Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды

Описаны основные методы идентификации трихотеценовых микотоксинов, среди которых различные биотесты, тонкослойная хроматография, газожидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия и иммунохимические методы, в том числе ELISA. Рассмотрены перспективы развит...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Veröffentlicht in:	Біополімери і клітина
Datum:	2003
Hauptverfasser:	Артюх, В.П., Гойстер, О.С., Хмельницкий, Г.А., Стародуб, Н.Ф.
Format:	Artikel
Sprache:	Russisch
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2003
Schlagworte:	Огляди
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156521
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды / В.П. Артюх, О.С. Гойстер, Г.А. Хмельницкий, Н.Ф. Стародуб // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 3. — С. 216-223. — Бібліогр.: 50 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1859624634047004672
author	Артюх, В.П. Гойстер, О.С. Хмельницкий, Г.А. Стародуб, Н.Ф.
author_facet	Артюх, В.П. Гойстер, О.С. Хмельницкий, Г.А. Стародуб, Н.Ф.
citation_txt	Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды / В.П. Артюх, О.С. Гойстер, Г.А. Хмельницкий, Н.Ф. Стародуб // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 3. — С. 216-223. — Бібліогр.: 50 назв. — рос.
collection	DSpace DC
container_title	Біополімери і клітина
description	Описаны основные методы идентификации трихотеценовых микотоксинов, среди которых различные биотесты, тонкослойная хроматография, газожидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия и иммунохимические методы, в том числе ELISA. Рассмотрены перспективы развития инструментальных методов определения микотоксинов на основе использования новых технологических решений. Описано основні методи ідентифікації трихотеценових мікотоксинів, серед яких різні біометоди, тонкошарова хроматографія, газо-рідинна хроматографія, високоефективна рідинна хроматографія, імуноферментні методи (ELISA), мас-спектрометрія. Розглянуто перспективи розвитку інструментальних методів визначення мікотоксинів на базі використання нових технологічних рішень. The basic methods of identification of trichothecene toxins are described in the review including biomethods, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, immuno-enzyme assay (ELISA), gas-liquid chromatography, mass spectrometry. The future trends of development of the instrumental methods based on new technological decisions are briefly discussed regarding mycotoxins determination.
first_indexed	2025-11-29T09:37:33Z
format	Article
fulltext	ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2003. Т. 19. № З Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды В. П. Артюх, О. С Гойстер, Г. А. Хмельницкий 1, Н. Ф. Стародуб Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины Ул. Леонтовича, 9, Киев, 01030, Украина 1 Национальный аграрный университет УААН Ул. Героев обороны, 15, Киев, 03041 , Украина Описаны основные методы идентификации трихотеценовых микотоксинов, среди которых раз личные биотесты, тонкослойная хроматография, газожидкостная хроматография, высокоэффек тивная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия и иммунохимические методы, в том числе ELISA. Рассмотрены перспективы развития инструментальных методов определения микотоксинов на основе использования новых технологических решений. Введение. Целью данного обзора явилась попытка охарактеризовать в сравнительном аспекте методы идентификации микотоксинов в организме и в объектах окружающей среды, сосредоточив основ ное внимание на токсине Т-2. Такой анализ, по нашему мнению, необходим для дальнейшего ре шения проблемы экспрессного контроля этого клас са токсикантов и разработки эффективных мер лечения и профилактики вызываемых ими заболе ваний. Микромицеты, продуцирующие микотоксины, широко распространены в природе, но наиболее характерны для умеренных широт [1 ]. Микотокси ны при соответствующей влажности и температуре накапливаются в кормах, пищевых продуктах. Раз личные генерации микромицетов способны проду цировать весьма обширный набор токсинов, таких как афлатоксины, рубратоксины, охратоксины, фу- монизины и трихотецетены [2, 3 ]. Поскольку нас интересует в основном Т-2 ток син, относящийся к трихотеценам, то основное внимание будет уделено именно этому виду мико токсинов. Трихотецены относятся к семейству хи мических соединений, получивших название сеск- витерпеноидов (sesquiterpenoids). Их отличитель ной чертой является трихотеценовое кольцо, © В. П. А Р Т Ю Х , О С. Г О Й С Т Е Р , Г. А. Х М Е Л Ь Н И Ц К И Й , М. Ф . С Т А Р О Д У Б , 2 0 0 3 содержащее олефиновую связь С-9 и эпоксидную группу в области С-12,13. Описано до 150 произ водных структуры, представленной ниже на схеме [ 1 , 4 ] (система нумерации и боковые группы тет- рациклического трихотеценового ядра). Продуцентом Т-2, как было установлено в конце 60-х годов, является Fusarium tricinctum и в меньшей степени — Mycothecium, Trichoderma, Tri- chothecium, Cephalosporium и Stackybotrys [5 ]. Известны случаи массового заболевания и ги бели людей в результате употребления продуктов, изготовленных из перезимовавшего в поле зерна (просо, пшеница, ячмень) , которое было поражено грибком вида Fusarium sporotrichioides [6, 7 ]. Вышеупомянутые ситуации относятся к собы тиям чрезвычайным, исключительным, актуаль ным же является выявление опасности хроническо го отравления малыми дозами микотоксинов. Ми котоксины поражают многие системы и ткани организма человека и животных. Патологические проявления хронического отравления малыми доза ми не имеют специфики, по которой можно было бы судить об этиологии заболевания, и поэтому часто диагносцируются как инфекционные заболе вания или же заболевания иного происхождения. В связи с этим очень важен оперативный контроль уровня загрязнения микотоксинами сырья для ком бикормовой и пищевой промышленности. 216 Т Р И Х О Т Е Ц Е Н О В Ы Е М И К О Т О К С И Н Ы : В Ы Я В Л Е Н И Е В О К Р У Ж А Ю Щ Е Й С Р Е Д Е Н Идентификация трихотеценов и, в частности, Т-2 представляет определенные трудности, хотя к настоящему времени уже разработана целая систе ма подходов, обеспечивающая контроль за содер жанием трихотеценов в продуктах сельскохозяйст венного производства растительного происхожде ния . С т а н д а р т н ы е а н а л и т и ч е с к и е п р о ц е д у р ы включают методы отбора проб, способы экстракции микотоксинов из образцов зерна, продуктов их переработки и биомедицинских препаратов. Из анализа источников литературы, посвященных ис пользованию различных подходов для выявления микотоксинов, вырисовывается картина, в некото рой степени отражающая ретроспективу развития методических подходов к контролю уровня мико- токсического загрязнения различных объектов. Это, прежде всего, — развитие доступных и про стых скрининговых методов, необходимых для бы строй идентификации. В первое время после воз никновения проблемы этим требованиям отвечали биотесты, хотя им присущи существенные недо статки, поскольку они малоспецифичны и с их помощью нельзя определить отдельные виды мико токсинов в анализируемой смеси. Кроме того, для осуществления такого анализа требуется достаточ но много времени. Следующим этапом было развитие методов на базе использовании технологии тонкослойной хро матографии (ТСХ), которая, в отличие от биоте стов, обеспечивала высокую специфичность, а так же возможность мультипараметрического опреде ления различных микотоксинов, но уступавшая биотестам по чувствительности. Параллельно раз вивалась газо-жидкостная хроматография (ГЖХ), применение которой стало существенным шагом вперед на пути повышения как чувствительности, так и специфичности в определении микотоксинов. Внедрение радиоиммунного анализа (РИА), так же как иммунохимического анализа (ИХА) и, в частности, различных модификаций твердофаз ного иммуноферментного анализа (ELISA), карди нальным образом расширило возможности количе ственной оценки токсинов. Эти методы по мере их усовершенствования могут использоваться как для первичного скрининга, так и для подтверждения результатов. Именно они и являются в настоящее время наиболее популярными в практике скринин га микотоксинов, и уже существуют коммерческие наборы для определения Т-2 и других микотокси нов методом ELISA. Аналогичную роль могут вы полнять методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и особенно при их целевой адаптации к физико-химическим особенностям этого класса химических соединений \|8 ]. В качест ве подтверждающих используется также масс-спек- троскопия и ядерно-резонансная спектроскопия. Безусловно, что для подтверждения результатов анализа все упомянутые выше методы могут быть использованы и в сочетании [9 ]. Биологические методы идентификации трихо- теценовых микотоксинов. Приступая к краткому описанию основных методических подходов, мы не претендуем на исчерпывающий их охват, а остано вимся лишь на наиболее употребляемых в практи ке. Для большинства аналитических процедур при определении Т-2 токсина и его производных требу ются экстракция и очистка исходного материала. Биологические методы идентификации трихотеце нов и, в частности, Т-2 токсина были в числе первых из применяемых для контроля степени загрязненности и нормативной регламентации пре дельно допустимой загрязненности сельскохозяйст венной продукции. Эти методы отличались простотой и дешевиз ной, но существенным недостатком была их низкая чувствительность и специфичность. В 1978 году в одних из первых методических рекомендациях да же не упоминалось о трихотеценах [10] . Образцы зерна или зернопродуктов подвергались экстракции с помощью органических расстворителей. После удаления последних получали так называемую ли- пидную фракцию, в состав которой (в случае загрязнения зерна) входили микотоксины, посколь ку они, как правило, плохо растворялись в воде, но очень хорошо — в органических растворителях. Токсичность этой фракции тестировали с помощью дрожжевой культуры или же испытывали на голу бях [10]. Впрочем, биологические методы довольно быс тро совершенствовались. До сего дня появляются новые и новые модификации и варианты биотестов с улучшенными характеристиками. Причем ис пользуется широкий круг биологических объектов: от позвоночных животных до клеточных культур. 217 ЛРТЮХ В П. И Д Р . Один из традиционных тестов [11] основан на регистрации раздражения кожи животного (мыши, крысы, кролика, безволосой морской свинки и др.) после нанесения на нее микотоксинов. Величина дозы коррелирует со степенью раздражения, но индивидуальная чувствительность вносит фактор неопределенности и поэтому этот метод считается пол у количественным. В соответствии с одним из вариантов крысе в кожу втирали 2 мкл раствора Т-2 токсина (концентрации 10—60 м к г / м л ) . Ус редненную действующую дозу определяли между концентрациями 10 и 60 м к г / м л через 48 ч после нанесения микотоксина. Отклонение результатов анализа не превышало 1,6 м к г / м л [12]. Распрост ранены также биотесты для оценки загрязнения кормов Т-2 токсином. В качестве примера можно привести тест с использованием однодневных утят, которые полу чали Т-2 токсин в дозах 0,25; 0,50 или 1 мкг / г корма на протяжении 7 дней. Первые признаки повреждения верхнего неба утят появлялись спустя 16 ч после начала эксперимента [13] . Традицион ным можно считать и биотест на Т-2 токсин, в котором критерием токсичности служит показатель смертности куриных эмбрионов [14]. Известны разработки по использованию кле точных систем [15] для оценки токсического дей ствия Т-2 токсина и его производных. Простейшие подходы включают попытки применения суспензии эритроцитов. Т-2 токсин обладает гемолитической активностью. Механизм такой активности аналоги чен эффекту перекиси водорода, сапонина и поли- оксиэтилена. Интересно и то, что при этом наблю дается обычный противогемолитический эффект витамина Е, манитола и гистидина, подавляющих свободнорадикальные процессы, что наводит на спекулятивные размышления относительно некото рых особенностей механизма токсического дейст вия Т-2 токсина. Защитный эффект антиоксидант- ных агентов был изучен и подтвержден рядом экспериментальных работ как в условиях in vivo, так и in vitro [16—19]. Применение более сложных клеточных систем в сочетании с цитологическими методами расшири ло возможности исследователей [20] . Так, осуще ствлена оценка цитотоксичности Fusarium mycoto- xins с помощью чувствительных клеток линии ВНК-21 (культура почечных клеток детенышей хомячков) по метаболической активности расщеп ления бромистого 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2-5- дифенилтетразолиума (МТТ-тест) . Клетки более чувствительны к трихотеценам типа А. Для Т-2 токсина цитотоксичность проявляется при его кон центрации 1,6 нг /мл , тогда как для деоксинивале- нола — 112 нг /мл . Как МТТ-тест (оценка осуще ствляется по нерастворимому формазану) , так и аналогичный MTS-тест (с водорастворимым форма- заном) демонстрируют разницу в чувствительности к Т-2 токсину и деоксиниваленолу, которая состав- ляляет 2,1 и 141 н г / м л соответственно. Следует все же заметить, что MTS-тест по сравнению с МТТ-тестом требует меньше времени для постановки и он проще в использовании [13 \|. Недавними разработками с использованием куль туры лимфоцитов показана сравнительная оценка цитотоксичности Т-2 токсина и таких его произ водных, как диацетоксисцирпенол, ниваленол и деоксиниваленол. Установлено, что трихотецены в разной степени влияют как на индуцируемую ми- тогеном пролиферацию лимфоцитов, так и на син тез иммуноглобулинов [21 ]. Дальнейшее развитие техники клеточной культуры позволило осущест вить скрининговую оценку концентраций микоток синов Fusarium, Применены три калориметриче ских биометода на мышиных фибробластах (ЗТЗ клетках) , в частности, метод, основанный на син тезе ДНК с включением 5-бромо-2-диоксиуридина (BrdU-тест), МТТ-тест и ЛДГ-тест по устойчиво сти клеточной мембраны (выход лактатдегидроге- назы). Авторы пришли к выводу о том, что BrdU- тест наиболее чувствителен к присутствию Т-2 токсина, так как ответную реакцию регистрирова ли уже при концентрации 4 нг /мл . В случае же МТТ- и ЛДГ-тестов она достигалась лишь при концентрациях 12 и 18 нг /мл соответственно [22]. Биотесты получили наибольшее развитие при использовании различных штаммов дрожжей. Это му предшествовали длительные исследования по подбору подходящих культур клеток, чувствитель ных к микотоксинам. Первые варианты сводились к качественному определению трихотеценов по на личию зон подавления роста микроорганизмов в исследуемых экстрактах. Такие тесты проводили в сочетании с тестами на голубях [10]. Недостатки очевидны — это низкая специфичность и сложно сть разработки четко стандартизированных проце дур, которые бы обеспечивали высокую воспроиз водимость. Тем не менее, именно биотесты с ис пользованием Candida pseudotropicalis и Torulohsis sp. 86А получили достаточно серьезное развитие, в ходе которого были устранены некоторые недостат ки, присущие первым разработкам. Модификации сделали эти тесты количественными и были офор млены в виде методических указаний [23]. Неко торое представление о характере скрининга штам мов дрожжей, чувствительных к токсину Т-2, мо жет дать работа [24] , в которой исследовано несколько десятков штаммов дрожжей, относящих- 218 ся к девяти различным родам, и при этом показа но, что только представители рода Saccharomyces обнаруживали незначительную чувствительность к действию Т-2 токсина. Ряд же других родов оказались нечувствитель ными: штаммы Candida castelii 1476, Torulaspora globosa 93, Debariomyces castelii 1652, Hansenula anomala 2554, 163, Metschnikowia bicuspidata 2628, Pichia bovis 1106, Pichia membranaefaciens 229, Sporobolomyces roseus 682, Zygosaccharomyces bailii 850. По этой причине дальнейший поиск чувстви тельной культуры проводили среди штаммов дрож жей из рода Saccharomyces и близких к нему таксономических групп. Всего изучено 47 штаммов Saccharomyces cerevisiae, один штамм Saccharo myces lactis, четыре штамма Kluyveromyces lactis, восемь штаммов Kluyveromyces marxianus и один штамм Z. bailii. Изучение порога чувствительности штаммов S. lactis ВЛМУ 459, штамма С. pseu- dotropicalis 44 пк и Saccharomyces fragilis 25-Д к препаратам чистого Т-2 токсина показало, что торможение зоны роста обнаруживается для S. lactis ВЛМУ 459 при наличии 20 нг, в то время как для других упоминавшихся выше штаммов это значение составляет 40—50 нг [24]. Упрощенные варианты биотестов [25] , осно ванные на использовании штаммов дрожжей, чув ствительных к Т-2 токсину, позволяют осуществ лять качественную оценку общей загрязненности зерна трихотеценами. При этом результаты оценки получают в течение 24 ч, т. е. метод нельзя назвать экспрессным, но к положительным его характеристикам можно отнести возможность ана лиза большого количества проб при относительно низкой стоимости анализа. Интересно и применение биотестов для изуче ния зависимости токсичности от структуры мико токсинов, что выполнено с помощью дрожжей К. marxianus. Отщепление изовалериановой груп пы, одной или двух ацетиловых или же двух ацетиловых плюс изовалериановой групп приводит к образованию диацетоксисцирпенола, НТ-2 токси на, T-2-триола и T-2-тетраола. Токсичность этих трихотеценов, как было установлено с помощью этого биотеста, была меньшей и по сравнению с токсичностью Т-2 токсина в 7, 36, 276 и 558 раз соответственно [26] . Воплощение идеи биоавтографического метода, который представляет собой совмещение преиму ществ ТСХ, позволяющей разделить микотоксины на пластинке, и микробиологического анализа, да ло возможность не только количественно оценивать микотоксины, но и одновременно определять не сколько их видов в одном образце [27 ]. Ниже Т Р И Х О Т Е Ц Е Н О В Ы Е МИКОТОКСИНЫ: В Ы Я В Л Е Н И Е В О К Р У Ж А Ю Щ Е Й С Р Е Д Е а- описан один из вариантов биоавтографического ме- •es тода, в соответствии с которым анализ экстракта к осуществляется в два этапа. Во-первых, после на несения экстракта проводят двухмерную хромато- ь- графию на пластинках типа «Сулифол» в системе )га диэтиловый эфир:гексан (1:1). Далее пластинку da высушивают, наносят на нее в качестве вещества- 8, «свидетеля» раствор Т-2 токсина и хроматографи- 9, руют вторично в перпендикулярном направлении в lii системе этшктолуол (3:1). На высушенную пла- и- стинку наносят сусло-агар и на его поверхности к- равномерно распределяют суточную культуру лу штамма дрожжей С. pseudotropicalis 44 пк. После ов инкубации (16 ч в термостате при температуре о- 28 °С) отмечают наличие зон подавления роста is, дрожжей и замеряют их диаметр. Зона подавления т роста, идентичная по хроматографической подвиж- ги ности таковой, вызванной веществом-«свидетелем», и- указывает на присутствие Т-2 токсина в исследуе- к мом образце. Его количество определяют расчет- то ным путем, причем чувствительность определения S. в зерне составляет 50 мкг /кг , а в комбикорме — ак около 90 мкг /кг [27]. го Этот же метод, но с использованием культуры Torulohsis sp. 86А обеспечивает выявление не- о- скольких микотоксинов одновременно, в том числе в- Т-2 токсина, с чувствительностью порядка 25 мкг в- на 1 кг зерна [28] . Таким образом, можно конста- ги тировать, что биотесты имеют ряд достоинств и ш сегодня нельзя утверждать, что потенциальные зя возможности данного подхода полностью исчерпа- го ны. Во всяком случае, об этом свидетельствуют а- публикации, продолжающие периодически появ- яо ляться в печати [29, 3 0 ] . Физико-химические методы анализа трихоте- е- ценов. Попытки разработать метод определения о- Т-2 токсина и его производных с помощью класси ки ческой, в том числе и ионообменной жидкостной п- хроматографии, не привели к успеху. В молекуле /х Т-2 токсина отсутствуют не только хромофорная ит система, но и структурные элементы, позволящие и- формировать ее без деструкции при мягких хими ях ческих воздействиях. Есть сведения о применении >ю иммуноаффинной и жидкостной хроматографии с для определения содержания деоксиниваленола в аз загрязненном зерне [31 ], а также жидкостной хро матографии для выявления В-трихотеценов в соче- [а, тании с масс-пектрометрией [32] . у- Более перспективным оказалось использование ш техники ГЖХ. Она оказалась одним из рутинных а- методов, применяемых для идентификации мико- ть токсинов как в сельскохозяйственных продуктах, е- так и в биомедицинских образцах. Все методы ке анализа реальных объектов с помощью ГЖХ требу- 219 ют многоступенчатой и длительной процедуры под готовки проб, а также стадии их химической моди фикации. Имеется ввиду, что перед хроматогра фией полярные группы микотоксиновых молекул должны быть преобразованы в эфирные или слож- ноэфирные группы. Образцы перед химической модификацией и последующей хроматографией требуют интенсивной очистки. Использование многочисленных подготови тельных операций ограничивает чувствительность метода на уровне 10 нг /мл . Более подробно проце дура подготовки анализируемого образца может быть проиллюстрирована кратким изложением схе мы одного из вариантов такого анализа Т-2 токси на в сыворотке крови 133 ]. Процедура начинается с его экстракции из образца с помощью этилацета- та, далее следует хроматография экстракта на ко лонке С18 в обратной фазе и соединение с гепта- флуоробутиратангидридом. В свою очередь, произ водные подвергают хроматографии на колонке OV-17 при различных температурных условиях, а регистрация ведется электрохимическим детекто ром. Минимально обнаруживаемый уровень Т-2 токсина в сыворотке крови составлял 30 нг /мл. В качестве внутреннего стандарта используется изо- Т-2 токсин. Воспроизводимость анализов достигает в среднем 95 ,5±8,6 % от введенного микотоксина в пределах концентраций от 40 до 120 нг /мл [33]. ГЖХ была и остается одним из подтверждающих методов анализа микотоксинов в объектах окружа ющей среды [34, 35] . В свое время весьма эффективным оказалось введение в практику анализа микотоксинов с по мощью ИХА и РИА [36, 37 ]. Это стало возможным после получения специфических антител к Т-2 токсину. Токсин экстрагировали метанолом, затем этот экстракт отмывали гексаном и пропускали через колонку Sep-Pak С18 (обратная фаза) . Далее экстракт упаривали для удаления органического растворителя, разбавляли 0,1 М натрий-фосфат- ным-буфером (рН 7,6) и анализировали с помощью РИА, используя осаждение сульфатом аммония комплекса антиген—антитело для отделения несвя занного Т-2 токсина. Экстракция и очистка Т-2 токсина позволяет добиться воспроизводимости анализа в пределах 78—85 % для кукурузы и 90—95 % для пшеницы от исходного количества. Sep-Pak-рафинирование позволяет избавиться от мешающих соединений и дает возможность определять данный токсин при концентрации 1,0 и 2,5 мкг /кг в кукурузе и пшенице соответственно. Воспроизводимость внут реннего контроля достигает 84 и 103 % для 1 — 20 мкг /кг Т-2 токсина в образцах пшеницы и 2,3—20 м к г / к г — в образцах кукурузы. Вариант РИА для определения Т-2 токсина в биологических жидкостях [37 ] обеспечивал чувствительность та кого же порядка и колебался в пределах от 2 до 5 нг /мл . Возможности ИХА можно расширить за счет получения различных типов антител \|38, 39 I, а также создавая разные методические схемы его выполнения [40 ]. В частности, разработан метод определения содержания Т-2 токсина в зерне на основе непря мого варианта твердофазного конкурентного имму- ноферментного анализа с использованием мечен ных ферментом вторых антител. Этот метод позво ляет определять содержание токсина в диапазоне 30—1000 нг /г \|41 ]. В другом случае моноклональные антитела к Т-2 токсину конъюгирвали с пероксидазой хрена и использовали в варианте прямого конкурентного определения микотоксина, при этом чувствитель ность анализа составляла не менее 10 нг/мл \|42 ] . Предложен более сложный вариант анализа на основе гомогенного конкурентного метода с исполь зованием комплементарно опосредованного лизиса липосом. Для этого солянокислый Т-2 токсин через аминогруппу присоединяли к фосфатидилэтанола- мину. Синтезированный таким образом комплекс внедряли в мембрану липосом. Во внутреннюю полость липосом в качестве свободного маркера помещали карбоксифлуоресцеин. В реакционную смесь, содержащую липосомы с фиксированным на их поверхности Т-2 токсином, вносили свободный Т-2 токсин в составе анализируемой пробы и моно клональные анти-Т-2 токсин антитела. В реакци онной смеси происходило конкурентное связывание моноклональных антител со свободным токсином в растворе и токсином на поверхности липосом. Да лее липосомы, на поверхности которых образовался комплекс Т-2 токсин—моноклональные антитела, разрушались и в раствор освобождался карбокси флуоресцеин. То есть, чем больше было Т-2 токси на в исследуемом образце, тем меньше карбокси- флуоресцеина оказывалось в свободном растворе. Этот метод обеспечивает чувствительность на уров не 2 нг /мл , что в 10 раз выше, чем у ELISA, и при использовании тех же антител сравнимо с резуль татами, полученными РИА методом [42 ] В качест ве подтверждающих методов, кроме упоминавшей ся ГЖХ [35], практикуют использование масс- спектроскопии. Масс-спектроскопия применена для характери стики, идентификации и подтверждения наличия микотоксинов. Она обеспечивает определение пи- кограммовых количеств микотоксинов [43, 44] . Наиболее эффективно использование комбинации 220 Т Р И Х О Т Е Ц Е Н О В Ы Е МИКОТОКСИНЫ: В Ы Я В Л Е Н И Е В О К Р У Ж А Ю Щ Е Й С Р Е Д Е методов ГЖХ и масс-спектроскопии [45] , а также HPLC—TCL [46 ]. Комбинация ГЖХ и масс-спект роскопии обеспечивает большую специфичность, чем при использовании одной ГЖХ [47, 48 ], поэ тому она и стала стандартной при определении микотоксинов как в сельскохозяйственных продук тах, так и в биомедицинских образцах. Ее чувстви тельность достигает 1 н г / м л . Основной недостаток — необходимость предва рительного химического преобразования анализи руемых соединений, что требует много времени. Одна из последних разработок совместного исполь зования ГЖХ—масс-спектроскопии [49] , предло женная в 2001 г., представляет собой специфичный и надежный метод идентификации микотоксинов без предварительного химического преобразования компонентов анализируемого образца. Этот метод позволяет достичь чувствительности на уровне 0,1 нг /мл. Всем рассмотренным выше методам определе ния микотоксинов присущ один недостаток, суще ственно затрудняющий оперативный контроль за уровнем загрязнения сырья для пищевой и комби кормовой промышленности, поскольку ни один из них нельзя отнести к экспресс-методам и эффек тивны они лишь в условиях стационарной лабора тории при наличии высококвалифицированного персонала. В настоящее время существует пробле ма оперативного контроля микотоксинов с по мощью экспресс-методов и приборов, пригодных к применению в полевых условиях. Предвестником решения этой проблемы можно считать публикацию, посвященную разработке экс прессного метода определения микотоксинов (фу- мазины) на основе использования явления поверх ностного плазменного резонанса (ППР) [50]. П П Р - сенсор для обнаружения фумазинов обладает чувствительностью на уровне 50 нг /мл при дли тельности анализа, не превышающей 10 мин. Ожи дается, что стоимость одного анализа будет на порядок ниже таковой методом ELISA, поэтому перспективность разработок в этом направлении кажется очевидной. Несомненно, что по чувстви тельности ППР-анализ уступает многим упоминав шимся выше методам определения микотоксинов. К бесспорным преимуществам можно отнести воз можность использования ППР-устройств в полевых условиях, прежде всего, для скрининга объектов окружающей среды и мониторинга состояния фу ражного и продовольственного зерна в местах дли тельного хранения и на предприятиях пищевой промышленности. Выводы. Современные методы позволяют об наруживать микотоксины в биологических образ цах и объектах окружающей среды с высокой точностью и избирательностью, но лишь в послед нее время появились отдельные работы, посвящен ные созданию методов, обеспечивающих, выполне ние анализа в режиме реального времени и в полевых условиях. Следовательно, можно констатировать, что на сегодня существует обширный арсенал методов оп ределения трихотеценов как в объектах окружаю щей среды, так и в биомедицинских препаратах. Дальнейшие усилия, как нам кажется, должны быть направлены на создание специальных инстру ментальных методов, основанных на биосенсорной технологии, и, что радует, в литературе начинают появляться первые сообщения о разработке подо бных методов, в частности, с использованием опти ческих иммуносенсоров. V. P. Artyukh, О. S. Goister, G. A. Khtnelnitsky, N. F. Starodub Trichothecene micotoxins: determination in environment Summary The basic methods of identification of trichothecene toxins are described in the review including biomethods, thin layer chro matography, high performance liquid chromatography, immuno- enzyme assay (ELISA), gas-liquid chromatography, mass spec trometry. The future trends of development of the instrumental methods based on new technological decisions are briefly discussed regarding mycotoxins determination. В. П. Артюх, О. С. Гойстер, Г. А. Хмельницький, М. Ф. Стародуб Трихотеценові мікотоксини: визначення в об'єктах довкілля Резюме Описано основні методи ідентифікації трихотеценових міко- токсинів, серед яких різні біометоди, тонкошарова хромато графія, газо-рідинна хроматографія, високоефективна рідинна хроматографія, імуноферментні методи (ELISA), мас-спек- трометрія. Розглянуто перспективи розвитку інструмен тальних методів визначення мікотоксинів на базі викори стання нових технологічних рішень. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Committee on protection against mycotoxins. Board on Toxi cology and Environmental Health Hazards, Commission on Life Sciences, National Research Council / / Protection. Against Trichothecene Mycotoxins.—Washington: Nat. Acad, press, 1983.—127 p. 2. Ciegler A. Mycotoxins: occurrence, chemistry, biological ac tivity / / Lloydia.—1975.—38, N 1.—P. 21—35. 3. Ciegler A., Bennett J. W. Mycotoxins and mycotoxicoses / / Bioscience.—1980.—30, N 8 .—P. 512—515 . 4. Cole R. J., Cox R. H. The trichothecenes / / Handbook of Toxic Fungal Metabolite / Eds R. J. Cole, R. H. Cox.—New York: Acad, press, 1981.—P. 152—263. 5. Bamdurg J. R., Riggs N. V., Strong F.M. The structure of toxins from two strains of Fusarium tricinctum II Tetra hedrons—1968.—24.—P. 3329—3333 . 6. Сиркисов A. X. Микотоксикозы.—M.: Изд-во ГИСХЛ, 1954.—216 с. 221 АРТЮХ В. П. И Д Р . 7. В hat V. R, Ramakrishna J., Sashidhar R. В. Outbreak of mycotoxicosis in Kashmir Valley / / Nutr. News India.— 1989.—10, N 1.—P. 1—3. 8. Jimenez M., Mateo J. J., Mateo R. Determination of type A trichothecenes by high-performance liquid chromatography with coumarin-3-carbonyl chloride derivatisation and fluores cence detection / / J. Chromatogr. A.—2000.—870.—P. 473— 481. 9. Omurtag G. Z., Yazicio D. Determination of T-2 toxin in grain and grain products / / J. Environ. Sci. Health B.—2000.—35, N 6.—P. 797—807. 10. Методические указания по определению токсичности зер новых культур и продуктов их переработки, пораженных грибами рода фузариум секции Sporotrichiella.—М: изд-во МЗ СССР, 1978 —5 с. 11. Wannemacher R. W., Jr., Bunner D. L., Neufeld H. A. Toxicity of trichothecenes and other related mycotoxins in laboratory animals / / Mycotoxins and Animal Foods / Eds J. E. Smith, R. S. Henderson. Boca Raton: CRC press, 1991. P. 499—552. 12. Hayes M. A., Schiefer H. B. A method for accurate measure ment of cutaneous irritancy of trichothecenes / / J . Environ. Pathol. Toxicol. Oncol .—1990.—10, N 3 — P. 103—105. 13. Shlosberg A. S., Klinger Y., Malkinson M. H. Muscovy ducklings, a particularly sensitive avian bioassay for T-2 toxin and diacetoxyscirpenol / / Avian. Dis .—1986.—30, N 4.— P. 820—824. 14. Rotter B. A., Thompson В. K, Prelusky D. В., Trenholm H. L. Evaluation of potential interactions involving trichothecene mycotoxins using the chick embryotoxicity bioassay / / Arch. Environ. Contam. Toxicol .—1991.—21, N 4.—P. 621—624. 15. Milo-Goldzweig I., Joffe A. Z., Yagen B. Trichothecene-in- duced hemolysis. 1. The hemolytic activity of T-2 toxin / / Toxicol, and Appl. Pharmacol. —1983 .—70, N 3.—P. 343— 347. 16. Ыа1 M., Shimada A., Ruiz F., Gonzalez de Mejia E. Effect of lycopene on lipid peroxidation and glutathione-dependent enzymes induced by T-2 toxin in vivo II Toxicol. Lett.— 1999.—1091, N 2.—P. 1 — 10. 17. Mezes M., Barta M., Nagy G. Comparative investigation on the effect of T-2 mycotoxin on lipid peroxidation and antioxidant status in different poultry species / / Res. Vet. Sci .—1999.— 66, N 1.—P. 19—23. 18. Atroshi F., Rizzo A., Sankari S., Biese I., Westermarck Т., Veijalainen P. Liver enzyme activities of rats exposed to ochratoxin A and T-2 toxin with antioxidants / / Bull. Environ. Contam. Toxicol .—2000.—64, N 4.—P. 586—592. 19. Shokri F., Ueidari M., Gharagozloo S., Ghazi-Khansari M. In vitro inhibitory effects of antioxidants on cytotoxicity of T-2 toxin / / Toxicology.—2000.—146, N 2—3.—P. 171 — 176. 20. Rotter B. A., Thompson В. K., Clarkin S., Owen Т. C. Rapid colorimetric bioassay for screening of Fusarium mycotoxins / / Nat. Toxins .—1993.—1, N 5 .—P. 303—307. 21. Thuvander A., Wikman C , Gadhasson I. In vitro exposure of human lymphocytes to trichothecenes: individual variation in sensitivity and effects of combined exposure on lymphocyte function / / Food Chem. Toxicol .—1999.—37, N 6.—P. 639— 648. 22. Widestrand J., Lundh Т., Pettersson H.t Lindberg J. E. Cytotoxicity of four trichothecenes evaluated by three colo rimetric bioassays / / Mycopathologia.—1999.—147, N 3 . — P. 149—155. 23. Методические указания по количественному определению Т-2 токсина в зерне и комбикормах / Главное управление ветеринарии Госагропрома СССР.—M., 1987.—11 с. 24. Болтянская Э. В., Куваева И. Б., Кроякова Е. А. Скри нинг штаммов дрожжей, чувствительных к токсину Т-2 / / Вопр. питания.—1988.—№ 6.—С. 67—68. 25. Binder J. A yeast bioassay for trichothecenes / / Nat. To xins .—1999.—7, N 6.—P. 401—406. 26. Madhyastha M. S., Marquardt R. R.r Abramaon D. Structure- activity relationships and interactions among trichothecene mycotoxins as assessed by yeast bioassay / / Toxicon.— 1994.—32, N 9.—P. 1147—1152. 27. Котик A. H., Труфанова В. А. Определение трихотеце- новых микотоксинов в кормах и культурах грибов биоавто графическим методом / / Тр. Всесоюз. ин-та зерна и продуктов его переработки.—1987.—Т. 65 .—С. 127—130. 28. Котик А. Н., Труфанова В. А. Биоавтографический метод определения трихотеценовых микотоксинов в зерне и про дуктах его переработки / / Гигиена и санитария.—1989.— № 9.—С. 53—54. 29. Engler К. Н., Coker R., Evans I. Н. J. A novel colorimetric yeast bioassay for detecting trichothecene mycotoxins / / Mic robiol. Meth. 1999. 35, N 3 . - - P . 207 - 218. 30. Engler К. H., Coker R. D., Evans І. I/. Uptake of aflatoxin Bl and T-2 toxin by two mycotoxin bioassay microorganisms: Kluyveromyces marxianus and Bacillus megaterium II Arch. Microbiol.—2000. —174, N 16.—P. 381—385. 31. Cahill L. M., Kruger S. С, M с Alice В. Т., Ramsey C. S., Prioli R., Kohn B. Quantification of deoxynivalenol in wheat using an immunoaffinity column and liquid chromatography / / J. Chromatogr. A.—1999.—859, N 1.—P. 23—28. 32. Razzari-Fazeli E., Bohm J., Luf W. Determination of nivalenol and deoxynivalenol in wheat using liquid chromatography-mass spectrometry with negative ion atmospheric pressure chemical ionisation / / J. Chromatogr. A.—1999.—854, N 1.—P. 245— 255. 33. Yagen В., Bialer M., Sintov A. Gas chromatographic assay with pharmacokinetic applications for monitoring T-2 and HT-2 toxins in plasma / / J. Chromatogr. —1985 .—343 , N 1.— P. 67—75. 34. Тутельян В. А., Эллер К. С, Соболев В. С. Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания Т-2 токсина а пищевых продуктах и продово льственном сырье.—M., 1984.—9 с. 35. Schothorst R. С, Jekel A. A. Determination of trichothecenes in wheat by capillary gas chromatography with flame ionisation detection / / Food Chem.—2001 . — 7 3 , N 1.—P. 111 — 117. 36. Chu F. S., Grossman S., Wei R. D., Microcha C. J. Production of antibody against T-2 toxin / / Appl. and Environ. Microbiol.—1979.—37.—P. 104—108. 37. Lee S., Chu F. S. Radioimmunoassay of T-2 toxin in corn and wheat / / J. Assoc. Off. Anal. Chem.—1981 .—64, N 1.— P. 156—161. 38. Gendloff E. #., Pestka J. J., Swanson S. P., Hart L. P. Detection of T-2 toxin in Fusarium sporotrichioides-'miected corn by enzyme-linked immunosorbent assay / / Appl. and Environ. Microbiol.—1984—47, N 57 .—P. 1161 — 1163. 39. Brimfield A. A., Miller M., Finkelman F. D., Chu S. F. Preparation and characterization of monoclonal antibodies to the trichothecene mycotoxin T-2 / / Appl. and Environ. Micro biol .—1985.—49, N 1.—P. 168—172. 40. Fan T. S. L., Zhang G. S., Chu F. S. An indirect enzyme- linked immunosorbent assay for T-2 toxin in biological fluids / / J. Food Protec—1984 .—47, N 12.—P. 964—967. 41. Кононенко Г. П., Буркин А. А., Соболева Н. А., Зотова Е. В. Иммуноферментный метод определения Т-2 токсина в контаминированном зерне / / Прикл. биохимия и микро биология.—1999.—35, № 4.—С. 457—462. 42. Ramakrishna N., Lacey J., Candlish A. A., Smith J. E., Goodbrand I. A. Monoclonal antibody-based enzyme linked 222 Т Р И Х О Т Е Ц Е Н О В Ы Е М И К О Т О К С И Н Ы : В Ы Я В Л Е Н И Е В О К Р У Ж А Ю Щ Е Й С Р Е Д Е immunosorbent assay of aflatoxin B l , T-2 toxin, and ochra- toxin A in barley / / J. Assoc. Off. Anal. Chem.—1990.—73, N 1.—P. 71 —76. 43. Ligler F. S., Bredehorst R., Talebian A., Shriver L. C , Hammer C. F, Sheridan J. P., Vogel C. W., Gaber В. P. A homogeneous immunoassay for the mycotoxin T-2 utilizing liposomes, monoclonal antibodies, and complement / / Anal. Biochem.—1987. — 1 6 3 , N 2.—P. 369—375. 44. Mirocha C. J., Panthre S. V., Pawlosky R.J., Hewetson D. W. Mass spectra of selected trichothecenes / / Modern Methods in the Analysis and Structure Elucidation of Mycotoxins / Ed. R. J. Cole.—New York: Acad, press, 1986.—P. 353—392. 45. Vesonder R. F., Rohwedder W. K. Gas chromatographic-mass spectrometric analysis of mycotoxins / / Modern Methods in the Analysis and Structure Elucidation of Mycotoxins / Ed. R. J. Cole.—New York: Acad, press, 1986.—P. 335—352. 46. Omurtag G. Z., Yazicio D. Occurrence of T-2 toxin in processed cereals and pulses in Turkey determined by HPLC nnd TT.C / / Food Addit Cnntam —2001 —\' IS —P 8 4 4 - 849. 47. Tanaka Т., Yoneda A., Inoue S., Sugiura Y., Ueno Y. Simultaneous determination of trichothecene mycotoxins and zearalenone in cereals by gas chromatography-mass spectro metry / / J. Chromatogr. A . — 2 0 0 0 . — 8 8 2 D , N I—2.—P. 23— 28. 48. Kostiainen R., Matsuura K.} Nojima K. Identification of trichothecenes by frit-fast atom bombardment liquid chromato- graphy-high-resolution mass spectrometry / / J . Chromatogr.— 1991.—538, N 12.—P. 323—330. 49. Niels K. F., Thran U. Fast methods for screening of tri chothecenes in fungal cultures using gas chromatography-tan- dem mass spectrometry / / J . Chromatogr. A.—2001.—929, N 1—2.—P. 75—78. " 50. Mullett W., Імі E. P. C, Yeung J. M. Immunoassay of fumonisins by a surface plasmon resonance biosensor / / Anal. Biochem. —1998 .—258 .—P. 161 — 167. УДК 619:615.93:004.13:636.084 Надійшла ло релакшї 17.01.02 223
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156521
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	0233-7657
language	Russian
last_indexed	2025-11-29T09:37:33Z
publishDate	2003
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
record_format	dspace
spelling	Артюх, В.П. Гойстер, О.С. Хмельницкий, Г.А. Стародуб, Н.Ф. 2019-06-18T15:19:37Z 2019-06-18T15:19:37Z 2003 Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды / В.П. Артюх, О.С. Гойстер, Г.А. Хмельницкий, Н.Ф. Стародуб // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 3. — С. 216-223. — Бібліогр.: 50 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000652 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156521 619:615.93:004.13:636.084 Описаны основные методы идентификации трихотеценовых микотоксинов, среди которых различные биотесты, тонкослойная хроматография, газожидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия и иммунохимические методы, в том числе ELISA. Рассмотрены перспективы развития инструментальных методов определения микотоксинов на основе использования новых технологических решений. Описано основні методи ідентифікації трихотеценових мікотоксинів, серед яких різні біометоди, тонкошарова хроматографія, газо-рідинна хроматографія, високоефективна рідинна хроматографія, імуноферментні методи (ELISA), мас-спектрометрія. Розглянуто перспективи розвитку інструментальних методів визначення мікотоксинів на базі використання нових технологічних рішень. The basic methods of identification of trichothecene toxins are described in the review including biomethods, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, immuno-enzyme assay (ELISA), gas-liquid chromatography, mass spectrometry. The future trends of development of the instrumental methods based on new technological decisions are briefly discussed regarding mycotoxins determination. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Біополімери і клітина Огляди Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды Трихотеценові мікотоксини: визначення в об'єктах довкілля Trichothecene micotoxins: determination in environment Article published earlier
spellingShingle	Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды Артюх, В.П. Гойстер, О.С. Хмельницкий, Г.А. Стародуб, Н.Ф. Огляди
title	Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды
title_alt	Трихотеценові мікотоксини: визначення в об'єктах довкілля Trichothecene micotoxins: determination in environment
title_full	Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды
title_fullStr	Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды
title_full_unstemmed	Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды
title_short	Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды
title_sort	трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды
topic	Огляди
topic_facet	Огляди
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156521
work_keys_str_mv	AT artûhvp trihotecenovyemikotoksinyopredelenievobʺektahokružaûŝeisredy AT goisteros trihotecenovyemikotoksinyopredelenievobʺektahokružaûŝeisredy AT hmelʹnickiiga trihotecenovyemikotoksinyopredelenievobʺektahokružaûŝeisredy AT starodubnf trihotecenovyemikotoksinyopredelenievobʺektahokružaûŝeisredy AT artûhvp trihotecenovímíkotoksiniviznačennâvobêktahdovkíllâ AT goisteros trihotecenovímíkotoksiniviznačennâvobêktahdovkíllâ AT hmelʹnickiiga trihotecenovímíkotoksiniviznačennâvobêktahdovkíllâ AT starodubnf trihotecenovímíkotoksiniviznačennâvobêktahdovkíllâ AT artûhvp trichothecenemicotoxinsdeterminationinenvironment AT goisteros trichothecenemicotoxinsdeterminationinenvironment AT hmelʹnickiiga trichothecenemicotoxinsdeterminationinenvironment AT starodubnf trichothecenemicotoxinsdeterminationinenvironment

Трихотеценовые микотоксины: определение в объектах окружающей среды

Institution

Ähnliche Einträge