Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli
Метионинаминопептидазы (MAP) играют важную роль в процессинге белка. Они избирательно удаляют N-концевой метионин у растущего полипептида как в эу-, так и прокариотических клетках. Однако при получении гетерологичных белков в бактериях дополнительный N-концевой метионин часто не отщепляется. Если ре...
Saved in:
| Published in: | Біополімери і клітина |
|---|---|
| Date: | 2003 |
| Main Authors: | , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2003
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156513 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli / И.Ю. Славченко, Е.В. Борейко, Н.В. Воробей, Т.Г. Гавриш, Е.Н. Пехота, В.А. Кордюм // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 3. — С. 274-280. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156513 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Славченко, И.Ю. Борейко, Е.В. Воробей, Н.В. Гавриш, Т.Г. Пехота, Е.Н. Кордюм, В.А. 2019-06-18T15:12:34Z 2019-06-18T15:12:34Z 2003 Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli / И.Ю. Славченко, Е.В. Борейко, Н.В. Воробей, Т.Г. Гавриш, Е.Н. Пехота, В.А. Кордюм // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 3. — С. 274-280. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.00065C https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156513 579.25 8 + 577.12 4 Метионинаминопептидазы (MAP) играют важную роль в процессинге белка. Они избирательно удаляют N-концевой метионин у растущего полипептида как в эу-, так и прокариотических клетках. Однако при получении гетерологичных белков в бактериях дополнительный N-концевой метионин часто не отщепляется. Если рекомбинантные белки предназначены для клинического применения, то очень важно, чтобы конечный продукт был идентичен природному аналогу, иначе он может обладать антигенными свойствами. Поэтому дополнительный N-концевой остаток метионина желательно удалить, что можно осуществить in vitro обработкой рекомбинантного белка препаратом очищенной MAP Е. coli. В настоящей работе разработан эффективный метод получения данного фермента с использованием системы экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7. Показано, что при культивировании продуцента MAP BL (рЕТ-МАР) при температуре 37 °С целевой белок накапливается преимущественно в нерастворимой форме с выходом 17 % от суммарных клеточных белков. Однако если клетки штамма-продуцента инфицировать фагом лямбда, то полученный лизат будет содержать МАР в растворимой форме в значительно большем количестве, чем не инфицированные клетки. В результате оптимизации таких параметров, как оптическая плотность культуры при заражении и последующая температура культиви рования продуцента, достигнут выход целевого белка в количестве, превышающем 40 % от растворимых белков, или 0,8 г/л. Рекомбинантный белок очищен с использованием ионообменной хроматографии до гомогенности более 90 %. Метіонінамінопептидази (МАР) відіграють важливу роль у процесінгу білка. Вони вибірково видаляють N-кінцевий метіонін у поліпептиду як в еу-, так і прокаріотичних клітинах. Однак при отриманні гетерологічних білків у бактеріях додатковий N-кінцевий метіонін часто не відщеплюється. Якщо рекомбінантні білки передбачається застосовувати у клініці, то дуже важливо, щоб кінцевий продукт був ідентичним природному аналогу, инакше в нього можуть бути антигенні властивості. Тому додатковий N-кіниевий залишок метіоніну бажано видалити, що можна здійснити in vitro, обробивши рекомбінантний білок препаратом очищеної МАР Е. coli. У цій роботі розроблено ефективний метод отримання даного ферменту з використанням системи експресії на основі РНК-полімерази фага Т7. Показано, що при культивуванні продуцента MAP BL (рЕТ-МАР) за температури 37 °С цільовий білок накопичується переважно в нерозчинній формі з виходом 17 % від сумарних клітинних білків. Однак якщо клітини штам у-продуцента інфікувати фагом лямбда, то одержаний лізат буде вміщувати МАР у розчинній формі в значно більшій кількості, ніж неінфіковані клітини. В результаті оптимізації таких параметрів, як оптична густина культури при зараженні і наступна температура культивування продуцента, досягнуто вихід цільового білка в кількості, що перевищує 40 % від розчинних білків, або 0,8 г/л. Рекомбінантний білок очищено з використанням іонообмінної хроматографії до гомогенності більше 90 %. Methionine aminopeptidases (MAPs) play an important role in protein processing. In both eukaryotic and prokaryotic cells MAPs selectively remove methionine residue from the N-termini of a nascent polypeptide. However, an extra N-terminal methionyl residue frequently remains in heterologous proteins being produced in bacteria. In case of recombinant proteins destined for clinical application, it is utmost important that the final product has an N-terminal identical to that of a natural counterpart, as otherwise it may possess antigenic properties. An extra N-terminal methionine residue of a recombinant polypeptide may be removed in vitro by treatment with methionine aminopeptidase from E. coli. In the present work, an effective method of this enzyme production has been developed using an expression system based on the bacteriophage T7 polymerase. It was shown, that upon the cultivation of the MAP producer BL (pET-MAP) at 37 °C the target protein mainly accumulated in an insoluble form with a yield 17 % of the total cellular protein. However, if the producer cells are infected by phage λ, a lysate obtained contains MAP in a soluble form with higher yield compared with non infected cells. Optimization of the conditions such as cells density at the phage infection and temperature of the producer cultivation resulted in the target product yield exceeding 40 % of the soluble cell proteins, or 0,8 g/1. The recombinant protein has been purified by ion-exchange chromatography to homogeneity not less than 90 %. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Біополімери і клітина Молекулярна та клітинна біотехнології Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli Суперсинте з та очищенн я метіонінамінопептидази Escherichia coli Overexpression and purification of methionine aminopeptidase from Escherichia coli Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli |
| spellingShingle |
Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli Славченко, И.Ю. Борейко, Е.В. Воробей, Н.В. Гавриш, Т.Г. Пехота, Е.Н. Кордюм, В.А. Молекулярна та клітинна біотехнології |
| title_short |
Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli |
| title_full |
Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli |
| title_fullStr |
Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli |
| title_full_unstemmed |
Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli |
| title_sort |
суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы escherichia coli |
| author |
Славченко, И.Ю. Борейко, Е.В. Воробей, Н.В. Гавриш, Т.Г. Пехота, Е.Н. Кордюм, В.А. |
| author_facet |
Славченко, И.Ю. Борейко, Е.В. Воробей, Н.В. Гавриш, Т.Г. Пехота, Е.Н. Кордюм, В.А. |
| topic |
Молекулярна та клітинна біотехнології |
| topic_facet |
Молекулярна та клітинна біотехнології |
| publishDate |
2003 |
| language |
Russian |
| container_title |
Біополімери і клітина |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Суперсинте з та очищенн я метіонінамінопептидази Escherichia coli Overexpression and purification of methionine aminopeptidase from Escherichia coli |
| issn |
0233-7657 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156513 |
| citation_txt |
Суперсинтез и очистка метионинаминопептидазы Escherichia coli / И.Ю. Славченко, Е.В. Борейко, Н.В. Воробей, Т.Г. Гавриш, Е.Н. Пехота, В.А. Кордюм // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 3. — С. 274-280. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT slavčenkoiû supersinteziočistkametioninaminopeptidazyescherichiacoli AT boreikoev supersinteziočistkametioninaminopeptidazyescherichiacoli AT vorobeinv supersinteziočistkametioninaminopeptidazyescherichiacoli AT gavrištg supersinteziočistkametioninaminopeptidazyescherichiacoli AT pehotaen supersinteziočistkametioninaminopeptidazyescherichiacoli AT kordûmva supersinteziočistkametioninaminopeptidazyescherichiacoli AT slavčenkoiû supersinteztaočiŝennâmetíonínamínopeptidaziescherichiacoli AT boreikoev supersinteztaočiŝennâmetíonínamínopeptidaziescherichiacoli AT vorobeinv supersinteztaočiŝennâmetíonínamínopeptidaziescherichiacoli AT gavrištg supersinteztaočiŝennâmetíonínamínopeptidaziescherichiacoli AT pehotaen supersinteztaočiŝennâmetíonínamínopeptidaziescherichiacoli AT kordûmva supersinteztaočiŝennâmetíonínamínopeptidaziescherichiacoli AT slavčenkoiû overexpressionandpurificationofmethionineaminopeptidasefromescherichiacoli AT boreikoev overexpressionandpurificationofmethionineaminopeptidasefromescherichiacoli AT vorobeinv overexpressionandpurificationofmethionineaminopeptidasefromescherichiacoli AT gavrištg overexpressionandpurificationofmethionineaminopeptidasefromescherichiacoli AT pehotaen overexpressionandpurificationofmethionineaminopeptidasefromescherichiacoli AT kordûmva overexpressionandpurificationofmethionineaminopeptidasefromescherichiacoli |
| first_indexed |
2025-12-07T20:49:13Z |
| last_indexed |
2025-12-07T20:49:13Z |
| _version_ |
1850884021395914752 |
| description |
Метионинаминопептидазы (MAP) играют важную роль в процессинге белка. Они избирательно удаляют N-концевой метионин у растущего полипептида как в эу-, так и прокариотических клетках. Однако при получении гетерологичных белков в бактериях дополнительный N-концевой метионин часто не отщепляется. Если рекомбинантные белки предназначены для клинического применения, то очень важно, чтобы конечный продукт был идентичен природному аналогу, иначе он может обладать антигенными свойствами. Поэтому дополнительный N-концевой остаток метионина желательно удалить, что можно осуществить in vitro обработкой рекомбинантного белка препаратом очищенной MAP Е. coli. В настоящей работе разработан эффективный метод получения данного фермента с использованием системы экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7. Показано, что при культивировании продуцента MAP BL (рЕТ-МАР) при температуре 37 °С целевой белок накапливается преимущественно в нерастворимой форме с выходом 17 % от суммарных клеточных белков. Однако если клетки штамма-продуцента инфицировать фагом лямбда, то полученный лизат будет содержать МАР в растворимой форме в значительно большем количестве, чем не инфицированные клетки. В результате оптимизации таких параметров, как оптическая плотность культуры при заражении и последующая температура культиви рования продуцента, достигнут выход целевого белка в количестве, превышающем 40 % от растворимых белков, или 0,8 г/л. Рекомбинантный белок очищен с использованием ионообменной хроматографии до гомогенности более 90 %.
Метіонінамінопептидази (МАР) відіграють важливу роль у процесінгу білка. Вони вибірково видаляють N-кінцевий метіонін у поліпептиду як в еу-, так і прокаріотичних клітинах. Однак при отриманні гетерологічних білків у бактеріях додатковий N-кінцевий метіонін часто не відщеплюється. Якщо рекомбінантні білки передбачається застосовувати у клініці, то дуже важливо, щоб кінцевий продукт був ідентичним природному аналогу, инакше в нього можуть бути антигенні властивості. Тому додатковий N-кіниевий залишок метіоніну бажано видалити, що можна здійснити in vitro, обробивши рекомбінантний білок препаратом очищеної МАР Е. coli. У цій роботі розроблено ефективний метод отримання даного ферменту з використанням системи експресії на основі РНК-полімерази фага Т7. Показано, що при культивуванні продуцента MAP BL (рЕТ-МАР) за температури 37 °С цільовий білок накопичується переважно в нерозчинній формі з виходом 17 % від сумарних клітинних білків. Однак якщо клітини штам у-продуцента інфікувати фагом лямбда, то одержаний лізат буде вміщувати МАР у розчинній формі в значно більшій кількості, ніж неінфіковані клітини. В результаті оптимізації таких параметрів, як оптична густина культури при зараженні і наступна температура культивування продуцента, досягнуто вихід цільового білка в кількості, що перевищує 40 % від розчинних білків, або 0,8 г/л. Рекомбінантний білок очищено з використанням іонообмінної хроматографії до гомогенності більше 90 %.
Methionine aminopeptidases (MAPs) play an important role in protein processing. In both eukaryotic and prokaryotic cells MAPs selectively remove methionine residue from the N-termini of a nascent polypeptide. However, an extra N-terminal methionyl residue frequently remains in heterologous proteins being produced in bacteria. In case of recombinant proteins destined for clinical application, it is utmost important that the final product has an N-terminal identical to that of a natural counterpart, as otherwise it may possess antigenic properties. An extra N-terminal methionine residue of a recombinant polypeptide may be removed in vitro by treatment with methionine aminopeptidase from E. coli. In the present work, an effective method of this enzyme production has been developed using an expression system based on the bacteriophage T7 polymerase. It was shown, that upon the cultivation of the MAP producer BL (pET-MAP) at 37 °C the target protein mainly accumulated in an insoluble form with a yield 17 % of the total cellular protein. However, if the producer cells are infected by phage λ, a lysate obtained contains MAP in a soluble form with higher yield compared with non infected cells. Optimization of the conditions such as cells density at the phage infection and temperature of the producer cultivation resulted in the target product yield exceeding 40 % of the soluble cell proteins, or 0,8 g/1. The recombinant protein has been purified by ion-exchange chromatography to homogeneity not less than 90 %.
|