Снижение концентрации глюкозы в системах in vitro и in vivo с помощью рекомбинантного вектора, несущего ген препроинсулина человека
Изучена экспрессия рекомбинантного гена препроинсулина человека. Фрагмент геномной ДНК, содержащий последовательность гена препроинсулина без собственного промотора, переклонирован в векторную ДНК плазмиды pTR-UF под контролем цитомегаловирусного промотора. Осуществлено тестирование полученной реко...
Saved in:
| Published in: | Биополимеры и клетка |
|---|---|
| Date: | 1999 |
| Main Authors: | , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1999
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156541 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Снижение концентрации глюкозы в системах in vitro и in vivo с помощью рекомбинантного вектора, несущего ген препроинсулина человека / Ф. Аджамиян, Е.М. Сухорада, Т.А. Рубан, Т.Г. Титок // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 4. — С. 297-299. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860264682698309632 |
|---|---|
| author | Аджамиян, Ф. Сухорада, Е.М. Рубан, Т.А. Титок, Т.Г. |
| author_facet | Аджамиян, Ф. Сухорада, Е.М. Рубан, Т.А. Титок, Т.Г. |
| citation_txt | Снижение концентрации глюкозы в системах in vitro и in vivo с помощью рекомбинантного вектора, несущего ген препроинсулина человека / Ф. Аджамиян, Е.М. Сухорада, Т.А. Рубан, Т.Г. Титок // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 4. — С. 297-299. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Биополимеры и клетка |
| description | Изучена экспрессия рекомбинантного гена препроинсулина человека. Фрагмент геномной ДНК, содержащий последовательность гена препроинсулина без собственного промотора, переклонирован в векторную ДНК плазмиды pTR-UF под контролем цитомегаловирусного промотора. Осуществлено тестирование полученной рекомбинантной плазмидной ДНК: in vitro – в клетках культуры ткани Нер-2 и in vivo – на стрептозотоциновых диабетических мышах, а также ввода препарата в ткань печени. В результате наших экспериментов обнаружено снижение концентрации глюкозы как в клетках культуры ткани, так и в крови экспериментальных животных. Представленные данные, по мнению авторов, свидетельствуют о возможности наличия экспрессии гена препроинсулина.
Вивчено експресію рекомбінантного гена препроінсуліну людини. Фрагмент геном ної ДНК, шр вміщує послідовність гена препроінсуліну без власного промотора, переклоновано у векторну ДНК плазм ід и pTR-UF під контролем цитомегаловірусного промотора. Здійснено тестування одержаної рекомбінантної плазм ід ної ДНК: in vitro – у клітинах культури Нер-2 і in vivo – на стрептозотоцинових діабетичних мишах, а також введення препарату в тканину печінки. В результаті експериментів виявлено зниження концентрації глюкози як у клітинах культури тканини, так і в крові дослідних тварин. Наведені дані, на думку авторів, свідчать про можливість експресії гена препроінсуліну.
The expression of human preproinsulin gene was studied. The fragment of genomic DNA, containing the sequences of preproinsulin gene without its personal promoter was cloned in the vector plasmid DNA pTR-UF under control of cytomegalovirus promoter. The obtained recombinant plasmid DNA was tested in vitro, in Hep-2 of tissue culture and in vivo at streptozotocin diabetic mice by introducing the preparation into the liver. As a result of our experiment we found out the reduction of glucose level both in the cells of tissue culture and in the blood of the experimental animals. The presented results, in the author's opinion, evidence about the availability of the expression of the human preproinsulin gene.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:59:19Z |
| format | Article |
| fulltext |
I S S N 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1999. Т. 15. № 4
Снижение концентрации глюкозы в системах in
vitro и in vivo с помощью рекомбинантного
вектора, несущего ген препроинсулина человека
Ф. Аджамиян, Е. М. Сухорада, Т. А. Рубан, Т. Г. Титок
Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины
Ул. Академика Заболотного 150, Киев, 03143 , Украина
Изучена экспрессия рекомбинантного гена препроинсулина человека. Фрагмент геномной ДНК,
содержащий последовательность гена препроинсулина без собственного промотора, переклониро
ван в векторную ДНК плазмиды pTR-UF под контролем цитомегаловирусного промотора.
Осуществлено тестирование полученной рекомбинантной плазм ид ной ДНК: in vitro — в клетках
культуры ткани Нер-2 и in vivo — на стрептозотоциновых диабетических мышах, а также ввода
препарата в ткань печени. В результате наших экспериментов обнаружено снижение концентра
ции глюкозы как в клетках культуры ткани, так и в крови экспериментальных животных.
Представленные данные, по мнению авторов, свидетельствуют о возможности наличия экспрес
сии гена препроинсулина.
Плазмида pTR-ins, схема которой представлена на
рис. 1, получена на основе плазмиды pTR-UF [1 ] .
Данная плазмида благодаря своим регуляторным
последовательностям, приведенным на р и с 2, мо
жет быть полезной для клонирования экзогенного
материала и дальнейшей его экспрессии в культуре
клеток и / и л и на уровне экспериментальных живо
тных. Была изучена экспрессия экзогенного гена
gfp 10, находящегося под влиянием регуляторных
последовательностей данной плазмиды [1 ]. Поэто
му для клонирования экзогенного гена препроинсу
лина и изучения дальнейшей его экспрессии было
решено использовать данную плазмиду в качестве
вектора.
Фрагмент вектора длиной 4933 п. н. получен
по рестрикционным сайтам Notl/Sall Фрагмент
геномной Д Н К (1620 п. н. ) , содержащий ген пре
проинсулина человека без собственного промотора,
также был вырезан по рестрикционным сайтам
Notl/Sall из плазмиды pSK91, полученной ранее
С. Д. Кириленко (отдел регуляторных механизмов
клетки Института молекулярной биологии и гене
тики НАН Украины). Схема конструирования ре-
© Ф . А Д Ж А М И Я Н , Е. М. С У Х О Р А Д А , Т. А. Р У Б А Н ,
Т. Г. Т И Т О К , 1 9 9 9
комбинантной плазмиды для изучения возможной
экспрессии гена инсулина представлена на рис. 2.
Лигирование вектора с фрагментом, содержа
щим ген инсулина, осуществляли с помощью Т 4 -
Д Н К лигазы стандартным методом [2 ]. Трансфор
мацию рекомбинантной Д Н К , получение компе
тентных бактериальных клеток и отбор клонов
после трансформации проводили методом, описан
ным в [3 ] , в штамме JM109 Escherichia colL Плаз
миды выделяли по методу [4 ]. Для конструирова
ния рекомбинантных молекул использовали фер
менты фирмы «Fermentas» (Латвия) .
В результате экспериментов получен клон, со
держащий ген инсулина, рестрикционная карта
которого соответствует схеме клонирования, приве
денной на рис. 2. Даннуую рекомбинантную моле
кулу проверяли как в культуре клеток, так и на
мышах.
В работе использовали линию клеток Нер-2
(культура клеток из карциномы гортани), получен
ную нами из Ассоциации клеточных культур (Рос
сия, Санкт-Петербург) . Клетки культивировали в
среде Игла с добавлением 10 % сыворотки крупно
го рогатого скота. Д л я опыта клетки рассевали в
пластиковые чашки диаметром 35 мм по 200 тыс.
на вариант. Клетки культивировали в атмосфере
297
А Д Ж А М И Я Н Ф . И Д Р .
fl(-) т
Рис. 2. Схема клонирования структурной части гена инсулина в
AAV-кассету вектора pTR-UF. TR — терминальный повтор аде-
сулина определяли по уровню концентрации глю
козы относительно контроля, результаты представ
лен на рис. 3.
Экспрессию гена препроинсулина in vivo иссле
довали на диабетических мышах линии C 5 7 B1/6J ,
полученных инъекцией стрептозотоцина в течение
5 дней по 40 м г / к г живого веса в день. Метод
получения мышей, страдающих диабетом, описан в
[6 ] . Плазмиды, включенные в липосомы, вводили
в печень диабетическим мышам через 2 недели
после первой инъекции стрептозотоцина. Липосомы
состава ф о с ф а т и д и л х о л и н : ХС : д и ц е т и л ф о с ф а т
(7 :2 : 1) готовили методом упаривания с обраще
нием фаз , Д Н К заключали в них методом Са-
fusion [7 ]. Общая концентрация введенной Д Н К
плазмид pTR-ins и pTR-UF (контроль) была 24 мг.
Экспрессию гена инсулина определяли по измене
нию концентрации глюкозы в крови животных,
начиная с 6 ч после введения, затем через 24 ч в
течение 7 сут. Максимальный эффект наблюдался
через 24—36 ч после инъекции. Через 48 ч концен
трация глюкозы возрастает, но не достигает исход
ного уровня (рис. 4) . На наш взгляд, падение
уровня глюкозы в крови контрольных мышей через
6 ч после введения физиологического раствора или
вектора без гена инсулина может быть следствием
стрессовой реакции.
Таким образом, как на уровне клеток в куль
туре, так и на организменном уровне у диабетиче
ских мышей показано снижение концентрации
са; SD/BA — донорные и акцепторные сигналы сплайсинга гена
вируса SV40; РА2 — сайт полиаденилирования
5 % С 0 2 и 80 % влажности при температуре 37 °С.
Концентрация трансформирующей Д Н К составля
ла 10 м к г / м л . Трансформацию клеток осуществля
ли методом кальций-фосфатного преципитата [5]
через 24 ч после посева. Изменения концентрации
глюкозы под действием гена инсулина определяли
в пробах культуральной среды стандартным глюко-
зооксидазным методом (Диаглюк-2) . Для этого
пробы культуральной среды отбирали через 5, 6, 7,
8 и 10 сут после трансфекции клеток. Перед
отбором проб клетки промывали дважды средой
Игла и затем добавляли среду Игла без сыворотки
с увеличенным содержанием глюкозы (500 м г % ) . В
качестве контроля использовали плазмиду pTR-UF
(без гена инсулина) . Уровень экспрессии гена ин-
Рис. 3. Уровень концентрации глюкозы в клетках Н Е Р - 2 после
введения в них плазмидных ДНК: 1 — среда; 2 — pTR-UF\ 3 —
pTR-ins (по оси ординат — концентрация глюкозы)
298
С Н И Ж Е Н И Е К О Н Ц Е Н Т Р А Ц И И Г Л Ю К О З Ы С П О М О Щ Ь Ю В Е К Т О Р А С ГЕНОМ
16 - і
~~0~ч ' ~6ч ' ~24ч ' 48ч 1 3 суш ' 7сут
Рис. 4. Динамика гликемии у диабетических СТЦ мышей
линии C57BI/6J после введения плазмид: I — после введения
физиологического раствора (контроль 1); 2 — после введения
pTR-UF (контроль 2) ; 3— после введения pTR-ins (по оси
ординат — концентрация глюкозы)
глюкозы, что может быть следствием экспрессии
гена инсулина человека под контролем цитомега-
ловирусного промотора.
Ф. Аджаміян, О. М. Сухорада, Т. А. Рубан, Т. Г. Тіток
Зниження концентрації глюкози в системах in vitro і in vivo за
допомогою рекомбінантного вектора, який містить ген
препроінсуліну людини
Резюме
Вивчено експресію рекомбінантного гена препроінсуліну люди
ни. Фрагмент геном ної ДНК, шр вміщує послідовність гена
препроінсуліну без власного промотора, переклоновано у век
торну ДНК плазм ід и pTR-UF під контролем цитомегало-
вірусного промотора. Здійснено тестування одержаної ре-
комбінантної плазм ід ної ДНК: in vitro — у клітинах культури
Нер-2 і in vivo — на стрептозотоцинових діабетичних мишах,
а також введення препарату в тканину печінки. В результаті
експериментів виявлено зниження концентрації глюкози як у
клітинах культури тканини, так і в крові дослідних тварин.
Наведені дані, на думку авторів, свідчать про можливість
експресії гена препроінсуліну.
F. Ajamian, Е. М. Suhorada, Т. A. Ruban, Т. A. Titok
Deckase of glucose level in vitro and in vivo by recombinant vector
containing human preproinsulin gene
Summary
The expression of human preproinsulin gene was studied. The
fragment of genomic DNA, containing the sequences of pre
proinsulin gene without ifs personal promoter was cloned in the
vector plasmid DNA pTR-UF under control of cytomegalovirus
promoter. The obtained recombinant plasmid DNA was tested in
vitro, in Hep-2 of tissue culture and in vivo at streptozotocin
diabetic mice by introducing the preparation into the liver. As a
result of our experiment we found out the reduction of glucose level
both in the cells of tissue culture and in the blood of the
experimental animals. The presented results, in the author's opi
nion, evidence about the availability of the expression of the human
preproinsulin gene.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
l.Zolotukhin S., Potter M., William W., Hauswirth J. G.,
Muzyczka N. A humanized green fluorescent protein cDNA
adapted for high level expression in mammalian cells / / J.
Virol .—1996.—70.—P. 4 6 4 6 — 4 6 5 4 .
2. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning; A
laboratory manual.—New York: Cold Spring Harbor Lab.
press, 1989.—456 p.
3. Nishimura A., Morita M., Nishimura Y, Sugino Y. A rapid
and highly efficient method for preparation of competent
Escherichia coli cells / / Nucl. Acids R e s . — 1 9 9 0 . — 1 8 —
P. 6169.
4. Kriey P., Melton D. Promega Biotech. Cata logue .—
1985 /1986 .—p. DB3 DB3.
5. Graham F. L., van der Eb A. J. Transformation of rat cells by
human adenovirus 5 / / Viro logy .—1973.—54.—P. 5 3 6 — 5 3 9 .
6. Титок Т. Г., Евсеенко А. А., Аджамиян Ф., Кордюм В. A.
Модели сахарного диабета, их выбор и использование в
экспериментальных исследованиях / / Биополимеры и кле
тка.—1999.—15, № 2 .—С. 103—108.
7. Марголис Л. Б., Бергельсон Л. Д. Липосомы и их взаи
модействие с клетками.—М.: Наука, 1986 .—240 с.
УДК 571 .21:616 .379—008.64
Поступила в редакцию 19.05.99
299
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156541 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:59:19Z |
| publishDate | 1999 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Аджамиян, Ф. Сухорада, Е.М. Рубан, Т.А. Титок, Т.Г. 2019-06-18T16:15:49Z 2019-06-18T16:15:49Z 1999 Снижение концентрации глюкозы в системах in vitro и in vivo с помощью рекомбинантного вектора, несущего ген препроинсулина человека / Ф. Аджамиян, Е.М. Сухорада, Т.А. Рубан, Т.Г. Титок // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 4. — С. 297-299. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000529 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156541 571.21:616.379—008.64 Изучена экспрессия рекомбинантного гена препроинсулина человека. Фрагмент геномной ДНК, содержащий последовательность гена препроинсулина без собственного промотора, переклонирован в векторную ДНК плазмиды pTR-UF под контролем цитомегаловирусного промотора. Осуществлено тестирование полученной рекомбинантной плазмидной ДНК: in vitro – в клетках культуры ткани Нер-2 и in vivo – на стрептозотоциновых диабетических мышах, а также ввода препарата в ткань печени. В результате наших экспериментов обнаружено снижение концентрации глюкозы как в клетках культуры ткани, так и в крови экспериментальных животных. Представленные данные, по мнению авторов, свидетельствуют о возможности наличия экспрессии гена препроинсулина. Вивчено експресію рекомбінантного гена препроінсуліну людини. Фрагмент геном ної ДНК, шр вміщує послідовність гена препроінсуліну без власного промотора, переклоновано у векторну ДНК плазм ід и pTR-UF під контролем цитомегаловірусного промотора. Здійснено тестування одержаної рекомбінантної плазм ід ної ДНК: in vitro – у клітинах культури Нер-2 і in vivo – на стрептозотоцинових діабетичних мишах, а також введення препарату в тканину печінки. В результаті експериментів виявлено зниження концентрації глюкози як у клітинах культури тканини, так і в крові дослідних тварин. Наведені дані, на думку авторів, свідчать про можливість експресії гена препроінсуліну. The expression of human preproinsulin gene was studied. The fragment of genomic DNA, containing the sequences of preproinsulin gene without its personal promoter was cloned in the vector plasmid DNA pTR-UF under control of cytomegalovirus promoter. The obtained recombinant plasmid DNA was tested in vitro, in Hep-2 of tissue culture and in vivo at streptozotocin diabetic mice by introducing the preparation into the liver. As a result of our experiment we found out the reduction of glucose level both in the cells of tissue culture and in the blood of the experimental animals. The presented results, in the author's opinion, evidence about the availability of the expression of the human preproinsulin gene. ru Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Биополимеры и клетка Структура и функции биополимеров Снижение концентрации глюкозы в системах in vitro и in vivo с помощью рекомбинантного вектора, несущего ген препроинсулина человека Зниження концентрації глюкози в системах in vitro і in vivo за допомогою рекомбінантного вектора, який містить ген препроінсуліну людини Decreasing of glucose level in vitro and in vivo by recombinant vector containing human preproinsulin gene Article published earlier |
| spellingShingle | Снижение концентрации глюкозы в системах in vitro и in vivo с помощью рекомбинантного вектора, несущего ген препроинсулина человека Аджамиян, Ф. Сухорада, Е.М. Рубан, Т.А. Титок, Т.Г. Структура и функции биополимеров |
| title | Снижение концентрации глюкозы в системах in vitro и in vivo с помощью рекомбинантного вектора, несущего ген препроинсулина человека |
| title_alt | Зниження концентрації глюкози в системах in vitro і in vivo за допомогою рекомбінантного вектора, який містить ген препроінсуліну людини Decreasing of glucose level in vitro and in vivo by recombinant vector containing human preproinsulin gene |
| title_full | Снижение концентрации глюкозы в системах in vitro и in vivo с помощью рекомбинантного вектора, несущего ген препроинсулина человека |
| title_fullStr | Снижение концентрации глюкозы в системах in vitro и in vivo с помощью рекомбинантного вектора, несущего ген препроинсулина человека |
| title_full_unstemmed | Снижение концентрации глюкозы в системах in vitro и in vivo с помощью рекомбинантного вектора, несущего ген препроинсулина человека |
| title_short | Снижение концентрации глюкозы в системах in vitro и in vivo с помощью рекомбинантного вектора, несущего ген препроинсулина человека |
| title_sort | снижение концентрации глюкозы в системах in vitro и in vivo с помощью рекомбинантного вектора, несущего ген препроинсулина человека |
| topic | Структура и функции биополимеров |
| topic_facet | Структура и функции биополимеров |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156541 |
| work_keys_str_mv | AT adžamiânf sniženiekoncentraciiglûkozyvsistemahinvitroiinvivospomoŝʹûrekombinantnogovektoranesuŝegogenpreproinsulinačeloveka AT suhoradaem sniženiekoncentraciiglûkozyvsistemahinvitroiinvivospomoŝʹûrekombinantnogovektoranesuŝegogenpreproinsulinačeloveka AT rubanta sniženiekoncentraciiglûkozyvsistemahinvitroiinvivospomoŝʹûrekombinantnogovektoranesuŝegogenpreproinsulinačeloveka AT titoktg sniženiekoncentraciiglûkozyvsistemahinvitroiinvivospomoŝʹûrekombinantnogovektoranesuŝegogenpreproinsulinačeloveka AT adžamiânf znižennâkoncentracííglûkozivsistemahinvitroíinvivozadopomogoûrekombínantnogovektoraâkiimístitʹgenpreproínsulínulûdini AT suhoradaem znižennâkoncentracííglûkozivsistemahinvitroíinvivozadopomogoûrekombínantnogovektoraâkiimístitʹgenpreproínsulínulûdini AT rubanta znižennâkoncentracííglûkozivsistemahinvitroíinvivozadopomogoûrekombínantnogovektoraâkiimístitʹgenpreproínsulínulûdini AT titoktg znižennâkoncentracííglûkozivsistemahinvitroíinvivozadopomogoûrekombínantnogovektoraâkiimístitʹgenpreproínsulínulûdini AT adžamiânf decreasingofglucoselevelinvitroandinvivobyrecombinantvectorcontaininghumanpreproinsulingene AT suhoradaem decreasingofglucoselevelinvitroandinvivobyrecombinantvectorcontaininghumanpreproinsulingene AT rubanta decreasingofglucoselevelinvitroandinvivobyrecombinantvectorcontaininghumanpreproinsulingene AT titoktg decreasingofglucoselevelinvitroandinvivobyrecombinantvectorcontaininghumanpreproinsulingene |