Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами

Н-фосфонатним твердофазным методом отримано модифіковані імідазофеназиновими нуклеозидами по 3'-, 5'- та внутрішніх положеннях олігонуклеотиди, комплементарні до ділянок рибосомного оперона, 16S рРНК мікоплазм та Escherichia coli. Показано, шр нуклеозиди імідазо[4,5-b]феназину та його 2-м...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	1999
Hauptverfasser:	Макітру, В.Л., Шаламай, А.С., Дубей, І.Я., Федоряк, Д.М.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1999
Schriftenreihe:	Биополимеры и клетка
Schlagworte:	Структура и функции биополимеров
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156762
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами / В.Л. Макітрук, А.С. Шаламай, І.Я. Дубей, Д.М. Федоряк // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 5. — С. 367-373. — Бібліогр.: 29 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156762
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1567622025-02-09T20:14:04Z Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами Синтез и изучение антисмысловых олигонуклеотидов, модифицированных имидазофеназиновыми нуклеозидами Synthesis and study of antisense oligonuclcolides modified with imidazophenazine nucleosides Макітру, В.Л. Шаламай, А.С. Дубей, І.Я. Федоряк, Д.М. Структура и функции биополимеров Н-фосфонатним твердофазным методом отримано модифіковані імідазофеназиновими нуклеозидами по 3'-, 5'- та внутрішніх положеннях олігонуклеотиди, комплементарні до ділянок рибосомного оперона, 16S рРНК мікоплазм та Escherichia coli. Показано, шр нуклеозиди імідазо[4,5-b]феназину та його 2-метального аналога, діючи як ефективні інтеркалятори, суттєво впливають на стабільність комплементарних дуплексів і тим самим підвищують антисенсову активність модифікованих олігонуклеотидних послідовностей. Н-фосфонатным твердофазным методом получены модифицированные имидазофеназиновыми нуклеозидами по 3'-, 5'- и внутренним положениям олигонуклеотиды, комплементарные участкам рибосомного оперона, 16S рРНК микоплазм и Escherichia coli. Показано, что нуклеозиды имидазо[4,5-b]феназина и его 2-метильного аналога, действуя как эффективные интеркаляторы, существенно влияют на стабильность комплементарных дуплексов, повышая тем самым антисмысловую активность модифицированных олигонуклеотидных последовательностей. Oligonucleotides containing imidazophenazine nucleosides at 3'-, 5'-and internal positions, which are complementary to certain regions of ribosomal operon DNA and I6S rRNA of mycoplasmas and E. coli, have been synthesized by H-phosphonate solid phase method. It has been shown that nucleosides of imidazol [4,5-b]phenazine and its 2-methyl analog as efficient intercalating agents strongly affect the stability of complementary complexes increasing the antisense activity of modified otigonucleotide sequence. 1999 Article Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами / В.Л. Макітрук, А.С. Шаламай, І.Я. Дубей, Д.М. Федоряк // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 5. — С. 367-373. — Бібліогр.: 29 назв. — укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000532 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156762 577.113.4.547.963.32 uk Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров
spellingShingle	Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Макітру, В.Л. Шаламай, А.С. Дубей, І.Я. Федоряк, Д.М. Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами Биополимеры и клетка
description	Н-фосфонатним твердофазным методом отримано модифіковані імідазофеназиновими нуклеозидами по 3'-, 5'- та внутрішніх положеннях олігонуклеотиди, комплементарні до ділянок рибосомного оперона, 16S рРНК мікоплазм та Escherichia coli. Показано, шр нуклеозиди імідазо[4,5-b]феназину та його 2-метального аналога, діючи як ефективні інтеркалятори, суттєво впливають на стабільність комплементарних дуплексів і тим самим підвищують антисенсову активність модифікованих олігонуклеотидних послідовностей.
format	Article
author	Макітру, В.Л. Шаламай, А.С. Дубей, І.Я. Федоряк, Д.М.
author_facet	Макітру, В.Л. Шаламай, А.С. Дубей, І.Я. Федоряк, Д.М.
author_sort	Макітру, В.Л.
title	Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами
title_short	Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами
title_full	Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами
title_fullStr	Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами
title_full_unstemmed	Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами
title_sort	синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1999
topic_facet	Структура и функции биополимеров
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156762
citation_txt	Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами / В.Л. Макітрук, А.С. Шаламай, І.Я. Дубей, Д.М. Федоряк // Биополимеры и клетка. — 1999. — Т. 15, № 5. — С. 367-373. — Бібліогр.: 29 назв. — укр.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT makítruvl sinteztavivčennâantisensoviholígonukleotidívmodifíkovanihímídazofenazinoviminukleozidami AT šalamaias sinteztavivčennâantisensoviholígonukleotidívmodifíkovanihímídazofenazinoviminukleozidami AT dubeiíâ sinteztavivčennâantisensoviholígonukleotidívmodifíkovanihímídazofenazinoviminukleozidami AT fedorâkdm sinteztavivčennâantisensoviholígonukleotidívmodifíkovanihímídazofenazinoviminukleozidami AT makítruvl sinteziizučenieantismyslovyholigonukleotidovmodificirovannyhimidazofenazinovyminukleozidami AT šalamaias sinteziizučenieantismyslovyholigonukleotidovmodificirovannyhimidazofenazinovyminukleozidami AT dubeiíâ sinteziizučenieantismyslovyholigonukleotidovmodificirovannyhimidazofenazinovyminukleozidami AT fedorâkdm sinteziizučenieantismyslovyholigonukleotidovmodificirovannyhimidazofenazinovyminukleozidami AT makítruvl synthesisandstudyofantisenseoligonuclcolidesmodifiedwithimidazophenazinenucleosides AT šalamaias synthesisandstudyofantisenseoligonuclcolidesmodifiedwithimidazophenazinenucleosides AT dubeiíâ synthesisandstudyofantisenseoligonuclcolidesmodifiedwithimidazophenazinenucleosides AT fedorâkdm synthesisandstudyofantisenseoligonuclcolidesmodifiedwithimidazophenazinenucleosides
first_indexed	2025-11-30T10:14:26Z
last_indexed	2025-11-30T10:14:26Z
_version_	1850209907156975616
fulltext	ISSN 0233-7657. Биополимеры и клетка. 1999. Т. 15. № 5 СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ БИОПОЛИМЕРОВ Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами В- Л. Макітру к, А. С. Ш а ламай, І. Я. Д у б е й \ Д . М. Ф е д о р я к 1 Інститут молекулярної біології та генетики HAH України Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, 03143, Україна * Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України Вул. Мурманська, 1, Київ, 02094, Україна Н-фосфонатним твердофазным методом отримано модифіковані імідазофеназиновими нуклеози дами по 3'-, 5'- та внутрішніх положеннях олігонуклеотиди, комплементарні до ділянок рибосомного оперона, J6S рРНК мікоплазм та Escherichia coli. Показано, шр нуклеозиди імі- дазо[4,5-Ь]феназину та його 2-метального аналога, діючи як ефективні інтеркалятори, суттєво впливають на стабільність комплементарних дуплексів і тим самим підвищують антисенсову активність модифікованих олігонуклеотидних послідовностей- Вступ. В останні роки дослідження в галузі хіміч ного синтезу антисенсових олігонуклеотидів спря мовані в першу чергу на вирішення проблем, пов'язаних зі збільшенням стабільності комплемен тарних комплексів, покращанням транспорту оліго нуклеотидних послідовностей крізь цитоплазматич ний клітинний бар'єр та з підвищенням їхньої стійкості до дії клітинних нуклеаз [1—5]. Для розв'язання цих задач запропоновано велику кіль кість методів та варіантів модифікації олігонук леотидів, що базуються на зміні їхнього фосфоді- ефірного скелета чи структури вуглеводних та гетероциклічних фрагментів або на ковалентному приєднанні до олігомерів груп різноманітної хіміч ної природи [1, 3, 6, 7] . Для зв'язування з певними ділянками оліго нуклеотидних послідовностей часто застосовуються гетероароматичні поліциклічні сполуки ряду акри дину, антрахінону, фенантроліну, феназину та ін., тобто структури, які мають значні інтеркаляційні властивості й тим самим здатні стабілізувати ком плекс олігонуклеотид—мішень [1, 3, 4, 7—12]. Такі групи, як правило, вводять по кінцях послі довності пост-синтетично через відповідний лінкер. © В. Л. МАКІТРУК, А. С ШАЛАМАЙ, І. Я. Д У Б Е Й , Д . М. Ф Е Д О Р Я К , 1 9 9 9 Особливий інтерес становлять аналоги нуклео- зидів (АН), що містять залишки інтеркаляторів як аглікони. Такі нуклеозиди можна вводити в задані положення олігонуклеотидної послідовності безпо середньо в процесі хімічного синтезу. В літературі число таких прикладів досить обмежене [13, 14]. Показано, що АН з бензімідазо- та нафтоіміда- зопіримідиновими агліконами в складі олігонук леотидів здатні суттєво підвищувати стабільність комплементарних дуплексів. Основний вклад при цьому вносять міжплощинні взаємодії аглікона АН з пуриновими гетероциклами, розміщеними в ком плементарному ланцюгу [13]. Аналогічним чином стабілізує дуплекси введення в нуклеотидну по слідовність нуклеозидів, які містять фенотіазино- та феноксазинопіримідинові трициклічні структури [14]. Враховуючи особливості будови планарних тетрациклічних систем імідазофеназинового ряду, їхні унікальні спектральні характеристики, перш за все значні флюоресцентні властивості, було синте зовано на їх основі рибо- та дезоксирибонуклеози- ди, які після відповідних хімічних трансформацій вводилися в задані положення олігонуклеотидних послідовностей. Матеріали і методи. В роботі використано 367 М А К П Р У К В. Л. ТА ІН. дициклогексилкарбодиімід (DCC) та N-метилімі- дазол (Melm) («Fluka», Швейцарія), півалоїлхло- рид (PivCl) («Мегск», ФРН), реактиви для електро форезу фірми «Reanal» (Угорщина). Інші реагенти та розчинники були вітчизняного виробництва. Аб солютні піридин та ацетонітрил для олігонуклео- тидного синтезу отримували перегонкою над від повідними осушниками, згідно з [15]. УФ-спектри поглинання записували на спектрофотометрі Spe- cord М-40 («Кагі Zeiss Jena», ФРН). Теоретичні коефіцієнти екстинкції олігонуклеотидів обчислю вали, як описано в роботі [16]. Одержання нуклеозидних синтонів для оліго- нуклеотидного синтезу. Синтез Nl-^-D-рибофура- нозиду та 2'-дезоксирибофуранозиду імідазо[4,5- Ыфеназину та його 2-метильного аналога I, II описано в роботі [17]. 5'-0-захищені нуклеозиди отримували за допомогою обробки 1,2 екв. три- толілметилхлориду в сухому піридині аналогічно до описаних методик [15]. Після стандартної об робки реакційної суміші продукти очищали хрома тографією на силікагелі Kieselgel 60 («Мегск») в градієнті концентрації (0—3 %) метанолу в хлоро формі. Н-фосфонати IV а, б одержували шляхом З'-О-фосфорилювання 5'-О-ТТМ-похідних дезок- синуклеозидів трис(триазоліл)фосфіном в абсолют ному ацетонітрилі з наступною хроматографічною очисткою продуктів у градієнті (0—10 %) МеОН у хлороформі в присутності 1 % триетиламіну, за відомим методом синтезу нуклеозид-Н-фосфонатів [18]. Синтез полімерних носіїв. Полімерні носії для твердофазного синтезу отримували на основі пори стого силікагелю «Силохром С-80» (діаметр пор 100 нм). Його обробляли амінопропілтриетокси- силаном в 95 %-му етанолі, згідно з методикою [15]. Полімер з привитими 3-амінопропільними групами обробляли янтарним ангідридом у піридині в присутності N-метилімідазолу з утворенням сук- цинатного похідного носія. Іммобілізацію на повер хню одержаного СООН-модифікованого полімеру 5'-0-тритолілметилпохідних рибозидів III а, б або природних захищених дезоксинуклеозидів здійсню вали в піридині за допомогою DCC у присутності п-нітрофенолу, як описано в [19]. При іммобілі зації рибозидів імідазофеназинів далі додатково блокували вільні Т (3') -гідроксильні групи ковален тно приєднаних нуклеозидів за допомогою обробки полімеру 10 %-м оцтовим ангідридом у піридині протягом 6 год. Контроль за повнотою протікання стадій синтезу полімерних носіїв здійснювали згід но з [15, 19]. Ступінь іммобілізації модифікованих нуклеозидів НІ на полімер становив 35— 37 мкмоль/г, як було визначено спектрофотомет рично по кислотному відщепленню 5'-0-триарил- метильної групи від носія. Олігонуклеотидний синтез. Синтез модифіко ваних імідазофеназиновими нуклеозидами оліго нуклеотидних послідовностей (таблиця) здійсню вали у відповідності зі звичайною схемою твердо- фазного Н-фосфонатного синтезу олігонуклеотидів [18 ]• Синтез проводили на автоматичному синтеза торі «Виктория-6М» (Росія) або в ручному варіанті. Середній вихід реакцій міжнуклеотидної конден сації становив 96—97 %. Для одержання олігонук леотидів, що містять нуклеозид імідазофеназину І а, б на 3'-кінці, синтез здійснювали на описаному вище носієві «Силохром С-80», модифікованому цим нуклеозидом. Для введення аналога нуклеози- ду в задане внутрішнє положення олігонуклео тидної послідовності Н-фосфонат захищеного нук- леозиду IV а, б використовували як Р-компонент реакції конденсації на відповідній стадії в тих самих умовах, що й стандартні нуклеозид-Н-фос- Олігонуклеотиди, модифіковані нуклеозидами імідазофеназину (Phz) та його 2-метилпохідної (PhzMe) N9 Послідовність (5 ' •-> З') Примітка 1 (dT)10 2 CACCTCCTTTCTPhz 3 PhzACCTCCTTTCTPhz 4 CACPhzTCCCTTTCT 5 AGAAAGGAGGTGPhz 6 APhzAAAGGAGGTGPhz 7 GTATCTAAPhzM e 8 PhzM eGTATCTAAT 9 GACGGGCGGTGTGTAPhz 10 PhzACGGGCGGTGTGTAC Модельна послідовність Комплементарна до ділянки 1510—1522 рибосомного оперону молікутів Те саме Комплементарна до ділянки 1510—1522 16S рРНК молікутів Те саме Комплементарна до ділянки 787—795 16S рРНК Е. соїі Те саме Комплементарна до ділянки 1398—1407 16S pPHKZs. соїі Те саме 11 12 PhzM eACGGGCGGTGTGTACPhz « CCTTGTTACGACTPhz Комплементарна до ділянки 1492—1505 16S рРНКЕ. соїі 368 С И Н Т Е З ТА В И В Ч Е Н Н Я А Н Т И С Е Н С О В И Х О Л І Г О Н У К Л Е О Т И Д І В фонати. В синтезі застосовували 0,04—0,05 М роз чини Р-компонентів у суміші ацетонітрил—піридин (4:1) та 0,2—0,25 М півалошхлорид як конденсую чий реагент у тому ж розчиннику при тривалості конденсації 2,5 хв. Після завершення нарощування олігонуклеотидного ланцюга та окислення гідро- фосфорильних груп (2 %-й розчин йоду в системі піридин—вода, 9 8 : 2 , 15 хв) полімерний носій обробляли концентрованим водним розчином аміа ку протягом ночі при 55 °С (у випадку оліго- тимідилату — при кімнатній температурі). Дебло ковані олігонуклеотиди виділяли електрофорезом у поліакриламідному гелі та знесолювали за допомо гою гель-фільтрації на колонці PD-10 («Рпагша- сіа», Швеція). Результати і обговорення. Модифіковані оліго нуклеотиди, що містять ковалентно приєднані за лишки інших молекул, широко застосовуються в молекулярно-біологічних дослідженнях, медицині та біотехнології. їх використовують як зонди для детекції нуклеїнових кислот та праймери для їх нього секвенування, специфічні інгібітори експресії генів, при вивченні механізму дії ферментів і т. д. Отримано кон'югати олігонуклеотидів з флюорофо- рами, ліпофільними молекулами, інтеркаляторами, пептидами та білками, хімічними нуклеазами та сполуками інших класів [1—12]. В останні роки інтенсивно розвивається синтез олігонуклеотидів, модифікованих залишками інтеркаляторів. Приєд нання інтеркаляторів суттєво підвищує стабільність дуплексних і триплексних комплексів модифікова них олігомерів з комплементарними послідовно стями нуклеїнових кислот, що особливо важливо для ефективного пригнічення експресії генів. Крім того, флюоресцентні властивості інтеркаляторів да ють можливість досить легко детектувати їхні кон'югати. Таким чином, олігонуклеотиди, модифі ковані інтеркалюючими сполуками, мають цінні властивості для їхнього використання як антисенсо- вих реагентів. Заритова та ін. вперше отримали кон'югати олігонуклеотидів з Ы-(2-гщроксиетил)феназшиеви- ми групами. Хромофор вводили пост-синтетично шляхом окислювального амінування барвника амі ногрупою попередньо синтезованого олігомера, що містив аміноалкільний лінкер. Катіонна феназино- ва система різко підвищувала стійкість комплемен тарних комплексів нуклеїнових кислот [20—23]. Ми звернули увагу на нейтральні сполуки фенази- нового ряду — імідазо[4,5-Ь]феназини. Одночасно вони близькі за структурою до відомого ефективно го інтеркалятора — антибіотика дауноміцину. Рані ше на основі спектрально-флюоресцентних дослід жень нами було показано, що похідні імідазо- феназину взаємодіють з нуклеїновими кислотами за механізмом інтеркаляції, стабілізуючи полінук- леотидні дуплекси [24, 25 ]. Для введення цього інтеркалятора в олігонук леотиди розроблено оригінальний підхід, в якому хромофор заміщує основу в потрібному положенні нуклеотидної послідовності. Отримані кон'югати містять імідазофеназинову групу, зв'язану з вугле водним залишком глікозидним зв'язком. Запропо нований нами метод грунтується на одержанні Nl-рибозида чи -дезоксирибозида імідазофеназину з подальшим перетворенням останніх у відповідні похідні, які можуть бути введені в олігонуклеотид у процесі твердофазного синтезу. У першу чергу були одержані рибофуранозиди імідазо[4,5-Ь]феназину та його 2-метилпохідної І а, б. Рибонуклеозиди синтезували за допомогою спрощеного одностадійного варіанту «силільної конденсації» і далі дезоксигенували по положенню 2' з утворенням дезоксирибоз вдів II а, б. Експери ментальні деталі синтезу модифікованих нуклео- зидів описано в нашій роботі [17]. На основі вільних нуклеозидів І та II отримано відповідно 5'-0-тритолілметилзахищені рибонуклеозиди III а, б та Н-фосфонати 2'-дезоксинуклеозидів IV а, б (рис. 1). Нуклеозиди І а, б тритилювали в піри дині, а для одержання Н-фосфонатів спочатку ана- Рис. 1. Синтез похідних імідазофеназинових нуклеозидів для використання в олігонуклеотидному синтезі 369 МАКІТРУК В. Л. ТА ІН. логічно захищали 5'-гідроксил відповідного дезок- синуклеозиду II тритолілметильною групою, а далі фосфорилювали 3'-гідроксил трис(триазоліл)фосфі ном в ацетонітрилі. Для синтезу олігонуклеотидних послідовно стей, що містять аномальний нуклеозид на 3'-кінці, ми отримали полімерні носії з іммобілізованими нуклеозидами (рис. 2). Як основу було використано відомий силікатний носій для твердофазного синте зу «Силохром С-80». Його амінували обробкою амінопропілтриетоксисиланом, а далі вводили якір ну карбоксильну групу за допомогою янтарного ангідриду. Одержаний носій модифікували значно доступнішими рибозидами. Посадку аналога нукле- озиду здійснювали, обробляючи одержаний полімер 5'-0-тритолілметилзахищеним рибонуклеозидом імідазофеназину III а, б у присутності DCC та п-нітрофенолу, з наступним блокуванням вільних карбоксильних груп носія додаванням етанолу. Тритолілметильна (триметилтритильна, ТТМ) функція, яку використовували в даній роботі для захисту 5'-гідроксильних груп модифікованих нук леозидів, за легкістю деблокування близька до стандартної кислотолабільної монометокситритиль- ної (ММТг) групи. Іммобілізація відбувається з утворенням складноефірного зв'язку між СООН- групою полімеру та 2 '- або 3'-гідроксилом нуклео зид у. Полімер, таким чином, одночасно містить нуклеозидні залишки, ковалентно зв'язані по двох положеннях. Надалі це не впливає на одержання олігонуклеотидних продуктів, оскільки після від щеплення олігомера з носія в обох випадках утво рюється олігонуклеотид, що містить на 3'-кінці рибонуклеозид імідазофеназину. З' (2')-Гідроксиль ні групи іммобілізованих нуклеозидів блокували за допомогою ацилювання оцтовим ангідридом у піри дині. Величина посадки нуклеозидів III на «Силох ром С-80», визначена по відщепленню 5'-0-захис~ ної триарилметильної групи кислотою, становила 35—37 мкмоль/г. Синтез олігонуклеотидів на мо дифікованих таким чином полімерах дозволяє от римати послідовності, що містять 3'-кінцевий нук леозид імідазофеназину. Для введення залишку імідазофеназину в інші положення олігонуклеотидного ланцюга були вико ристані З'-Н-фосфонати 5'-0-захищених 2'-дезок- синуклеозидів IV а, б. Одержані Н-фосфонати слу жили Р-компонентами реакції міжнуклеотидної конденсації на потрібній стадії синтезу олігонук- леотидної послідовності при тих самих умовах, що й Н-фосфонати природних нуклеозидів (рис 3). За допомогою Н-фосфонатного реагента модифікова ний нуклеозид може бути введений в будь-яке положення олігонуклеотидного ланцюга, крім 3 ' - термінального. При цьому олігонуклеотиди можна синтезувати як на звичайних носіях, що містять природні нуклеозиди, так і на отриманих нами полімерах з іммобілізованими модифікованими 370 С И Н Т Е З ТА В И В Ч Е Н Н Я А Н Т И С Р . Н С О В И Х О Л І Г О Н У К Л Е О Т И Д І В нуклеозидами. Це дозволяє отримувати олігонук леотиди, модифіковані одночасно по У- і 5'-кінцях або будь-якому з внутрішніх положень синтезова ної послідовності. В принципі, при використанні описаних нами модифікованих полімерних носіїв та Н-фосфонатів імідазофеназинових нуклеозидів мо жна одержувати послідовності, які включатимуть будь-яку кількість залишків інтеркалятора в зада них місцях. Твердофазним Н-фосфонатним методом було синтезовано цілий ряд олігонуклеотидів, що мі стять нуклеозиди імідазофеназинів у різних поло женнях. Нуклеотидні послідовності отриманих олі гонуклеотидів наведено в таблиці. Серед них є як модельні послідовності для вивчення фізико-хіміч- них властивостей модифікованих олігонуклеотидів (1), так і олігомери, комплементарні до певних консервативних, так званих сигнатурних, ділянок рибосомного оперона, та продукту його експресії — рибосомної РНК мікоплазм (молікутів) (2—6) та Е. соїі (7—12). Антисигнатурні олігонуклеотиди 2— 12 — це природні послідовності, в яких одна чи дві нуклеотидні ланки в різних положеннях замінено похідними імідазо[4,5-Ь Іфеназину. Синтез здійснювали як в автоматичному, так і в ручному варіанті. Середній вихід реакцій конден сації становив 96—97 % на стадію. Після завер шення нарощування олігонуклеотидного ланцюга та окислення гідрофосфорильних груп олігонук леотиди відщепляли від полімерного носія та дебло кували за допомогою обробки концентрованим роз чином аміаку, а цільові продукти очищали препа ративним гель-електрофорезом. Олігонуклеотиди, в складі яких знаходяться нуклеозиди імідазофена- зину, легко проявляються в гелі при УФ-опро- мінюванні у вигляді чітких смуг з жовтою флюо- ресценцією. Слід відмітити, що інтенсивна флюо- ресценція хромофора імідазофеназину (максимум емісії барвника в складі олігонуклеотидів спостері гається при 537—539 нм) робить його зручною репортерною групою для детекції нуклеїнових кис лот, а також для вивчення процесів комплексоут- ворення. Були досліджені фізико-хімічні та біологічні властивості синтезованих нами олігонуклеотидних послідовностей. В їхніх електронних спектрах по глинання поруч з УФ-поглинанням олігонуклео- тиду та імідазофеназину при 260—270 нм реєст рується смуга адсорбції барвника у видимій області (375—385 нм). При цьому співвідношення інтен сивностей поглинання модифікованих послідовно стей в ультрафіолетовій і видимій областях добре корелювало з розрахованими за коефіцієнтами ек стинкції інтеркалятора та відповідного олігонук- леотиду. Спектри підтвердили присутність двох залишків інтеркалятора в молекулі оліго- 371 МАКІТРУК В Л. ТА ІН. нуклеотидів 3, 6 та 11. Спектрально-флюорес- центні та гібридизаційні властивості олігонуклео тидних кон'югатів імідазофеназину докладніше описані в нашій недавній роботі [26 ]. Показано, що залишок інтеркалятора різко підвищує стабільність комплексів модифікованих олігонуклеотидів з ком плементарними послідовностями. Так, введення 3 ' - термінального нуклеозиду імідазофеназину в дека- тимідилат (dT), 0 збільшувало температуру топлен ня його дуплексів з poly-А або (dA), 5 на 10—12 °С і в ще більшій мірі (на 15—20 °С) стабілізувало потрійні комплекси модифікованого (dT), 0 . Спектроскопічні дослідження взаємодії похід них феназинів з ДНК показали, що основним типом зв'язування нейтрального хромофора імі дазофеназину є інтеркаляція барвника, тоді як у разі четвертинних солей феназинію значний внесок в утворення комплексів роблять також електроста тичні взаємодії з фосфатними групами [24—26]. На нашу думку, в останньому випадку знижується специфічність впізнавання послідовностей-мішеней модифікованими олігонуклеотидами порівняно з олігомерами, що містять нейтральний імідазофе- назин. При цьому стабілізуючий вплив нейтраль них та катіонних інтеркаляторів феназинового ряду на комплементарні комплекси виявляється прак тично однаковим. Олігонуклеотиди, модифіковані імідазофенази- нами, виявилися активними антисенсовими реаген тами, що ефективно блокували транскрипцію й трансляцію в молікутах в експериментах in vitro. Так, транскрипція пригнічувалася реагентами 3—4 приблизно на 80 %. При цьому інгібуюча ак тивність модифікованих антисигнатурних олігонук леотидів була суттєво вищою, ніж у немодифіко- ваних аналогів. Біологічні дані, отримані при вив ченні сполук 2—6, комплементарних 3'-кінцевій послідовності 16S рРНК мікоплазм та відповідної їй ділянки рибосомного оперону, наведено в ряді на ших попередніх робіт [27—29 1. Вивчення взаємодії модифікованих олігонук леотидів 7 та 9 з відповідними ділянками 16S рРНК підтверджує ймовірність утворення комплементар них дуплексів. Це демонструють величини неадек ватного пригнічення окремих стадій біосинтезу біл ка. З іншого боку, показано можливість викори стання синтетичних олігонуклеотидів для регулювання певних процесів функціонування ва жливих рибосомних центрів. Результати дослід жень біологічної активності модифікованих оліго нуклеотидів, комплементарних до ділянок рибосом- ної РНК Е. соїі, будуть опубліковані додатково. Таким чином, у даній роботі описано синтез ряду олігонуклеотидних послідовностей, модифі кованих рибо- та 2'-дезоксирибонуклеозидами імі- дазо[4,5-Ь ]феназину та його 2-метильного аналога в різних положеннях. Показано, що імідазофе- назинові нуклеозиди як ефективні інтеркалятори в складі модифікованих олігонуклеотидів, компле ментарних до консервативних ділянок рибосомного оперону, 16S рРНК молікутів та Е. соїі, суттєво підвищують їхню антисенсову активність і стабілізують комплекси з комплементарними нук леїновими кислотами. Слід відмітити, що, крім стабілізації комплементарних комплексів, ковален тно приєднаний залишок імідазофеназину, ймо вірно, здатний збільшити транспорт антисенсових олігонуклеотидів у клітину в зв'язку зі своїми ліпофільними властивостями. Аномальний нуклео зид, зв'язаний з З'-кінцем олігонуклеотидів, може підвищити стійкість останніх до дії клітинних нук- леаз, подібно до інших 3'-термінальних груп [1 — 4 ]. Ці питання вимагають додаткового вивчення. В. Л. Макитрук, А. С. Шаламай, И. Я. Дубей, Д М. Федоряк Синтез и изучение антисмысловых олигонуклеотидов, модифицированных имидазофеназиновыми нуклеозидами Резюме Н-фосфонатным твердофазным методом получены модифи цированные имидазофеназиновыми нуклеозидами по 3'-, У- и внутренним положениям олигонуклеотиды, комплементарные участкам рибосомного оперона, 16S рРНК микоплазм и Es cherichia coll Показано, что нуклеози ы имидазо[4,5-Ь]фенази- на и его 2-ме тильно го аналога, действуя как эффективные интеркаляторы, существенно влияют на стабильность комп лементарных дуплексов, повышая тем самым антисмысловую активность модифицированных олигонуклеотидных последова тельностей. V. L. Makitruk, A. S. Shalamay, I. Y. Dubey, D. М. Fedoryak Synthesis and study of antisense oligonucleotides modified with imidazophenazine nucleosides Summary Oligonucleotides containing imidazophenazine nucleosides at 3'-, 5'- and internal positions, which are complementary to certain regions of ribosomal operon DNA and 16 S rRNA of mycoplasmas and E. coli, have been synthesized by H-phosphonate solid phase method. It has been shown that nucleosides of imidazo[4,5-b]phenazine and its 2-methyl analog as efficient intercalating agents strongly affect the stability of complementary complexes increasing the antisense activity of modified oligonucleotide sequence. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. Uhlmann E., Peyman A. Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principle / / Chem. Rev.—1990.—90, N 4.— P. 543—584. 2. Knorre D. C , Vlassov V. V. Antisense oligonucleotide deriva tives as gene-targeted drugs / / Biomed. Sci.—1990—1, N 3.—P. 334—343. 3. Goodchild J. Conjugates of oligonucleotides and modified 372 С И Н Т Е З ТА В И В Ч Е Н Н Я А Н Т И С Е Н С О В И Х О Л І Г О Н У К Л Е О Т И Д І В oligonucleotides: a review of their synthesis and properties / / Bioconjugate Chem.—1990.—1, N 3.—P. 165—187. 4. English U., Gauss D. H. Chemically modified oligonucleotides as probes and inhibitors / / Angew. Chem. Int. Ed. Engl.— 1991.—30, N 6.—P. 613—629. 5. Conkin В., Sasmor H., Digiorgio J., Warren W. Producing pharmaceutical-grade antisense DNA: an envolving discipline / / Millipore Bioforum (Technology news for the life scien tist).—Bedford, 1992.—P. 2—4. 6. Beaucage S. JL, Iyer R. P. The nationalization of oligonuc leotides via phosphoramidite derivatives / / Tetrahedron.— 1993.—49, N 10.—P. 1925—1963. 1. Коршун В. А., Берлин Ю. А. Введение нерадиоактивных репортерных групп в синтетические олигонуклеотиды и их детекция / / Биоорг. химия.—1994.—20, № 6.—С. 565— 616. 8. Asseline U., Toulme F., Thuong N. Т. OUgodeoxynucleotides covalently linked to intercalating dyes as base sequence-specific ligands. Influence of dye attachment site / / EMBO J.— 1984.—3, N 4.—P. 795—800. 9. Helcne C , Montenay-Carestier Т., Saison V. Oligonucleotides covalently linked to intercalating agents: a new class of gene regulatory substances / / Biochimie. —1988.—67, N 7.— P. 777—783. 10. Helene C. The anti-gene strategy: control of gene expression by triplex-forming oligonucleotides / / Anti-Cancer Drug De sign.—1991.—6, N 5.—P. 569—584. 11. Thuong N. Т., Helene C. Sequense-specific recognition and modification of double-helical DNA by oligonucleotides / / Angew. Chem. Int. Ed. Engl.—1993.—32, N 5.—P. 666— 690. 12. Asseline U.f Thuong N Т., Helene C. Synthesis and properties of oligonucleotides covalently linked to intercalating agents / / New J. Chem.—1997.—21, N 1.—P. 5—17. 13. Bischofberger N., Matteucci M. D. Syntnesis of novel poly- cyclic nucleoside anologues, incorporation into oligonucleotides, and interaction with complementary sequences / / J. Amer. Chem. Soc—1989.—Ill , N 8.—P. 3041—3046. 14. Lin K.-Y., Jones R. J., Matteucci M. Tricyclic 2'-deoxy- cytidine analogs: syntheses and incorporation into oiigodeoxy- nucleotides which have enhanced binding to complementary RNA / / J. Amer. Chem. Soc.—1995.—117, N 13.—P. 3873— 3874. 15. Oligonucleotide synthesis: a practical approach / Ed. M. J. Gait.—Oxford: IRL press, 1984.—218 p. 16. Handbook of biochemistry and molecular biology / Ed. G. Fasman / / Boca Raton: CRC press, 1975.—P. 175. 17. Макитру к В. Л., Шалам ай А. С , Кондратюк И. В. Синтез и изучение рибофуранозидов ряда феназазолов / / Биополимеры и клетка.—1997.—13, № 6.—С. 453—459. 18. Froehler В. С, Ng Р. С, Matteucci М. D. Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates / / Nucl. Acids Res.—1986.—14, N 13.—P. 5399—5407. 19. Matteucci M. D.y Caruthers M. H. Synthesis of deoxy- oligonucleotides on a polymer support / / J. Amer. Chem. Soc.—1981.—103, N 11.—P. 3185—3191. 20. Зарытова В. Ф., Кутявин И. В., Сильников В. Н., Шишкин Г. В. Модификация нуклеиновых кислот в стаби лизированных комплементарных комплексах. I. Синтез алкилирующих производных олигодезоксирибонуклеоти- дов, содержащих на 5'-конце остаток ^(2-оксиэтил)фе- назиния / / Биоорг. химия.—1986.—12, № 7.—С. 911 — 920. 21. Kutyavin /. К, Podyminogin М. A., Bazhina Y. N. N-(2- HydroxyethyDphenazinium derivatives of oligonucleotides as effectors of the sequence-specific modification of nucleic acids with reactive oligonucleotide derivatives / / FEBS Lett.— 1988.—238, N 1.—P. 35—38. 22. Зарытова В. Ф., Иванова Е. М., Кутявин И. В. Синтез производных олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих на 3'-конце цепи остаток ^(2-оксиэтил)феназиния / / Изв. СО АН СССР. Сер. хим.—1989.—№ 6.—С. 3—9. 23. Lokhov S. С, Podyminogin М. A., Sergeev D. S. Synthesis and high stability of complementary complexes of N-(2- hydroxyethyDphenazinium derivatives of oligonucleotides / / Bioconjugate Chem.—1992.—3, N 5.—P. 414—419. 24. Благой TO. П., Зозуля В. Н., Волошин И. М., Макитрук В. Л., Шаламай А. С, Щербакова А. С. Исследование вза имодействия производных феназина с ДНК методом поля ризованной флюоресценции / / Биополимеры и клетка.— 1997 . -13 , № 1.—С. 22—29. 25. Zozulya V., Blagoi У и., Lober G. et ai Fluorescence and binding properties of phenazine derivatives in complexes with polynucleotides of various base compositions and secondary structure / / Biophys. Chem.—1997 - 65.—P. 55—63. 26. Зозуля В. M., Благой Ю. П., Дубей /. Я., Федоряк О. Д., Щербакова А. С , Федоряк Д. М. Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину / / Биополимеры и клетка.—1998.—14, № 1.—С. 54—61. 27. Бабичев В. В., Скрипаль И. Г., Безуглый С. В. и др. Олигодезоксирибонуклеозиды, комплементарные участкам рибосомального оперона молликутов, как ингибиторы транскрипции in vitro II Микробиол. жури.—1993.—55, № 6.—С. 29—35. 28. Коробкова Е. С, Панченко Л. 77., Шаламай А. С, Скри паль И. Г. Способность олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных З'-концевому участку 16S-pPHK мол ликутов, подавлять трансляцию на их рибосомах в системе in vitro II Микробиол. журн.—1995.—57, № 3.—С. 30— 36. 29. Skripal 1. G., Babichev V. V., Panchenko L. P. et ai Antisignature oligonucleotides and their analogs as inhibitors of mollicutes-cofactors of HIV / / Мікробіол. журн.—1997.—59, № 2.—С. 3—11. УДК 577.113.4.547.963.32 Надійшла до редакції 08.04.98 373

Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами

Institution

Ähnliche Einträge