогранулированной целлюлозе. Целлюлоза с иммобилизованным ScFv-CBD использована как аффинный сорбент для очистки рекомбинантного IFN-α2b человека.
|
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156478 |
| citation_txt |
Іммобілізовані одноланцюгові антитіла для афінного очищення рекомбінантного інтерферону α2b людини / П.В. Гільчук, О.В. Окунєв, Д.М. Іродов, М.В. Павлова, О.Я. Яковенко // Біополімери і клітина. — 2006. — Т. 22, № 2. — С. 157-161. — Бібліогр.: 12 назв. — укр., англ |
| work_keys_str_mv |
AT gílʹčukpv ímmobílízovaníodnolancûgovíantitíladlâafínnogoočiŝennârekombínantnogoínterferonuα2blûdini AT okunêvov ímmobílízovaníodnolancûgovíantitíladlâafínnogoočiŝennârekombínantnogoínterferonuα2blûdini AT írodovdm ímmobílízovaníodnolancûgovíantitíladlâafínnogoočiŝennârekombínantnogoínterferonuα2blûdini AT pavlovamv ímmobílízovaníodnolancûgovíantitíladlâafínnogoočiŝennârekombínantnogoínterferonuα2blûdini AT âkovenkooâ ímmobílízovaníodnolancûgovíantitíladlâafínnogoočiŝennârekombínantnogoínterferonuα2blûdini AT gílʹčukpv immobilizovannyeodnonocepočečnyeantiteladlâaffinnoiočistkirekombinantnogoifnα2bčeloveka AT okunêvov immobilizovannyeodnonocepočečnyeantiteladlâaffinnoiočistkirekombinantnogoifnα2bčeloveka AT írodovdm immobilizovannyeodnonocepočečnyeantiteladlâaffinnoiočistkirekombinantnogoifnα2bčeloveka AT pavlovamv immobilizovannyeodnonocepočečnyeantiteladlâaffinnoiočistkirekombinantnogoifnα2bčeloveka AT âkovenkooâ immobilizovannyeodnonocepočečnyeantiteladlâaffinnoiočistkirekombinantnogoifnα2bčeloveka AT gílʹčukpv immobilizedsinglechainantibodiesforaffinitypurificationofrecombinanthumanifnα2b AT okunêvov immobilizedsinglechainantibodiesforaffinitypurificationofrecombinanthumanifnα2b AT írodovdm immobilizedsinglechainantibodiesforaffinitypurificationofrecombinanthumanifnα2b AT pavlovamv immobilizedsinglechainantibodiesforaffinitypurificationofrecombinanthumanifnα2b AT âkovenkooâ immobilizedsinglechainantibodiesforaffinitypurificationofrecombinanthumanifnα2b |
| first_indexed |
2025-11-24T16:09:58Z |
| last_indexed |
2025-11-24T16:09:58Z |
| _version_ |
1850850930430312448 |
| fulltext |
Im mo bi lized sin gle chain an ti bod ies for af fin ity pu ri fi ca tion
of re com bi nant hu man ifn-a2b
P.V. Gilchuk, O.V. Okunev, D.M. Irodov, M.V. Pav lo va, O.Ya. Yakovenko
The In sti tute of Mo lec u lar Bi ol ogy and Ge net ics, NAS of Ukraine
150, Ac a de mi cian Zabolotny Str., Kyiv, 03143, Ukraine
1 Na tional Taras Shevchenko Uni ver sity of Kyiv
64, Volodymyrska Str., Kyiv, 01033, Ukraine
gilchuk@ukr.net
A lab o ra tory method for ob tain ing immunoaffinity me dia for chro mato graphic pu ri fi ca tion of pro teins based on ori ent ing
and non-co va lent im mo bi li za tion of re com bi nant an ti body frag ments on cel lu lose ma trix is de scribed. The sin gle-chain an -
ti body (ScFv) against hu man IFN-a2b was ge net i cally fused to cel lu lose-bind ing do main (CBD) from Clostridium
thermocellum cellulosome and ex pressed in Esch e richia coli. Af ter the iso la tion of the tar get pro tein in func tion ally ac tive
form from bac te ria cells the di rected im mo bi li za tion on microgranular cel lu lose has been car ried out. The cel lu lose with im -
mo bi lized ScFv-CBD-fu sion was used as af fin ity me dia to per form the pu ri fi ca tion of re com bi nant hu man IFN-a2b.
Keywords: sin gle chain an ti bod ies, immunoaffinity chro ma tog ra phy, pro tein im mo bi li za tion, fu sion pro tein.
Re com bi nant an ti body frag ments (rAbs) con struc tion and
their ex pres sion in heterologous sys tems rep re sents the
mod ern ap proach of ob tain ing highly se lec tive im mu no -
log i cal re agents for fun da men tal re searches, di ag nos tics
and ther apy [1, 2]. Sin gle chain an ti bod ies (ScFv) are the
re com bi nant mol e cules, de signed by the ge netic fu sion of
vari able do mains from heavy and light an ti body chains via
the ar ti fi cial linker, which are ex pressed by the pro duc ers
as one polypeptide chain [3]. Now a days, ScFv an ti bod ies
are widely used in many ap plied and fun da men tal re -
searches, which are con di tioned by the ca pa bil ity of se lect -
ing the mol e cules with the de sired bind ing char ac ter is tics
and the pos si bil ity of their large-scale pro duc tion us ing
high-ef fi cient ex pres sion sys tems [4].
One of the at trac tive di rec tions of rAbs ap pli ca tion is
the de vel op ment of in ex pen sive ma trixes for
immunoaffinity chro ma tog ra phy (IAC). Re cently the
prin ci pal ap pli ca bil ity of an ti body frag ments for pu ri fi ca -
tion of tar get pro teins by immunoaffinity chro ma tog ra phy
157
ISSN 0233-7657. Biopolymers and cell. 2006. Vol. 22. ISS 2. Translated from Ukrainia.
ã P.V. Gilchuk, O.V. Okunev, D.M. Irodov, M.V. Pav lo va, O.Ya.
Yakovenko, 2006
Mo lec u lar and Cell Biotechnologies
(IAC) has been shown [5, 6], and dif fer ent strat e gies for
their im mo bi li za tion on chro mato graphic ma trixes, in -
clud ing chem i cal cou pling or in di rect bind ing via some en -
gi neered pro tein part ners, have also been re ported [7, 8].
The most com mon dis ad van tage of chem i cal im mo bi li za -
tion meth ods is the ran dom ori en ta tion of an ti gen-bind ing
site of an ti body mol e cules on the ma trix sur face, which
leads to its low avail abil ity for the in ter ac tion with an ti gen.
Cur rent work pres ents the lab o ra tory method of
immunoaffinity me dia ob tain ing for chro mato graphic pu -
ri fi ca tion of hu man re com bi nant IFN-a2b, which is based
on di rect and ori ented im mo bi li za tion of ScFv an ti bod ies
on cel lu lose ma trix via cel lu lose bind ing do main (CBD)
Clostridium thermocellum. ScFv’s against hu man IFN-a2b
were se lected out from an im mune mouse cDNA li brary
ac cord ing to pro to cols as de scribed in the Amersham Bio -
sci ences (Swe den) Re com bi nant Phage An ti body Sys tem
man ual [9]. The gene en cod ing anti-IFN-a2b ScFv was
am pli fied from plasmid pCANTAB 5E and subcloned into
plasmid pET-24a (+) (Novagen) as N-ter mi nus fu sion
with cel lu lose bind ing do main - CBD (GenBank Acession
№X68233) (Fig.1). For the achieve ment of the high-level
pro duc tion of ScFv-CBD the cor re spond ing plasmid was
trans formed into E. coli strain BL21 (DE3) car ry ing the T7
RNA poly mer ase gene and the fu sion pro tein were ex -
pressed as in clu sion bod ies. Af ter the iso la tion of in clu sion
bod ies the ScFv-CBD was solubilized in 6 M GuHCl and
pu ri fied un der de na tur ing con di tions by Ni+2-im mo bi lized
af fin ity chro ma tog ra phy (IMAC) [10]. The pu ri fied
ScFv-CBD was re folded by grad ual re mov ing of
solubilizing re agent us ing Quix Stand ultrafiltration sys tem
(Amersham Bio sci ences) and the method de scribed in the
work [11].
Re folded ScFv-CBD was di rectly im mo bi lized on
microgranular cel lu lose CC31 (Whatman, Great Brit ain)
[12]. Pre pared af fin ity cel lu lose (~40 ml) was washed sev -
eral times with the phos phate-sa line buffer PBS pH (8.0)
and packed into the chro mato graphic col umn XK 16
(Amersham Bio sci ences). The pu ri fi ca tion pro ce dure was
car ried out us ing the “Acta Prime” chro ma tog ra phy
equip ment (Amersham Bio sci ences) as fol lows. Clar i fied
cell lysates of E.coli cells, con tain ing re com bi nant hu man
IFN-б2b (VDNK PharBiotech, ВНДК «ФармБіотек»,
Ukraine), were loaded on the col umn. Af ter wash ing the
col umn for sev eral times with PBS the bound IFN-a2b was
eluted by the buffer, con tain ing 0,1 M glycine-HCl, 0,5 M
NaCl (pH 3,0). IFN-a2b con cen tra tion was de ter mined
by mea sur ing ad sorp tion at A280, and the pu rity of eluted
IFN-a2b was an a lyzed by elec tro pho re sis in 15% SDS-
polyacrilamide gel (SDS-PAGE).
158
P.V. Gilchuk, O.V. Okunev, D.M. Irodov, M.V. Pav lo va, O.Ya. Yakovenko
Fig.1. The scheme of “ScFv-CBD” ex pres sion cas sette in plasmid vec tor
pET-24 a(+)
Antigen
Spacer
ScFv
CBD
Cellulose
Fig.2. The sche matic im age of fu sion pro tein ScFv-CBD, con tain ing af fin ity moi eties for an ti gen bind ing and im mo bi li za tion on cel lu lose
The de signed fu sion pro tein (~46 kDa) con tains two
af fin ity moi eties, rep re sented by N-ter mi nus of ScFv an ti -
body and C-ter mi nus of CBD, which are join ing with 13
amino acid spacer- (-Gly3-Ser-Glu-Gly3-Ser-Glu-Gly3-).
In tro duced af fin ity tag se quence “(His)6-tag” from the ex -
pres sion vec tor fa cil i tates one-step pu ri fi ca tion of
ScFv-CBD from in clu sion bod ies by IMAC. The con -
ducted de sign of fu sion pro tein mol e cule pro vides sta ble
com plex for ma tion be tween cel lu lose-bind ing do main and
car bo hy drate scaf fold of cel lu lose, and ex poses the an ti -
gen-bind ing site of the ScFv to the op ti mal po si tion for the
in ter ac tion with the an ti gen (Fig.2).
Bi o log i cally ac tive ScFv-CBD was re cov ered from the
E.coli in clu sion bod ies as de scribed above. The refolding
ef fi cacy was cal cu lated by the per cent age of re cov ered bi o -
log i cal ac tiv ity sep a rately for each moi ety of fu sion pro tein
(ScFv and CBD) us ing the ap proach ear lier de vel oped by
us (not pub lished data). It has the fol low ing prin ci ple: the
bi o log i cal ac tiv ity for ScFv is the ca pa bil ity of bind ing an ti -
gen, while for CBD it is the se lec tive in ter ac tion with cel lu -
lose. Thus, the ac tiv ity of CBD was cal cu lated ac cord ing to
the per cent age ScFv-CBD pro tein, which was se lec tively
bound onto cel lu lose af ter the refolding. The anal y sis of
ScFv ac tiv ity was car ried out by es ti ma tion of the pro tein
mo lar ra tio in im mune com plexes ScFv-CBD / IFN-a2b,
which were eluted from af fin ity cel lu lose un der harsh de -
na tur ing con di tions and loaded for sep a ra tion to 15%
SDS-PAGE (Fig.3). Us ing the de scribed meth ods, it was
de ter mined that the refolding ef fi cacy for ScFv and CBD
moi eties of fu sion pro tein amounts to 98 and 45% re spec -
tively.
The us age of ef fec tive refolding method al lowed re cov -
ery of sol u ble and ac tive ma te rial from in clu sion bod ies
which proved to be enough to ob tain pre para tive af fin ity
col umn (40 ml of af fin ity cel lu lose with ca pac ity for the
ScFv-CBD of ~2 mg/ml) and to ful fill the pu ri fi ca tion of
re com bi nant IFN-a2b (mo lec u lar weight ~18 kDa).
Clar i fied lysate of E.coli cells, con tain ing ex pressed re -
com bi nant hu man IFN-a2b, was loaded on the af fin ity
col umn. The elu tion of bound IFN-a2b was car ried out at
mild con di tions (pH 3,0) which pro vided its se lec tive dis -
so ci a tion with out sig nif i cant “leak age” of im mo bi lized
ScFv-CBD (Fig.4, a). Ac cord ing to the SDS-PAGE data
the pu rity of IFN-a2b in eluted frac tions amounts to more
than 95% and only one ad di tional mi nor band is vis i ble
(~45 kDa), which is the prod uct of ScFv-CBD dis so ci a -
tion from cel lu lose at pH 3,0 (Fig.4, b). Nev er the less, the
amount of eluted fu sion pro tein was less than 0,1% per one
pu ri fi ca tion cy cle, which prac ti cally did not in flu ence the
col umn per for mance. The col umn dy namic ca pac ity for
IFN-a2b was cal cu lated ac cord ing to the mea sure ment
data of pu ri fied IFN-a2b con cen tra tion, it amounted to
about 0,1 mg of IFN-a2b per 1ml of af fin ity cel lu lose. The
im por tant re sult is the fact that we dem on strated the pos si -
bil ity of re peated pu ri fi ca tion of IFN-a2b for the same af -
fin ity col umn af ter its sub se quent re load ing.
In cur rent work we pres ent the lab o ra tory method for
ob tain ing af fin ity me dia us ing sin gle chain an ti bod ies
which im mo bi lized via cel lu lose bind ing do main. The
prin ci pal ap pli ca bil ity of immunoaffinity col umn for
one-step chro mato graphic pu ri fi ca tion of re com bi nant
hu man IFN-a2b from clar i fied lysates of pro ducer cells
(pu rity ~95%) was dem on strated, and high sta bil ity of im -
mo bi lized ScFv an ti bod ies at sev eral sub se quent pu ri fi ca -
tion cy cles was also shown.
The au thors ex press sin cere grat i tude to the work ers of
The In sti tute of Bio chem is try named af ter O.V. Palladin of
NAS of Ukraine S.I. Andrianov, O.Yu. Slominsky and
Pro fes sor G.L. Volkov for me thodic in struc tions and the
pos si bil ity of us ing ultrafiltration and chro ma tog ra phy
equip ment, to the work ers of VDNK PharBiotech for pro -
vid ing pro tein ex tracts from E.coli pro duc ers to ful fill the
pu ri fi ca tion of re com bi nant hu man IFN-a2b, and to pro -
fes sor Y. Shoham (Haifa, Is rael) for pre sent ing us a gift of
the plasmid with CBD for in ves ti ga tions .
159
Im mo bi lized sin gle chain an ti bod ies for af fin ity
Fig.3. SDS-PAGE anal y sis dem on strat ing the pro tein com plexes which
are formed on cel lu lose with im mo bi lized ScFv-CBD (~45 kDa) af ter
bind ing of IFN-a2b (~18 kDa) to the col umn. Im mune com plexes were
eluted from cel lu lose by the buffer con tain ing 8 M of urea, 0,5% of SDS
and 0,1 M of 2-mercaptoethanol. The amount of pro teins, loaded to lines
1-3, cor re sponds to 10; 5 and 2,5 ml of af fin ity cel lu lose; M - mo lec u lar
weight marker; the gel was stained by Coomassie bril liant blue R-250.
П. В. Гильчук, О. В. Окунев, Д. М. Иродов, М. В. Павлова, О. Я.
Яковенко
Иммобилизованные одноноцепочечные антитела для аффинной
очистки рекомбинантного IFN-a2b человека
Резюме
Представлен лабораторный метод получения иммуноаффинного
сорбента для хроматографической очистки белков, основанный на
ориентированной и нековалентной иммобилизации
рекомбинантных фрагментов антител на целлюлозном носителе.
На основе ДНК-последовательностей однонитчатых антител
(ScFv) к IFN-a2b человека и связывающего целлюлозу домена (CBD)
из целлюлозолитического комплекса Clostridium thermocellum
сконструирован слитый белок (ScFv-CBD). После экспрессии
ScFv-CBD в клетках Esch e richia coli и выделения целевого белка в
функционально активной форме проведенa его прямая
иммобилизация на микрогранулированной целлюлозе. Целлюлоза
с иммобилизованным ScFv-CBD использована как аффинный
сорбент для очистки рекомбинантного IFN-a2b человека.
Ключевые слова: одноцепочечные антитела, иммуноаффинная
хроматография, иммобилизация белка, слитый белок.
REFERENCES
1. Moroney S., Pluckhun A. Mod ern an ti body tech nol ogy: The im pact
on drug de vel op ment // Mod ern
Biopharmaceuticals.—Weinheim: Wiley VCH, 2005.—4.—P.
1147—1186.
160
P.V. Gilchuk, O.V. Okunev, D.M. Irodov, M.V. Pav lo va, O.Ya. Yakovenko
Fig.4. Pu ri fi ca tion of re com bi nant hu man IFN-a2b with im mo bi lized on cel lu lose sin gle chain an ti bod ies: a – elu tion pro file (1 – load ing of clar i fied
lysate from E.coli cells with IFN-a2b; 2 – pro teins that did not bind to the col umn and were re moved by wash ing with PBS; 3 – elu tion of bound
IFN-a2b at pH 3,0); b – SDS-PAGE anal y sis (1 – pro teins in clar i fied lysate from E.coli cells with IFN-a2b; 2-4 – pro teins in eluted frac tions; M -
mo lec u lar weight marker; the gel was stained by Coomassie bril liant blue R-250.
2. Holliger P., Hud son P. J. En gi neer ing an ti body frag ments and the
rise of sin gle do mains // Na ture Biotechnol.—2005.—23.—P.
1126—1136.
3. Huston J. S., Levinson D., Mudgett-Hunter M., Tai M., Novotny J.,
Margolies M. N., Ridge R. J., Bruccoleri R. E. Pro tein en gi neer ing
of an ti body bind ing sites: re cov ery of spe cific ac tiv ity in an anti-
digoxin sin gle chain Fv analoghue pro duced in Esch e richia coli //
Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1988.—85.—P. 5879—5883.
4. Pluckthun A., Krebber A., Krebber C., Horn U., Knupfer U.,
Wenderoth R., Nieba L., Proba K., Riesenberg D. Pro duc ing an ti -
bod ies in Esch e richia coli: from PCR to fer men ta tion // An ti body
en gi neer ing / Eds J. McCafferty, H. R. Hoogenboom.—Ox ford:
IRL press, 1996.—P. 203—252.
5. Berry M. J., Davies J., Smith C. G., Smith I. Im mo bi li za tion of Fv
an ti body frag ments on po rous sil ica and their util ity in af fin ity
chro ma tog ra phy // J. Chromatogr.—1991.—587.—P. 161—169.
6. Schild A., Kleist D., Welschof M., Opelz G., Ramensee H. G., Schild
H., Terness P. One-step sin gle chain Fv re com bi nant an ti -
body-based pu ri fi ca tion of gp96 for vac cine de vel op ment // Can -
cer Res.—2000.—60.—P. 4175—4178.
7. Berdichevsky Y., Lamed R., Frenkel D., Gophana U., Bayer E. A.,
Yaron S., Shoham Y., Benhar I. Ma trix-as sisted refolding of sin
gle-chain Fv-cel lu lose bind ing do main fu sion pro tein // Pro tein
Exp. Purif.—1999.—17.—P. 249—259.
8. Blank K., Lidner P., Diafenbach B., Pluckthun A. Self-im mo bi lized
re com bi nant an ti bod ies for immunoaffinity chro ma tog ra phy: ge -
netic, par al lel, and scal able pro tein pu ri fi ca tion // Pro tein Exp.
Purif.—2002.—24.—P. 313—322.
9. Окунев О. В., Гильчук П. В., Иродов Д. М. Получение и
характеристика одноцепочечных антител к интерферону a2b человека
// Укр. бiохiм. журн.—2005.—77, № 5.—P. 106—115.
10. Re com bi nant pro tein hand book: Pro tein am pli fi ca tion and sim ple
pu ri fi ca tion // Amersham Parmacia Biotech. (18-1142-75).—Р.
108.
11. Sinacola J. R., Rob in son A. S. Rapid refolding and pol ish ing of sin -
gle-chain an ti bod ies from Esch e richia coli in clu sion bod ies // Pro -
tein Exp. Purif.—2002.—26.—P. 301—308.
12. Morag E., Lapidot A., Govorko D., Lamed R., Wilchek M., Bayer E.
A., Shoham Y. Ex pres sion, pu ri fi ca tion, and char ac ter iza tion of the
cel lu lose-bind ing do main of the scaffoldin sub unit from the
cellulosome of Clostridium thermocellum // Appl. En vi ron.
Microbiol.—1995.—61.—P. 1980—1986.
ÓÄÊ 579.69+577.112+543.544.17
Надiйшла до редакцiї 20.12.05
161
Im mo bi lized sin gle chain an ti bod ies for af fin ity
|